BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC LÊN MEN NƢỚC THANH LONG BẰNG VI KHUẨN ACID LACTIC CÁN BỘ HƯỚNG DẪN: ThS HUỲNH XUÂN PHONG SINH VIÊN THỰC HIỆN: NGUYỄN THÚY VI MSSV: 3082567 Lớp: Công nghệ Sinh học TT K34 Cần Thơ, Tháng 5/2013 Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƢỚNG DẪN SINH VIÊN THỰC HIỆN ThS Huỳnh Xuân Phong Nguyễn Thúy Vi DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng 05 năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn đến Trường Đại học Cần Thơ, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học, Quý Thầy Cô tận tình giảng dạy thời gian học tập vừa qua Xin đươ ̣c bày tỏ lòng biế t ơn sâu sắ c của ̀ h đế n ThS Huỳnh Xuân phong đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện tốt để thực đề tài Xin chân thành cảm ơn TS Ngô Thị Phương Dung , anh Nguyễn Ngọc Thạnh anh Phạm Hồng Quang – cán phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, anh chị cán bô ̣ các phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học Thực phẩm, Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học hỗ trợ , đóng góp ý kiế n tạo điều kiện thuận lợi để thực đề tài Xin ghi ơn gia đình tất bạn bè động viên, giúp đỡ suốt thời gian qua Kính chúc Quý Thầy Cô nhiều sức khỏe, thành đạt có cống hiến quý báu cho nghiệp giáo dục đào tạo Xin chân thành cảm ơn! Nguyễn Thúy Vi Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÓM LƢỢC Đề tài nhằm phân lập dòng vi khuẩn acid lactic có khả ứng dụng để sản xuất nước long lên men Nghiên cứu điều kiện thực để khảo sát sản xuất nước long lên men tỉ lệ pha loãng, tỉ lệ đường phối chế, mật số giống chủng, nhiệt độ ủ, thời gian lên men điều kiện bảo quản thích hợp Kết phân lập dòng vi khuẩn từ nước long lên men tự nhiên loại bột men tiêu hóa Kết cho thấy tất dòng vi khuẩn phát triển điều kiện pH thấp (1,5 – 3,5) có khả ứng dụng sản xuất nước long lên men (đạt mật số log CFU/mL) Trong dòng vi khuẩn Lactobacillus acidophilus A phân lập từ bột men tiêu hóa Antibio có khả lên men nước long tốt (hàm lượng acid đạt 1,38% w/v mật số 8,44 log CFU/mL) Xác định điều kiện lên men thích hợp với điều kiện: dịch long nguyên chất với tỉ lệ đường phối chế 9%, lên men 37˚C 48 nồng độ giống chủng log CFU/mL Sản phẩm đánh giá tốt mùi vị (không nồng acid độ vừa phải), mật số vi khuẩn 9,3 log CFU/mL Nhiệt độ tồn trữ sản phẩm − 6ºC tuần đảm bảo mùi, vị mật số vi khuẩn (trước trữ 6,87 log CFU/mL sau trữ 7,02 log CFU/mL) Từ khóa: Lactobacillus acidophilus, lên men, probiotic, long, vi khuẩn acid lactic Chuyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ MỤC LỤC LỜI CẢM TẠ TÓM LƢỢC i MỤC LỤC ii DANH SÁCH BẢNG iv DANH SÁCH HÌNH v DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT vi CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục tiêu đề tài CHƢƠNG LƢỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1 Giới thiệu probiotic 2.2 Sơ lƣợc vi khuẩn acid lactic 2.2.1 Vi khuẩn acid lactic 2.2.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến phát triển vi khuẩn acid lactic 2.3 Lên men acid lactic 2.3.1 Cơ sở lý thuyết trình lên men acid lactic 2.3.2 Các yếu tố ảnh hưởng đến trình lên men 2.3.3 Ứng dụng thực tế lên men acid lactic 2.4 Giới thiệu long CHƢƠNG PHƢƠNG TIỆN VÀ PHƢƠNG PHÁP 10 3.1 Phƣơng tiện 10 3.1.1 Thời gian địa điểm 10 3.1.2 Phương tiện 10 3.