TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA: SAU ĐẠI HỌC  BÀI TIỂU LUẬN KHẢ NĂNG KHÁNG KHUẨN CỦA DỊCH CHẾT SINH HỌC TỪ CÂY DIỆP HẠ CHÂU ĐẮNG GVHD: TS Huỳnh Nguyễn Duy Bảo TS Nguyễn Thế Hân Nhóm thực hiện: Nhóm Lớp: CHTP2015 Nha Trang, tháng 10 năm 2015 DANH SÁCH HỌC VIÊN THỰC HIỆN TIỂU LUẬN STT Họ tên Nguyễn Trọng Hoành Phong Nguyễn Lê Thùy Linh Nguyễn Thị Thanh Nguyệt Nguyễn Thế Nguyên Mã học viên 57CH057 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ngày nay, ngành bào chế dược phẩm góp phần sản xuất hàng trăm loại kháng sinh có mặt thị trường đáp ứng nhu cầu chữa bệnh cho người, động vật (Nguyễn Thị Thanh Hồ Huỳnh Quang Trí, 1995) Tuy kháng sinh tổng hợp có nhiều ưu điểm nhược điểm kháng sinh tổng hợp không nhỏ dễ lờn thuốc, phụ thuộc vào thuốc, nhiều tác dụng phụ không mong muốn khác (Ngô Thế Hùng, 1985) Bên cạnh đó, phát triển khoa học ngày giúp nhà khoa học phát nhiều tác dụng phụ có hại kháng sinh tổng hợp hóa học Từ đó, người muốn trở lại với tự nhiên, để phát sử dụng cỏ có nguồn gốc tự nhiên Hiện nay, xu hướng sử dụng sản phẩm có nguồn gốc dược liệu tự nhiên ưa chuộng tính an toàn, sử dụng lâu dài, hạn chế tác dụng phụ sử dụng thuốc tổng hợp hóa học: hạn chế tượng lờn thuốc, kháng kháng sinh (Hoàng Hiệp, 2011) Các dược liệu có công dụng trị liệu Actiso (Cynara scolymus), Hoàng bá (Phellodendron amurense Rupr), Vọng cách (Premma integrifolia L.), Nhân trần (Adenosma glutinosum), Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus Schum et Thonn.,) Trong đó, Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) chứa nhiều chất chống oxy hóa thuộc nhóm xanthones có tác dụng ức chế mạnh trình peroxyd hóa lipid tế bào gan, hạn chế tượng viêm hoại tử gan, bảo vệ phục hồi tế bào gan (Hoàng Hiệp 2011) Ngoài ra, Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) có tác dụng kháng khuẩn nhiều loại vi khuẩn (Staphylococcus aureus, Salmonella typhimurium, Shigella flexerneri, Shigella shiga, Bacillus subtilis,…) (Akinjogunla ctv, 2010; ETTA ctv, 2011), chống nhiễm trùng máu PHẦN TỔNG QUAN TÀI LIỆU Giới thiệu Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) 1.1 Vị trí phân loại Theo Đỗ Huy Bích ctv (2004), Phyllanthus thuộc họ thầu dầu Tên khoa học: Phyllanthus amarus Tên thường gọi: chó đẻ, diệp hạ châu, rút đất, cam kiềm, trân châu thảo, diệp hòe thái, lào nha châu Vị trí phân loại: - Ngành Thực vật hạt kín (Basal angiosperms) - Lớp Hai mầm (Paleodicots) - Bộ Sơ Ri (Malpighiales) - Họ Thầu Dầu (Euphorbiaceae) - Chi Phyllanthus - Loài Phyllanthus amarus Schum et Thonn., (Đỗ Tất Lợi, 2004) 1.2 Hình thái phân bố Cây thảo, sống quanh năm, cao 20 – 30 cm, lên đến 60 – 70 cm, thân nhẵn, có màu xanh Lá đơn, mọc so le, xếp thành dãy, cành giống kép lông chim gồm nhiều Phiến hình bầu dục đầu tròn có mũi nhọn, màu xanh lục, đậm mặt trên, nhạt mặt Hoa mọc kẽ lá, nang, hình cầu, dẹt, mọc rủ xuống lá, mùa hoa: tháng – 6, mùa quả: tháng – Chi Phyllanthus L có nhiều loài phân bố chủ yếu vùng nhiệt đới cận nhiệt đới Ở Việt Nam, chi có khoảng 40 loài, đáng ý hai loài P urinaria P amarus có hình dáng gần giống P amarus thân có màu xanh, nang nhẵn, có tên gọi Diệp hạ châu đắng, P urinaria thân có màu đỏ, nang có gai, có tên gọi diệp hạ châu hay chó đẻ cưa.Cả hai loài mọc rải rác khắp nơi, phân bố khắp vùng nhiệt đới Ở Việt Nam, mọc hoang đất ẩm, khắp địa phương trừ vùng núi cao, lạnh Diệp hạ châu đắng ưa ẩm, ưa sáng chịu bóng, thường mọc lẫn bầu cỏ, ruộng cao, nương rẫy vườn nhà, Cây non mọc từ hạt vào cuối mùa xuân, sinh trưởng nhanh vào mùa hè tàn lụi vào mùa thu nên thường thu hái vào cuối mùa hè thời gian sinh trưởng, phát triển đầy đủ chứa lượng hoạt chất cao (Đỗ Huy Bích ctv, 2004) Hình Cây Diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) (a) Cây Diệp hạ châu đắng, (b) Quả, (c) Thân, (d) Rễ 1.3 Tính chất Vị đắng, tính lạnh, lợi tiểu, tiêu độc, tán ứ, thông huyết sát trùng (Đỗ Huy Bích ctv, 2004) Bộ phận dùng toàn cây, rửa dùng tươi hay phơi sấy khô 1.4 Thành phần hóa học Theo Đỗ Huy Bích ctv (2004), Phyllanthus chứa nhiều chất thuộc nhóm hóa học: - Triterpen (Stigmasterol, stigmasterol – – – beta glucosid, beta – sitosterol, beta – sitosterol glucosid, lup – 20 – en – beta – ol), flavonoid (Kaempferol, quercetin, rutin), tanin (Acid elagic, acid 3, 3’, – tri – methyl elagic, acid galic), phenol, acid hữu (Acid succinic, acid ferulic, acid dotriacontanoic), lignan (Phyllanthin, Hypophyllanthin) - Các thành phần khác: N - octadecan, acid dehydrochebulic methyl ester, triaontanol phylanthurinol acton Lá diệp hạ châu đắng chứa chất đắng quinin alkaloid, khô chứa chất đắng Hypophyllanthin (0,05 %) Phyllanthin (0,35 %), chất gây độc cá ếch Trong có niranthin, nirtetralin, phylteralin, quercetin, niruroidin, isobubialin, epibubialin, isoquercitrin, astragalin, rutin acid hữu (ascorbic, geraniinic, amariinic, phenolic repandusinic) 1.4.1 Phyllanthin Công thức hóa học: C24H34O6 Trọng lượng phân tử: 418,52316 g/mol Hình Cấu trúc Phyllanthin (Vandana ctv, 2008) Phyllanthin cho tinh thể hình kim kết tinh dầu hỏa, tan nhiều hexan, etylacetat, methanol, sắc ký lớp mỏng silicagel 60 F 254 Merck, dung môi động hexan – etylacetat (2:1) màu H 2SO4 10 % methanol hơ nóng rõ vết tròn có màu xanh dương nhạt, Rf = 0,35 (Nguyễn Thanh Hồng ctv, 2002) 1.4.2 Hypophyllanthin Công thức hóa học: C24H30O7 Trọng lượng phân tử: 430,4908 g/mol Hình Cấu trúc Hypophyllanthin (Vandana ctv, 2008) Hypophyllanthin kết tinh dầu hỏa hexan tinh thể hình kim dài, tan nhiều hexan, etylacetat Sắc ký lớp mỏng silicagel 60 F254 Merck, dung môi động hexan – etylacetat (2:1) màu H2SO4 10 % methanol, hơ nóng rõ vết tròn, có màu xanh dương đậm R f = 0,4 (Nguyễn Thanh Hồng ctv, 2002) 1.5 Tác dụng dược lý Diệp hạ châu đắng chứng minh có nhiều tác dụng dược lý Theo Đỗ Huy Bích ctv (2004), Diệp hạ châu đắng có tác dụng điều trị tiêu chảy rối loạn tiêu hóa làm giảm nhu động ruột, có tác dụng lợi tiểu điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ đường huyết (Đỗ Huy Bích ctv, 2004) Bên cạnh đó, Diệp hạ châu đắng sử dụng điều trị tiêu chảy rối loạn tiêu hóa làm giảm nhu động ruột, có tác dụng lợi tiểu điều trị bệnh tiết niệu, giúp hạ đường huyết Nước sắc Diệp hạ châu đắng có tác dụng nhiều loại vi khuẩn Gram âm Gram dương Escherichia coli (Akinjogunla ctv, 2010), Staphylococcus aureus (ETTA ctv, 2011) , Salmonella typhi (Flora Folasade, 2008), Shigella flexerneri, Shigella shiga, Baccillus subtilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella spp (Adegoke ctv, 2010) Chất kháng khuẩn tan nhiều ether dầu hỏa, ether ethylic, methanol (Nguyễn Thị Hồng ctv, 2002) Phân đoạn chiết với butanol có hoạt tính bảo vệ gan cao nhất, liều uống 50 mg/kg P có tác dụng bảo vệ 35 – 85 %, phân đoạn chiết với nước có tác dụng bảo vệ gan nhẹ 20 – 40 % Từ Tích Tổ (2008) cho Diệp hạ châu đắng có thành phần: flavonoid, alkaloid hợp chất phyllanthin, hypophyllathin, niranthin, phylteralin có tác dụng ức chế mạnh virus gây viêm gan (HBV) Diệp hạ châu đắng ức chế virus viên gan thông qua việc ức chế enzyme DNA polymerase HBV từ ức chế chép tế bào virus viêm gan, làm cho virus không nhân lên bị đào thải không bám vào DNA, làm giảm hoạt độ HBsAg anti-HBs, giúp phục hồi enzyme transminase từ 50 – 97 %, Bilirubin trở bình thường (trích dẫn Trần Thị Nhã Thi, 2011) Bên cạnh đó, Phyllanthin Hypophyllanthin có tác dụng bảo vệ tế bào gan chuột cống chống tính độc hại tế bào gây carbon tetrachlorid galactosamin Triterpentriacontanol Diệp hạ châu đắng có tác dụng bảo vệ gan chống lại tính độc hại tế bào gây galactosamin Acid galic chứa có tác dụng kháng khuẩn yếu phenolic flavonoid có tác dụng kháng khuẩn kháng nấm mạnh (Đỗ Huy Bích ctv 2004) Vậy, diệp hạ châu đắng có tác dụng dược lý hệ tiêu hóa, hệ tiết niệu, hệ sinh dục… tác động rõ rệt gan Trong đề tài này, nghiên cứu tiến hành chủ yếu dựa hoạt tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng để từ xác định giá trị nồng độ ức chế tối thiểu nồng độ diệt khuẩn tối thiểu cao thô điều chế 10 Sơ lược chiết suất hợp chất thiên nhiên Theo Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), chiết suất phương pháp dùng dung môi (đơn hay hỗn hợp) để tách lấy chất hay nhóm chất từ hỗn hợp cần nghiên cứu Phương pháp cổ điển li trích hợp chất thiên nhiên dùng dãy dung môi không phân cực đến phân cực mạnh để li trích, phân đoạn hợp chất khỏi hợp chất thiên nhiên Cách li trích thông dụng li trích nóng máy li trích