Bộ giáo dục đào tạo trờng đại học nông nghiệp hà nội đào ngọc sơn BC U NGHIấN CU K THUT TCH, NUễI CY PROTOPLAST KHOAI TY DIPLOID PHC V CHNG TRèNH TO GING KHOAI TY BNG DUNG HP T BO TRN Luận văn thạc sĩ nông nghiệp Chuyên ngành: trồng trọt Mã số: 60.62.01 Ngời hớng dẫn khoa học: ts nguyễn thị phơng thảo Hà Nội - 2009 LI CAM OAN Tụi xin cam ủoan rng s liu kt qu nghiờn cu lun ny l trung thc v cha s dng ủ bo v mt hc v no Tụi xin cam ủoan rng mi s giỳp ủ lun ny ủó ủc cm n, mi thụng tin trớch lun ủu ủó ủc ch rừ ngun gc H Ni, ngy 10 thỏng 12 nm 2009 Tỏc gi o Ngc Sn Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip i LI CM N Tụi xin trõn trng cm n s quan tõm giỳp ủ v mt chuyờn mụn ca cỏc Thy Cụ giỏo khoa Nụng Hc - Trng i hc Nụng nghip H Ni Tụi xin ủc by t lũng bit n sõu sc ủn cỏc thy cụ giỏo thuc b mụn Cụng Ngh Sinh Hc v GS TS Nguyn Quang Thch, TS Nguyn Th Phng Tho, ngi ủó trc tip ch bo v hng dn tụi hon thnh lun Tụi xin gi li cm n ủn bn bố v gia ủỡnh giỳp ủ cng nh h tr ủiu kin ủ tụi thc hin lun ny Mt ln na xin trõn trng cm n mi s giỳp ủ quý bỏu trờn./ H Ni, ngy 10 thỏng 12 nm 2009 Tỏc gi o Ngc Sn Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip ii Mục lục LI CAM OAN i LI CM N ii Mục lục iii DANH MC CC Kí HIU VIT TT vii PHN I M U .1 1.1 T VN .1 1.2 MC CH V YấU CU CA TI .3 1.2.1 Mc ủớch ca ủ ti 1.2.2 Yờu cu ca ủ ti .3 PHN II: TNG QUAN TI LIU .4 2.1 GII THIU CHUNG V CY KHOAI TY: 2.1.1 Ngun gc: 2.1.2 c ủim thc vt hc: 2.1.3, Giỏ tr dinh dng ca khoai tõy: 2.2 TèNH HèNH SN XUT KHOAI TY TRONG NC V TRấN TH GII: .8 2.2.1 Tỡnh hỡnh sn xut khoai tõy trờn th gii: 2.2.2 Tình hình sản xuất tiêu thụ khoai tây nớc .9 2.3 Hiện tợng thoái hoá giống khoai tây .12 2.4 Các nghiên cứu tạo giống chịu virus 14 2.5 Giới thiệu chung protoplast 16 2.5.1Khái niệm tế bào trần (protoplast ): .16 2.5.2 Phơng pháp tách Protoplast enzym: 16 2.5.3 Các nghiên cứu Protoplast thời kì 1960 - 1970 16 2.5.4 Các nghiên cứu Protoplast thời kì 1980 1990 19 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip iii 2.5.5 Cỏc phng phỏp dung hp 23 2.5.5.1 Dung hp t phỏt (spontaneuous fusion) 23 2.5.5.2 Dung hp cm ng (induced fusion) 23 2.5.6 Kh nng xy dung hp 27 2.5.7 La chn sn phm dung hp 27 25.7.1 Da vo s khỏc v hỡnh thỏi 28 2.5.7.2 Phng phỏp nhum hunh quang 28 2.5.7.3 Da vo phng phỏp kt hp t trng v gene ch th khỏng sinh 28 2.5.7.4 Da trờn cỏc biu hin di truyn, s dng cỏc gene ch th hoc gene ủỏnh du 28 2.5.7.5 Da trờn cỏc du chun di truyn 29 PHN III: VT LIU, NI DUNG V PHNG PHP NGHIấN CU 30 3.1 i tng vt liu, ủim v thi gian nghiờn cu 30 3.2 Ni dung nghiờn cu 30 3.2.1 Nghiờn cu, hon thin quy trỡnh tỏch, nuụi cy v tỏi sinh protoplast 30 3.2.1.1 Thớ nghim: Xỏc ủnh nng ủ enzym ti u (cellulose/macerozym) cho cỏc dũng khoai tõy nh bi 30 3.2.1.2 Thớ nghim 2: nh hng ca thi gian enzym ủn hiu qu tỏch protoplast 30 3.2.1.3 Thớ nghim 3: nh hng ca phng phỏp kh trựng mụi trng ủn kh nng