BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGÂN ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC, KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG CỦA CÁC DÒNG LAI BC1 GIỮA KHOAI TÂY LAI SOMA VÀ KHOAI TÂY TRỒNG LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI – 2014 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM NGUYỄN THỊ NGÂN ĐÁNH GIÁ MỘT SỐ ĐẶC TÍNH NÔNG SINH HỌC, KHẢ NĂNG KHÁNG BỆNH MỐC SƯƠNG CỦA CÁC DÒNG LAI BC1 GIỮA KHOAI TÂY LAI SOMA VÀ KHOAI TÂY TRỒNG CHUYÊN NGÀNH : CÔNG NGHỆ SINH HỌC MÃ SỐ : 60.42.02.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS NGUYỄN QUANG THẠCH HÀ NỘI – 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi cam đoan rằng, số liệu kết nghiên cứu luận văn trung thực chưa sử dụng để bảo vệ học vị Tôi cam đoan rằng, giúp đỡ cho việc thực luận văn cảm ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thị Ngân Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn này, cố gắng nổ lực thân, nhận nhiều quan tâm giúp đỡ nhiệt tình thầy cô, lời động viên giúp đỡ bạn bè, người thân Nhân dịp này, xin chân thành cảm ơn thầy giáo, cô giáo khoa Công nghệ sinh học trực tiếp giảng dạy, trang bị cho kiến thức bổ ích suốt thời gian học tập rèn luyện trường Đặc biệt xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới GS.TS Nguyễn Quang Thạch, NCS Hoàng Thị Giang người tận tình hướng dẫn, giúp đỡ động viên trình thực đề tài hoàn thiện luận văn Tôi xin cảm ơn giúp đỡ nghiên cứu viên, kỹ thuật viên, cán phòng Công nghệ Sinh học khoai tây – Viện sinh học nông nghiệp giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt thời gian thực đề tài Viện Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến bạn bè người thân gia đình động viên giúp đỡ tạo điều kiện cho suốt thời gian học tập hoàn thành tốt luận văn Một lần xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 15 tháng 09 năm 2014 Tác giả Nguyễn Thị Ngân Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM ƠN ii MỤC LỤC iii DANH MỤC BẢNG vii DANH MỤC HÌNH viii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT x MỞ ĐẦU 1 Đặt vấn đề .1 Mục đích yêu cầu nghiên cứu đề tài 2.1.Mục đích 2.2 Yêu cầu 2.3 Ý nghĩa đề tài 2.3.1 Ý nghĩa khoa học .2 2.3.2 Ý nghĩa thực tiễn .2 Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung khoai tây 1.1.1 Nguồn gốc, lịch sử phát triển 1.1.2 Tầm quan trọng khoai tây 1.1.3 Tình hình sản xuất khoai tây 1.2 Bệnh mốc sương khoai tây nguyên nhân gây bệnh: nấm P.i 1.2.1 Bệnh mốc sương khoai tây 1.2.2 Nấm mốc sương P.i 1.3 Tình hình nghiên cứu bệnh mốc sương giới Việt Nam 14 1.3.1 Tình hình nghiên cứu nước 14 1.3.2 Tình hình nghiên cứu nước 17 Chương VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1 Vật liệu nghiên cứu 20 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.1.1 Đối tượng nghiên cứu 20 2.1.2 Hóa chất thiết bị sử dụng 20 2.2 Nội dung nghiên cứu 21 2.2.1 Đánh giá khả kháng bệnh mốc sương lai BC1 giai đoạn (seedling) 21 2.2.2 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sương lai BC1 dòng/giống bố mẹ qua lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời 22 2.2.3 Đánh giá đặc tính kháng bệnh mốc sương lai BC1 dòng/giống bố mẹ qua lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ 23 2.2.4 Đánh giá đặc tính nông sinh học lai BC1 dòng/giống bố mẹ 24 2.2.5 Đánh giá có mặt gen kháng bệnh mốc sương hệ lai BC1 thị phân tử 25 2.2.6 Đánh giá khả tạo lai hệ BC2 từ lai BC1 lai trở lại với khoai tây trồng 25 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Phương pháp phân lập nấm Phytophthora infestans chuẩn bị dịch lây nhiễm – (theo Darsow et al, 2004; Hammann et al., 2009) 25 2.3.2 Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh trồng từ hạt lai (theo Darsow et al, 2004; Hammann et al., 2009) 26 2.3.3 Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời (Darsow et al, 2004,2008; Hammann et al, 2009) 27 2.3.4 Phương pháp đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ (Darsow et al, 2004; Hammann et al, 2009) 29 2.3.5 Phương pháp đánh giá có mặt gen kháng bệnh mốc sương thị phân tử 29 2.3.6 Phương pháp đánh giá tính trạng nông sinh học điều kiện nhà lưới (QCVN 01 – 59: 2011/BNNPTNT; QCVN 01- 69:2011/BNNPTNT) 31 2.3.7 Phương pháp phân tích tiêu hóa sinh 31 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv 2.3.8 Phương pháp lai hồi giao số tổ hợp khoai tây có triển vọng với khoai tây trồng 32 2.3.9 Phương pháp xử lý số liệu 33 Chương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 34 3.1 Kết phân lập mẫu nấm mốc sương 34 3.2 Kết đánh giá tính kháng bệnh trồng từ hạt lai 35 3.3 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai BC1 so với dòng/giống khoai tây bố mẹ phương pháp lây nhiễm nhân tạo 39 3.3.1 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời 39 3.3.2 Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ 43 3.4 Kết đánh giá đặc tính nông sinh học lai BC1 so với dòng/giống khoai tây bố mẹ 45 3.4.1 Đánh giá khả sinh trưởng phát triển lai BC1 dòng giống bố mẹ 45 3.4.2 Kết đánh giá yếu tố hình thành suất, phẩm chất củ thu lai BC1 so với dòng/giống bố mẹ 50 3.4.3 Kết đánh giá tiêu hình thái củ lai BC1 dòng giống bố mẹ 54 3.4.4 Kết phân tích số tiêu hóa sinh đánh giá chất lượng củ đối tượng thí nghiệm 56 3.5 Kết đánh giá có mặt gen kháng mốc sương thị phân tử 58 3.6 Kết đánh giá khả tạo lai hệ BC2 từ lai BC1 lai trở lại với khoai tây trồng 61 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 63 Kết luận 63 Kiến nghị 63 TÀI LIỆU THAM KHẢO 64 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v PHỤ LỤC 69 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang Bảng 1.1 Diện tích, suất sản lượng khoai tây khu vực giới năm 2012 (FAOSTAT) Bảng 1.2 Diện tích, suất sản lượng khoai tây Việt Nam giai đoạn 2006 - 2012 (FAOSTAT) Bảng 2.1: Các dòng bố mẹ lai BC1 làm vật liệu nghiên cứu 20 Bảng 2.2 Trình tự mồi gen kháng Rpi-blb1 1/1’ 30 Bảng 3.1 Tỷ lệ mọc trồng từ hạt lai 36 Bảng 3.2: Khả kháng bệnh mốc sương lai BC1 giai đoạn (seedling) 38 Bảng 3.3 Khả kháng bệnh mốc sương lai BC1 so với dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo đơn tách rời 41 Bảng 3.4: Kết đánh giá tính kháng bệnh mốc sương lai BC1 so với dòng bố mẹ lây nhiễm nhân tạo lát cắt củ 44 Bảng 3.5 Các lai BC1 kháng bệnh mốc sương thí nghiệm lây nhiễm nhân tạo 45 Bảng 3.6: Kết đánh giá khả sinh trưởng phát triển lai BC1 so với dòng/giống bố mẹ 47 Bảng 3.7 Năng suất yếu tố cấu thành suất củ dòng/ giống lai khoai tây BC1 giống khoai tây bố mẹ 51 Bảng 3.8 Các tiêu hình thái củ dòng lai BC1 dòng /giống khoai tây bố mẹ 55 Bảng 3.9 Kết đánh giá số tiêu hóa sinh số dòng/giống khoai tây 57 Bảng 3.10 Tổng hợp có mặt gen kháng mốc sương lai BC1 dòng/giống bố mẹ 60 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii Bảng 3.11 Số lượng hạt hình thành sau lai tạo 62 DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang Hình 3.1 Phân lập nấm bệnh 1- Lấy mẫu bị nhiễm bệnh, nuôi lát cắt củ điều kiện tối, độ ẩm 99%; 2- Nấm bệnh sau 5-6 ngày nuôi cấy 34 Hình 3.2: 1-Bọc động bào tử 2-Cành bọc động bào tử quan sát kính hiển vi 35 Hình 3.3 Cây giai đoạn hai thật sau tỉa thưa 36 Hình 3.4 Cây sau gieo hạt 10 ngày 1-Cây khoai tây dòng 13.1310; 2- Cây khoai tây dòng 13.1314; 3- Cây khoai tây dòng 13.1320 37 Hình 3.5: 1- Phủ nilone giữ ẩm sau