Bộ giáo dục đào tạo trờng đại học nông nghiệp hà nội Nguyễn thị thủy NH GI A DNG DI TRUYN VI KHUN Streptomyces sp GY BNH GH C KHOAI TY THU THP T MIN BC VIT NAM luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành : CÔNG NGHệ SINH HọC Mã số : 60.42.80 Ngời hớng dẫn khoa học : ts NGUYễN THị PHƯƠNG THảO Hà Nội - 2012 LI CAM OAN Tụi xin cam oan õy l cụng trỡnh nghiờn cu ca riờng tụi Cỏc kt qu lun l hon ton trung thc v cha tng cụng b bt k cụng trỡnh no H Ni, ngy 16 thỏng nm 2012 Hc Viờn Nguyn Th Thy Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip i LI CM N Trong quỏ trỡnh hc tp, thc hin lun tt nghip, tụi ó nhn c s giỳp tn tỡnh ca cỏc on th, cỏ nhõn v ngoi trng Vi lũng bit n sõu sc, tụi xin gi li cm n chõn thnh n cụ giỏo TS Nguyn Th Phng Tho, ging viờn B mụn CNSHTV, Khoa Cụng ngh sinh hc- Trng i hc nụng nghip H Ni l ngi ó hng dn v tn tỡnh giỳp tụi sut quỏ trỡnh thc v hon thnh lun ny Tụi xin chõn thnh cm n cỏc thy cụ giỏo Khoa Cụng ngh sinh hc, cỏc thy cụ giỏo; cỏn b nghiờn cu ca b mụn CNSH Thc Vt, trng H Nụng nghip H Ni ó to iu kin tt nht tụi hon thnh lun tt nghip Tụi cng xin by t lũng bit n chõn thnh ti TS H Vit CngTrung tõm bnh cõy nhit i, cỏc cỏn b Vin Sinh hc Nụng nghip, GS Wanner- Trung tõm khoa hc cõy trng M ó phi hp, t vn, giỳp tụi thi gian thc tt nghip Tụi xin by t lũng bit n n gia ỡnh, bn bố luụn bờn cnh ng viờn, giỳp tụi quỏ trỡnh hc v thc tt nghip Xin chõn thnh cm n! H Ni, ngy 16 thỏng nm 2012 Hc Viờn Nguyn Th Thy Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip ii MC LC I M U 1.1 Tớnh cp thit ca ti 1.2 Mc ớch, yờu cu 1.2.1 Mc ớch: 1.2.2 Yờu cu: 1.3 í ngha khoa hc v ý ngha thc tin 1.3.1 í ngha khoa hc: 1.3.2 í ngha thc tin: II TNG QUAN TI LIU 2.1 Gii thiu chung v bnh gh thng khoai tõy 2.1.1 Triu chng 2.1.2 Nguyờn nhõn gõy bnh v c im phỏt sinh 2.1.3 c im ca tỏc nhõn gõy bnh 2.1.4 Tng tỏc gia tỏc nhõn gõy bnh v kớ ch 2.1.5 Bin phỏp phũng tr 2.2 C s phõn t ca tớnh gõy bnh v a dng di truyn ca cỏc chng Streptomyces spp gõy bnh gh thng c khoai tõy 2.2.1 C s phõn t ca tớnh gõy bnh 2.2.2 a dng di truyn ca cỏc chng Streptomyces gõy bnh gh thng c khoai tõy 11 III VT LIU V PHNG PHP NGHIấN CU 17 3.1 Vt liu 17 3.2 Phng phỏp nghiờn cu 17 3.2.1 Phng phỏp phõn lp - lm thun (Loria, 1988) 17 3.2.2 Phng phỏp ỏnh giỏ c im hỡnh thỏi, sinh hoỏ: c tin hnh theo phng phỏp ca Wanner (2006), Loria v Davis 1988 17 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip iii 3.2.3 Phng phỏp ỏnh giỏ c tớnh gõy hi (Wanner, 2006) 19 3.2.4 Phng phỏp chit tỏch DNA (Miniprep of bacteria genomic DNA (molecular Cell Physiology, 2002) 20 3.2.5 Phng phỏp xỏc nh cỏc gen liờn quan n quỏ trỡnh gõy bnh, nh loi cỏc isolate v gii trỡnh t 16s rRNA 21 IV KT QU V THO LUN 25 4.1 Kt qu phõn lp vi khun Streptomyces t c khoai tõy b bnh gh thng 25 4.2 c im hỡnh thỏi ca cỏc chng phõn lp 25 4.3 c im nuụi cy ca cỏc isolate phõn lp 30 4.4 