phõn chia ca protoplast 30 3.2.1.4 Thớ nghim 4: Nghiờn cu nh hng ca cỏc mụi trng nuụi cy khỏc ti thi gian phõn chia 31 3.2.1.5 Thớ nghim5: Nghiờn cu nh hng cỏc mụi trng rn ti s hỡnh thnh microcallus 31 3.2.1.6 Thớ nghim 6: Nghiờn cu nh hng thi gian chuyn sang mụi trng to microcallus ti s hỡnh thnh microcallus 31 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip iv 3.2.2 Bc ủu xõy dng quy trỡnh dung hp protoplast bng hoỏ cht PEG 31 3.2.2.1 Thớ nghim 1: nghiờn cu nh hng ca nng ủ PEG khỏc ti hiu sut dung hp 31 3.2.2.2 Thớ nghim 2: Nghiờn cu nh hng ca thi gian PEG ti hiu qu dung hp 31 3.2.2.3 Thớ nghim: Nghiờn cu nh hng ca mt ủ protoplast ti hiu sut dung hp bng PEG 32 3.2.2.4 Thớ nghim 4: Nghiờn cu nh hng ca cỏc phng phỏp PEG khỏc ủn cht lng protopast sau dung hp 32 3.2.2.5 Thớ nghim5: nh nng ủ Ca2+ ủn s tỏi to thnh t bo v s phõn chia protoplast 32 3.3 Phng phỏp nghiờn cu 32 3.3.1 To vt liu in vitro 32 3.3.2 Tỏch t bo trn 33 3.3.3.Dung hp t bo trn 35 3.3.4 Cỏc ch tiờu theo dừi 35 PHN IV: KT QU NGHIấN CU V THO LUN 36 4.1 Thớ nghim 1: Xỏc ủnh nng ủ enzym ti u (C/M) cho cỏc dũng khoai tõy nh bi 36 4.2 Thớ nghim 2: nh hng ca thi gian enzym ủn hiu sut tỏch protoplast 38 4.3 Thớ nghim 3: nh hng ca phng thc kh trựng mụi trng ti kh nng phõn chia ca Protoplast 44 4.4 Thớ nghim4: Kt qu nghiờn cu nh hng ca mụi trng nuụi cy v cỏc dũng khỏc vi thi gian phõn chia ca protolast 45 4.5 Thớ nghim 5: Kt qu mụi trng thớch hp cho to microcallus 48 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip v 4.6 Thớ nghim 6: Kt qu nh hng thi gian chuyn sang mụi trng microcallus ti kh nng hỡnh thnh microcallus 49 4.7.Nghiờn cu xõy dng quy trỡnh dung hp protoplast bng hoỏ cht PEG 52 4.7.1 Nghiờn cu quy trỡnh dung hp protoplast bng PEG 52 4.7.1.1 Thớ nghim1: Kt qu thớ nghim v nh hng nng ủ PEG khỏc ti cht lng protoplast sau quỏ trỡnh dung hp 53 4.7.1.2 Thớ nghim 2: Nghiờn cu nh hng ca thi gian PEG khỏc ủn kh nng kt dớnh ca protoplast 54 4.7.1.3 Thớ nghim 3: Nghiờn cu nh hng ca mt ủ protoplast ti hiu sut ca quỏ trỡnh dung hp 56 4.7.1.4 Thớ nghim 4: Nghiờn cu nh hng ca phng phỏp PEG khỏc ti cht lng protoplast sau dung hp 59 4.7.1.5 Thớ nghim 5: Nghiờn cu nh hng ca nng ủ Ca2+ b sung vo mụi trng nuụi cy 62 PHN V: KT LUN V NGH 66 5.1 KT LUN 66 5.2 ngh 67 Tài liệu tham khảo 68 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip vi DANH MC CC Kí HIU VIT TT NST: Nhim sc th PVX: Potaco virus X PVY: Potato virus Y PEG: Polyethylene glycol P/ml: Protoplast/ml dung dch tỏch Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip vii PHN I M U 1.1 T VN Khoai tõy (Solanum tuberosum) ca h Solanaceae (h c dc) l mt nhng loi rau c ủc s dng rng rói nht vựng khớ hu ụn ủi phng Tõy v l loi cõy thc phm cú giỏ tr kinh t cao Trong c khoai tõy cha nhiu protein, lipit v cỏc loi vitamin nh: Caroten, B1, B2, B3, B6 v vitamin C Ngoi khoai tõy cũn cha nhiu nguyờn t khoỏng quan trng