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 11 3.2.1 Phân lập định danh mức độ giống dòng vi khuẩn acid lactic 11 3.2.2 Khảo sát khả chịu pH thấp vi khuẩn acid lactic phân lập 12 3.2.3 Khảo sát khả lên men nước long vi khuẩn acid lactic 12 3.2.4 Khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch long tỷ lệ phối chế đường saccharose 13 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ 3.2.5 Khảo sát mật số giống chủng nhiệt độ lên men 15 3.2.6 Khảo sát nhiệt độ thời gian tồn trữ sản phẩm 16 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 17 4.1 Phân lập định danh mức độ giống dòng vi khuẩn acid lactic 17 4.2 Khả chịu pH thấp vi khuẩn acid lactic phân lập 18 4.3 Khả lên men nước long vi khuẩn acid lactic 20 4.4 Tỷ lệ pha loãng dịch long tỷ lệ phối chế đường saccharose 22 4.5 Ảnh hưởng mật số giống chủng, nhiệt độ thời gian lên men 26 4.6 Nhiệt độ thời gian tồn trữ sản phẩm 29 CHƢƠNG 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 5.1 Kết luận 31 5.2 Đề nghị 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC Phụ lục Các phƣơng pháp phân tích Phụ lục Phƣơng pháp đánh giá cảm quan Phụ lục Các kết phân tích thống kê Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH BẢNG Bảng Thành phần acid béo hai giống long Bảng Tỉ lệ thành phần môi trường MRS agar 11 Bảng Đặc điểm hình thái dòng vi khuẩn acid lactic 17 Bảng Mật số vi khuẩn môi MRS lỏng có pH thấp 19 Bảng Một số tiêu sau lên men nước long 21 Bảng Giá trị pH độ Brix tỉ lệ nước long phối chế đường 23 Bảng Mô tả tiêu đánh giá sản phẩm nước long lên men 25 Bảng Kết đánh giá cảm quan dạng dịch long đường phối chế 25 Bảng Kết khảo sát nồng độ giống chủng nhiệt độ ủ 26 Bảng 10 Kết đánh giá cảm quan nồng độ, nhiệt độ thời gian ủ 28 Bảng 11 Kết khảo sát nhiệt độ thời gian tồn trữ sản phẩm 29 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH SÁCH HÌNH Hình Hylocereus undatus (thanh long ruột trắng) Hình Hylocereus polyrhizus (thanh long ruột đỏ) Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch long phối chế đường saccharose 14 Hình Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo sát nồng độ giống chủng, nhiệt độ thời gian lên men 15 Hình Sự thay đổi hàm lượng acid theo dạng nước long nồng độ đường 24 Hình Sự thay đổi mật số vi khuẩn theo dạng dịch long nồng độ đường 24 Hình Hàm lượng acid thay đổi theo nhiệt độ thời gian chủng giống 27 Hình Mật số vi khuẩn thay đổi theo nhiệt độ nồng độ giống chủng 28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT CFU Colony Forming Unit FAO Food and Agriculture Organization of the United Nations LAB Lactic Acid Bacteria MRS De Man, Rogosa and Sharpe tb tế bào WHO World Health Organization HL Hàm lượng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG GIỚI THIỆU 1.1 Đặt vấn đề Thực phẩm nhu cầu thiết yếu thiếu người Xã hội ngày phát triển, đời sống người ngày nâng cao Vì vậy, nên việc ăn no không nhu cầu mà nhu cầu thưởng thức tìm hiểu tác dụng thực phẩm sức khỏe đặt lên hàng đầu Từ đó, mối quan hệ sản phẩm thực phẩm chế độ dinh dưỡng có lợi cho sức khỏe giúp thể chống lại bệnh tật trở thành khuynh hướng nghiên cứu chuyên gia dinh dưỡng nhà khoa học nhằm tạo sản phẩm có giá trị cao mặt sinh học, gọi sản phẩm “probiotic” (chế phẩm sinh học) Sản phẩm probiotic định nghĩa “những vi sinh vật không gây bệnh có khả tồn sau