BỘ GIÁO DỤC VÀ ðÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT VIỆN KHOA HỌC NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM - - VŨ THUÝ NGA NGHIÊN CỨU BỆNH HÉO RŨ DƯA HẤU VÀ VI SINH VẬT ðỐI KHÁNG VỚI KÝ SINH GÂY BỆNH Ở MỘT SỐ TỈNH PHÍA BẮC LUẬN VĂN THẠC SĨ NÔNG NGHIỆP Chuyên ngành: Bảo vệ thực vật Mã số: 60.62.10 Người hướng dẫn khoa học: PGS.TS NGUYỄN VĂN VIẾT HÀ NỘI – 2008 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………2 LỜI CAM ðOAN Tôi xin cam ñoan ñây công trình nghiên cứu với giúp ñỡ tập thể cán nghiên cứu thuộc Bộ môn Vi sinh vật -Viện Thổ nhưỡng Nông hoá Các số liệu kết nêu luận văn trung thực chưa ñược công bố công trình khác Tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm số liệu luận văn Hà Nội, tháng năm 2008 Tác giả Vũ Thuý Nga Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………3 LỜI CẢM ƠN Trước hết, xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS Nguyễn Văn Viết, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam ñã nhiệt tình hướng dẫn thực ñề tài hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn lãnh ñạo Bộ môn Vi sinh vật, Viện Thổ nhưỡng Nông hoá, toàn thể anh chị em cán công nhân viên Bộ môn ñã tạo ñiều kiện thuận lợi nhiệt tình giúp ñỡ trình thực ñề tài Tôi xin cảm ơn Phòng ðào tạo Sau ñại học-Viện Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp Việt Nam (trước ñây) Ban ðào tạo Sau ñại học, Viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam toàn thể thầy cô giáo ñã tận tình giúp ñỡ, dạy bảo suốt trình học tập thực ñề tài Cuối xin cảm ơn gia ñình bạn bè ñồng nghiệp ñã ñộng viên, khuyến khích, giúp ñỡ thời gian thực ñề tài Hà Nội, tháng năm 2008 Tác giả Vũ Thuý Nga Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………4 MỤC LỤC Trang phụ bìa Trang Lời cam ñoan…………………………………………………………… CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Lời cảm ơn……………………………………………………………… 2.1.lục………………………………………………………………… Vật liệu nghiên cứu……… Mục Nguồn mẫucác dùng cứu Danh 2.1.1 mục ký hiệu, chữtrong viết nghiên tắt………………………………… Vi bảng……………………………………………………… sinh vật ñối kháng Danh 2.1.2 mục Giống hấu Danh 2.1.3 mục hìnhdưa ……………………………………………………… 2.1.4 Môi trường nuôi cấy vi sinh vật MỞ ðẦU 2.2 Nội dung nghiên cứu………………………………………… Tính cấp thiết ñề tài 2.3 Phương pháp nghiên cứu Mục tiêu ñề tài 2.3.1 Phương pháp ñiều tra mức ñộ gây hại bệnh héo rũ Ý nghĩadưa khoa hấuhọc thực tiễn ñề tài ðối tượng, phạm vi ñiểm cứu 2.3.2 Phương pháp thuñịa thập mẫunghiên bệnh héo rũ………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆUnhân VÀ gây CƠbệnh…………… SỞ KHOA HỌC 2.3.3 Phương pháp xác ñịnh nguyên CỦA ðỀ TÀI Phương 1.1.2.3.3.1 Cơ sở khoa họcpháp ñể ñề ẩm tài ………… Phương pháp phân lậpnăng nấm gây mẫudưa câyhấu bệnh 1.2.2.3.3.2 Tình hình sản xuất tiềm phátbệnh triểntừcây 2.3.3.3 Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh 1.3 Bệnh héo rũ trồng …………… 2.3.4 Phương pháp lây bệnh nhân tạo ñể xác ñịnh nguyên nhân 1.3.1.Bệnh héo rũ nấm Fusarium …………… gây bệnh 2.3.5 Phương pháp xác ñịnh tên tác nhân gây bệnh 1.3.2 Bệnh héo rũ vi khuẩn 2.3.6 Phương pháp nghiên cứu vi sinh vật ñối kháng 1.3.3 héopháp rũ dưa khả hấu thí nghiệm ñối kháng vi sinh vật 2.3.7 Bệnh Phương ñối kháng với tác nhân gây bệnh 1.4 Vi sinh vật ñối kháng 2.3.7.1 