nh: K, Ca, Mg v P[7] Hin nay, trờn th gii khoai tõy ủng hng th v din tớch cỏc loi cõy trng lm lng thc thc phm v ủng th v sn lng[5] Vit Nam khoai tõy l mt cõy trng v ủụng quan trng cụng thc luõn canh: lỳa xuõn-lỳa sm-khoai tõy v l mt cõy trng lý tng cho v ủụng ca ng bng Bc B[2] Mt thc t phi xột ủn l hu ht cỏc ging khoai tõy nc ta ủu cho nng sut thp v phm cht kộm dn m nguyờn nhõn ch yu l thoỏi hoỏ ging vi hai tỏc nhõn: virus v s gi húa ca ging Hin tng ny ủũi hi phi sm ủc khc phc ủ gúp phn phỏt trin nn sn xut khoai tõy nc ta[7] Trong s phỏt trin ca Cụng ngh sinh hc hin ủi thỡ cụng ngh t bo trn ủó m ủng khc phc hin tng trờn Cụng ngh ny ủó ủc Wenzel (1979) ủ xut thụng qua s ủ, ủú l bng cỏch gim ủ bi xung mt na (2n=2x=24), sau ủú chn lc cỏ th lng bi mang cỏc ủt tớnh mong mun v cui cựng l dung hp t bo trn hai t bo th lng bi ủó chn lc ủ to ging khoai tõy t bi (tetrapoloid) ủó t hp ton b ủc tớnh mong mun ca hai th lng bi Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip S ủ to ging khoai tõy s dng tng hp k thut: Lai to, nuụi cy ht phn, nhõn ủụi nhim sc th v dung hp t bo trn (Wenzel v cng s, 1979) a1*a2a3a4 Cỏc dũng t bi ủu a1a2* a3a4 a1a2a3* a4 a1a2a3a4* (4x) To dũng nh bi nh k thut parthenogenetic Chn lc (2x) a1*a a2*a a3*a a4 * a To dũng ủn bi bng nuụi cy ht phn - nh bi hoỏ to 2x Chn lc (2x) a1*a1* ì a2*a2* a*1a*2 Dũng t bi vi ủc tớnh a3*a3* ì (+) a4*a4* a*3a*4 a1*a2*a3*a4* ủnh hng ủó t hp a: B genom ủn bi *: c tớnh mong mun Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 4.7.1.5 Thớ nghim 5: Nghiờn cu nh hng ca nng ủ Ca2+ b sung vo mụi trng nuụi cy Trong cỏc nghiờn cu dung hp trờn, cỏc protoplast sau dung hp ủc nuụi cy trờn 24a hoc 24b (hai mụi trng thớch hp nht cho mụi trng cy ti to thnh v phõn chia protoplast) nhng chỳng tụi ủó vp phi khú khn nh lng t bo v tng lờn sau 2-3 ngy nuụi cy, s phõn chia ca cỏc t hp lai sau dung hp xy khụng ủng ủu v quỏ trỡnh ny xy vi tc ủ chm, thi gian phõn chia ngn Theo quan ủim ca chỳng tụi nng ủ Ca2+ mụi trng nuụi cy protoplast sau dung hp bng hoỏ cht PEG ngoi tỏc dng kớch thớch tỏi to thnh t bo, kớch thớch t bo phõn chia, Ca2+ cũn cú tỏc dng hp thu PEG cũn sút li sau quỏ trỡnh trỏnh gõy ủc cho t bo Vỡ vy vic tỡm nng ủ Ca2+ thớch hp ủ b sung vo mụi trng nuụi cy t hp protoplast sau dung hp l rt cn thit 1000mg/l Ca2+ 2000mg/l Ca2+ 1500mg/l Ca2+ Hỡnh 13: S phõn chia ca protoplast ca dũng B208 trờn cỏc mụi trng nuụi cú b sung nng ủ Ca2+ khỏc Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 62 Chỳng tụi tin hnh b sung Ca (NO3)2 cỏc nng ủ khỏc vo mụi trng nuụi cy ca B208, sau ngy thỡ thu ủc hỡnh nh phõn chia: Bng 11: S phõn chia ca protoplast ca dũng B208 trờn cỏc mụi trng nuụi cú b sung nng ủ Ca2+ khỏc Nng ủ Ca2+ 500mg/l Ca2+ 1000mg/l Ca2+ 1500mg/l Ca2+ 2000mg/l Ca2+ 4 4 Mụi trng 24a 24b Trong thớ nghim ta ủó xỏc ủnh ủc hai mụi trng 24a v 24b l hai mụi trng thớch hp nht cho nuụi cy protoplast