trình tiêu hóa có tác động tích cực đến sức khỏe sinh lý vật chủ” Hiện có nhiều sản phẩm probiotic sử dụng cho người, vật nuôi, trồng sản xuất sử dụng dạng lỏng dạng bột Vi khuẩn acid lactic nhóm vi sinh vật sử dụng rộng rãi sản phẩm probiotic sữa chua, nem chua, rau cải muối chua,… Những sản phẩm không dùng để ăn uống mà dùng để chữa bệnh đường ruột, dày, vi khuẩn acid lactic có khả tạo kháng sinh ngăn chặn, tiêu diệt vi khuẩn gây bệnh Nước trái môi trường tốt cho phát triển vi khuẩn sản phẩm probiotic Trái rau cải thực phẩm có lợi cho sức khỏe chúng chứa nhiều chất chống oxy hóa, vitamin, chất xơ khoáng Hơn nữa, chúng không chứa chất gây dị ứng cho người tiêu dùng Trong loại trái long loại trái phổ biến có giá trị dinh dưỡng cao Quả long chín có màu đặc trưng hấp dẫn, vị chua ngọt, mùi thơm ngon; chứa nhiều vitamin A, C, đường, acid hữu nên long sử dụng phổ biến dạng trái tươi Nhằm để tận dụng nguồn nguyên liệu phổ biến có giá trị dinh dưỡng cao làm đa dạng hóa sản phẩm chế biến từ long Đề tài thực nhằm sản xuất nước long lên men vi khuẩn acid lactic tạo sản phẩm có giá trị mặt sinh học 1.2 Mục tiêu đề tài Phân lập, tuyển chọn số dòng vi khuẩn acid lactic nghiên cứu qui trình sản xuất nước long lên men vi khuẩn aicd lactic Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Kết đánh giá cảm quan cho thấy mẫu ủ 37ºC có nồng độ log tế bào/mL mẫu ủ nhiệt độ 25ºC nồng độ giống chủng log tế bào/mL có điểm thấp mùi thơm đặc trưng long ít, vị nhiều Ở nồng độ giống chủng ban đầu log tế bào/mL lên men 30 37ºC chất lượng cảm quan sản phẩm đánh giá cao (8,3 – 8,9/10 điểm) Kết hợp với kết khả sinh acid tăng mật số, sản phẩm lên men 37ºC 48 với nồng độ giống chủng ban đầu log tế bào/mL chọn để ứng dụng vào qui trình lên men 4.7 Nhiệt độ thời gian tồn trữ sản phẩm Vấn đề quan trọng sản phẩm probiotic làm thể để tồn trữ sản phẩm sau sản xuất mà đảm bảo chất lượng sản phẩm không đổi Kết thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thời gian tồn trữ trình bày Bảng 10 Bảng 11 Kết khảo sát nhiệt độ thời gian tồn trữ sản phẩm Thời gian (tuần) pH – 6ºC 20 – 25ºC HL acid (%w/v) 28 – 32ºC – 6ºC 3,51 20 – 25ºC 28 – 32ºC Mật số (log CFU/mL) – 6ºC 0,634 20 – 25ºC 28 – 32ºC 6,87 3,53c 2,62f 2,67d 0,631e 1,54d 1,62b 6,86e 7,66b 7,92a 3,58b 2,61g 2,63ef 0,622e 1,59c 1,62b 6,89d 5,87f 5,71g 3,66a 2,60g 2,64e 0,622e 1,59c 1,67a 7,02c 5,42h 5,32i Ghi chú: Các số liệu bảng giá trị trung bình lần lặp lại Các giá trị (theo nhóm tiêu) có mẫu tự giống không khác biệt ý nghĩa mặt thống kê độ tin cậy 95% Những mẫu có nhiệt độ tồn trữ nhiệt độ phòng mát (20 – 25ºC) nhiệt độ môi trường (28 – 32ºC) mật số sau tuần có khuynh hướng tiếp tục tăng, từ 6,87 log tế bào/mL lên khoảng 7,66 - 7,92 log tế bào/mL đồng thời hàm lượng acid tăng so với trước tồn trữ (từ 0,634% w/v lên khoảng 1,54 - 1,62% w/v) làm cho sản phẩm có mùi nồng khó chịu vị chua Nguyên nhân khoảng nhiệt độ vi khuẩn phát triển nên vòng tuần chúng tiếp tục gia tăng mật số lên men Nhưng từ tuần thứ trở mật số vi khuẩn bắt đầu giảm lượng acid sinh ức chế ngược lại vi khuẩn hàm lượng acid không tăng mật Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 30 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ số giảm xuống thấp 6,0 log tế bào/mL Như vậy, nhiệt độ không thích hợp để tồn trữ sản phẩm không giữ đặc tính sản