Đang tải... (xem toàn văn)
Trong cuộc sống enzyme ngày càng có nhiều ứng dụng thực tiễn đóng góp to lớn cho cuộc cách mạng sinh học trong thời đại mới: lĩnh vực công nghiệp như bột giặt, sữa, chuẩn đoán bệnh, chế biến dầu, chuyển hóa sinh học
Họ tên: Đặng Vinh Quang Lớp: Gi-53 MSSV: 530894 Bài tiểu luận hóa sinh đại cương Tên đề tài: Tìm hiểu về đặc tính biểu hiện cao Lipase kiềm và chịu nhiệt của chủng Ralstoniasp.M1 ở E.coli. I.Mở Đầu Trong cuộc sống enzyme ngày càng có nhiều ứng dụng thực tiễn đóng góp to lớn cho cuộc cách mạng sinh học trong thời đại mới: lĩnh vực công nghiệp như bột giặt, sữa, chuẩn đoán bệnh, chế biến dầu, chuyển hóa sinh học…bên cạnh đó có những loại enzyme với đặc tính rất quý như: chịu nhiệt, chịu kiềm và loại enzyme này hứa hẹn mở ra nhiều thành công trong lĩnh vực sinh học (enzyme). Xuất phát từ yêu cầu đó em tim hiểu về đặc tính biểu hiện cao Lipase kiềm và chịu nhiệt của chủng Ralstoniasp.M1 ở E.coli. Đây là một loại enzyme ngoài những đặc tính củ enzyme binh thường nó còn có tác dụng xúc tác để đồng phân nhờ một số đặc tính như đặc hiệu cơ chất, vị trí, chọn lọc đồng phân, bền nhiệt và kiềm. II.Nội Dung Lipase vi khuẩn họ I được chia thành 7 phân họ dựa vào mức độ tương đồng trình tự amino acid. Lipase Subfamily I.1 (P. aeruginosa, Acinetobacter sp. ,P. fragi, etc), và I.2 (B. glumae, B. cepacia, C. viscosum, P. luteola, Ralstonia sp. M1, etc) có độ tương đồng trình tự amino acid cao (>33%) và hầu hết chúng còn có một đặc điểm chung khác là gene lipase luôn luôn gắn kết với gene thứ hai nằm ngay sau hoặc trước gene lipase. Gene thứ hai mã hóa một protein được gọi là lipase-specific foldase (modulator, activator, helper protein, hoặc chaperone) cần thiết để hoạt hóa lipase và tiết lipase ngoại bào. Trong nghiên cứu trước, gene lipA và gene lipB lần lượt mã hóa lipase và chaperone chủng Ralstonia sp. M1 đã được nhân dòng, phân tích và xác định thuộc phân họ I.2 Burkholderia lipase/chaperone. Trong điều kiện của bài tiểu luận này, tôi chỉ xin tìm hiều sơ lược về biểu hiện của ezyme lipase hoàn thiện LipA và chaperone (LipBhis đã cắt 56aa ở E. coli BL21 dưới sự điều khiển của T7 promoter. Cả hai protein được tinh sạch và lipase được hoạt hóa với chaperone. Một số tính chất hóa lý của lipase tái tổ hợp được nghiên cứu. Lipase LipA được biểu hiện ở E. coli BL21 pELipAB với năng suất cao 70 mg protein/gram tế bào tươi và được tinh sạch theo phương pháp đơn giản nhiều bước ly tâm - siêu âm. SDS-PAGE biểu thị một băng duy nhất sau khi tinh sạch Chaperone được biểu hiện ở E. coli BL21 pELipB với mức độ cao 12 mg protein/gram tế bào tươi. (LipABis tinh sạch cho một băng protein trên SDS-PAGE ) • Nhiệt độ tối ưu và độ bền với nhiệt Nhiệt độ tối ưu của LipA là 55°C. Hoạt tính lipase tăng dần từ 20% (25°C) lên tối đa 100% (55°C) và sau đó giảm mạnh xuống 69% (60°C). Từ 60 - 75°C, hoạt tính giảm rất