Tuy nhiờn trờn nn hai mụi trng ny, ta thay ủi nng ủ Ca2+ (b sung Ca (NO3)2) cho ta s thay ủi rừ rng v thi gian phõn chia ca cỏc t hp lai dung hp cng nh ci thin cht lng phõn chia ca cỏc protoplast trờn hai mụi trng ny - Cỏc protoplast phõn chia din nhanh, ủng ủng, t l protoplast phõn chia cao - Mụi trng 24a thỡ cú s khỏc bit rừ rt thay ủi nng ủ Ca2+ v nng ủ Ca2+ 1500mg/1 cng cho hiu qu phõn chia cao nht (ch sau ngy nuụi cy ủó cú hin tng phõn chia) Mc dự nng ủ Ca2+ ny trờn mụi trng 24b cho thi gian phõn chia lõu hn so vi 24a nhng cỏc t bo phõn chia ủng ủu hn - nng ủ Ca2+ 500mg/1 v 1000mg/1 cho thi gian phõn chia chm nht (sau ngy), cỏc t hp sau dung hp phõn chia khụng ủng ủu, lng t bo b v sau ngy nuụi cy tng so vi thi ủim bt ủu nuụi cy iu ny cú th khng ủnh thờm vai trũ ca nng ủ Ca2 mụi trng nuụi cy sau dung hp Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 63 24a sau ngy 24b sau ngy 24a sau tun 24b sau tun Hỡnh 14: S phõn chia ca protoplast ca dũng B208 sau 3ngy v sau tun nuụi cy Sau tun nuụi cy trờn mụi trng ny thỡ protoplast phõn chia v hỡnh thnh cỏc cm t bo cú kớch thc ln õy l mt bc tin quan trng, v cng l bc ngot ủ chỳng tụi cú th tin hnh bc tip theo ủú l chuyn sang mụi trng microcallus Khỏc hn vi cỏc nghiờn cu trc ủõy cỏc t bo phõn chia ch dng li mc phõn chia ca tng protoplast, sau mt thi gian nuụi cy cỏc t bo ny cú hin tng cht hỡnh thnh cỏc cn xỏc t bo Kt lun: Trờn hai mụi trng 24a v 24b cú b sung 1500mg/l Ca2+ l hai mụi trng thớch hp ủ nuụi cy protoplast sau dung hp bng hoỏ cht PEG T ủú chỳng tụi xõy dng quy trỡnh dung hp bng PEG nh sau: Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 64 100 l Hn hp d d protoplast ca loi 25àl PEG 22,5%, phỳt Sau phỳt PEG Ra ln bng dd Ca2+ 20 phỳt, ln bng mt 24a ,20 phỳt Sau tun cy chuyn sang mt OX5 Nuụi trờn mt 24a +1500mg/lCa2 B sung 1-2 git mt 24a sau ngy Sau ngy nuụi cy Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 65 PHN V KT LUN V NGH 5.1 KT LUN S thay ủi t l ca M/C cú nh hng rừ rt ủn hiu sut tỏch Protoplast Vi mi dung dch enzym khỏc cho ta hiu sut tỏch protoplast khỏc nhau: dung dch enzym I phự hp cho vic tỏch protoplast ca cỏc ging A56, B186, H34, A41 V B208, dung dch enzym II phự hp cho vic tỏch protoplast ca ging H195, dung dch enzym III phự hp cho vic tỏch protoplast ca ging A15, A16 ó xỏc ủnh ủc thi gian enzym thớch hp cho tng ging (A15 l 14h, B186 l 15h, H195 l 14h, A56 l 14h, A16 l 14h) ó tỡm phng phỏp kh trựng mụi trng nuụi thớch hp nht l phng phỏp lc vụ trựng ó tỡm mụi trng nuụi thớch hp ủ nuụi cy protoplast sau tỏch l 24a, 24b ó tỡm mụi trng thớch hp ủ kớch thớch to microcallus l mụi trng OX5 ó xỏc ủnh ủc phng thc cy chuyn thớch hp nht ủ cỏc protoplast phõn chia v to microcallus l: Protoplast sau tỏch ủc nuụi cy trờn mụi trng 24a hoc 24b lng; c sau tun b sung thờm 1-2 git mụi trng nuụi; nuụi búng ti 24-25oC; Sau 3-4 tun thỡ cy chuyn sang mụi trng cng OX5 