lây nhiễm 2- Cây bị nhiễm bệnh sau 3-4 ngày lây nhiễm 3- Cây khỏe mạnh đưa khu vực riêng 38 Hình 3.6 : Triệu chứng bệnh mốc sương số dòng khoai tây 1- Dòng khoai tây dại blb2G 2- dòng khoai tây trồng Delikat 3- BC1 13.1303.2; 4- BC1 13.1303.6; 5- BC1 13.1303.4 40 Hình 3.7: Lát cắt củ số dòng lai sau lây nhiễm nhân tạo ngày: 1Bắt đầu lây nhiễm nhân tạo 2-Lát củ lai tổ hợp lai 2283/5 (x) Delikat 44 Hình 3.8 Hình thái số dòng khoai tây: 48 Hình 3.9: Cấu trúc tán số dòng khoai tây A- BC1- 13.1302 (pnt 2G (+) Delikat /2195/2 (x) Delikat); B- BC1- 13.1304 (pnt 2G (+) Delikat /2235/1 (x) Delikat) 49 Hình 3.10 : Số củ/khóm số tổ hợp lai A- pnt2G A; B- Atlantic; C- pnt2G + Atlantic ; D-BC1 13.1317 (pnt2G (+) Atlantic/248/1 (x) Atlantic) 54 Hình 3.11 : Đặc điểm hình thái củ khoai tây số tổ hợp lai(1- 13.1310, 213.1311, 3- 13.1315) 54 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii Phụ lục 2: Thành phần phản ứng PCR STT Tên hóa chất Thể tích PCR Buffer 10X µl dNTP 2,5 mM µl Forward primer 10ppmol/µl 1,0 µl Reverse primer 10ppmol/ µl 1,0 µl Nước cất 10,5 µl MgCl2 1,5 µl Taq polymerase 5U/ µl DNA tổng số Tổng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp µl 1,0 µl 20 µl Page 70 Phụ lục 3: Hóa chất điện di sản phẩm PCR - Agarose 1-1,5% - Dung dịc TAE 1X - Sản phẩm PCR - Vật liệu thiết bị máy móc cần thiết cho kỹ thuật điện di Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 71 Phụ lục 4: Hóa chất phân tích hóa sinh Dung dịch K3Fe(CN)6 0,05N: 16,5g K3Fe(CN)6 70g Na2CO3 hòa tan lít nước cất, bảo quản lọ có màu Dung dịch Na2S2O3 0,05N: 12,4g Na2S2O3 hòa tan lít nước cất đun sôi 30 phút để nguội Dung dich (KI + ZnSO4):- lấy 10g ZnSO4 hòa tan 160ml nước cất - 5g KI hòa tan vào 40ml nước cất Trước sử dụng trộn hai dung dịch với theo tỷ lệ ZnSO4 : KI = 4:1 Dung dịch CH3COOH 10% Tinh bột 1%, 0,5% HCl 6N 25%, 2% NaOH 10% Phenolphtalein 1% cồn 960 Dung dịch I2 0,01N Nước cất Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 72 Phụ lục 5: Các tiêu theo dõi phương pháp đánh giá STT Chỉ tiêu Dạng củ Màu vỏ củ Màu thịt củ Giai đoạn đánh giá Sau thu hoạch Thu hoạch Khi thu hoạch Độ sâu mắt ngủ Số củ khối lượng củ/khóm Khối lượng củ không đạt thương phẩm Thu hoạch Thu hoạch Đơn vị tính điểm 6 8 10 % Mức độ biểu Tròn Ô Van ngắn Ô Van Ô Van Dài Dài Rất Dài Kem nhạt Vàng Đỏ Đỏ phần Xanh Xanh phần Nâu đỏ Màu khác Trắng Kem Vàng nhạt Vàng trung bình Vàng đậm Đỏ Đỏ phần Xanh Xanh phần Màu khác Rất nông nông Trung bình Sâu Rất sâu Củ to: đường kính>50mm Củ trung bình đường kính 30-50mm Củ nhỏ: đường kính < 30mm Kg/ô Thu hoạch Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Phương pháp đánh giá Quan sát củ đánh giá Quan sát vỏ củ đánh giá Cắt đôi củ quan sát thịt củ Quan sát mắt củ đánh giá Phân loại đếm số củ theo đường kính Cân số củ bị bệnh, củ dị dạng lần nhắc lại Page 73 XỬ LÝ SỐ LIỆU CHIEU CAO CAY 01:19 Friday, September 15, 2014 The ANOVA Procedure Dependent Variable: N Source Sum of DF Squares Model 19 Error 4730.392750 20 49.375000 Corrected Total Source T Mean Square F Value 39 248.968039 4779.767750 Coeff Var Root MSE 0.989670 3.822236 1.571226 19 F Anova SS 4730.392750 N Mean 41.10750 Mean Square F Value 248.968039 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Pr > F 100.85 [...]