phẩm không thỏa mãn yêu cầu sản phẩm probiotic Những mẫu tồn trữ nhiệt độ – 6ºC mật số hàm lượng acid tương đối ổn định (0,622 – 0,631% w/v) Nhiệt độ thấp ức chế hoạt động vi khuẩn giữ đặc tính tốt Tuy nhiên, mật số vi khuẩn có huynh hướng tăng từ tuần đầu đến tuần thứ ba trình tồn trữ (mật số sau tuần 7,02 log CFU/mL so với ban đầu 6,87 log CFU/mL) Tóm lại, sản phẩm tồn trữ – 6ºC có hàm lượng acid mật số vi khuẩn không thay đổi nhiều so với lúc kết thúc lên men Vậy nhiệt độ thích hợp để tồn trữ sản phẩm - 6ºC kết nghiên cứu cho thấy sản phẩm giữ chất lượng sau tuần tồn trữ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 31 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Phân lập dòng vi khuẩn acid lactic từ nước long lên men từ nhiên loại bột men tiêu hóa - Tất dòng vi khuẩn acid lactic phân lập có khả phát triển môi trường pH thấp (1,5 – 3,5) nên chúng ứng dụng sản phẩm probiotic (đạt mật số log CFU/mL sau ủ 37ºC) - Tất dòng vi khuẩn có khả lên men nước ép long, dòng Lactobacillus acidophillus A phân lập từ bột Antibio tuyển chọn với đặc điểm tốt (hàm lượng acid đạt 1,38% w/v mật số 8,44 log CFU/mL) - Dạng nước long chọn để sản xuất nước long lên men dạng nước nguyên chất không phối trộn với nước phối chế với 9% đường saccharose - Các điều kiện thích hợp cho qui trình lên men sản xuất nước long lên men: nhiệt độ lên men 37ºC 48 giờ, nồng độ giống chủng log tế bào/mL (tỷ lệ giống chủng 1%) đảm bảo mặt chất lượng sản phẩm yêu cầu mật số vi khuẩn cần thiết cho sản phẩm probiotic - Nhiệt độ tồn trữ sản phẩm - 6ºC thời gian tuần đảm bảo chất lượng sản phẩm giữ mùi thơm vị đặc trưng long trì mật số vi khuẩn ổn định (6,86 – 7,02 log CFU/mL) 5.2 Đề nghị -Khảo sát thời gian tồn trữ sản phẩm với thời gian lâu Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 32 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Kiều Hữu Ảnh 1999 Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp Nxb Khoa học Kỹ thuật, trang 119 – 124 Lê Mỹ Hồng, 2000 Bài giảng Kỹ thuật chế biến sản phẩm rau muối chua Khoa Nông nghiệp sinh học ứng dụng – Đại học Cần Thơ Lương Phước Trường, 2012 Phân lập tuyển chọn vi khuẩn acid lactic sản xuất nước đu đủ lên men Luận văn Đại học, chuyên nghành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học, Đại học Cần Thơ Nguyễn Thị Hiền 2006 Công nghệ sản xuất mì sản phẩm lên men cổ truyền Nxb Khoa học Kỹ thuật, trang 209 – 211 Tiếng Anh Caplice, E and G.F Fitzgerald 1999 Food fermentation: role of microorganisms in food production and preservation Int J Food Microbiol 50: 131-149 Dai, D., N N Nanthkumar, D S Newburg and W.A Walker 2000 Role of oligosaccharides and glycol conjugates in intestinal host defense J Pediatric Gastroenterol Nutr, 30: S23-S33 Fontaine, N., J.C Meslin, V Lory and C Andrieux 1996 Intestinal mucin distribution in the germ-freeand in the heteroxenic rather boring a human bacterial flora: Effect of inulin in the diet” Br J Nutr, 75: 881-892 Glick, B 1995 The immune system of poultry, Poultry Production Elsevier Science, Amsterdam, pp.55-62 Gregor, Rei 1999 The Scientific Basis for Probiotic Strain of Latobacillus Appl Environment Microbiology, 65(9): 3763-3766 Guarner, F and G.J Schaafsma 1998 Probiotics International Journal of Food Microbiology, 39: 237-238 Hershberg, R.M and L F Mayer 2000 Antigen