liên tục li trích hồi lưu Sau lần li trích với loại dung môi cần làm khô hợp chất thiên nhiên tiếp tục li trích với loại dung môi Mỗi phân đoạn li trích, cất thu hồi dung môi tiến hành phân tích riêng Nguyên tắc chiết suất: phương pháp chiết xuất bao gồm việc chọn dung môi, dụng cụ chiết cách chiết Mỗi loại hợp chất có độ hòa tan khác loại dung môi Dựa vào tính phân cực dung môi nhóm hợp chất ta dự đoán có mặt chất phân đoạn li trích Dung môi để chiết suất hợp chất: tính trung tính, không độc, không dễ gây cháy, hòa tan hợp chất cần khảo sát, sau tách chiết dung môi loại bỏ dễ dàng, cần tránh dung môi độc benzen dễ cháy dietyl eter có nhiệt độ sôi thấp Người ta thường sử dụng dung môi không hòa tan nước hydrocacbon (hexan, toluen), alcol (butanol), ceton (metyl etyl ceton), acetat (etyl, butyl) Các dung môi tương đối rẻ tiền, có bán sẵn, độ nhớt thấp, tỉ trọng tương đối cao so với nước Các phương pháp chiết suất hợp chất thiên nhiên: có hai phương pháp thường sử dụng để chiết suất chiết nhiệt độ thường (chiết lạnh) chiết nóng, phương pháp chiết có dung môi thiết bị chiết khác Phương pháp chiết lạnh phương pháp chiết nhiệt độ phòng (27 – 30 oC) thời gian 10 – 15 ngày áp dụng với đa số dược liệu Phương pháp đơn giản, dễ thực hiện, không cần máy móc phức tạp thường dùng điều chế cao thô hạn chế tác dụng nhiệt độ tới hoạt chất dược liệu Khác với phương pháp chiết lạnh, phương pháp chiết nóng phương pháp chiết nhiệt độ 60 – 100 oC thời gian – 10 ngày thường áp dụng cho 10 22 thực microplate 96 giếng (Chen, 2011) Pha g cao thô Diệp hạ châu đắng vào 20 ml dung dịch DMSO 5% (Abdul, 2010) Từ dung dịch gốc pha loãng liên tục môi trường theo dãy nồng độ giảm dần từ 50 mg/ml; 25 mg/ml đến 1,561 mg/ml (Abdoul ctv, 2010) Cuối cùng, chuẩn bị giếng có chứa 150 µl môi trường 150 µl dung dịch gốc sử dụng làm đối chứng dương giếng có chứa 300 µl môi trường có nhỏ µl vi khuẩn sử dụng làm đối chứng âm Môi trường MHA pha với nước cất, vô trùng 121 oC vòng 15 phút, sau môi trường lấy để nguội khoảng 40 – 50 oC cho vào dãy pha loãng nồng độ dung dịch gốc Tiếp theo, hút µl huyễn dịch vi khuẩn 1,5 x 105 CFU/ml (Neeraj ctv, 2010; Mohana ctv, 2008) nhỏ vào giếng Ủ đĩa 37 oC 24 Tổng thể tích tất giếng 300 µl Đánh giá kết dựa vào phát triển vi khuẩn giếng Xác định phần trăm ức chế vi khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng: Theo Neeraj ctv (2010): khả ức chế vi khuẩn hợp chất kháng khuẩn sau nuôi cấy 37 oC vòng 24 thể qua phần trăm ức chế vi khuẩn Phần trăm ức chế vi khuẩn xác định công thức (Sultanbawa ctv, 2009): Phần trăm ức chế (%) = {1 – (A24 – A0)/(C24 – C0)}*100 đó: A0 : Giá trị OD thời điểm nhỏ vi khuẩn A24: Giá trị OD thời điểm sau ủ vi khuẩn C0: Giá trị OD đối chứng âm thời điểm nhỏ vi khuẩn C24 : Giá trị OD giếng đối chứng âm sau ủ vi khuẩn Chỉ tiêu theo dõi: - Giá trị OD thời điểm sau nhỏ sau ủ vi khuẩn - Phần trăm ức chế vi khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng 22 23 PHẦN KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM Điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng 1.1 Hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng Diệp hạ châu đắng sau chiết với cồn methanol xử lý máy cô quay cuối thu cao thô Diệp hạ châu đắng Hiệu suất chiết suất cao thô Diệp hạ châu đắng qua lần chiết tính toán trình bày qua Bảng Bảng Hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng qua hai lần chiết Lần chiết Trọng lượng mẫu tươi (g) Trọng lượng mẫu sau sấy(g) Trọng lượng cao sau cô quay (g) Hiệu suất chiết xuất (%) 3000 700 25,87 3,70 1000 250 15,52 6,21 Qua Bảng ghi nhận hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng dung môi methanol cao lần chiết thứ hai (6,21 %) Điều sai sót thao tác kỹ thuật thực trình cô quay làm thất thoát lượng dịch chiết, lần chiết 1, chưa chiết kiệt lượng dịch chiết lần lọc thứ (lọc lại cặn với methanol sau lọc dịch chiết lần thứ 3) Bên cạnh đó, Diệp hạ châu đắng thu hái, sử dụng để điều chế cao thô lần chiết 1có độ tuổi già nên hàm lượng hoạt chất ít, làm giảm hiệu suất chiết xuất (Nguyễn Văn Đàn Nguyễn Viết Tựu, 1985; Huỳnh Kim Diệu, 2008) Điều đươc giải thích theo kết nghiên cứu Huỳnh Kim Diệu (2008); Salim ctv, (2010): yếu tố tự nhiên: nhiệt