Thí nghiệm ñánh giá khả kiểm soát bệnh héo rũ viñối sinh vật ñối kháng kháng 1.4.1 Nấm 2.3.7.2 Thí nghiệm ñánh giá ảnh hưởng vi sinh vật ñối kháng 1.4.2 Vi ñối kháng ñếnkhuẩn trồng khả sống sót chúng 1.5 Mối quan hệ quần thể vi sinh vật chế hoạt ñộng ñất Phương vi sinh vật ñốixác kháng 2.3.8 pháp ñịnh tên vi sinh vật ñối kháng 2.3.8 Phương pháp xử lý số liệu 1.5.1 Mối quan hệ quần thể vi sinh vật CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận sỹ khoa nghiệp ………………………5 1.5.2 Cơ chế hoạt ñộng củavănvithạc sinh vật học ñốiNông kháng 3.1 ðiều tra mức ñộ nhiễm bệnh héo rũ triệu chứng héo rũ pháp dưa hấu 1.6 Biện sinh học sử dụng vi sinh vật ñối kháng công tác bảo vệ thực vật 36i ii 36 iii 36 vi 36 vii 36 ix 36 36 36 3 36 37 37 37 37 38 10 38 12 39 16 40 20 41 22 41 24 26 42 43 29 44 29 45 30 45 33 3.1.1 ðiều tra mức ñộ nhiễm bệnh héo rũ dưa hấu số tỉnh phía Bắc 3.1.2 Thu mẫu bệnh dưa hấu héo rũ………… 3.1.3 Triệu chứng bệnh héo rũ dưa hấu 3.2 Nghiên cứu xác ñịnh tác nhân gây bệnh héo rũ dưa hấu 3.2.1 Phân lập, nuôi cấy tác nhân gây bệnh 3.2.2 ðặc ñiểm hình thái tác nhân gây bệnh héo dưa hấu…… 3.2.3 Lây nhiễm nhân tạo ñể khẳng ñịnh tác nhân gây bệnh…… 3.2.4 Xác ñịnh tên tác nhân gây bệnh…………………………… 3.3 Phân lập, tuyển chọn ñánh giá hoạt tính sinh học vi sinh vật ñối kháng…………………………………………… 3.3.1 Thu thập, phân lập tuyển chọn vi sinh vật ñối kháng…… 3.3.2 ðặc ñiểm sinh học vi sinh vật ñối kháng 3.3.3 Hình thái khuẩn lạc tế bào vi sinh vật ñối kháng 3.3.4 Hoạt tính sinh học vi sinh vật ñối kháng 3.3.5 Một số yếu tố ảnh hưởng ñến sinh trưởng phát triển vi sinh vật ñối kháng 3.4 Nghiên cứu xác ñịnh tên vi sinh vật ñối kháng……………… 45 52 54 55 5 56 59 60 61 61 64 65 68 70 3.4.1 Dòng 5.1………………………………………………… 3.4.2 Dòng M 3.4.3 Dòng B17 3.4.4 Dòng Tri1 3.4.5 Dòng Tri2 76 76 77 78 78 79 3.5 Nghiên cứu khả kiểm soát bệnh héo rũ dưa hấu vi sinh vật ñối kháng 80 3.5.1 Ảnh hưởng vi sinh vật ñối kháng ñến khả kiểm soát bệnh héo rũ dưa hấu 3.5.2 Ảnh hưởng vi sinh vật ñối kháng ñến sinh trưởng dưa hấu 80 82 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận Kiến nghị 86 86 87 TÀI LIỆU THAM KHẢO 88 PHỤ LỤC Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………6 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT Chữ viết tắt Chữ viết ñầy ñủ BVTV Bảo vệ thực vật CFU (colony forming unit) ðơn vị hình thành khuẩn lạc cs Cộng CLA Môi trường CLA FAO Tổ chức Nông lương giới f.sp (forma specialis) Dạng chuyên tính G+ Gram dương NA Môi trường NA PDA Môi trường PDA SPA Môi trường SPA STT Số thứ tự TCN Tiêu chuẩn ngành TLB Tỉ lệ bệnh TTC Triphenyl Tetrazolium Caseinhydrolysate TWA Môi trường TWA VSV Vi sinh vật Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………7 DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 1.1 Tình hình sản xuất dưa hấu giới năm 2004……… 1.2 Giá trị sản lượng dưa hấu số nước giới……………… 3.1 Tỉ lệ (%) dưa hấu bị bệnh héo rũ số tỉnh phía Bắc 47 năm 2007 3.2 Diễn biễn bệnh héo rũ dưa hấu ñồng ruộng huyện Vĩnh 50 Tường, Vĩnh Phúc (vụ Xuân-Hè 2007) 3.3 Tình hình bệnh héo rũ dưa hấu huyện Yên Lạc, Vĩnh Phúc năm 51 2007………………………………………………………………… 3.4 Số lượng mẫu bệnh thu thập ñịa phương ………… 53 3.5 Các dòng nấm ñược phân lập từ mấu bệnh……… … 58 3.6 Kết lây nhiễm bệnh nhân tạo dưa