Đang tải... (xem toàn văn)
NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill
BÁO CÁO LUẬN VĂN THẠC SĨ SINH HỌC TÊN ĐỀ TÀI: NGHIÊN CỨU GEN DREB5 MÃ HÓA PROTEIN LIÊN QUAN ĐẾN QUÁ TRÌNH PHIÊN MÃ CỦA NHÓM GEN CHỊU HẠN Ở CÂY ĐẬU TƯƠNG [Glycine max (L.) Merrill] NGƯỜI THỰC HIỆN: NGUYỄN HIỆP HÒA NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS. CHU HOÀNG MẬU ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM NỘI DUNG 1. Mở đầu 2. Tổng quan tài liệu 3. Vật liệu và phương pháp nghiên cứu 4. Kết quả và thảo luận 5. Kết luận và đề nghị 1. MỞ ĐẦU 1.1 Lí do chọn đề tài Đậu tương (Glycine max (L.) Merrill) thuộc cây họ đậu (Fabaceae), đây là một trong những cây lương thực có tầm quan trọng bậc nhất trên thế giới, tuy nhiên đậu tương thuộc nhóm cây chịu hạn kém. Chính vì vậy vấn đề cải thiện tính chịu hạn của đậu tương có ý nghĩa vô cùng quan trọng trong việc nâng cao năng suất. Prorein DREB là nhân tố phiên mã kích hoạt nhóm gen liên quan đến tính chịu hạn của đậu tương không phụ thuộc vào ABA, sản phẩm của gen DREB được tìm thấy nhiều khi cây gặp hạn, lạnh và mặn. Trong phân họ DREB ở đậu tương, việc nghiên cứu cấu trúc DREB5 vẫn còn mới mẻ cho đến nay mới có một công trình duy nhất của Chen M và cs (2007) Xuất phát từ các lí do trên chúng tôi đã tiến hànhđề tài luận văn thạc sĩ là: “Nghiên cứu gen DREB5 mã hóa protein liên quan đến quá trình phiên mã của nhóm gen chịu hạn ở cây đậu tương [Glycine max (L.) Merrill]”. 1.2. Mục tiêu đề tài So sánh khả năng chịu hạn của các giống đậu tương và xác định đặc điểm về cấu trúc của gen DREB5 ở cây đậu tương. 1.3. Nội dung nghiên cứu - Đánh giá khả năng chịu hạn của các giống đậu tương ở giai đoạn cây đậu tương non 3 lá chét; - Thu thập thông tin về gen DREB5, thiết kế mồi để nhân gen DREB5; - Tách chiết RNA tổng số, phiên mã ngược tạo cDNA và khuếch đại gen DREB5 bằng kỹ thuật PCR; - Tách dòng và đọc trình tự gen DREB5 ở cây đậu tương; - So sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương nghiên cứu với trình tự đã công bố trên GenBank. 1.4. Ý nghĩa khoa học Là cơ sở cho việc thiết kết vector chuyển gen DREB5 ở đậu tương nhằm cải thiện tính chịu hạn. 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU *Trong luận văn này chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu 29 tài liệu và nhận thấy rằng: -Đậu tương là cây đứng hàng thứ 3 về tầm quan trọng đối với con người, sau lúa và ngô -Đậu tương thuộc nhóm cây chịu hạn kém -Protein của gen DREB tham gia tích cực vào quá trình chống chịu hạn ở thực vật nói chung và cây đậu tương nói riêng -DREB5 thuộc họ gen DREB5 vẫn còn ít được quan tâm nghiên cứu, cho đến nay chỉ có một công trình nghiên cứu duy nhất của Chen M (2007) 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1. Vật liệu Bảng 3.1. Danh sách các giống đậu tương nghiên cứu STT Tên giống Kí hiệu Nguồn gốc Nơi cung cấp 1 Xanh Tiên Đài XTĐ Hà Giang Viện Ngô 2 Bản Dốc BD Cao Bằng Viện Ngô 3 Khánh Hòa KH Khánh Hòa Viện Ngô 4 Lâm Đồng LĐ Lâm Đồng Viện Ngô 5 ĐT 84 ĐT84 Viện KHNN Viện KHNN 6 VX 93 VX93 Viện KHNN Viện KHNN 3.2. Hóa chất, thiết bị, địa điểm nghiên cứu • Các loại hóa chất, máy móc phục vụ nghiên cứu phân lập gen do các hãng Invitrogen, Fermentas, Bioneer cung cấp. • Địa điểm nghiên cứu: Bộ môn Sinh học phân tử và Công nghệ gen - Viện KHSS - ĐHTN; Phòng thí nghiệm Di truyền và SHHĐ - Khoa Sinh - KTNN- Trường Đại học Sư phạm - ĐHTN và Phòng Miễn Dịch học - Viện CNSH. 3.3. Phương pháp nghiên cứu • 2.