microcallus (mi dũng khỏc thỡ cú thi gian cy chuyn khỏc nhau) ủó xỏc ủnh ủc quy trỡnh ca dung hp protoplast bng hoỏ cht PEG vi cỏc thụng s sau: - Mt ủ protoplast dung hp l 2,75.106 t bo/1ml Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 66 - Nng ủ PEG dung hp protoplast l 2,25% - Thi gian PEG: phỳt - Phng phỏp PEG sau dung hp: ln bng dung dch Ca2 + ln bng mụi trng nuụi - Sau dung hp bng hoỏ cht PEG thỡ protoplast sau dung hp s ủc nuụi trờn 24a v 24b ci tin (b sung 1500mg Ca(NO3)2) 5.2 ngh Do thi gian thc cú hn, hn na k thut tỏch v dung hp protoplast l mt lnh vc mi m Vờt Nam cho nờn cũn nhiu ủ chỳng tụi cha ủi sõu nghiờn cu ủc Vỡ vy chỳng tụi ủ ngh: - Tip tc tin hnh nuụi cy, dung hp bng PEG ủ thu ủc lai tỏi sinh Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 67 Tài liệu tham khảo Phần tiếng việt Hồ Hữu An (2005) Cây có củ kỹ thuật thâm canh khoai tây NXB Lao động x hội Đỗ Kim Chung (2003) Thị trờng khoai tây Việt Nam NXB văn hoá thông tin Nguyễn Quang Thạch (1993) Một số biện pháp khắc phục thoái hoá giống khoai tây (Solanmun tuberosum.L) Đồng Bắc Bộ Luận văn Phó tiến sỹ khoa học Nông nghiệp Nguyễn Quang Thạch, Nguyễn Thị Lý Anh, Nguyễn Thị Phơng Thảo (2005) Giáo trình Công nghệ sinh học Nông Nghiệp NXB Nông nghiệp Fao 2001 Fao/ESS 2005 Nguồn từ Internet: http://faostat.fao.org,/site/340/default.aspx http/www.pnas.orb/chi/content/full/1.02/41 /1.4694 http://www.gtz.de/vietnain/projects/projects rural vgppp vn.htm-22k http//www.rauhoaquavietnaln._v_il/default.as~x?tabID=5&Q31 &Lang ID_-1 &NewsID=3235 http://www.lcinhtenoilt),thon.com.vn/Story/quocte/2008/419989.htinl http://vietbao.vn/Suc-khoe/Khoai-tay-dau-chi-la-thucpham/30202252/248/ http://vietbao.vii/Suc-khoe/Khoai-tay-Nguon-bo-stub-dinh-duont;cao/45128943/248/ Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 68 Phần Tiếng Anh Butenko.R.G and Kuchko (1980) Somatic hybridization of Solanum tuberosum and Solanum chacoense Bitt by protoplast fusion Advances in protoplast research, pergainon press of ford.293-330 Chaput.M.H; Sihach Kr.D; Ducreux.G et al (1990) Somatic hybrid plants produce by electrofusion between dihaploid potatoes BF 15(H1), Aminca (H6) and Cardinal (H3) Plant Cell Rep 9.411-414 10 Cooking et al (1960) A method for isolation of plant protoplast and vacuoles Nature 187.333 336 11 Davey et al ( 1972) Uptake of bacteria by isolated higher plant protoplast Nature 239, 455 456 12 Deim Ling S; Wenzel G (1988) Somatic fusion for breeding tetraploid potatoes Plant Breeding 101.181-189 13 Haberlach et al (1985) Isolation culture and regeneration of plantsn from potato an several related Solanum species Plant Sci 39 208 212 14 Cheng, J.; Saunders, J.A.; Sinden, S.L.1995.Colorado potato beetle resistant somatic hybrid potato plants produced via protoplast electrofusion In vitro Cell Dev Biol.31:90-95 15 Karlsson, S.B.; Eriksson,T.1988 Somatic hybridization