độ, thời tiết, lượng mưa…; đặc điểm trồng: chiều cao, độ tuổi… có ảnh hưởng đến hàm lượng hoạt chất Diệp hạ châu đắng Theo Arvind ctv, (2008), với dung môi chiết, phương pháp chiết xuất cho hàm lượng hoạt chất khác Như vậy, dung môi sử dụng chiết, độ tinh khiết 23 24 dung môi, phương pháp chiết xuất, nguồn gốc, độ tuổi Diệp hạ châu đắng thu hái ảnh hưởng đến hiệu suất chiết xuất cao thô Diệp hạ châu đắng 1.2 Ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng Ẩm độ cao thô ảnh hưởng đến độ ổn định cao Ẩm độ cao thô lớn độ ổn định hiệu điều trị cao thấp Ngoài ẩm độ cao thô ảnh hưởng đến MIC Ẩm độ cao thô cao ảnh hưởng đến giá trị MIC cao Ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng qua lần chiết 1, tính toán trình bày qua Bảng Bảng Hàm lượng vật chất khô ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng qua hai lần chiết Lần chiết Hàm lượng vật chất khô (%) Ẩm độ (%) 86,99 13,01 82,64 17,36 Ở lần chiết thứ đạt ẩm độ thấp lần thứ hai Điều lần chiết thứ thời gian cô quay dài so với lần thứ hai Ngoài thời điểm thu hái Diệp hạ châu đắng lần không giống (lần mẫu thu hái đầu tháng 2, lần thứ hai tháng 4) nên dẫn đến khác biệt thời tiết, ảnh hưởng đến điều kiện phát triển Diệp hạ châu, dẫn đến khác biệt độ ẩm cao thô hai lần chiết Kết cho thấy hàm lượng vật chất khô tăng dần ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng giảm dần Kết ẩm độ lần chiết phù hợp với tiêu chuẩn Dược Điển Việt Nam III ghi nhận Phạm Ngọc Bùng Nguyễn Thị Nga (2004) ẩm độ cao đặc không 20 % Khảo sát hiệu suất ẩm độ cao thô Diệp hạ châu đắng cho thấy chiết xuất Diệp hạ châu đắng với cồn methanol phương pháp ngâm lạnh cho ta sản phẩm với hiệu suất chiết ẩm độ cao thô theo tiêu chuẩn nên sử dụng cho thí nghiệm 24 25 Định lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao thô Diệp hạ châu đắng HPLC Phyllanthin Hypophyllanthin có tác dụng ức chế mạnh virus gây viêm gan (Từ Tích Tổ, 2008) Hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao thô Diệp hạ châu đắng có ảnh hưởng đến tác dụng dược lý cao thô, hàm lượng hợp chất cao thô cao tác dụng dược lý cao thô Diệp hạ châu đắng virus gây viêm gan lớn lớn Phản ứng HPLC giúp định hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao thô từ xác định xác tác dụng dược lý cao thô, qua xác định khả điều trị viêm gan cao thô Diệp hạ châu đắng Sau điều chế cao thô Diệp hạ châu đắng, phản ứng định hàm lượng hợp chất Phyllanthin Hypophyllanthin cao thô Diệp hạ châu đắng HPLC tiến hành 10 12 14 16 18 mAU 10 13.450 25 26 14.155 Phyllanthin Hypophyllanthin Hình Sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllanthin lần chiết bước sóng 280 nm 13 14 15 16 17 18 mAU 26 27 13.951 14.849 Phyllanthin Hypophyllanthin Hình Sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllanthin lần chiết bước sóng 280 nm Dựa vào sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllathin chuẩn, thấy khoảng thời gian từ phút thứ 13 đến phút thứ 15 khoảng thời gian xuất peak chuẩn Phyllanthin Hypophyllanthin Do so sánh với sắc ký đồ Phyllanthin Hypophyllanthin mẫu cao thô Diệp hạ châu đắng khoảng thời gian tương ứng với thời gian xuất peak chuẩn, có xuất hợp chất kết luận peak xuất khoảng thời gian peak Phyllathin Hypophyllanthin Qua sắc ký đồ thu từ phản ứng HPLC, thấy lần chiết thời gian lưu Phyllanthin Hypophyllanthin có khác biệt lần chiết 1, thời gian lưu có khác biệt so với peak chuẩn so với lần (ở lần chiết 1, hợp chất Phyllanthin Hypo – 27 28 phyllanthin xuất sắc ký đồ sớm so với lần chiết từ 0,5 đến 0, phút) Điều lần chiết 1, có tượng cột không ổn định Như thấy, tính ổn định cột có ảnh hưởng lớn đến kết phản ứng HPLC Kết hàm lượng hợp chất Phyllanthin Hypo – phyllanthin cao thô Diệp hạ châu thể Bảng Bảng Hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao thô Diệp hạ châu đắng Lần chiết Phylanthin (%) Hypophyllanthin (%) 0,308 0,049 0,446 0,136 Qua Bảng thấy hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin cao Diệp hạ châu đắng lần chiết cao lần chiết (Phyllanthin: 0,138 % Hypophyllanthin: 0,087 %) Hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin lần chiết có giá trị thấp kết nghiên cứu Arvind (2006) Srivastava (2008) (Phyllanthin: 0,074 %, Hypophyllanthin: 