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo • Phương pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non được xác định theo Lê Trần Bình (1998) [1]. • 3.3.2. Phương pháp sinh học phân tử • Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Tách RNA bằng AccuZol kit (Bioneer – Hàn Quốc) • Kỹ thuật RT-PCR • Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR • Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng 3.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Đánh giá khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non bằng phương pháp gây hạn nhân tạo Phương pháp đánh giá nhanh khả năng chịu hạn ở giai đoạn cây non được xác định theo Lê Trần Bình (1998) [1]. 2.3.2. Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp tách chiết RNA tổng số: Tách RNA bằng AccuZol kit (Bioneer – Hàn Quốc) Kỹ thuật RT-PCR Phương pháp tinh sạch sản phẩm RT-PCR Phương pháp gắn gen vào vector tách dòng Phương pháp biến nạp vector tái tổ hợp vào tế bào khả biến E.coli DH5α Phương pháp PCR trực tiếp từ khuẩn lạc (clony-PCR) Phương pháp tách chiết plasmid Phương pháp xác định trình tự nucleotit 2.3.3.Phương pháp xử lí số liệu Phương pháp thống kê bằng chương trình Excel Phương pháp xử lý trình tự gen 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng của một số giống đậu tương nghiên cứu ĐT 84 XTĐ BD KH L Đ VX93 Hình 4.1. Hình dạng hạt đậu tương nghiên cứu 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân tích đặc điểm hình thái, khối lượng của các giống đậu tương nghiên cứu Bảng 3.1. Mầu sắc, khối lượng, kích thước hạt đậu tương nghiên cứu Giống Hình dạng hạt Màu sắc hạt Màu sắc rốn hạt Khối lượng 1000 hạt (g) Kích thước hạt Dài (cm) Rộng (cm) XTĐ Ovan Xanh nhạt Trắng 94,3± 0,22 0,66±0,03 0,49±0,02 BD Ovan Vàng Đen 89,79± 0,44 0,65±0,04 0,43±0,03 KH Ovan Vàng Đen 172,9± 0,25 0,81± 0,01 0,65±0,01 LĐ Ovan Vàng nhạt Đen 156,39± 0,44 0,72±0,03 0,58±0,03 ĐT84 Ovan Vàng Nâu 178,44±0,40 0,87± 0,05 0,69± 0,03 VX93 Ovan Vàng Đen 163,71± 0.30 0,79± 0,01 0,61± 0,02 Theo bảng số liệu thì giống có kích thước và khối lượng lớn nhất là ĐT84 và nhỏ nhất là BD84 [...]... tự gen DREB 5 có mã số EF 583447.1 của giống đậu tương Trung Quốc có độ tương đồng đạt 90,4% Trình tự axit amin của protein của hai gen này có độ tương đồng đạt 87,8% 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.2 Đề nghị Tiếp tục phân tích so sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương thuộc nhóm chịu hạn tốt với nhóm chịu hạn kém để xác định mối liên quan giữa sự thay đổi trong cấu trúc gen DREB5 với khả năng chịu hạn. .. số chịu hạn tương đối của giống đậu tương DB là cao nhất (41,03), nhỏ nhất là ĐT84 (21,22) - Đã thiết kế, tổng hợp cặp mồi DREBsoy5F-DREBsoy5R và khuếch đại thành công gen DREB5 từ mRNA của giống đậu tương Xanh Tiên Đài, tách dòng và xác định trình tự gen DREB5 từ giống đậu tương Xanh Tiên Đài, gen có kích thước 924bp - Trình tự nucleotit của gen DREB5 của giống đậu tương Xanh Tiên Đài Việt Nam và trình. .. năng chịu hạn tương đối của các giống đậu tương Bảng 3.3 Chỉ số chịu hạn tương đối của các giống đậu tương