between anther derived dihaploid lines of Solanum tuberosum L (Potato) Current plant Science and Biotechnology in Agriculture 7:197 198 16 Mollres, C.; Wenzel, G.1992 Somatic hybridization of dihaploid potato protoplats as a tool for potato breeding Bot Acta 105: 133 139 17 Richara E.Veilleux et al (1998) Protoplast fusion for the production of intermonoploid somatic hybridization cultivated Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 69 potato Blacksburg.Vigrinia Matteij.W.M and Puite.K.J(1992) Tetraploid potato Hybrid through protoplast fusion and analysis of their performance in the Field Theor Appl.Genet 83 18 Thach,N.Q.; Frei, U.; Wenzel,G.1993 Somatic Fusion for combining virus resistance in solanum tuberosum L Theor Appl Genet 85:836-867 19 waara, S.; Tegelstrom, H.; Wallin, A.; Eriksson, T.1989 Somatic Hybridization between anther Derived dihaploid clones of potato (Solanum tuberosum L.) and the identification of hybrid plants by isozyme analysis Theor Appl Genet 77:49-56 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 70 Phụ lục Thành phần môi trờng lỏng nuôi cấy protoplast Môi trờng SKM Hoá chất (mg/l) SKM KNO3 1990 MgSO4.7H2O 350 CaCl2.H2O 600 KCl 300 KH2PO4 680 Na2-EDTA 40 H3BO3 MnSO4 7H2O 10 ZnSO4 7H2O Na2MO4 7H2O 0.25 CuSO4 H2O 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 Kl 0.75 Sacarose 10000 Glucose 10000 Mannitol 40000 Sorbitol 250 Ribose 250 Xylose 250 Mannose 250 Rhamnose 250 Fructise 250 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 71 Cellobiose 250 Inositol 50 Na- Pyruvat Fumarsaure Ciyronensaure Maleinsaure Ca-Pantothenat 0.5 Cholincholorid 0.5 Ascorbinsaure Nicotinamid PyridoxinHCl 0.5 ThianinHCl Aminobenzoesaure 0.01 Folsaure 0.2 Biotin 0.005 VitaminA VitaminD3 VitaminB12 Riboflavin 0.1 2,4D NAA Zeatin BAP 0.4 Caseinhydrolysat 250 BSA 2000 Nớc dừa 22 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 72 Môi trờng KM8P Hoá chất (mg/l) SKM NH4NO3 H3BO3 CaCl2 2H2O CoCl2 6H2O CuSO4 7H2O 600 453 0.025 0.025 Na2-EDTA FeSO4 7H2O 37.25 27.85 MgSO4 MnSO4.2H2O Molybdic acid 146.55 10 0.25 KCl Dl 300 0.75 KNO3 KH2PO4 1900 170 ZnSO4 7H2O P-Aminobenzoic acid L- Ascorbic Biotin D-Calcium pantothenat Choline chloride Folic acid Myo-Inositol 0.02 0.01 1 0.4 100 Nicotinamide Pyrodoxine HCl 1 Riboflavin Thiamine HCl 0.2 Vitamin A Vitamin B12 Glucose 0.01 0.02 68400-100000 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 73 Môi trờng 24a, 24b Hoá chất (mg/l) 24a 24b 1500 1500 KH2PO4 50 50 MgSO4 150 150 CaCl2 500 500 NaFeEDTA 10 10 MnSO4 12.5 12.5 ZnSO4 5 H3BO3 2.5 2.5 Kl 0.25 0.25 Na2MoO4 0.125 0.125 CoCL2 0.0125 0.0125 CuSO4 0.0125 0.0125 Glycine 2 Nicotinamid 2 Thiamine HCl 10 10 Pyridoxine HCl 2 Sucrose 10000 10000 Glucose 30000 30000 Sorbitol 40000 40000 NAA 0.05 Zeatin 0.1 MES 250 250 Inositol 100 50ml/l 250 250 Ca(NO3)2.4H2O Nớc dừa Lactanbumin Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 