0,184 %) Sự khác biệt vùng địa lý, khác biệt điều kiện tự nhiên, điều kiện thời tiết, hàm lượng Phyllanthin Hypophyllanthin Diệp hạ châu đắng có khác nhau, bên cạnh với dung môi sử dụng, phương pháp chiết dẫn đến khác biệt Khảo sát tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương 3.1 Thử tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng Sau tiến hành khảo sát tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn S aureus ATCC, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC, S typhimurium ATCC, S flexerneri ATCC, kết thí nghiệm ghi nhận trình bày Bảng Qua Bảng 4, cho thấy cao thô Diệp hạ châu đắng có khả ức chế chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Ở nồng độ 50 mg/ml đến nồng độ 12,5 mg/ml cao thô 28 29 Diệp hạ châu đắng ức chế 100 % phát triển chủng vi khuẩn, nồng độ thấp hơn, khả ức chế cao thô giảm dần đến nồng độ 3,125 mg/ml khả ức chế cao thô < 25 % chủng vi khuẩn Riêng S aureus ATCC nồng độ 3,125 mg/ml cao thô không khả ức chế, khả ức chế cao thô S aureus ATCC yếu so với chủng vi khuẩn lại Kết ghi nhận cao thô Diệp hạ châu đắng có tính kháng khuẩn chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Điều phù hợp với kết nghiên cứu Flora Folasade (2008); Đỗ Huy Bích ctv (2004); ETTA ctv (2011) cao thô Diệp hạ châu đắng có khả ức chế chủng vi khuẩn Gram dương: S aureus ATCC, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC Gram âm S typhimurium ATCC, S.flexerneri ATCC Việc phát hoạt tính kháng khuẩn Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn phù hợp với kinh nghiệm dân gian: dùng Diệp hạ châu đắng để trị mụn nhọt, lở loét, trị rối loạn đường ruột, tiêu chảy cho thấy triển vọng việc phòng trị dược liệu tự nhiên Bảng Khả ức chế (%) cao thô Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Khả ức chế đến chủng vi khuẩn khảo sát nồng độ cao thô khác Vi khuẩn 50 25 12,5 6,25 3,25 1,561 ++++ ++++ ++++ + - - B subtilis ++++ ++++ ++++ +++ + - S pyogenes ++++ ++++ ++++ +++ + - S typhimurium ++++ ++++ ++++ + + - S flexerneri ++++ ++++ ++++ +++ + - Gram + S aureus Gram - ++++: ức chế 75 – 100 %, +++: ức chế 50 – 75 %, ++: ức chế 25 – 50 %, +: ức chế < 25 %, -: không khả ức chế Gram +: Gram dương, Gram - : Gram âm 29 30 Hình 10 B subtilis MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml MHA (1): Nồng độ 50 mg/ml, (2) Nồng độ 25 mg/ml, (3) Nồng độ 12,5 mg/ml, (4) Nồng độ 6,25 mg/ml, (5) Nồng độ 3,125 mg/ml, (6) Nồng độ 1,561 mg/ml Hình 11 S typhimurium ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml MHA (1): Nồng độ 50 mg/ml, (2) Nồng độ 25 mg/ml, (3) Nồng độ 12,5 mg/ml, (4) Nồng độ 6,25 mg/ml, (5) Nồng độ 3,125 mg/ml, (6) Nồng độ 1,561 mg/m Hình 12 S aureus ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml BHI (1): Nồng độ 50 mg/ml, (2) Nồng độ 25 mg/ml, (3) Nồng độ 12,5 mg/ml, (4) Nồng độ 6,25 mg/ml, (5) Nồng độ 3,125 mg/ml, (6) Nồng độ 1,561 mg/ml 30 31 Hình 13 S pyogenes MBC 12,5 mg/ml NA Khuẩn lạc S pyogenes Hình 14 Đối chứng + (bên trái) đối chứng - (bên phải) B subtilis MHA Qua Bảng 5, thấy cao thô Diệp hạ châu đắng có khả ức chế chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương Kết phù hợp với kết thí nghiệm thử tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng Bên cạnh đó, thấy cao thô Diệp hạ châu đắng ức chế mạnh S aureus ATCC MIC >3,125 mg/ml, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC, S typhimurium ATCC, S flexerneri ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml MIC 3,125 mg/ml, MBC 12,5 mg/ml S aureus ATCC cao thô 31 32 Diệp hạ châu đắng nghiên cứu cao so với kết nghiên cứu Adegoke ctv (2010): MIC 50 mg/ml, MBC 100 mg/ml Qua cho thấy cao thô Diệp hạ châu đắng điều chế với dung môi methanol phương pháp chiết lạnh có khả ức chế S aureus ATCC mạnh so với dịch chiết điều chế ethanol nghiên cứu Adegoke ctv (2010) Như thấy phương pháp chiết, dung môi chiết xuất có ảnh hưởng lớn đến khả kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng S aureus có khả đề kháng nhiều kháng sinh: penicillin (Frank Henry, 2009), tetracyline, trimethoprin + sulfamethazin, chloramphenicol, erythomycin, methicillin, ampicillin, co – trimoxaol, erythromycin, lincomycin với tỉ lệ cao (Nguyễn Bữu Châu, 