ST T Giống Chỉ số chịu hạn tương đối Số ngày sau khi xử lí bởi hạn có tỷ lệ 100% cây chết 1 XTĐ 26,12 12 2 BD 41,03 15 3 KH 40,17 15 4 LĐ 35,08 13 5 ĐT84 21,22 11 6 VX93 23,95 12 Trước khi xử lí han 9 ngày xử lí hạn 15 ngày xử lí hạn 4 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.3 Kết quả phân lập gen DREB5 từ cây đậu. .. TCTCTGGCTA GGCACATTTG CGAGGAGAGA ATGCAAGGCT TTCCTTTTTC Hình 3.10 Trình tự gen DREB5 ở đậu tương Xanh Tiên Đài – Việt Nam Theo trình tự này gen DREB5 gồm 924bp trong đó mạch nghiên cứu có 207 T, 268 A, 190 G và 259 C 3 KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.4.6 So sánh trình tự nucleotit giữa DREB5 của Xanh tiên đài Việt Nam và DREB5 của EF 583447 trong ngân hành gen có nguồn gốc từ Trung Quốc bằng phần mềm Bioedit | | |... GATCAGGATT GA Hình 4.11 So sánh trình tự gen DREB5 của giống đậu tương Xanh Tiên Đài của Việt Nam và EF 583447 có trong ngân hàng gen quốc tế từ giống đậu tương của Trung Quốc Theo hình 3.11 chúng tôi xác định được những vị trí khác nhau về trình tự nucleotit như sau: - Gen DREB5 Xanh Tiên Đài của Việt Nam đã không có nucleotit ứng với vị trí từ 193 đến 202 (AGCACCA GC)và từ vị trí 527 đến 535 (AAGA ACAAC)so... sánh trình tự axit amin của DREB5 ở giống đậu tương Xanh Tiên Đài Việt Nam và giống đậu tương có mã số EF 583447.1 của Trung Quốc có trong ngân hàng gen quốc tế Theo kết quả này Xanh tiên đài của Việt Nam đã không có axit amin ở các vị trí từ 58-60 (ứng với HHQ ), 177,178, 180 (ứng với EQQ) EF 583447 Trung Quốc không có axit amin ở các vị trí 201(ứng với P), 292-294 (ứng với DAD) Sự tương đồng của hai... của hai giống về trình tự axit amin đạt 87,8% 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1 Kết luận - Các giống đậu tương nghiên cứu rất đa dạng về đặc điểm hình thái, kích thước và khối lượng hạt Hạt của giống địa phương thường có kích thước nhỏ, đa dạng về hình dạng, mầu sắc hạt cũng như mầu rốn hạt, các giống đậu tương lai thường có kích thước lớn hơn -Các giống đậu tương địa phương có khả năng chịu hạn tốt hơn các... VÀ THẢO LUẬN 4.4 Kết quả phân lập gen DREB5 từ cây đậu tương 4.4.3 Kết quả dòng hóa sản phẩm gen DRED5 trong vector tách dòng Hình 4.7: Đĩa nuôi cấy xuất hiện các khuẩn lạc trắng và khuẩn lạc xanh 4.4.4 Kết quả tách plasmid M 1 2 4kb 3,9kb 1kb 0,93kb Hình 4.8: Ảnh điện di sản phẩm tách plasmid M: marker Lamda cắt bằng Hind III Hai dòng 1 và 2 là DNA plasmid mang gen DREB5 có kích thước khoảng hơn 0,93kb... với vị trí từ 193 đến 202 (AGCACCA GC)và từ vị trí 527 đến 535 (AAGA ACAAC)so với EF583447 - EF583447 của Trung Quốc không có nucleotit ứng với vị trí từ 605 đến 607 (CCC) 675 đến 677 (GGT)và từ 882 đến 890 (TGATGCTCA) Theo kết quả này chúng tôi đã xác định được sự tương đồng về trình tự gen DREB5 của hai giống đạt 90,4% EF 583447 Xanhtiendai EF 583447 Xanhtiendai EF 583447 Xanhtiendai EF 583447 Xanhtiendai... cây đậu tương 4.3.1 Tách chiết RNA từ lá mầm của các giống đậu tương M 1 2 RNA Hình 4.5 Ảnh điện di RNA tổng số trên gel agarose 1% Ghi chú : M: chỉ thị phân tử DNA của thực khuẩn thể l được cắt bằng HindIII 1 : Xanh tiên đài 2 : ĐT84 3.4.2 Kết quả RT-PCR tạo DNA M 1kb 1 2 0,93kb Hình 4.6 Ảnh điện di DNA sản phẩm của RT-PCR với cặp mồi DREBsoy5F và DREBsoy5R Ghi chú: M: chỉ thị phân tử DNA của thực