... cứu của đề tài 2.1.Mục đích Chọn lọc được các dòng con lai ở thế hệ BC1 có khả năng kháng bệnh mốc sương và mang các tính trạng nông sinh học tốt 2.2 Yêu cầu - Đánh giá được tính kháng bệnh mốc sương của các con lai BC1 ở giai đoạn cây con (seedling) - Đánh giá các các con lai BC1 về các đặc tính nông sinh học (hình thái ,sinh trưởng, phát triển, năng suất và phẩm chất củ) - Đánh giá khả năng kháng bệnh. .. và mang các tính trạng nông sinh học tốt Quá trình lai lại và chọn lọc sẽ được tiếp tục cho tới khi tạo được giống khoai tây mang tính kháng bệnh mốc sương có năng suất cao và phẩm chất tốt Theo hướng này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài : Đánh giá một số đặc tính nông sinh học, khả năng kháng bệnh mốc sương của các dòng lai BC1 giữa khoai tây lai soma và khoai tây trồng ” 2 Mục đích và yêu... bệnh mốc sương trên lá của các con lai BC1 thông qua lây nhiễm nhân tạo trên lá đơn tách rời; - Đánh giá khả năng kháng bệnh mốc sương trên củ của các con lai BC1 bằng lây nhiễm nhân tạo trên củ nhỏ - Đánh giá sự có mặt của gen kháng bệnh mốc sương ở thế hệ con lai BC1 bằng chỉ thị phân tử - Nghiên cứu khả năng tạo con lai thế hệ BC2 từ các con lai BC1 lai trở lại với khoai tây trồng 2.3 Ý nghĩa của. .. thí nghiệm đánh giá khả năng kháng mốc sương của con lai và kiểm tra ở mức độ phân tử đánh giá sự có mặt của gen kháng mốc sương trong con lai soma Sau đó, con lai soma được dùng làm dòng mẹ lai hữu tính với khoai tây trồng qua nhiều đời để chọn tạo giống vừa kháng bệnh mốc sương, vừa có các đặc tính nông sinh học tốt, cho năng suất củ cao 1.3.2 Tình hình nghiên cứu trong nước Theo nghiên cứu của Vũ Hoan... lai soma Tuy nhiên các con lai soma còn mang nhiều đặc tính của khoai tây dại cần được cải tạo Các vật liệu lai soma mang tính kháng bệnh mốc sương sẽ được lai lại (backcross- BC) với các giống khoai tây trồng (làm bố) để chọn ra các con lai vừa có khả năng kháng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 1 bệnh mốc sương vừa có kiểu hình giống với khoai tây trồng và. .. trong vườn ươm và đồng ruộng được đánh giá các đặc tính sinh trưởng phát triển cũng như năng suất Đánh giá khả năng sinh trưởng và phát triển, khả năng cho chọn lọc của các con lai BC1 và các dòng/ giống bố mẹ Đánh giá các yếu tố hình thành năng suất, phẩm chất củ thu được của các con lai BC1 và các dòng/ giống bố mẹ Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 24 ... giống khoai tây kháng bệnh mốc sương dựa vào nguồn khoai tây dại qua dung hợp tế bào trần và lai lại (backcross) 2.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 2 Lựa chọn được các dòng khoai tây có khả năng kháng bệnh mốc sương , có kiểu hình của khoai tây trồng và mang các tính trạng nông sinh học tốt phục vụ cho chương trình chọn tạo giống khoai tây. .. Kết quả tạo ra các dòng khoai tây trồng trọt mang đặc tính kháng bệnh virus, mốc sương rõ rệt cùng với các dạng đặc tính nông sinh học tốt của bố mẹ Các nghiên cứu gần đây cho thấy các loài khoai tây dại như S pinatisectum, S tarnii, S bulbocastanum mang nguồn gen kháng bệnh mốc sương cao (Thieme et al., 2008; 2010) Tuy nhiên rất khó để chuyển đặc tính kháng này qua lai tạo hữu tính giữa các loài dại... hợp các dòng/ giống khoai tây nhị bội để tổ hợp các đặc tính kháng bệnh virus PVX, PVY Gần đây, Hoàng Thị Giang, Đỗ Thị Thu Hà và các cs, 2013 của Viện SHNNHọc viên Nông nghiệp Việt Nam đã có sự hợp tác liên kết với Viện Nghiên cứu chọn tạo giống cây trồng JKI Đức đã tiến hành nghiên cứu tạo, đánh giá con lai soma khác loài giữa các giống khoai tây trồng và các dòng khoai tây dại mang khả năng kháng bệnh. .. nhằm tổ hợp đặc tính kháng bệnh mốc sương Năm 2010, các nhà khoa học tại John Innes Centre and the Sainsbury Laboratory bổ sung thêm một gen từ dòng khoai tây hoang dại vào khoai tây Desiree để tăng khả năng kháng tự nhiên của khoai tây với bệnh mốc sương Đến năm 2012, năm thứ 3 của thí nghiệm, trong khi các cây khoai tây không chuyển gen đều bị nhiễm bệnh mốc sương thì các cây chuyển gen vẫn sinh trưởng,