2007) việc điều trị Diệp hạ châu đắng giúp hạn chế sử dụng kháng sinh, tránh tượng kháng kháng sinh, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người môi trường xung quanh PHẦN KẾT LUẬN Một số kết luận rút từ kết nghiên cứu khảo sát tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng số vi khuẩn Gram âm Gram dương: - Chiết xuất Diệp hạ châu đắng với cồn methanol phương pháp chiết lạnh thu cao thô Diệp hạ châu đắng có hiệu suất (3,70 %; 6, 21 %) ẩm độ (13,01 %; 17, 36 %) phù hợp theo tiêu chuẩn Dược điển Việt Nam (ẩm độ cao thô không 20 %) - Sử dụng HPLC xác định hàm lượng Phyllanthin (0,308 %; 0,446 %) Hypophyllanthin (0,049 %; 0,136 %) cao thô Diệp hạ châu đắng - Cao thô Diệp hạ châu đắng có khả kháng khuẩn chủng vi khuẩn khảo sát Cao thô ức chế S aureus ATCC MIC >3,125 mg/ml, B subtilis ATCC, S pyogenes 32 33 ATCC, S typhimurium ATCC, S flexerneri ATCC MIC 3,125 mg/ml MBC 12,5 mg/ml TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu nước Cao Thị Mai Phương, Nguyễn Thị Phương Mai Nguyễn Thị Hương 2002 Dược Điển Việt Nam III Nhà xuất Y học - Hội Đồng Dược Điển, 336, phụ lục 9, 10, 142 Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Dong ctv 2004 Cây Thuốc Và Động Vật Làm Thuốc Ở Việt Nam, Tập II Nhà xuất Khoa Học Và Kỹ Thuật Đỗ Tất Lợi 2004 Cây thuốc vị thuốc Việt Nam Nhà xuất Y học Huỳnh Kim Diệu 2008 Sử dụng Xuân Hoa (Pseuderanthemun palatiferum) để phòng trị tiêu chảy heo theo mẹ sau cai sữa Luận án tiến sĩ Nông Nghiệp, trường Đại Học Nông Lâm Tp HCM Lê Xuân Phương 2001 Vi sinh vật học công nghiệp Nhà xuất Xây dựng Hà Nội Ngô Thế Hùng 1985 Độc tính dược phẩm Nhà xuất Y Học, thành phố Hồ Chí Minh Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn 2009 Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào số chủng Bacillus phân lập khả 33 34 ứng dụng chúng xử lý nước thải Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên Công nghệ, 101 – 106 Nguyễn Bữu Châu 2007 Kiểm tra tính nhạy cảm kháng sinh vi khuẩn Escherichia coli, Salmonella spp Staphylococcus aureus phương pháp MIC Luận văn tốt nghiệp bác sĩ thú y, trường Đại học Cần Thơ Nguyễn Kim Phi Phụng 2007 Phương pháp cô lập hợp chất hữu Nhà xuất Đại học Quốc gia, TP Hồ Chí Minh 10 Nguyễn Ngọc Hải, Nguyễn Thị Kim Loan 2009 Thực hành nghiên cứu vi sinh vật Nhà xuất Nông Nghiệp 11 Nguyễn Thanh Hồng, Nguyễn Ngọc Hạnh, Nguyễn Quang Trung, Phạm Ngọc Thành Trần Thi Huệ 2002 Tạp chí Hóa học, 11 – 16 12 Nguyễn Thị Chính Trương Thị Hòa 2005 Vi sinh vật y học Nhà xuất đại học quốc gia Hà Nội, 53 – 69; 123 – 128 13 Phạm Ngọc Bùng Nguyễn Thị Nga 2004 Kỹ thuật bào chế sinh dược học dạng thuốc Nhà xuất y học Hà Nội, 213 – 215; 230 – 234 14 Phùng Quốc Chương 2002 Kết kiểm tra tính mẫn cảm với số thuốc kháng sinh vi khuẩn Salmonella phân lập từ vật nuôi Đắc Lắc Tạp chí Khoa học kỹ thuật thú y, 15 – 18 15 Trần Thị Ánh Nguyệt 2010 Khảo sát điều kiện nuôi cấy phương pháp tách chiết enzyme cellulase từ vi khuẩn Bacillus Subtilis Tuyển tập Báo cáo hội nghị Sinh viên nghiên cứu khoa học lần thứ 7, Đại học Đà Nẵng 16 Trần Thị Nhã Thi 2011 Đánh giá hiệu điều trị viêm gan, vàng da chó cao đặc chiết diệp hạ châu đắng (Phyllanthus amarus) Luận văn Cao học, Trường Đại học Nông Lâm 17 Trường đại học Dược Hà Nội 1993 Tài liệu thực tập vi sinh kháng sinh, – 9; 22 – 24 18 Từ Tích Tổ, 2008 Chẩn đoán phòng trị viêm gan, xơ gan ung thư gan Nhà xuất Tổng Hợp Thành phố Hồ Chí Minh, 54 – 131 19 Võ Thị Hoàng Mi 2005 Các phương pháp chuẩn đoán thương hàn thông dụng Khoa Công nghệ sinh học – Đại học Mở Bán công TP.HCM Tài liệu nước 20 Adegoke AA., PA Iberi, DA Akinpelu, OA Aiyegoro, CI Mboto Studies on phytochemical screening and antimicrobial potentials of Phyllanthus amarus against multiple antibiotic resistant bacteria International Journal of Applied Research in Natural Products, 3: – 12 21 Attur – ur – Rahman, Chouldhany M Iqbal, J Thomson William 2005 Bioassay Techniques For Drug Development The Taylor and Francis – e – Library, 14 – 16 34 35 22 Bala Neeraj, A B Aitken Elizabeth, Cusack Andrew and J Steadman Kathryn 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 2011 Evalution of antibacterial activity of Australian basidiomycetous macrofungi using