Kh nng tit sc t ca cỏc isolate phõn lp c nuụi trờn mụi trng ISP6 35 4.5 Kt qu phõn nhúm cỏc isolate phõn lp c 38 4.6 c trng phõn t ca cỏc isolate phõn lp c 42 4.6.1 nh loi mt s chng phõn lp c 43 4.6.2 Kt qu gii trỡnh t 16s rRNA ca cỏc chng phõn lp c 46 4.6.3 Kim tra s cú mt ca cỏc gen liờn quan n quỏ trỡnh lõy bnh cỏc isolate phõn lp c 51 4.7 Kt qu lõy nhim nhõn to 55 IV KT LUN 59 V NGH 61 Ti liu tham kho 62 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip iv DANH MC BNG Bng Thnh phn phn ng PCR cho kim tra cỏc gen gõy bnh v nh loi cỏc isolate phõn lp 21 Bng Thnh phn phn ng PCR cho nhõn dũng gen 16s rRNA 23 Bng Trỡnh t cỏc cp mi c trng cỏc gen trờn PAI v cỏc on trờn rRNA 23 Bng 4: c im hỡnh thỏi, h khun ty ca cỏc isolate trờn mụi trng ISP2 26 Bng 5: c im hỡnh thỏi cỏc isolates trờn mụi trng ISP3 31 Bng 6: c im hỡnh thỏi cỏc isolate trờn mụi trng ISP4 33 Bng 7: Kh nng tit sc t ca cỏc isolate trờn mụi trng ISP6 35 Bng 8: c im hỡnh thỏi ca cỏc nhúm nuụi cy trờn mụi trng ISP2 39 Bng 9: Kt qu nh loi v kt qu kim tra cỏc gen thuc o gõy bnh ca 12 isolate phõn lp c 43 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip v DANH MC HèNH Hỡnh 1: Hỡnh thỏi khun lc v h khun ty ca Streptomyces spp Hỡnh 2: S cỏc gen thuc o gõy bnh ca S turgidiscabies 10 Hỡnh 3: Cỏc vựng bin ng trờn trỡnh t 16s rRNA ca cỏc chng Streptomyces gõy bnh gh thng c khoai tõy (Wanner, 2006) 14 Hỡnh 3: Khun lc vi khun Streptomyces trờn mụi trng thch nc 25 Hỡnh 4: Kh nng tit sc t ca cỏc isolate phõn lp c nuụi trờn mụi trng ISP6 37 Hỡnh 5: Hỡnh thỏi, bo t ca cỏc nhúm phõn lp c nuụi trờn 42 mụi trng ISP2 42 Hỡnh 7: Kt qu nhõn gen 16s RNA vi cp mi 16sF1 v 16sR1 46 Hỡnh 8: Kt qu nhõn dũng 16s rRNA vi cp mi 16sF1 v 16sR1 47 Hỡnh 9: Kt qu kim tra s cú mt gen TomA cỏc isolate phõn lp c, s dng cp mi Tom3, Tom4 54 Hỡnh 10: Kt qu kim tra gen s cú mt gen TxtAB cỏc isolate phõn lp c, s dng cp mi (TxtABF1, TxtABR1) 55 Hỡnh 11: Kt qu kim tra s cú mt gen Nec1 cỏc isolate phõn lp c, s dng cp mi (Nf, Nr) 55 Hỡnh 12: Triu trng biu hin bnh trờn c khoai tõy sau thỏng lõy nhim 58 Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip vi DANH MC CC CM T VIT TT C (i chng) ISP (international scab project): d ỏn nghiờn cu bnh gh quc t Lad (ladder): Thang chun NST: nhim sc th PAI (pathogenicity island): o gõy bnh PYI (pepton yeast extract iron): mụi trng pepton iron WA (water agar): mụi trng thch nc YME (yeast malt extract): mụi trng cao mch v cao nm men Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip vii I M U 1.1 Tớnh cp thit ca ti Bnh gh thng khoai tõy vi khun gram dng sng t thuc chi Streptomyces gõy nờn, l mt nhng bnh hi nghiờm trng xut hin tt c cỏc vựng trng khoai tõy trờn th gii bao gm: M, n , Chõu , Chõu Phi (Wanner, 2006) M, bnh gh l bnh hi nghiờm trng th trờn cõy khoai tõy (Hao v cng s, 2009) Bnh cng nh hng n cỏc cõy trng cú c khỏc bao gm, c ci, c