BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO TRƯỜNG ðẠI HỌC NÔNG NGHIỆP HÀ NỘI TRẦN MAI HƯƠNG ðÁNH GIÁ CHẤT LƯỢNG VAC XIN CÚM GIA CẦM H5N1 RE-5 NHẬP KHẨU TỪ TRUNG QUỐC ðANG LƯU HÀNH Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH : THÚ Y Mà SỐ : 60.64.01.01 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS PHẠM NGỌC THẠCH HÀ NỘI – 11/2013 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan rằng: Các kết nghiên cứu Luận văn trung thực, khách quan chưa ñược sử dụng ñể bảo vệ học vị Các thông tin trích dẫn Luận văn ñã ñược rõ nguồn gốc Hà nội, ngày tháng 11 năm 2013 Tác giả luận văn Trần Mai Hương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… ii LỜI CẢM ƠN Trong suốt năm học tập hoàn thành luận văn, với nỗ lực thân, ñã nhận ñược giúp ñỡ, hướng dẫn tận tình nhiều cá nhân tập thể, cho phép ñược tỏ lòng biết ơn cảm ơn chân thành tới: Ban Giám hiệu Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội, Ban Quản lý ðào tạo, Khoa Thú y, Bộ môn Nội - Chẩn - Dược - ðộc chất, thầy, cô giáo ñã giúp ñỡ, tạo ñiều kiện ñể học tập, tiếp thu kiến thức chương trình học PGS.TS Phạm Ngọc Thạch, người Thầy ñã tận tình bảo, hướng dẫn giúp ñỡ hoàn thành luận văn Ban Lãnh ñạo toàn thể cán phòng Siêu vi trùng, Trung tâm Kiểm nghiệm Thuốc Thú y Trung ương I ñã tạo ñiều kiện thuận lợi cho học tập thực luận văn Nhân dịp hoàn thành luận văn, cho phép ñược gửi lời cảm ơn sâu sắc tới gia ñình, người thân bạn bè ñã ñộng viên giúp ñỡ vượt qua khó khăn suốt trình học tập, nghiên cứu, thực ñề tài Một lần nữa, xin ñược bày tỏ lòng biết ơn, cảm ơn chân thành tới tập thể, cá nhân ñã tạo ñiều kiện giúp ñỡ hoàn thành chương trình học tập Hà Nội, ngày tháng 11 năm 2013 Tác giả Trần Mai Hương Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iii MỤC LỤC Lời cam ñoan ii Lời cảm ơn iii Mục lục iv Danh mục chữ viết tắt vi Danh mục bảng vii Danh mục hình viii MỞ ðẦU Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Bệnh cúm gia cầm 1.1.1 Tình hình dịch cúm gia cầm giới nước 1.1.2 Hình thái, cấu trúc vi rút cúm gia cầm 1.1.3 Biến ñổi tính kháng nguyên vi rút cúm gia cầm 1.1.4 ðộc lực vi rút cúm gia cầm 10 1.1.5 Nuôi cấy lưu giữ vi rút cúm gia cầm 11 1.1.6 Sức ñề kháng vi rút cúm gia cầm 11 1.1.7 Dịch tễ học bệnh cúm gia cầm 12 1.1.8 Triệu chứng, bệnh tích bệnh cúm gia cầm 14 1.1.9 Chẩn ñoán bệnh cúm gia cầm 15 1.2 Vắc xin phòng bệnh cúm gia cầm 16 1.2.1 Hiểu biết chung vắc xin 16 1.2.2 Phòng bệnh cúm gia cầm vắc xin 17 Chương ðỐI TƯỢNG, NỘI DUNG, ðỊA ðIỂM, NGUYÊN VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 23 2.1 ðối tượng, nội dung ñịa ñiểm nghiên cứu 23 2.1.1 ðối tượng nghiên cứu 23 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… iv 2.1.2 Nội dung nghiên cứu 23 2.1.3 ðịa ñiểm nghiên cứu 24 2.2 Nguyên vật liệu nghiên cứu 24 2.2.1 Nguyên liệu nghiên cứu 24 2.2.2 Vật liệu nghiên cứu 24 2.3 Phương pháp nghiên cứu 25 2.3.1 Bố trí thí nghiệm 25 2.3.2 Phương pháp xét nghiệm 28 2.4 Xử lý số liệu 35 Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 36 3.1.1 Kết kiểm tra vô trùng 36 3.1.2 Kết kiểm tra An toàn 37 3.1.3 Kết kiểm tra Hiệu lực 38 3.2 Kết ñánh giá chất lượng vắc xin cúm gia cầm H5N1 chủng Re-5 ñàn gà thực ñịa 41 3.2.1 Ảnh hưởng tiêm phòng ñến số tiêu sinh lý gà 41 3.2.2 ðáp ứng miễn dịch kháng H5 gà ñược tiêm vắc xin 44 3.2.3 Kết thử thách với chủng vi rút cường ñộc gà sau dùng vắc xin cúm gia cầm H5N1 Re-5 hai công ty Vinavetco Navetco 3.2.4 49 Kiểm tra có mặt vi rút cúm gia cầm H5N1 ñàn gà ñược tiêm phòng vắc xin 56 KẾT LUẬN VÀ ðỀ NGHỊ 59 Kết luận 59 ðề nghị 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO 61 PHỤ LỤC 65 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT HA Hemagglutination test HI Haemagglutination Inhibition RT-PCR Real time Polymerase Chain Reaction PBS Phosphate Buffer Saline TCVN Tiêu