processing and presentation by intestinal epithelial cells polarity and complexity Immunol Today, 21: 123-28 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 33 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Mattila-Sandholm, T., P.Myllarinen, R Crittenden, G.Mogensen, R.Fonden and M.Saarela, 2002 Technological challenges for future probiotic foods Int Dairy J pp 173 – 182 McCracken, V.J and R.G Lorenz 2001 The gastrointestinal ecosystem: Aprecarious alliance among epithelium, immunity and microbiota Cell Microbiol, 3: 1-11 Rachel, O I and Adebayo-Tayo, B.C 2012 Screening of Lactic Acid Bacteria Isolated from Fermented Food for Bio-molecules Production AU J.T., 15(4): 205-217 Schrezenmeir, J., de Vrese, M 2001 Probiotic, Preprobiotic and Synbiotics – Approaching a Definition, Am J Clin Nutr., 73: 361-364 Temmerman, R., Pot B, Huys G, Swings J 2002 Identification and antibiotic susceptibility of bacterial isolates from probiotic products Int J Food Microbiol., 81: 1-10 Trang web http://vi.wikipedia.org/wiki/Thanh_long_(th%E1%BB%B1c_v%E1%BA%ADt (ngày 21/01/2013) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 34 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC PHỤ LỤC CÁC PHƢƠNG PHÁP PHÂN TÍCH Phƣơng pháp nhuộm Gram - Qui trình: Lấy sinh khối môi trường thạch MRS cho vào giọt nước vô trùng miếng lam vô trùng Dùng que cấy trải mỏng theo hình xoắn ốc, hơ nhẹ miếng lam qua lại đầu lửa khoảng - lần để giết chết vi sinh vật dán chúng lên lam Nhỏ - giọt crystal violet cho phủ nơi cố định, để 60 giây Rửa nước vài giây, chậm nhẹ cho khô bớt nước Nhỏ - giọt dung dịch iot để 60 giây Rửa nước, chậm nhẹ Rửa cồn + acetone thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối phiến kính đến giọt cồn + acetone không màu tím Rửa nước vài giây, chậm nhẹ Nhỏ - giọt fuchsin, để 60 giây Rửa nước vài giây, chậm nhẹ hơ lửa cho khô nước - Kết quả: Vi khuẩn Gram (+) bắt màu tím xanh crystal - violet Vi khuẩn Gram (-) bắt màu hồng đỏ fuchsin Phƣơng pháp thử nghiệm Catalase Lấy sinh khối tâm khuẩn lạc môi trường thạch MRS sau 24 - 48 ủ Chuyển sinh khối lên miếng lam Nhỏ lên sinh khối giọt H2O2 3% Quan sát nhanh hình thành bọt khí ghi nhận kết - Kết quả: Dương tính (+): có hình thành bọt khí (O2) Âm tính (-): hình thành bọt khí Phƣơng pháp thử nghiệm oxydase - Đặt sản phẩm giấy lọc có tẩm sẵn thuốc thử oxydase lên miếng lam vô trùng - Nhỏ giọt nước cất lên vị trí đặt giấy cho vừa thấm ướt giấy - Dùng que cấy, lấy sinh khối vi khuẩn sau 18-24h ủ, đặt lên giấy lọc thấm nước trước Quan sát phản ứng 1-2 phút Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Kết quả: Dương tính: giấy lọc đổi màu xanh dương Âm tính: giấy lọc không đổi màu Vi khuẩn acid lactic xác định dòng phân lập có kết oxydase âm tính Phân giải CaCO3 Những dòng phân lập cấy chuyển môi trường MRS agar có bổ sung 1,5% CaCO3 Vi khuẩn acid lactic có khả sinh acid lactic phân giải CaCO3 nên tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc Sau ủ, chọn dòng vi khuẩn có khả tạo vùng sáng quanh khuẩn lạc Phƣơng pháp xác định hàm lƣợng acid lactic sinh - Lấy 100 mL nước cất (đã tách khí cách đun sôi, làm nguội) cho vào bình tam giác 250 mL, cho vào mL dung dịch thị phenolphtalein Đặt bình tam giác lên máy khuấy từ khuấy - Nhẹ nhàng đặt đầu cực đo máy pH vào dung dịch dung dung dịch NaOH 0,1 