chậm từ 69% xuống 57%. Lipase này là enzyme ưa nhiệt. Nhiệt độ ủ khác nhau 25 - 80°C ảnh hưởng rất rõ ràng tới độ bền lipase trong đệm 0,1 M Tris-HCl pH 8,0 trong 30 phút. Hoạt tính tương đối không xử lý nhiệt (mẫu đối chứng) được định là 100%. Hoạt tính lipase còn lại tỷ lệ nghịch với nhiệt độ. Nó tăng lên 117% khi được ủ ở nhiệt độ thấp (25 - 40°C). Ở nhiệt độ ủ 45°C hoạt tính giữ được 84%. Sau đó, hoạt tính giảm mạnh xuống 3% ở 60°C. Lipase bị bất hoạt (<3%) ở dải nhiệt độ 60 - 80°C. Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính lipase (¡) và độ bền (¨). Đối với tối ưu nhiệt độ, hoạt tính của 1 g lipase hoạt hóa được đo bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở pH 8,0 và nhiệt độ khác nhau 25 - 75C. Đối với độ bền nhiệt, 1 g lipase được ủ trong đệm 0,1 M Tris-HCl, pH 8,0, trong 30 phút, ở nhiệt độ khác nhau 25 - 80°C, và hoạt tính được xác định bằng phương pháp pH-stat với 1% dầu olive làm cơ chất ở pH 9,0 và 55°C. • pH tối ưu và độ bền pH Hoạt tính tối ưu của LipA được khảo sát ở 55°C với dải pH 7,0 - 11,5. Lipase biểu thị hoạt tính tối ưu ở pH 10,75. Hoạt tính tương đối tăng chậm và dần dần từ 0,4% ở pH 7,0 lên 14,1% ở pH 8,5 sau đó không thay đổi nhiều 13,7 - 15,5% trong dải pH 8,5 - 9,75. Hoạt tính còn lại tăng mạnh từ 15,5% ở pH 9,75 lên hoạt tính tối đa 100% ở 10,75 cũng như giảm mạnh sau tối đa. Tại pH 11,5 lipase mất hoạt tính. Lipase này rất kiềm. pH khác nhau của đệm ủ 0,1 M ảnh hưởng rõ rệt lên độ bền lipase sau 30 phút ủ ở 30°C. Hoạt tính tương đối lipase không ủ (4°C) làm đối chứng được định là 100%. Độ bền LipA rất thấp ở dải pH 4,0 - 6,0, hoạt tính còn lại tăng dần từ 5% (pH 4,0) lên 45% (pH 6,0). Hoạt tính lipase còn lại một nửa (45 - 55%) ở pH 6,0 - 8,0 và tăng mạnh tới tối đa ở pH 9,0 (112% hoặc 131% lần lượt đối với đệm Tris-HCl hoặc glycine/KOH). Khi pH tăng lên 10, hoạt tính lipase tương đối là 88%. Sau đó hoạt tính giảm mạnh xuống 9% ở pH 11,0. ở pH 11,0 - 12,5, LipA biểu thị độ bền thấp (8 - 9%). III.Kết Luận Và Đề Nghị Lipase và chaperone chủng Ralstonia sp. M1 được biểu hiện cao trong E. coli BL21 với mức lần lượt là 70 và 12 mg/g tế bào tươi. Lipase sau khi hoạt hóa hoạt động ở nhiệt độ và pH tối ưu 55°C và 10,75. Đây là một enzyme kiềm và chịu nhiệt. Độ bền nhiệt tới 45°C, trong môi trường kiềm pH 8,5 - 10,0. Tù những kết luận trên ta cần nhanh chóng nghiên cứ thêm về các khâu sản suất để ứng dụng vào thực tiễn cuộc sống. Tiếp tục nghiên cứu nhằm tìm ra nhiều loại enzyme có đặc tính quý phục vụ cho con người trong cuộc sống cũng như nhiều lĩnh vực : y học, công nghiệp, nông nghiệp, khoa học quân sự… IV. Tài Liệu Tham Khảo 1. Giáo trình hóa sinh thực vật – NXB Nông nghiệp Hà Nội – 2006 2. Cở sở hóa sinh – NXB Giáo dục – 2008 3. Công nghệ sinh học (tập ba) enzyme và các ứng dụng – NXB Giáo dục 4. Tạp chí di truyền học và ứng dụng số 4 năm 2004 5. Sinh học Việt Nam