chuẩn Việt Nam EID50 50 Embryo Infection Dose BSL2 Bio Safety Laboratory Level DNA Deoxyribonucleic Acid RNA Ribonucleic Acid Ct Threshold Cycle AGP Agar Gel Precipitation Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… vi DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 3.1 Kết kiểm tra tiêu vô trùng vắc xin 3.2 Kết kiểm tra tiêu An toàn vắc xin cúm gia cầm A/H5N1, chủng Re-5 3.3 36 37 Kết kiểm tra hiệu giá kháng thể kháng vi rút cúm H5 huyết gà sau tiêm vắc xin 40 3.4 Kết theo dõi lâm sàng gà ñược tiêm phòng 43 3.5 Hiệu giá HI trung bình gà thời ñiểm lấy mẫu sau tiêm vắc xin công ty Vinavetco 3.6 Hiệu giá HI trung bình gà thời ñiểm lấy mẫu sau tiêm vắc xin công ty Navetco 3.7 48 Kết kiểm tra kháng thể H5 trước công cường ñộc phản ứng HI 3.9 47 So sánh biến ñộng hiệu giá kháng thể gà thời ñiểm sau tiêm vắc xin hai công ty Vinavetco Navetco 3.8 46 49 Kết bảo hộ gà vắc xin sau thử thách với chủng vi rút cường ñộc 50 3.10 Kết phát vi rút H5N1 sau công cường ñộc 54 3.11 Kết kiểm tra có mặt vi rút cúm H5 ñàn gà ñược tiêm phòng thời ñiểm lấy mẫu kỹ thuật Real time RT – PCR Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… 57 vii DANH MỤC HÌNH STT Tên hình Trang 1.1 Hình thái vi rút cúm gia cầm H5N1 kính hiển vi ñiện tử 1.2 Cấu trúc vi rút cúm H5N1 1.3 Các kiểu ñột biến 10 1.4 ðường truyền lây vi rút cúm 13 3.1 So sánh hiệu giá kháng thể trung bình GMT gà ñược tiêm vắc xin hai công ty Vinavetco Navetco 39 3.2 Biến ñộng hiệu giá kháng thể gà thời ñiểm lấy mẫu 45 3.3 So sánh hiệu bảo hộ gà hai lô vắc xin sau công cường ñộc với chủng vi rút khác 3.4 So sánh có mặt vi rút gà hai lô vắc xin thời ñiểm ngày sau công với hai chủng vi rút 3.5 3.7 55 So sánh có mặt vi rút gà hai lô vắc xin thời ñiểm 10 ngày sau công với hai chủng vi rút 3.6 52 55 Sơ ñồ kiểm tra dịch ổ nhớp (Swab) ñàn gà sau tiêm vắc xin phản ứng Real time RT – PCR 58 ðường cong biểu thị kết Real-time RT-PCR 58 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… viii MỞ ðẦU Tính cấp thiết ñề tài Cúm gia cầm (AI - Avian Influenza) bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc ñộ lây lan nhanh với tỷ lệ gây chết cao ñàn gia cầm nhiễm bệnh Bệnh xảy khắp nơi giới gây thiệt hại mặt kinh tế, có ảnh hưởng lớn ñến trị, xã hội… Vì vậy, bệnh cúm gia cầm ñược Tổ chức Thú y giới (OIE) xếp vào bảng A bệnh truyền nhiễm nguy hiểm Dịch cúm gia cầm xảy lần ñầu tiên Việt Nam vào cuối năm 2003 với nhiều ñợt dịch gây thiệt hại nghiêm trọng ñến ngành chăn nuôi gia cầm ảnh hưởng ñến sức khỏe người Dự ñoán nhiều năm nữa, bệnh mối ñe dọa nguy hiểm cho phát triển ngành chăn nuôi gia cầm nước ta cho sức khỏe cộng ñồng Theo khuyến cáo Tổ chức Thú y giới, việc phối hợp tốt biện pháp an toàn sinh học kết hợp với chủng ngừa vacxin làm tăng ngưỡng nhiễm mẫm bệnh hạn chế lây lan virut từ gia cầm sang gia cầm từ gia cầm sang người Việt Nam số nước giới ñã tiến hành ñồng biện pháp tiêu hủy ñàn gia cầm, cấm lưu thông tiêu thụ gia cầm sản phẩm gia cầm, kiểm soát giết mổ biện pháp an toàn sinh học… Mặc dù biện pháp ñã cho kết ñịnh song tốn kém, gây thiệt hại lớn kinh tế kết khống chế bệnh thấp Vì thế, song song với việc áp dụng biện pháp ñồng khác, sử dụng vacxin ñược xem biện pháp hỗ trợ tích cực việc phòng hạn chế lây lan bệnh cúm gia cầm ðáp ứng yêu cầu thực tế, ñể ñánh giá chất lượng vacxin cúm gia cầm nhập nay, góp phần tích cực vào việc khống chế dịch cúm gia cầm, nâng cao hiệu chăn nuôi, tiến hành nghiên cứu ñề tài: “ðánh giá chất lượng vac xin Cúm gia cầm H5N1 Re-5 nhập từ Trung Quốc ñang lưu hành Việt Nam” Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… Formatted: 2 Mục ñích ñề tài - ðánh giá tiêu Vô trùng, An toàn Hiệu lực vắc xin quy mô phòng thí nghiệm Deleted: vacxin Formatted: Indent: First line: 1.27 cm, No widow/orphan control Deleted: tính - ðánh giá khả ñáp ứng miễn dịch