N chuẩn tới pH = 8,2 (có xuất màu hồng nhạt bền khoảng phút) Lượng NaOH tiêu hao không cần tính - Lấy xác mL dịch tiếp tục chuẩn dung dịch NaOH 0,1 N đến đạt pH = 8,2 (có màu hồng nhạt bền khoảng phút) Như số mL cần để trung hòa n mL - Hàm lượng acid tổng dịch tính theo mg đương lượng lít dịch (mEq/l) g acid lít (g/L) Ở hàm lượng tổng tính theo acid lactic Ax = (n*0,009*1000)/V Trong đó: Ax: lượng acid có lít sản phẩm, g/L n: Số mL NaOH 0,1 N tiêu hao định phân mẫu V: Lượng mẫu mang phân tích (5mL) 0,009: Số gam acid lactic tương ứng với 1mL NaOH 0,1 N 1000: Hệ số qui đổi từ lít sang mililit Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Phƣơng pháp đếm sống vi sinh vật Lấy mẫu: - Có tính chất đại diện; Lượng mẫu lấy vừa phải, đủ phân tích - Dụng cụ lấy mẫu, chứa mẫu phải vô trùng Pha loãng mẫu: - Cân xác g mẫu (hoặc lấy mL mẫu) cho vào ống nghiệm chứa mL nước muối sinh lý vô trùng 0,85% Lắc máy học, để lắng 30 giây, độ pha loãng 10-1 - Lấy mL dịch pha loãng nồng độ 10-1 cho vào ống nghiệm có chứa mL nước muối sinh lý vô trùng 0,85% Lắc máy học, để lắng 30 giây, độ pha loãng 10-2 Tiếp tục làm vậy, ta dãy nồng độ pha loãng 10-3, 10-4,… Nuôi cấy mẫu: - Dùng pipet vô trùng lấy mL mẫu pha loãng cho vào đĩa petri vô trùng, nồng độ đĩa pipet vô trùng riêng - Rót vào khoảng 15 – 20 mL môi trường MRS agar trùng làm nguội khoảng 45oC Lắc tròn xuôi ngược chiều kim đồng hồ, chiều lần - Đĩa đặt mặt phẳng ngang cho đông tự nhiên - Lật úp đĩa ủ nhiệt độ 30ºC 48 - Sau lấy kiểm tra kết quả: Đếm tất khuẩn lạc xuất đĩa petri nồng độ (chọn đĩa có số khuẩn lạc: 30 < x < 300) - Sử dụng đĩa đối chứng để kiểm soát cách lấy mL dung dịch nước muối sinh lý 0,85% trùng cho vào đĩa petri, thêm 15 – 20 mL môi trường nuôi ủ điều kiện đĩa mẫu ∑C - Tính kết quả: N= (n1+0,1*n2)d Trong đó: N: Tổng số vi khuẩn acid lactic có g hay mL mẫu ∑C: Tổng số khuẩn lạc đếm tất đĩa chọn n1: Số đĩa chọn đếm khuẩn lạc nồng độ n2: Số đĩa chọn đếm khuẩn lạc nồng độ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ d: Nồng độ pha loãng mẫu mà đĩa petri chọn để đếm có số khuẩn lạc thoả điều kiện 30 < x < 300 PHỤ LỤC PHƢƠNG PHÁP ĐÁNH GIÁ CẢM QUAN - Hội đồng cảm quan : Hội đồng gồm người, hội đồng ưu tiên số người tham gia số lẻ Kiểm nghiệm viên phải người có trình độ, hiểu biết nghàng công nghệ thực phẩm Bảng PL1 Bảng sở đánh giá cảm quan nƣớc long lên men Tính chất Thang điểm Màu sắc Mùi Vị Trạng thái Mức cảm quan Màu vàng tươi Màu vàng sẫm Màu vàng nhạt Màu khác lạ Màu tối Biểu màu hư hỏng Mùi thơm đặc trưng long Mùi thơm đặc trưng long có mùi đường Có mùi nồng Sản phẩm mùi thơm đặc trưng Sản phẩm có mùi khác lạ Sản phẩm có mùi hư hỏng Ngọt dịu Ngọt vừa Ngọt đậm Vị nhạt Vị lạ Hư hỏng Đồng nhất, suốt, không cặn Trong đồng nhất, không cặn Hơi đục, không cặn Không đồng nhất, đục, có cặn Đục, nhiều cặn, có vật thể lạ Bị đục có dấu hiệu hư hỏng - Cách tính điểm : Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Theo phương pháp cho điểm kiểm nghiệm viên vào kết ghi nhận được, đối chiếu với bảng tiêu cụ thể dùng số nguyên cho điểm từ - Tích điểm trung bình tiêu với hệ số quan trọng tiêu điểm trung bình có trọng lượng Trong thí nghiêm phương pháp cho điểm phương pháp dùng để đánh giá chất lượng sản phẩm với nhiều tiêu Ở Việt Nam tiêu chuẩn qui định tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79 