rt v khoai lang (Hill v Lazarovits, 2005) Mc gõy hi ca bnh gh trờn c khoai tõy bin ng theo tng vựng, tng nm kt qu tỏc ng gia mụi trng, kiu gen v tỏc nhõn gõy bnh (Wanner, 2006) Trờn c khoai tõy, cỏc triu chng gh thng bin ng t m nõu ni trờn v c n h en ti kộo di vi milimet vo tht c khoai tõy Cỏc tn thng cú th nh v ri rc, hoc cú th kt li ph rng trờn b mt ca c Do ú bnh phỏ hy hỡnh dng, cht lng v giỏ tr thng mi ca c khoai tõy, nh hng rt ln n hiu qu kinh t (Hao v cng s, 2009) Trờn th gii, Streptomyces gõy bnh gh c khoai tõy ó c phõn loi da trờn mụ t c im hỡnh thỏi cỏc chng phõn lp t mụ b bnh kt hp vi kim tra s cú mt ca cỏc gen gõy bnh v gii trỡnh t 16s rRNA Cú nhúm loi gõy bnh ln bc M: S scabies, S acidiscabies, S europaeiscabiei, v S stelliscabiei (Bouchek v cng s (2000); Healy v cng s (1991), Lambert v Loria (1989) Nghiờn cu bnh gh trờn khoai tõy Pasco v cng s (2005) cho rng, cú ớt nht loi gõy bnh gh c khoai tõy chõu u: S scabies, S europaeiscabies v S stelliscabies Trong ú, Vit Nam, bnh gh khoai tõy xy tt c cỏc vựng trng khoai tõy trờn c nc Cỏc nghiờn cu v bnh gh khoai tõy ch yu trung vo ỏnh giỏ tớnh mn cm i vi bnh, nguyờn nhõn phỏt sinh bnh trờn ng rung (Dang Thi Dung v cng s, 2003) m cha cú mt cụng trỡnh Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip nghiờn cu no v thnh phn loi gõy bnh cng nh cỏc c trng hỡnh thỏi, húa sinh, phõn t ca cỏc chng gõy bnh ny Vy thnh phn loi gõy bnh gh c khoai tõy cỏc vựng nghiờn cu ca Vit Nam cú c trng nh th no? Nhm cung cp c s d liu v cỏc c trng hỡnh thỏi, húa sinh v phõn t ca cỏc vi khun Streptomyces gõy bnh gh thng c khoai tõy Vit Nam cng nh c tớnh gõy hi ca chỳng trờn khoai tõy chỳng tụi thc hin ti: ỏnh giỏ a dng di truyn vi khun Streptomyces sp gõy bnh gh c khoai tõy thu thp t Bc Vit Nam 1.2 Mc ớch, yờu cu 1.2.1 Mc ớch: - Phõn loi phõn t cỏc vi khun Streptomyces gõy bnh gh c khoai tõy thu thp t Bc Vit Nam - ỏnh giỏ a dng di truyn ca chỳng v hỡnh thỏi, húa sinh v phõn t (cỏc gen gõy bnh) 1.2.2 Yờu cu: - Phõn lp c vi khun Streptomyces gõy bnh gh t c khoai tõy b bnh - Phõn loi cỏc mu phõn lp c da trờn c im hỡnh thỏi, húa sinh v gii trỡnh t 16s rRNA - Kim tra s cú mt ca cỏc gen liờn quan n kh nng gõy bnh ca cỏc mu phõn lp bng PCR s dng cỏc cp mi c hiu - ỏnh giỏ tớnh gõy bnh ca cỏc mu phõn lp bng lõy nhim nhõn to 1.3 í ngha khoa hc v ý ngha thc tin 1.3.1 í ngha khoa hc: ti ó to c c s d liu tin cy v cỏc im hỡnh thỏi, húa sinh v phõn t ca vi khun Streptomyces sp gõy bnh gh thng trờn khoai tõy Vit nam õy l mt cụng trỡnh nghiờn cu cú h thng, s dng cỏc phng phỏp nghiờn cu hin i v phõn loi, ỏnh giỏ di truyn vi khun Streptomyces sp v l cụng trỡnh ln u tiờn c tin hnh nc ta Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip Hỡnh 10: Kt qu kim tra gen s cú mt gen TxtAB cỏc isolate phõn lp c, s dng cp mi (TxtABF1, TxtABR1) 14: Lad 100bp, 15: C (+): ATCC49173, 16: C (-): nc Hỡnh 