ñàn gà ñược tiêm vắc xin Deleted: vacxin thời ñiểm sau tiêm thực ñịa Formatted: 2, Space Before: pt, After: pt Ý nghĩa khoa học ñề tài ðánh giá ñược chất lượng vắc xin Cúm gia cầm tái tổ hợp phân Deleted: vacxin type H5N1, chủng Re-5 nhập nhập từ Trung Quốc khả ñáp ứng miễn dịch ñàn gia cầm thực ñịa ñối với vắc xin ñể có ñề xuất tham mưu công tác ñạo phòng, chống dịch cúm gia cầm nước ta giai ñoạn Deleted: vacxin Deleted: xác Deleted: vấn Deleted: với lãnh ñạo việc Deleted: hạn chế Deleted: bệnh Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ……………………… Page 11: [35] Deleted LANG TRAN 7/16/2013 9:35:00 AM Virus cúm gà phát triển tốt tế bào xơ phôi gà CEF - (Chicken Embryo Fibroblast) tế bào dòng có nguồn gốc thận chó MDCK - (Madin Darby Canine Kidney cell) với ñiều kiện môi trường nuôi cấy tế bào không chứa Trypsin (Ninh Văn Hiểu, 2006) [16] Page 16: [36] Deleted 2.7 LANG TRAN 7/18/2013 5:23:00 PM Kiểm soát bệnh Bệnh cúm gia cầm bệnh truyền nhiễm nói chung, trình sinh dịch có khâu quan trọng nguồn bệnh, yếu tố truyền lây, ñộng vật cảm nhiễm có liên hệ khâu Nếu thiếu khâu, ñặc biệt khâu thứ bệnh xảy Nếu có ñủ khâu liên hệ khâu bệnh xảy ðể kiểm soát, khống chế bệnh cúm gia cầm có hiệu cần tác ñộng vào khâu trình sinh dịch - ðối với nguồn bệnh: tiêu hủy triệt ñể gia cầm nhiễm bệnh, thực tốt công tác vệ sinh khử trùng ñể tiêu diệt mầm bệnh Tăng cường công tác giám sát phát bệnh Khi phát thấy gia cầm mang virus phải tiêu hủy - ðối với yếu tố truyền lây: thực tốt kiểm dịch vật chuyển, kiểm dịch gia cầm nhập khẩu, không vận chuyển gia cầm từ nước khu vực có dịch vào ñịa phương Thực nuôi nhốt, nuôi cách ly, hạn chế người phương tiện vào khu vực chăn nuôi Không nuôi chung loại gia cầm (gà, vịt, ngan) hộ Ngăn chặn xâm nhập giã cầm tiếp xúc với gia cầm Quản lý chặt chẽ việc buôn bán, giết mổ gia cầm, quy hoạch khu vực buôn bán giết mổ gia cầm riêng Thực tốt công tác vệ sinh, khử trùng, tiêu ñộc Tuyên truyền hướng dẫn biện pháp chăn an toàn sinh học, biện pháp phòng chống dịch cúm gia cầm ñể người chăn nuôi nhân dân tự giác, chủ ñộng thực - ðối với ñộng vật cảm thụ: tích cực tuyên truyền ñể thay ñổi dần tập quán chăn nuôi nhỏ lẻ sang chăn nuôi trang trại, chăn nuôi công nghiệp Quy hoạch khu vực chăn nuôi gia cầm xa khu dân cư Xây dựng chuồng trại ñúng tiêu chuẩn kỹ thuật, không gây ô nhiễm môi trường Thực tốt quy trình vệ sinh thú y Chăm sóc nuôi dưỡng tốt ñể nâng cao sức ñề kháng tự nhiên cho gia cầm Trong ñiều kiện chăn nuôi gia cầm Việt Nam nay, ñể kiểm soát dịch cúm gia cầm, biện pháp quan trọng tạo miễn dịch chủ ñộng cách tiêm vacxin cho ñàn gia cầm Như ñể kiểm soát dịch cúm gia cầm có hiệu cần thực ñồng biện pháp ñể tác ñộng vào khâu trình sinh dịch ñó có biện pháp tiêm vacxin cho ñàn gia cầm Page 19: [37] Deleted LANG TRAN 7/16/2013 2:58:00 PM 2.8.2.1 Sự cần thiết tiêm vacxin phòng bệnh cúm Trong thực tế sản xuất, có nhiều nguyên nhân khác làm cho biện pháp an toàn sinh học không ñủ mạnh ñể khống chế lây lan chủng virus ñộc lực cao xuất kẽ hở ñó mà bệnh có nguy xâm nhập vào ñàn gây bệnh Do ñó việc sử dụng vacxin giải pháp có ích làm giảm thiệt hại kinh tế góp phần khống chế bệnh có hiệu Hiện có quan ñiểm tồn song song việc sử dụng vacxin ñể phòng chống bệnh cúm gia cầm thể ñộc cao (Bộ NN & PTNT, 2005a) [4] * Quan ñiểm OIE: Sử dụng vacxin phòng bệnh cúm gia cầm thể ñộc lực cao biện pháp hỗ trợ song song với biện pháp tổng hợp khác tiêu hủy gia cầm nhiễm bệnh, an toàn sinh học, kiểm soát vận chuyển Theo OIE sử dụng vacxin dập dịch, hạn chế thiệt hại trực tiếp hạn chế lây lan virus * Quan ñiểm Trung Quốc: Trung Quốc tuân thủ nguyên tắc phòng chống dịch cúm gia cầm OIE dịch nổ Trung Quốc cho việc sử dụng vacxin nhằm mục ñích phòng bệnh ðiều ñó xuất phát từ sở Trung Quốc nước có lượng thủy cầm (chủ yếu vịt) chiếm ñại ña số 75% tổng số vịt toàn