hấu……………………… 59 3.7 Danh sách vi sinh vật ñối kháng ñược phân lập từ ñất………… 62 3.8 Các dòng vi sinh vật ñối kháng nấm gây bệnh héo dưa hấu………… 64 3.9 ðặc ñiểm sinh học vi sinh vật ñối kháng…………………… 65 3.10 ðặc ñiểm khuẩn lạc, tế bào vi sinh vật ñối kháng… ……… 66 3.11 Hoạt tính sinh học vi sinh vật ñối kháng…………………… 68 3.12 Ảnh hưởng pH tới trình sinh trưởng phát triển vi sinh 70 vật ñối kháng………………………………………………………… 3.13 Ảnh hưởng nhiệt ñộ tới trình sinh trưởng phát triển 71 vi sinh vật ñối kháng 3.14 Ảnh hưởng O2 ñến sinh trưởng phát triển vi sinh vật ñối 72 kháng …………………… ………………………………………… 3.15 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng phát triển vi khuẩn M Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………8 73 3.16 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng phát triển 74 vi khuẩn 5.1 3.17 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng phát triển 74 vi khuẩn B17 3.18 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng phát triển 75 nấm Tri1 3.19 Ảnh hưởng môi trường nuôi cấy ñến sinh trưởng phát triển 75 nấm Tri2 3.20 Ảnh hưởng vi sinh vật ñối kháng ñến khả kiểm soát bệnh 81 héo rũ dưa hấu 3.21 Ảnh hưởng vi sinh vật ñối kháng ñến số khả tích luỹ 83 chất khô dưa hấu ñất khử trùng vụ Thu 2007 3.22 Khả sống sót vi sinh vật ñối kháng ñất …………… Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………9 84 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình Tên hình Trang 3.1 Ruộng dưa hấu bị héo rũ Hoà Bình 46 3.2 Tỉ lệ (%) dưa hấu bị héo rũ tỉnh phía Bắc vụ Xuân 49 2007………………………………………………………………… 3.3 Tỉ lệ (%) dưa hấu bị héo rũ huyện Yên Lạc, Vĩnh Phúc năm 51 2007………………………………………………………………… 3.4 Cây dưa hấu bị bệnh héo rũ 53 3.5 Biểu bệnh héo rũ thân, rễ dưa hấu……………………… 54 3.6 Biểu bệnh héo rũ lát cắt ngang ñoạn thân dưa hấu………… 55 3.7 Một số dòng nấm gây héo rũ dưa hấu môi trường PDA……… 56 3.8 Bào tử nhỏ nấm gây bệnh héo rũ dưa hấu chụp kính hiển vi với 57 ñộ phóng ñại x 40…………………………………………………… 3.9 Bào tử lớn nấm gây bệnh héo rũ dưa hấu chụp kính hiển vi với 57 ñộ phóng ñại x 40….………………………………………………… 3.10 Thí nghiệm lây nhiễm bệnh nhân tạo dưa hấu 60 3.11 Khuẩn lạc vi khuẩn ñối kháng……………………………… 67 3.12 Hình dạng tế bào vi khuẩn ñối kháng…………………………… 67 3.13 ðặc ñiểm hình thái nấm ñối kháng………………………………… 68 3.14 Khả ñối kháng vi sinh vật môi trường nhân tạo… 69 3.15 Thí nghiệm vi sinh vật ñối kháng dưa hấu……………………… 82 3.16 Thí nghiệm ảnh hưởng vi sinh vật ñối kháng ñến dưa hấu MỞ ðẦU Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………10 84 Tính cấp thiết ñề tài Dưa hấu (Citrullus lanatus) thuộc họ Bầu bí (Cucurbitaceae) loại có vỏ cứng, chứa nhiều nước, có nguồn gốc từ miền nam châu Phi Dưa hấu ñược xem loại trái phổ biến ñời sống hàng ngày có giá trị dinh dưỡng cao ðặc biệt tiết trời trở nên oi bức, nóng nực, dưa hấu ngon ngọt, dễ ăn mà cung cấp cho thể lượng nước lớn, nhiều vitamin nguyên tố vi lượng quý giá Hơn nữa, y học cổ truyền ruột vỏ dưa hấu ñược dùng làm thuốc chữa bệnh (Viện Thông tin Y dược Việt Nam, 2007)[40] Hiện dưa hấu loại trái nhiệt ñới Việt Nam phù hợp với nhu cầu người tiêu dùng nước giới, nên có triển vọng xuất cao Dưa hấu 16 loại trái tươi ñầu tiên Việt Nam ñược Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn gửi danh sách ñể