11: Kt qu kim tra s cú mt gen Nec1 cỏc isolate phõn lp c, s dng cp mi (Nf, Nr) 1: Lad 100 bp, 2: C (+): ATCC49173, 3: C (-): nc 4.7 Kt qu lõy nhim nhõn to Streptomyces gõy bnh gh thng gõy cỏc loi hỡnh triu chng bnh khỏc trờn b mt c khoai tõy: vt (pitted), m ni (raised) hoc dng li (netted) (Bouchek-Mechiche v cng s, 2000) Kt qu lõy nhim nhõn to 12 isolate phõn lp c vi ging khoai tõy Atlantic c th hin bng 12 Sau thỏng lõy nhim, tt c cỏc c khoai tõy thu c cú ng kớnh > 1cm c ỏnh giỏ mc nhim bnh Kt qu cho thy, i chng khụng lõy nhim khụng cú biu hin bnh thỡ 12 isolate u gõy bnh trờn c Atlantic vi cỏc cp bnh khỏc Vt bnh hỡnh thnh cú mu nõu húa bn Trong ú, 7/12 isolates chim 58.3% (DLS12, YB1, YB31, YB40, YP44, YP46, Trng i hc Nụng Nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 55 HLLS7) gõy cỏc m nõu nh ri trờn b mt c vi ng kớnh vt bnh [...]... kháng đối với bệnh ghẻ cao hơn rõ rệt so với cây không được chọn lọc Tuy cơ sở di truyền về tính kháng vẫn chưa được làm sáng tỏ nhưng tạo giống kháng bệnh vẫn là một hướng đi mang tính chiến lược trong vi c làm giảm thiểu tác động của bệnh ghẻ cho các vùng trồng khoai tây 2.2 Cơ sở phân tử của tính gây bệnh và đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces spp gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây 2.2.1 Cơ... nghiệp………………… 10 2.2.2 Đa dạng di truyền của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây Nguyên nhân gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây được mô tả lần đầu tiên vào cuối thế kỉ 19 ở Bắc Mỹ (Thaxter, 1892) Nhiều nghiên cứu gần đây chỉ ra rằng, bệnh này xảy ra ở khắp các vùng trồng khoai tây trên thế giới, trong đó tác nhân gây bệnh chủ yếu là S.scabies Các loài gây bệnh thu c chi này có khả năng... khoai tây 2.2.1 Cơ sở phân tử của tính gây bệnh Khả năng gây bệnh ghẻ củ khoai tây của các loài thu c chi Streptomyces có liên quan đến một nhóm gen gây bệnh thu c đảo gây bệnh PAI (pathogenic island) PAI của Streptomyces được mô tả từ S turgidiscabies Đó là một vùng trình tự giới hạn 425kb chứa các gen tổng hợp protein gây bệnh được tìm thấy trên vùng NST liền kề của S acidiscabies và S scabies Các gen... có vai trò trong vi c phá vỡ lớp bảo vệ của bề mặt củ khoai tây (suberin, cutin) tạo điều kiện cho sự xâm nhiễm của tác nhân gây bệnh (Beauséjour và cộng sự, 1999) Như vậy, có rất nhiều sản phẩm của gen tham gia vào quá trình tương tác gây bệnh của các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ thường trên củ khoai tây Hình 2: Sơ đồ các gen thu c đảo gây bệnh của S turgidiscabies (Kerset và cộng sự, 2005 ) Trường... phân động vật Bệnh lan truyền qua củ giống và qua nước tưới Tỷ lệ mắc và mức độ nghiêm trọng của bệnh ghẻ củ khoai tây thay đổi từ năm này sang năm khác và từ vùng này đến vùng khác Bệnh gây hại mạnh ở những ruộng trồng khoai tây độc canh nhiều vụ liên tiếp 2.1.3 Đặc điểm của