giới, tiêu hủy ñàn vịt có kháng thể kháng lại virus cúm gia cầm thiệt hại lớn Trung Quốc sử dụng biện pháp ñồng song song với việc sử dụng vacxin toàn quốc nhằm khống chế ổ dịch xảy phòng trừ lây lan từ nước ngoài, từ ñịa phương có dịch sang ñịa phương khác Những nghiên cứu thực nghiệm nghiên cứu thực ñịa cho thấy vacxin ñược sử dụng ñúng ñạt ñược số mục ñích (Tô Long Thành, 2006) [25]: - Bảo hộ gia cầm không xuất triệu chứng lâm sàng chết - Giảm thiểu thải virus môi trường làm giảm lây lan - Giảm tình trạng mẫn cảm ñàn gia cầm với chủng virus gây bệnh Khi ñịnh sử dụng vacxin chiến lược phòng chống cúm gia cầm quốc gia cần phải làm rõ số vấn ñề (Tô Long Thành, 2006) [25]: - Chủng virus dùng ñể sản xuất vacxin phải có type phụ haemaglutinin phải ñược chứng minh ñộng vật có khả phòng hộ cho vật chống lại virus cường ñộc ñang lưu hành - Phải có quy trình kỹ thuật sách ñể ñảm bảo việc bảo quản, cung cấp sử dụng vacxin - Phải tiến hành biện pháp giám sát huyết virus ñi kèm ñể xác ñịnh diện virus ñàn gia cầm ñã ñược tiêm phòng - Có kế hoạch, lộ trình cụ thể thời gian sử dụng vacxin chiến lược phòng chống chung Theo Breytenbach (2004) [7] việc sử dụng vacxin ñòi hỏi thận trọng, cần có chế ñộ giám sát chặt chẽ tùy tình hình quốc gia Thực tế cho thấy hiệu chương trình tiêm chủng cho kết khác từ nước qua nước khác mà nguyên nhân lý giải khác chỗ sử dụng biện pháp phòng bệnh hỗ trợ trực tiếp cho chương trình tiêm chủng 2.8.2.2 Page 19: [38] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 3:07:00 PM Việc sử dụng vacxin vô hoạt ñã ñạt ñược hiệu phương diện sinh học kinh tế số nước Page 19: [39] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 3:07:00 PM Hiệu lực vacxin việc ngăn ngừa bệnh giảm lượng vi rút thải môi trường ñã ñược chứng minh thông qua nghiên cứu thực ñịa thử nghiệm (Swayne D E & Suarez D L, 2000) [62] Nhược ñiểm loại vacxin phân biệt gia cầm ñược tiêm chủng với gia cầm tiếp xúc với mầm bệnh thực ñịa, trừ có chưa ñược tiêm chủng ñược nhốt chuồng Page 20: [40] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 3:08:00 PM Sau tiếp xúc với vi rút thực ñịa, bảo hộ lâm sàng giảm thải vi rút môi trường ñược ñảm bảo phản ứng miễn dịch sản sinh kháng nguyên nhóm H ñồng chủng, kháng thể chống lại Neuraminidase sản sinh vi rút thực ñịa sử dụng chất ñánh dấu lây nhiễm thực ñịa (Ilaria Capua, Stefano Marangon, 2004) [21]; (Capua I., Marangom S., 2000) [38] ðối với loại vacxin ñồng chủng dị chủng so sánh thấy mức ñộ bảo hộ lâm sàng việc giảm thải virus môi trường bên vacxin ñồng chủng ñược cải thiện khối lượng kháng nguyên vacxin cao ðối với vacxin dị chủng, mức ñộ bảo hộ không tỷ lệ chặt chẽ với mức ñộ ñồng chủng gen ngưng kết tố hồng cầu vacxin chủng thực ñịa Nhiều nghiên cứu thực nghiệm ñã chứng minh vacxin vô hoạt ñơn giá ña giá có chất hỗ trợ ñã tạo kháng thể cho gia cầm, có tác dụng phòng vệ làm giảm số nhiễm, số chết, không giảm ñẻ trứng Tuy vậy, gia cầm ñược tiêm vacxin trở nên mắc bệnh mà triệu chứng lâm sàng thải virus mà tiềm tàng khả lây lan, gây bệnh nghiêm trọng (Kishida N, Sakoda Y, 2005) [51]; (Klenk, H D., W Keil, 1983) [52] Page 20: [41] Formatted LANG TRAN 7/16/2013 3:00:00 PM Indent: First line: 1.27 cm, Line spacing: Multiple 1.45 li Page 20: [42] Deleted LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM Vacxin sống vi rút tái tổ hợp TrovacAIV - H5 Merial ( Liên doanh Pháp - Mỹ) lấy nguồn gen H5 từ chủng A/Turkey/Ireland/83(H5N2), sử dụng cho gia cầm lúc ngày tuổi ñã ñược sử dụng Việt Nam Vacxin Page 20: [43] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 3:09:00 PM Một ưu ñiểm vacxin tái tổ hợp vacxin chứa kháng nguyên H không xảy phản ứng ñối với phản ứng miễn dịch ngưng kết kép thạch Chính ñiều tra huyết học khó thực ñược ñối với loại vacxin Vacxin tái tổ hợp cho phép phân biệt ñộng vật nhiễm bệnh ñộng