phía Mỹ xem xét cấp phép nhập năm 2006 (Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 2006)[2] Mặt khác, dưa hấu trồng có giá trị kinh tế cao thích hợp với nhiều loại ñất Trong trình chuyển ñổi cấu trồng, ñưa dưa hấu luân canh với lúa ñã thực trở thành trồng hiệu quả, góp phần tăng thêm thu nhập cho người nông dân số tỉnh Hải Dương, Hoà Bình, Vĩnh Phúc, Bắc Giang… ðiều kiện khí hậu nhiệt ñới nóng ẩm nước ta thuận lợi cho loại bệnh phát sinh loại trồng nói chung, riêng ñối với dưa hấu Tại vùng trồng dưa hấu nào, dịch bệnh ñối tượng gây hại quan trọng làm hạn chế phát triển sản xuất làm giảm suất dưa hấu Trong số bệnh hại, ñáng ý bệnh héo rũ dưa hấu gây hại nghiêm trọng nhiều nơi, làm cho dưa hấu bị chết hàng loại, suất giảm sút, gây thiệt hại kinh tế cho người nông dân Bệnh héo rũ dưa hấu có hầu hết vùng nhiệt ñới cận nhiệt ñới Bệnh có phổ chủ rộng biện pháp phòng trừ hạn chế Các giải pháp chọn Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………11 khuẩn Pseudomonas solanacearum số ký chủ miền Bắc Việt Nam, Các công trình nghiên cứu nghiên cứu sinh, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, trang 273-278 28 Phạm Chí Thành (1988), Phương pháp thí nghiệm ñồng ruộng, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 29 Thông tin Khoa học tỉnh Lâm ðồng (1993), Số 30 Thông tin Khoa học Công nghệ Hoà Bình (2004), Số 31 Trần Thị Thanh Thuỷ, Nguyễn Thu Hà, Nguyễn Ngọc Quyên, ðinh Duy Kháng (2002), “Phân lập, tuyển chọn, xác ñịnh loài vi khuẩn thuộc chi Pseudomonas có khả sinh IAA, ức chế vi khuẩn gây bệnh héo xanh lạc”, Tuyển tập công trình Khoa học kỹ thuật Nông nghiệp 2001-2002, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, trang 243-251 32 Phạm Văn Toản (2003), “Khả sử dụng hỗn hợp vi sinh vật làm phân bón chức cho số trồng nông nghiệp, công nghiệp lâm nghiệp”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, 127-131 33 Phạm Văn Toản, Trương Hợp Tác (2004), Phân bón vi sinh vật nông nghiệp, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 34 Phạm Văn Toản (2005), “Khả kiểm soát bệnh héo xanh vi khuẩn phân bón vi sinh vật ña chủng, chức năng”, Khoa học công nghệ nông nghiệp phát triển nông thôn 20 năm ñổi mới, tập 1, trang 255-265 35 Vi Anh Tuấn (1999), “Một số kết nghiên cứu sử dụng vi sinh vật chống bệnh héo xanh vi khuẩn hại lạc ”, Kết nghiên cứu Khoa học Nông nghiệp năm 1998, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, trang 195-201 36 Nguyễn Văn Tuất (1997), “Phương pháp chuẩn ñoán giám ñịnh bệnh nấm bệnh vi khuẩn hại trồng”, Phương pháp nghiên cứu Bảo vệ thực vật, tập 1, trang 58-78 37 Nguyễn Văn Tuất (2002), Kỹ thuật chuẩn ñoán giám ñịnh bệnh hại trồng, Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………97 Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội 38 Phạm Văn Ty, ðào Thị Lương (2003), “Khả sinh kháng sinh chống vi khuẩn gây bệnh héo xanh Streptomyces arabicus 112”, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc, 145-149 39 Nguyễn Văn Viết, Phan Duy Hải (2002), “Nghiên cứu tiềm tích luỹ nguồn nấm vi khuẩn héo xanh gây chết lạc ñất dốc ñồi núi khả hạn chế quản lý dịch hại tổng hợp Thanh Hà, Kim Bôi, Hoà Bình 2001- 2002”, Tuyển tập công trình Khoa học Kỹ thuật Nông nghiệp 20012002, Nhà xuất Nông nghiệp, Hà Nội, trang 