Phương pháp áp dụng việc kiểm tra tiêu cảm quan chung riêng biệt tiêu : trạng thái, màu sắc, mùi vị Tiêu chuẩn Việt Nam sử dụng hệ 20 điểm xây dựng tên thang thống có bậc (từ - 5) điểm điểm cao tiêu Hệ số quan trọng cho sản phẩm nước cà rốtép xây dựng sau: Bảng PL2 Bảng tiêu cảm quan hệ số quan trọng Tên tiêu Mức quan trọng (%) Hệ số quan trọng Màu sắc 30 1.2 Mùi 20 0.8 Vị 25 Trạng thái 25 Để phân cấp chất lượng điểm có trọng lượng sử dụng tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3215-79 qui định cắp chất lượng sản phẩm thực phẩm có điểm chung điểm trung bình chưa có trọng lượng số tương ứng sau: Bảng PL3 Bảng xếp loại chất lƣợng sản phẩm Các chất lƣợng Điểm chung Yêu cầu điểm trung bình chƣa có trọng lƣợng tiêu Loại tốt 18,6-20,0 Các tiêu quan trọng ≥ 4,7 Loại 15,2-18,5 Các tiêu quan trọng ≥ 3,8 Loại trung bình 11,2-15,1 Mỗi tiêu ≥ 2,8 Loại 7,2-11,1 Mỗi tiêu ≥ 1,8 Loại 4,0-7,1 Mỗi tiêu ≥ 1,1 Loại hỏng Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 0-3,9 Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ PHỤ LỤC CÁC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Bảng PL4 Khả phát triển môi trƣờng có pH thấp vi khuẩn acid lactic PHỤ LỤC CÁC KẾT QUẢ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ Bảng PL4 Khả phát triển môi trƣờng có pH thấp vi khuẩn acid lactic Bảng PL5 Kết thống kê giá trị pH thí nghiệm thử khả ứng dụng lên men nƣớc long vi khuẩn acid lactic Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng PL6 Kết thống kê mật số vi khuẩn T0 thí nghiệm thử khả ứng dụng lên men nƣớc long vi khuẩn acid lactic Bảng PL7 Kết thống kê mật số vi khuẩn T48 thí nghiệm thử khả ứng dụng lên men nƣớc long vi khuẩn acid lactic Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng PL8 Kết thống kê hàm lƣợng acid thí nghiệm khảo sát nồng độ giống chủng nhiệt độ ủ Bảng PL9 Kết thống kê mật số vi khuẩn thí nghiệm khảo sát nồng độ giống chủng nhiệt độ ủ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng PL10 Kết thống kê Giá trị pH thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thời gian tồn trữ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học Khóa 34 – 2013 Trường Đại học Cần Thơ Bảng PL11 Kết thống kê Hàm lƣợng acid thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thời gian tồn trữ Bảng PL12 Kết thống kê Mật số vi khuẩn thí nghiệm khảo sát nhiệt độ thời gian tồn trữ Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC&PT Công nghệ Sinh học [...]... glucose vi khuẩn acid lactic được chia làm 2 loại: vi khuẩn acid lactic đồng hình và vi khuẩn acid lactic dị hình - Vi khuẩn acid lactic đồng hình: sản phẩm chủ yếu là acid lactic Một số vi khuẩn acid lactic lên men đồng hình (Lê Mỹ Hồng, 2000): Streptococcus lactis, Streptococcus thermophilus , Lactobacillus acidophilus, Pediococcus cereviceae,… - Vi khuẩn acid lactic dị hình: ngoài acid lactic còn... sinh vật, điển hình là vi khuẩn acid lactic Lên men acid lactic là một trong những loại hình lên men điển hình nhất trong tự nhiên Dựa vào sản phẩm tạo thành sau lên men mà người ta chia chúng ra thành hai nhóm vi khuẩn: lên men đồng hình và lên men dị hình - Lên men đồng hình: quá trình lên men tạo acid lactic theo chu trình EmbdenMeyerhorf Trong tế bào vi khuẩn lên men acid lactic đồng hình có đầy... 80ºC hầu hết vi khuẩn acid lactic bị chết sau 