vật tiêm chủng vacxin chúng không sản sinh kháng thể chống lại kháng nguyên Nucleoprotein phổ biến tất vi rút cúm gà Chỉ ñộng vật nhiễm bệnh thực ñịa tạo kháng thể nhóm A (Nucleoprotein) phát kháng thể qua phản ứng ngưng kết thạch phản ứng ELISA Việc sử dụng vacxin ñược giới hạn với loài mà vi rút ñích nhân lên ñược giới hạn ñàn gà có huyết âm tính với vi rút ñích Ví dụ, ILTV không nhân lên gà tây gà tây ñặc biệt quan trọng vấn ñề dịch tễ bệnh cúm gà, việc sử dụng vacxin ñược hạn chế vùng gà tây Vacxin nhược ñộc vi rút cúm nhân tạo: sử dụng vi rút cúm ñược làm nhược ñộc kỹ thuật xoá bỏ gen ñộc Vacxin AND: sử dụng AND tái tổ hợp làm vacxin, vacxin chứa gen HA, NA, NP ñơn lẻ ña gen c Chiến lược DIVA Lựa chọn vacxin tương ñồng không hoàn toàn cho phép áp dụng chiến lược “DIVA” (phân biệt vật nhiễm bệnh vật ñược tiêm phòng) ñể cho thấy vi rút môi trường ñang lưu hành ñàn gia cầm dùng vacxin Nhóm H tương ñồng ñảm bảo tính bảo hộ, khả phân biệt gà chủng ngừa gà nhiễm bệnh dựa vào ñáp ứng huyết nhóm N phản ứng miễn dịch huỳnh quang gián tiếp Gà chủng ngừa dương tính với nhóm N dùng vacxin, dương tính với nhóm N vi rút môi trường cho thấy ñã nhiễm bệnh Sự phát triển vacxin xét nghiệm khác cho phép phát ñược lây nhiễm thực ñịa ñàn ñã tiêm chủng vacxin việc làm ưu tiên ñối với công nghiệp dược ñối với viện nghiên cứu tiêm chủng vacxin ñã giải pháp ñể khồng chế bệnh cúm gà (Breytenbach J.H, 2003) [6] Nếu việc tiêm chủng vacxin ñược xem xét kế hoạch dự phòng phải dự ñoán trước ñược ngân hàng vacxin ñã ñược cấp phép, cho phép bắt buộc thực ñược chiến lược “Phân biệt vật bị nhiễm bệnh với vật tiêm chủng vacxin”, ñảm bảo ñược sức khỏe ñộng vật, ñối xử nhân ñạo với cộng ñồng thương mại quốc tế (Ilaria Capua, Stefano Marangon, 2003) [20] 2.8.2.3 Page 20: [44] Formatted LANG TRAN 7/16/2013 3:00:00 PM 4, Space After: pt, Widow/Orphan control Page 20: [45] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:03:00 AM Font: Not Bold, Font color: Blue, Condensed by 0.3 pt Page 20: [46] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:03:00 AM Font: Not Bold, Font color: Blue, Condensed by 0.3 pt Page 20: [47] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:03:00 AM Font: Not Bold, Font color: Blue, Condensed by 0.3 pt Page 20: [48] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:03:00 AM LANG TRAN 7/16/2013 3:01:00 PM Font: Not Bold, Font color: Blue Page 20: [49] Formatted Indent: First line: 1.27 cm, Space After: pt, Line spacing: Multiple 1.45 li Page 20: [50] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:03:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 3:06:00 PM Font: Not Italic, Font color: Blue Page 20: [51] Deleted Vacxin ñược sử dụng qua ñường tiêm da nơi gáy cổ máy tiêm bán tự ñộng hay tự ñộng, tiêm ñồng thời với vacxin phòng bệnh Marek, ñó thuận lợi dễ kiểm soát so với thực hộ chăn nuôi Vacxin tạo ñáp ứng miễn dịch sớm không tạo miễn dịch truyền ngang từ ñàn gà ñược chủng ngừa nuôi chung với gà nhạy cảm chưa tiêm phòng Page 20: [52] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:04:00 AM LANG TRAN 7/16/2013 3:01:00 PM Font: Not Italic, Font color: Blue Page 20: [53] Formatted Indent: First line: 1.27 cm, Space After: pt, Line spacing: Multiple 1.45 li Page 20: [54] Formatted LANG TRAN 7/16/2013 3:01:00 PM Indent: First line: 1.27 cm, Space After: pt, Line spacing: Multiple 1.45 li Page 20: [55] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:04:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 3:19:00 PM LANG TRAN 7/19/2013 3:19:00 PM Font: Not Italic, Font color: Blue Page 23: [56] Formatted Font: 16 pt, Font color: Blue Page 23: [57] Formatted Font color: Blue, Portuguese (Brazil) Page 23: [58] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 3:19:00 PM Font: (Default) Times New Roman, Font color: Blue, Portuguese (Brazil) Page 23: [59] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 3:19:00 PM Font: (Default) Times New Roman, Font color: Blue Page 23: [60] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 3:19:00 PM Font: 16 pt, Bold, Font color: Blue, Portuguese (Brazil) Page 23: [61] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 3:19:00 PM Font color: Blue, Portuguese (Brazil) Page 23: [62] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 10:38:00 AM Nguyên liệu ñịa ñiểm nghiên cứu Page 23: [63] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 11:12:00 AM Nguyên liệu * ðộng vật thí nghiệm Gà Lương Phượng 3-4 tuần tuổi, gà khỏe chưa ñược tiêm phòng vacxin cúm gia cầm Page 23: [64] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:39:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Not Italic, Font color: Blue Page 23: [65] Formatted Font: Not Bold, Not Italic, Font color: Blue, English (U.S.) Page 23: [66] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Not Bold, Not Italic, Font color: Blue, English (U.S.) Page 23: [67] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Not Bold, Not Italic, Font color: Blue, English (U.S.) Page 23: [68] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Not Bold, Not Italic, Font color: Blue, English (U.S.) Page 23: [69] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Times New Roman, 14 pt, Not Bold, Font color: Blue Page 23: [70] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Not Bold, Not Italic, Font color: Blue, English (U.S.) Page 23: [71] Formatted LANG TRAN Font: Not Bold, Not Italic, Font color: Blue, English (U.S.) 7/19/2013 10:48:00 AM Page 23: [72] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Not Bold, Not Italic, Font color: Blue, English (U.S.) Page 23: [73] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Times New Roman, 14 pt, Not Bold, Font color: Blue Page 23: [74] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 10:48:00 AM Font: Times New Roman, 14 pt, Not Bold, Font color: Blue Page 25: [75] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 11:30:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:30:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:30:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:30:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:30:00 AM LANG TRAN 7/16/2013 3:49:00 PM Font: Not Italic, Font color: Blue Page 25: [75] Formatted Font: Not Italic, Font color: Blue Page 25: [75] Formatted Font: Not Italic, Font color: Blue Page 25: [75] Formatted Font: Not Italic, Font color: Blue Page 25: [75] Formatted Font: Not Italic, Font color: Blue Page 25: [76] Deleted - Vacxin cúm gia cầm vô hoạt subtype H5N1 chủng Re-6 sản xuất Da Hua Nong (ðại Hoa Nông - Trung Quốc) công ty Vinavetco nhập * Môi trường hoá chất bảo quản bệnh phẩm: Bệnh phẩm dịch ngoáy ổ nhớp (swab), họng, khí quản ñược bảo quản dung dịch vận chuyển Có thể sử dụng môi trường 199 môi trường glycerol có bổ sung kháng sinh, bảo quản 40C từ - ngày, ñể lâu nên giữ nhiệt ñộ -200C - Môi trường 199 chứa 0,5% BSA (Albumin huyết bò) - Môi trường Glycerol + Bổ sung kháng sinh: Penicillin G 2.000.000 U/lít Streptomycin 200 mg/lít Polymyxin B 2.000.000 U/lít Gentamicin 250 mg/lít Nystatin 500.000 U/lít Ofloxacin HCl 60 mg/lít Sulfmethoxaole 200 mgítit + Pha chế PBS NaCl 8g KCl 0,2 g Na2HPO4 1,15 g KH2PO4 0,2 g Nước cất vừa ñủ 1000 ml Hấp vô trùng 1210C/15 phút, bổ sung kháng sinh có trộn với glycerol theo tỷ lệ 1:1 * Chuẩn bị dung dịch làm phản ứng: - Dung dịch PBS 0,01M pH7,2: Na2HPO4 1,096 g NaH2PO4…H2O 0,316 g NaCl 8,5 g Nước cất lít Page 25: [77] Formatted LANG TRAN 7/16/2013 4:06:00 PM LANG TRAN 7/19/2013 11:33:00 AM Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue, Swedish (Sweden) Page 25: [77] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 11:32:00 AM LANG TRAN 7/19/2013 1:52:00 PM Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [77] Formatted Font color: Blue Page 25: [78] Deleted 3.3.1 Page 25: [78] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 1:52:00 PM LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM LANG TRAN 7/16/2013 4:09:00 PM Page 25: [79] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 1:54:00 PM Page 25: [80] Deleted LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM LANG TRAN 7/16/2013 4:09:00 PM Page 25: [81] Deleted LANG TRAN 7/19/2013 1:54:00 PM Page 25: [82] Deleted LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM LANG TRAN 7/19/2013 1:54:00 PM LANG TRAN 7/19/2013 1:54:00 PM LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM kiểm nghiệm Page 25: [78] Deleted vacxin Page 25: [79] Deleted 3.3.1.1.1 v vacxin Page 25: [80] Deleted vacxin Page 25: [81] Deleted 3.3.1.1.2 a vacxin Page 25: [82] Deleted vacxin Page 25: [82] Deleted vacxin Page 25: [83] Deleted 3.3.1.1.3 Page 25: [83] Deleted h Page 25: [84] Deleted vacxin Page 25: [84] Deleted LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM LANG TRAN 7/13/2013 3:39:00 PM LANG TRAN 7/19/2013 1:51:00 PM vacxin Page 25: [84] Deleted vacxin Page 35: [85] Deleted Phương pháp RT-PCR ñược sử dụng ñể phát vi rút dịch ngoáy hầu họng ñược tiến hành sau: * Chiết tách RNA: Có thể chiết tách RNA kít phương pháp chiết tách Trizol Các mẫu swab nên chiết tách kít, sử dụng nên theo hướng dẫn nhà sản xuất (có thể sử dụng kít Qiagen® Rneasy Extraction cat # 7410450 prep 74106 250 prep) - Chiết tách Trizol: + Cho 0,75 ml Trizol® LS reagent (hoặc ml Trizol® reagent) + 0,25 ml dịch bệnh phẩm (0,1 ml dịch bệnh p hẩm dùng Trizol® reagent) vào ống 1,5 ml Lắc ñều ñể nhiệt ñộ phòng phút + Thêm 0,2 ml Chloroform vào ống Lắc mạnh 15 giây ñể nhiệt ñộ phòng phút + Ly tâm ống tốc ñộ 12.000g 15 phút 40C + Chuyển phần nước (khoảng 500 µl) sang ống microtube + Thêm 0,5 ml Isopropanol lắc ñều ðể - 10 phút nhiệt ñộ phòng + Ly tâm tốc ñộ 10.000g phút 40C Bỏ dung dịch ống + Rửa RNA ñóng ñáy ống cồn 80%, lắc mạnh ly tâm tốc ñộ 10.000g phút 40C + Bỏ dung dịch ống làm khô RNA 10 phút nhiệt ñộ phòng hoà tan lại với 30 µl nước cất Rnase nước cất ñã xử lý DEPC * Tiến hành phản ứng RT - PCR: - Công thức pha: Công thức pha thay ñổi cho phù hợp với loại primer loại kít RT - PCR khác + Công thức áp dụng cho kít RT - PCR bước hãng Qiagen H2 O 12µl 5X Buffer 5µl dNTP 1µl Enzyme mix 1µl Primer forward 0,5µl Primer reverse 0,5µl Mẫu RNA 5µl Tổng cộng 25µl - Chu trình nhân gen: 1) 600C - phút 2) 420C - 10 phút 3) 500C - 30 phút 4) 950C - 15 phút 5) 940C - 30 giây (tách sợi) 6) 500C - 30 giây (gắn primer) 7) 720C - phút (kéo dài) 8) Chu trình 35 - 40 vòng 9) 720C - 10 phút 10) Giữ 40C Quy trình nhân gen áp dụng cho primer H5 (F936 R1299) N1 (F6 R595), ñối với cặp primer khác quy trình thay ñổi cho phù hợp * Chạy ñiện di: - Chuẩn bị thạch agarose 1.5% pha dung dịch TAE TBE có Ethidium Bromide (10µg/µl) - ðổ thạch vào khuôn ñiện di (có lược) - Thạch khô, rút lược cho mẫu vào giếng (5 µl sản phẩm PCR + µl dung dịch loading buffer) - Sử dụng Marker trọng lượng phân tử (thang 100 bp) - Chú ý chạy PCR phải có mẫu ñối chứng dương ñối chứng âm ñi kèm (mẫu ñối chứng nước cất sạch) * ðọc kết quả: - Mẫu dương tính: Xuất vạch giống với mẫu ñối chứng dương tính - Mẫu âm tính: Không có vạch ðánh giá kết quả: Có virus cúm virus cúm thuộc subtype dựa vào primer chạy mẫu [...]