74 Thành phần dung dịch tách protoplast Tên dung dịch Thành phần - Đa lợng, vi lợng vitamin theo MS - Riêng nồng độ NH4NO3 150mg/l -11g/100ml Sucrose Dung dịch enzyme (Mollers) - 1g/100ml polivynylpyrrolidon (PVP) - 0.125g/100ml BSA - 0.2g/100ml Macerozym -0.8g/100ml Cellulose - 0.8g/100ml MES - Muối khoáng vitamin theo MS Dung dịch tráng - Riêng nồng độ NH4NO3 150mg/l - 110g/1 sucrose - Muối khoáng vitamin theo MS Dung dịch rửa - Riêng nồng độ NH4NO3 150mg/l - 17g/l NaCl Dung dịch rửa II -9.1g/100ml Mannitol - 0.01g/1CaCl2 Thành phần dung dịch PEG Hoá chất PEG 22.5% PEG25% PEG30% PEG 40% 16.875 18.75 30 60 Sucrose 1.8 3.2 Glucose 5.4 CaCl2.2H2O 0.15 0.167 0.267 0.375 KH2PO4 0.01 0.011 0.0178 (g/100ml) PEG6000 Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 75 Thành phần dung dịch rửa dung hợp Hoá chất PEG 22.5% PEG25% PEG30% PEG 40% CaCl2.2H2O 0.74 0.74 0.74 0.97 Glycine 0.38 0.38 0.38 Sucrose 11 11 11 - Glucose 7.2 NaOH 1.2 DMSO 1ml (g/100ml) Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun thc s khoa hc nụng nghip 76 [...]... vách tế bào (Pojinar, 1967) Tế bào trần phân lập từ mô cà chua đợc khảo sát chi tiết đầu tiên quá trình cung cấp enzym để phục hồi trở lại vách tế bào (Pojinar,1967) Mặc dù báo cáo đầu tiên về enzym phân lập tế bào trần đợc công bố vào năm 1960 (Cooking, 1960){11} nhng m i đến 10 năm sau sự phân chia tế bào đầu tiên từ tế bào trần mới đợc báo cáo) Nagata và Takebe, 1970){20}: Thí nghiệm khảo sát tế bào. .. sinh sản ổn định tế bào trần lá ngũ cốc Thành công chỉ đạt đợc trong mời năm gần đây trong việc tái tạo cây nguyên vẹn từ tế bào trần lúa, cô lập không phải từ lá nhng từ dịch nuôi cấy tế bào (Abdullah, 1986) Thành công ban đầu khi lấy tế bào trần của cây thuốc lá và cây Pectunia để tái tạo vách tế bào rồi trải qua sự phân chia để tạo thành mô sẹo, sau đó phân hoá thành cơ quan để tạo thành rễ và chồi... b-glucurionidase Rất hữu ích khi so sánh một vài tính chất chuyển nạp của tế bào trần thực vật và tế bào động vật Thật vậy, sự thúc đẩy để định lợng tính khả thi chuyển DNA trực tiếp vào tế bào thực vật, đặc biệt là tế bào thực vật đ đợc loại bỏ vách tế bào băng enzym nh trong trờng hợp tế bào trần thực vật, từ các báo cáo nuôi cấy mô tế bào động vật cho thấy có khả năng chọn và biểu hiện một nhóm gen và... thu và tích hợp ADN, cô lập nhân và nhiễm sắc thể từ tế bào trần (Bajaj, 1989) Việc khám phá ra tế bào trần có thể bị nhiễm bởi virus khảm thuốc lá (Cooking và Pojinar, 1969) kích thích sự quan tâm về vấn đề hấp thu vào hệ thống tế bào trần, mà đỉnh điểm là sự biểu hiện của Plasmid Ti trong vi khuẩn Agrobacterium gây khối u, đợc đa vào tế bào trần để biến đổi tế bào trần, cung cấp bằng chứng đầu tiên... đợc 6 12 triệu tế bào trần Nguyên tắc chung của phơng pháp này là sử dụng hỗn hợp enzym: Xelluloza, hemixelluloza và pectinaza để phân giải thành tế bào và giải phóng