tác nhân gây bệnh Khuẩn lạc của Streptomyces rắn chắc, khô, dạng vôi, dạng nhung tơ Bề mặt của khuẩn lạc có thể nhẵn, có mấu lồi,... giảm tỷ lệ mắc bệnh và mức độ nghiêm trọng của bệnh Tuy không làm giảm năng suất nhưng bệnh ảnh hưởng lớn đến mẫu mã cũng như chất lượng của củ Do đó, bệnh làm giảm hiệu quả kinh tế của các vùng sản xuất khoai tây 2.1.1 Triệu chứng Bệnh ghẻ thường gây nên rất nhiều triệu chứng khác nhau trên củ khoai tây Khi bệnh nhẹ, bệnh biểu hiện thành dạng lưới trên bề mặt củ Nghiêm trọng hơn bệnh gây ra những đám... lông và giáp mô Streptomyces là vi khuẩn đa hình thái như: Dạng hình chùy, dạng phân nhánh hay dạng sợi dài gọi là khuẩn ti hay phân nhánh thành chùm, thành bó gọi là khuẩn ti thể (Mycelium) Đường kính của khuẩn ti từ 0,2 – 2,5µm Kích thước và khối lượng của khuẩn ti thể thường không ổn định, chúng phụ thu c vào từng loài Streptomyces và từng điều kiện nuôi cấy Ở đa số các loài Streptomyces, khuẩn ty... mm; ghẻ sao với những vết bệnh sâu đến 7mm (Hooker, 1981) 2.1.2 Nguyên nhân gây bệnh và đặc điểm phát sinh Bệnh ghẻ thường củ khoai tây do vi khuẩn gram dương sống trong đất thu c chi Streptomyces gây nên Tác nhân sinh học chủ yếu là Streptomyces scabies Tuy nhiên, có một số loài Streptomyces khác cũng gây ra bệnh ghẻ thường trên những củ đang sinh trưởng và các cây trồng rễ cọc, bao gồm S.turgidiscabies... chống và quản lý bệnh ghẻ thường khoai tây do vi khuẩn Streptomyces sp một cách hiệu quả hơn Trường Đại học Nông Nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp………………… 3 II TỔNG QUAN TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu chung về bệnh ghẻ thường khoai tây Bệnh ghẻ thường khoai tây là một trong những bệnh hại nghiêm trọng xuất hiện ở tất cả các vùng trồng khoai tây trên thế giới Hiện nay, bệnh đã trở thành... là Streptomyces luridiscabiei sp nov., Streptomyces puniciscabiei sp nov và Streptomyces niveiscabiei sp nov (Park và cộng sự, 2003); S reticuliscabiei gây ra bệnh ghẻ lưới được tìm thấy ở châu Âu (Bouchek-Mechiche, 2000); S reticuliscabiei và S aureofaciens phát hiện gây ra bệnh ghẻ lưới và ghẻ nâu đỏ ở Canada và Phần Lan (Faucher, 1992; Kreuze,1999) Số lượng các chủng Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai ... tử vi khuẩn Streptomyces gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây Vi t Nam độc tính gây hại chúng khoai tây thực đề tài: Đánh giá đa dạng di truyền vi khuẩn Streptomyces sp gây bệnh ghẻ củ khoai tây thu. .. thu thập từ miền Bắc Vi t Nam 1.2 Mục đích, yêu cầu 1.2.1 Mục đích: - Phân loại phân tử vi khuẩn Streptomyces gây bệnh ghẻ củ khoai tây thu thập từ miền Bắc Vi t Nam - Đánh giá đa dạng di truyền. .. khoai tây 2.2 Cơ sở phân tử tính gây bệnh đa dạng di truyền chủng Streptomyces spp gây bệnh ghẻ thường củ khoai tây 2.2.1 Cơ sở phân tử tính gây bệnh Khả gây bệnh ghẻ củ khoai tây loài thu c chi Streptomyces