... dịch cúm gia cầm phát ra tại: Bangladesh, Bhutan, Trung Quốc, Cămpuchia, ðặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Hàn Quốc, Nepal và Việt Nam (OIE) b) Tình hình dịch cúm gia cầm ở Việt Nam Dịch cúm gia cầm H5N1 bùng phát tại Việt Nam vào cuối tháng 12/2003 Deleted: Deleted: nay Deleted: ngày Deleted: : Cuối tháng 12 năm 2003, dịch cúm gia cầm thể ñộc lực cao với tác nhân gây bệnh là vi rút cúm gia cầm H5N1. .. (NAVETCO) Vắc xin có thể phòng bệnh cúm gia cầm do vi rút H5N1 nhánh Deleted: 1 và nhánh 2.3.2.1 (nhóm A) gây bệnh cho gà và do vi rút H5N1 nhánh 1 gây bệnh cho vịt Deleted: Vacxin Deleted: ñang thử nghiệm sản xuất Deleted: Như vậy, tới ñây Việt Nam sẽ có vacxin cúm gia cầm ñạt tiêu chuẩn quốc tế, phù hợp với chủng gây bệnh cúm gia cầm ở nước ta với giá thành chắc chắn sẽ rẻ hơn so với vacxin nhập hiện... rút cúm H5N1 lưu hành ở Việt Nam ñều giống nhau và có cùng nguồn gốc - Mặc dù chưa biết nguồn gốc của 2 ñoạn M và NP, các ñoạn gen của vi rút ñều ñã ñược phát hiện và công bố ở Trung Quốc trước khi xảy ra dịch cúm ở nước ta Deleted: virus Deleted: virus Deleted: - Như vậy có thể kết luận rằng virus cúm H5N1 ở Việt Nam có nguồn gốc từ Trung Quốc và virus lưu hành ở nước ta chỉ có một loại xuất phát từ. .. cúm gia cầm thể ñộc lực cao ở gà và vịt Sự lây lan nhanh chóng dịch cúm gia cầm xảy ra ñồng thời ở một số nước ñã trở thành mối quan tâm lớn trên toàn cầu (Tô Long Thành, 2004) Deleted: có 30 quốc gia và vùng lãnh thổ trên thế giới báo cáo xuất hiện dịch cúm gia cầm do vi rút H5N1, ñặc biệt là tại Indonesia, dịch cúm gia cầm dây dưa kéo dài Tại một số quốc gia Châu Phi nơi ñược cho là vi rút cúm gia cầm. .. trực tiếp và hạn chế sự lây lan của virus.¶ * Quan ñiểm của Trung Quốc: Trung Quốc tuân thủ các nguyên tắc phòng chống dịch cúm gia cầm của OIE khi dịch nổ ra Trung Quốc còn cho việc sử dụng vacxin nhằm mục ñích phòng bệnh ðiều ñó xuất phát từ cơ sở Trung Quốc là nước có lượng thủy cầm (chủ yếu là vịt) chiếm [37] Deleted: vacxin Vi rút cúm gia cầm ñược nuôi cấy trong phôi gà 9 - 11 ngày tuổi, sau Formatted:... Trung Quốc ñã có 7 ca nhiễm vi rút cúm ở người ¶ Năm 2010, dịch cúm gia cầm phát ra tại 16 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Bangladesh, Bhutan, Bun-ga-ri, Cămpuchia, Trung Quốc, ðặc khu hành chính Hồng Kông, Ấn ðộ, Israel, Lào, Mông Cổ, Myanma, Nepal, Ru-ma-ni, Nga, Tây Ban Nha và Việt Nam. ¶ Năm 2011, dịch cúm trên gia cầm phát ra tại 14 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm: Bangladesh, Cămpuchia, Trung. .. hủy gia cầm nhiễm bệnh, an toàn sinh học, kiểm soát vận chuyển Theo OIE sử dụng vacxin là dập dịch, hạn chế thiệt hại trực tiếp và hạn chế sự lây lan của virus * Quan ñiểm của Trung Quốc: Trung Quốc tuân thủ các nguyên tắc phòng chống dịch cúm gia cầm của OIE khi dịch nổ ra Trung Quốc còn cho việc sử dụng vacxin nhằm mục ñích phòng bệnh ðiều ñó xuất phát từ cơ sở Trung Quốc là nước có lượng thủy cầm (chủ... trường thạch nấm ñể ở nhiệt ñộ phòng, theo dõi liên tục trong Deleted: vacxin 7 ngày Nếu ở các môi trường kiểm tra không có nấm và vi khuẩn mọc thì kết [79] Deleted: vacxin…vacxin [80] Deleted: 3.3.1.1.2…a [81] luận vắc xin vô trùng - Chỉ tiêu An toàn Với mỗi lô vắc xin sử dụng 20 gà 4 tuần tuổi, khỏe mạnh, trong ñó 10 gà ñược Deleted: vacxin…vacxin…vacxin [82] tiêm vắc xin cúm gia cầm vào dưới da... truyền (ILTV) Deleted: vacxin Deleted: Một ưu ñiểm của vacxin tái[43] tổ Formatted [44] Formatted [45] Formatted [46] Deleted: Các Formatted 1.2.2.3 Một số loại vắc xin phòng bệnh cúm gia cầm ñược sử dụng ở Việt Nam [47] Deleted: vacxin - Vắc xin Trovac AIV H5 Formatted Vắc xin Trovac AIV H5 là vắc xin vectơ tái tổ hợp vi rút ñậu sống chứa gen Hemagglutinin H5 của chủng vi rút cúm chủng A/turkey/... Cămpuchia, Myanma, Malaysia, Trung Quốc, Thái Lan cũng ñã tái phát dịch Các quốc gia có ngành chăn nuôi tiên tiến như: Hàn Quốc, Nhật Bản và một số quốc gia ở Châu Âu như: Nga, Hung-ga-ri, Ru-ma-ni, Anh, cũng ghi nhận có các ổ dịch ở gia cầm. ¶ Năm 2008, dịch cúm gia cầm phát ra tại 28 quốc gia và vùng lãnh thổ bao gồm Deleted: Deleted: - Ngoài các ổ dịch do vi rút cúm H5N1 nêu trên, còn có 7 nước