10 - 30 phút g pH môi trƣờng Các chủng vi khuẩn acid lactic chịu được pH thấp khác nhau, đối với vi khuẩn phân lập từ rượu vang có thể chịu được pH 3,0 - 3,5 hoặc thấp hơn (Kiều Hữu Ảnh, 1999) 2.3 Lên men acid lactic 2.3.1 Cơ sở lý thuyết của quá trình lên men acid lactic Lên men acid lactic là quá trình chuyển hóa đường thành acid lactic nhờ vi sinh vật,... số vi khuẩn của từng nghiệm thức lúc mới chủng giống (thời điểm T0) và sau 2 giờ ủ bằng phương pháp đếm sống - Chỉ tiêu thu thập: Mật số của các dòng vi khuẩn - Kết quả: Chọn dòng vi khuẩn có khả năng chịu pH thấp nhất 3.2.3 Khảo sát khả năng lên men nƣớc thanh long bằng vi khuẩn acid lactic a Mục đích: Thử nghiệm khả năng ứng dụng của các dòng vi khuẩn acid lactic đã được phân lập để lên men nước thanh. .. cao, nước thanh long được công nhận là một trong những thức uống tốt cho sức khỏe Để xác định các dòng vi khuẩn acid lactic đã được phân lập có thể ứng dụng trong sản xuất nước thanh long lên men để tạo thành sản phẩm probiotic và để so sánh khả năng ứng dụng của cá dòng vi khuẩn acid lactic này với nhau, tiến hành cho lên men thanh long bằng các dòng vi khuẩn này Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 21 Vi n... danh ở mức độ giống các dòng vi khuẩn acid lactic Nguồn giống được chọn từ các loại bột men tiêu hóa bán trên thị trường và tiến hành phân lập trên môi trường MRS cho đến khi thuần Tuy nhiên, bản thân nước thanh long vẫn có sự hiện diện của vi khuẩn acid lactic Do đó, ngoài nguồn vi khuẩn acid lactic lấy từ bột men tiêu hóa còn phân lập thêm vi khuẩn acid lactic từ thanh long Sở dĩ phân lập như vậy... dòng vi khuẩn acid lactic - Khảo sát khả năng chịu pH thấp của vi khuẩn acid lactic được phân lập - Khảo sát khả năng ứng dụng trong sản xuất nước thanh long lên men bằng vi khuẩn acid lactic - Khảo sát tỷ lệ pha loãng dịch thanh long và tỷ lệ phối chế đường saccharose - Khảo sát mật số giống chủng và nhiệt độ lên men - Khảo sát nhiệt độ và thời gian tồn trữ sản phẩm Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Vi n... nitơ Do đó, vi khuẩn acid lactic phải sử dụng nguồn nitơ có sẵn trong môi trường để đảm bảo cho sự phát triển của chúng c Nguồn vitamin Vitamin rất cần cho sự phát triển của vi khuẩn acid lactic, các vitamin này đóng vai trò là coenzyme trong quá trình trao đổi chất của chúng Vi khuẩn acid lactic nói chung, đặc biệt là trực khuẩn rất cần vitamin làm nguồn chất sinh trưởng Rất ít vi khuẩn acid lactic có... pH: đo bằng pH kế các chỉ tiêu trước và sau lên men - Hàm lượng chất hoà tan (độ Brix): đo bằng Brix kế các chỉ tiêu trước và sau lên men - Acid tổng số (qui ra acid lactic) : Xác định hàm lượng acid sau lên men bằng phương pháp chuẩn độ với dung dịch NaOH 0,1N - Mật số vi khuẩn acid lactic: Đếm sống sau khi lên men trên môi trường MRS agar - Đánh giá cảm quan Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 17 Vi n NC&PT... 15% Chuẩn bị - Giống : vi khuẩn acid lactic được nuôi trong môi trường MRS broth ở 37ºC trong 24 giờ - Mẫu nước ép thanh long nguyên chất: 480 mL - Mẫu thanh long xay + 20% nước: 384 mL dich quả + 96 mL nước cất - Mẫu thanh long xay + 40% nước: 288 mL dịch quả + 192 mL nước cất - Mẫu thanh long xay + 60% nước: 192 mL dịch quả + 288 mL nước cất Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 14 Vi n NC&PT Công nghệ Sinh