high – throughput 96 well plate assay Pharmaceutical Biology, 49: – C Chitravadivu, S Manian and K Kalaichelvi 2009 Antimicrobial studies on selected medicinal plants, Erode Region, Tamilnadu, India In Middle-East Journal of Scientific Research, Department of Biotechnology, K.S.Ranagasamy College of Technology, Tiruchengode - 637 215, Tamilnadu, India, pp 147 – 152 C Smith Tara 2010 Streptococcus group A Second edition, – 17 C Thongson, M P Davidson, W Maharnchanakul and J Weiss 2004 Antibactetrial activity of ultrasound assisted solvent extracted spices Letters in applied microbiology, 39: 401 - 406 C.O Gordian and O.A Godswill 2007 Chemicals detected in plants used for Folk Medicine in South Eastern Nigeria In Department of Plant Science and Biotechnology, University of Port Harcourt, Choba, Port Harcourt Nigeria, pp 67 – 72 Cimolai Nevial 2009 Streptococcus pyogenes is alive and well BCMJ, 51: 122 – 127 D C Mohana, S Satish and K A Raveesha 2008 Antibacterial evaluation of some plant extracts against some Human pathogenic bacteria In Advances in Biological Research, Medical Microbiology Laboratory; Department of Microbiology and Biotechnology, Bangalore University, Jnana Bharathi Campus, Bangalore - 560 056, India; Department of Studies in Microbiology; Department of Studies in Botany, University of Mysore, Manasagangotri, Mysore - 570 006, India, pp 49 – 55 De Britto A John, Sheeba Gracelin D Steena Herin, Roshan Sebastian 2011 Antibacterial activity of a few medicinal plants against Xanthomonas campestris and Aeromonas hydrophila Journal of Biopesticides, 4: 57 – 60 ETTA, Edim Hannah, ELOMA, Nnanke, OKON, Archibong Essien and OFFOR, Ubana 2011 Investigating the effect of a local Herb – P Amarus (Schum and Thonn.) on entero – pathogenic Staphylococcus aureus and Escherichia coli International Journal of Tropical Medicine and Public Health, 1: 01 – 05 Fullá Oelia, Prado Valeria, Durán Claudia, Lagos Rpsanna and M L Myron 2005 Surveillance for antimicrobial resistance profiles among Shigella Species isolated from a semirural community in Northern Adiministrative area of Santiago, Chile Am J Trop Med Hyg., 72: 851 – 854 H Havickova F Sisak, H Hradecka, I Rychlik, I Kolackova, R Appiskova 2006 Antibiotic resistance of Salmonella spp isolates from pigs in the Czech Republic Veterinarni Medicina, 303 – 310 K Tripatthi Arvind, K Verma Ram, K Gupta Anik, M Gupta Madan and P S Khanuja Suman 2006 Quantitative Determination of Phyllanthin and Hypophy – llanthin in Phyllanthus Species by High-performance Thin Layer Chromatography Phytochem Anal 17: 394 – 397 35 36 34 Khan Salim, Al-Qurainy Fahad, Ram Mauji, Ahmad Sayeed and Zainul Abdin Malik 2010 Phyllanthin biosynthesis in Phyllanthus amarus: Schum and Thonn growing at different altitudes In Journal of Medicinal Plants Research, Department of Botany and Microbiology, College of Science, King Saud University, Riyadh, 11451, Kingdom of Saudi Arabia; Centre for Transgenic Plant Development, Department of Biotechnology Faculty of Science, Jamia Hamdard, Hamdard Nagar, New Delhi, 110062, India; Department of Pharmacognosy and Phytochemistry, Faculty of Pharmacy, Jamia Hamdard, Hamdard Nagar, New Delhi, 110062, India, pp 041 – 048 35 M Uyub Abdul, N Nwachukwu Ikenna, A Azlan Ahmad and S Fariza Shaida 2010 In-vitro antibacterial activity and cytotoxicity of selected medicinal plant extracts from Penang Island Malaysia on metronidazole resistant Helicobacter pylori and some pathogenic bacteria Ethnobotany Research & Applications, 8: 095 – 106 36 [...]... Hệ enzyme của Bacillus subtilis rất phong phú và đa dạng Bacillus subtilis được hoạt hóa trên môi trường với thành phần: NaCl 0,5 %, pepton 1 %, cao nấm 1 %, cao thịt 0,3 %, agar 0,7 %, pH = 7, nhiệt độ 30 – 39 oC, nhưng phát triển tốt ở 37 oC (Trần Thị Ánh Nguyệt, 2010) Các đặc tính sinh hóa của Bacillus subtilis: hoạt tính catalase, phản ứng Methyl Red (+), phản ứng Voges Proskauer (+), khử Nitrate... chọn pha tĩnh sạch hơn, lựa chọn pha động tinh khiết hơn, sử dụng áp suất ổn định hơn Van nhiều cổng Bình chứa dung môi 5 Sơ lược về các phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn Cột bảo vệ Hộp trộn Một số