các tế bào trần Một nguyên tắc cơ bản là sau khi thành tế bào đợc tách ra, tế bào trần phải đợc phóng thích ngay vào môi trờng có áp suất thẩm thấu cao để tránh nớc xâm nhập vào không bào gây vỡ tế bào chất Nồng độ chất tạo áp suất thẩm... gen vào tế bào trần thực vật tơng tác với DNA; đó là các bằng chứng chứng tỏ rằng các mẫu DNA lớn có thể đa vào và biểu hiện ở tế bào động vật (Allshire, 1987) Trọng tâm của mọi thảo luận của các nghiên cứu tế bào trần đến tế bào và sinh học phân tử là các vấn đề của phạm vi nghiên cứu nh vậy đ cải thiện kiến thức của chúng ta về phát triển của sinh học thực vật Nh chúng ta đ thấy, tế bào trần có thể... 1975) nên tế bào trần đợc sử dụng rộng r i trong nhiều lĩnh vực thí nghiệm, từ nghiên cứu những tính chất vật lý của màng sinh chất (Ruesink, 1973) đến những nghiên cứu nhập bào và hấp thu những phần tử (Willison, 1971), các bào quan ( Potrykus, 1975) và vi sinh vật (Davey, 1972){7} Giai đoạn chính trong sự phục hồi trở lại của tế bào trần trong môi trờng nuôi cấy nguyên vẹn là quá trình tổng hợp và phát... 08 lần trồng bằng củ giống khoai tây Thờng Tín Năm 2002, diện tích khoai tây trong toàn tỉnh khoảng 15.000 ha {33} Do nhu cầu thị trờng tăng lên và do tiến bộ kỹ thuật đợc áp dụng trong sản xuất khoai tây đ làm cho năng suất khoai tây tăng lên Cây khoai tây ở Việt Nam đ thực sự đợc chú trọng phát triển Cả nớc hiện còn khoảng 200.000 ha đất có thể trồng đợc khoai tây ở các vùng nh đồng bằng Sông Hồng,... cho tế bào trần để từ đó dẫn đến việc tạo ra đợc các loại rau, ngũ cốc chuyển gen cũng nh các vụ thu hoạch cây trồng bằng chuyển nạp trực tiếp Trng i hc Nụng nghip H Ni Lun vn thc s khoa hc nụng nghip 19 ADN cho tế bào trần bao gồm các loại lúa chuyển gen (chuyển nạp bằng xung điện vào tế bào trần lúa) có khả năng sinh sản (Zang,1988) Những nghiên cứu trên cây lúa chuyển gen minh hoạ vai trò của tế bào. .. lá tái tạo nhanh chóng vách tế bào mới và khoảng 60 80% số vách tế bào mới đ phân cắt tế bào trong môi trờng nuôi cấy Mô sẹo đợc hình thành thúc đẩy sự tạo thành cành non rồi sau đó là cây thuốc lá nguyên vẹn (Takebe, 1971) Cùng thời gian đó, Kao (1974){16} cũng quan sát sự tái tạo và phân chia tế bào trần của cây đậu nành trong môi trờng nuôi cấy Và đến cuối năm 1970 thì nó đ trở thành quy trình trong ... nghip 15 2.5 Giới thiệu chung protoplast 2.5.1Khái niệm tế bào trần (protoplast ): Tế bào trần (protoplast) tê bào vi khuẩn tế bào thực vật bị tách bỏ thành tế bào nhờ phơng pháp vật lý enzym,... lại tế bào trần môi trờng nuôi cấy nguyên vẹn trình tổng hợp phát sinh trở lại vách tế bào (Pojinar, 1967) Tế bào trần phân lập từ mô cà chua đợc khảo sát chi tiết trình cung cấp enzym để phục. .. phóng thích tế bào trần đầu rễ lông hút ủ môi trờng có enzym khoảng phút có khoảng 10% tế bào trần phân chia để tạo tập đoàn tế bào mà sau tạo đợc chồi non Cây tái tạo có kiểu hình tế bào bình thờng,