phương pháp thường được sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn của một dung môi Van 2 cổng số hợp chất như: phương pháp khuếch tán trên thạch (Antibiotic Disc Diffusion Method) Cột sắc ký và phương pháp... khiểncó tính kháng khuẩn được tẩm vào các đĩa giấy (ϕ = 2 mm) tiệt trùng với hàm lượng nhất định Khi đĩa giấy được đặt lên bề mặt môi trường thạch đĩa đặc biệt, hợp chất có tính kháng khuẩn sẽ khuếch tán ra xung quanh và ngăn cản không cho vi Hình 4 Sơ đồ mô tả tổng quát các bộ phận của máy HPLC sinh vật mọc lên, tạo nên vòng vô khuẩn (trong trường hợp vi sinh vật bị tác động bởi hợp chất có tính kháng. .. sự khác nhau, bên cạnh đó với mỗi dung môi sử dụng, phương pháp chiết cũng dẫn đến sự khác biệt này 3 Khảo sát tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng trên các chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương 3.1 Thử tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng Sau khi tiến hành khảo sát tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng trên các chủng vi khuẩn S aureus ATCC, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC,... loại hợp chất có tính kháng khuẩn, bên cạnh đó giúp xác định được giá trị MIC, MBC của một hợp chất có tính kháng khuẩn đối với từng loại vi khuẩn Môi trường sử dụng: môi trường canh dinh dưỡng Nutrient Broth (Adegoke và ctv, 2010) hoặc môi trường Brain Heat Infusion (Rashmi, 2012) Kết quả được đánh giá dựa trên sự phát triển của vi khuẩn trong môi trường Ghi nhân độ pha loãng hợp chất kháng khuẩn cao... ctv, 2000; Nguyễn Thị Chính và Trương Thị Hòa, 2005) Staphylococcus aureus kháng với penicillin G do vi khuẩn này sản xuất được men penicillinase, kháng MRSA (Methicillin resistant Staphylococcus aureus) do tạo ra một loại protein gắn vào thụ thể hoạt động của methicillin, tỉ lệ S aureus kháng methicillin lên trên 50 % S aureus kháng thuốc cao với penicillin (89,4 %) (Frank và Henry, 2009), tertracycline... đắng có tính kháng khuẩn trên các chủng vi khuẩn Gram âm và Gram dương Điều này phù hợp với kết quả nghiên cứu của Flora và Folasade (2008); Đỗ Huy Bích và ctv (2004); ETTA và ctv (2011) rằng cao thô Diệp hạ châu đắng có khả năng ức chế các chủng vi khuẩn Gram dương: S aureus ATCC, B subtilis ATCC, S pyogenes ATCC và Gram âm S typhimurium ATCC, S.flexerneri ATCC Việc phát hiện ra hoạt tính kháng khuẩn... Hùng 1985 Độc tính dược phẩm Nhà xuất bản Y Học, thành phố Hồ Chí Minh 7 Ngô Tự Thành, Bùi Thị Việt Hà, Vũ Minh Đức, Chu Văn Mẫn 2009 Nghiên cứu hoạt tính enzym ngoại bào của một số chủng Bacillus mới phân lập và khả năng 6 33 34 ứng dụng chúng trong xử lý nước thải Tạp chí Khoa học ĐHQGHN, Khoa học Tự nhiên và Công nghệ, 101 – 106 8 Nguyễn Bữu Châu 2007 Kiểm tra tính nhạy cảm đối với kháng sinh của... Farland 0,5 Rút 10 µl + 8,99 ml NaCl 0,85 %, được nồng độ 1,5 x 105 CFU/ml Hình 7 Sơ đồ qui trình chuẩn độ vi khuẩn sử dụng trong nghiên cứu (Thongson và ctv, 2004) 2.3.2 Thử tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng Xác định tính kháng khuẩn của cao thô Diệp hạ châu đắng bằng phương pháp pha loãng liên tục trong môi trường MHA (Chitravadivu và ctv, 2009; Britto và ctv, 2011) 21 22 thực hiện trên microplate... (Nguyễn Thị Nguyệt và ctv, 2010) 3.5 Shigella flexerneri Shigella flexerneri thuộc giống Shigella, họ Enterobacteriaceae, dựa vào đặc điểm kháng nguyên thân O và các đặc tính sinh hóa người ta chia Shigella flexerneri ra làm 4 nhóm chính: A, B, C, D; ngoài ra còn có kháng nguyên K; mỗi nhóm có nhiều kiểu huyết thanh Shigella flexerneri có dạng hình que thẳng dài, kích thước từ 1 – 3 µm, không có lông, ... cổng Bình chứa dung môi Sơ lược phương pháp thử hoạt tính kháng khuẩn Cột bảo vệ Hộp trộn Một số phương pháp thường sử dụng để xác định hoạt tính kháng khuẩn dung môi Van cổng số hợp chất như:... khác biệt Khảo sát tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng chủng vi khuẩn Gram âm Gram dương 3.1 Thử tính kháng khuẩn cao thô Diệp hạ châu đắng Sau tiến hành khảo sát tính kháng khuẩn cao thô... hạn chế sử dụng kháng sinh, tránh tượng kháng kháng sinh, gây ảnh hưởng đến sức khỏe người môi trường xung quanh PHẦN KẾT LUẬN Một số kết luận rút từ kết nghiên cứu khảo sát tính kháng khuẩn cao