120-127 40 Viện Thông tin Y dược Việt Nam (2007), Báo Sức khoẻ ñời sống phát hành ngày 30 tháng 10 41 http://www.bacgiang.gov.vn 42 http:// www.vnexpress.net 43 http://www.haiduong.gov.vn 44 http://khcnhoabinh.gov.vn 45 http:// www.vinhphuc.gov.vn TIẾNG ANH 46 Agrios G.N (1988), Plant Pathology, 3rd ed Academic Press, New York 47 Andre K Gonsalves, Stephen A Ferreira (1993), Fusarium oxysporum, University of Hawaii, Mannoa 48 Aspiras R.B., Cruz, A.R de la (1985), “Potential biological control of bacterial wilt in tomato and potato with Bacillus polymyxa FU6 and Pseudomonas fluorescens”, Bacterial wilt disease in Asia and the South Pacific Proceedings of an International Workshop held at PCARRD, Los Banos, Philippines, 8-10 October (Ed by Persley, G.J.) ACIAR Proceedings 13, 89-92 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………98 49 Baker K.F., Cook R.J (1985), Plant Pathogen Control, Freeman, San Francisco 50 Barea L.E (2005), “Microbial co-operation in the rhizosphere”, Journal of experimental Botany, Vol 56, No 417, pp 1761-1778 Published by Oxford University Press 51 Burgess, L.W., Liddell, C.M and Summerell, B.A (1988), Laboratory Manual for Fusarium Research Second Edition, The University of sydney, Autralia 52 Bruce C (1993), “Carton, genetic improvement of boisecticides based on the insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis”, Proceeding of the 2nd Canberra Bacillus thuringiensis meeting 53 Carol Miles (2005), Icebox Watermelons, Crop Production, Vegetable and Extenston, Washington State University, USA 54 Chae Gun Phae, Makoto Shoda and Nobuhiro Kita (1992), “Control of crown, root rot and bacterial wilt of tomato by Bacillus subtilis NB22”, Phytopath Soc Japan, 58, 329-339 55 Chris Gunter (2005), Vegetable Crops Hotline, A newsletter for commercial vegetable growers, Purdue University Cooperative Extension Service, Indian 56 Dirk W.Muntean (1995), Beneficial soil microorganisms, Soil and Plant Laboratory Inc, Bellevue, WA 57 Dolly Carr (1983), Fusarium Species, Printed in the United States of America 58 Gao Xue-wen, Yao Shi-yi, Huong Pham, Joachim Vater and Wang Jin-sheng (2004), “Lipopeptide antibiotics produced by the engineered strain Bacillus subtilic GEB3 and detection of its bioactivity”, Agricultural Sciences in China, 3(3), 192-197 59 Hamish Robertson (2004), "Citrullus lanatus", Watermelon, Tsamma Iziko Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………99 Museums of Cape town 60 Han Chet, Ada Viterbo, Michal Shoresh (2004), Plant Biocontrol by Trichoderma spp., Nature Microbiol, Rev.2, pp 43-56 61 Handelsman J., Stabb E.V (1996), Biocontrol of soilborne plant pathogens, Plant cell, Vol.8, No.10, pp 1885-1869 62 He L.Y., Sequeira L and Kelman A (1983), “Characteristic of trains of Pseudomonas solanacearum from China”, Plant disease, 67, 1357 – 1362 63 Jetiyanon K and Kloepper J.W (2002), “Mixture of plant growth-promoting rhizobacteria for induction of systemic resistance against multiple plant diseases”, Biological Control, 24, 285-291 64 Jian - Hua Guo, Hong-Ying Qi, Ya-Hui Guo, Hong-Lian Ge, Long-Ying Gong, Li-Xin Zhang and Ping-Hua Sun (2003), “Biocontrol of tomato wilt by plant growth-promoting rhizobacteria”, Copyright@2003 Published by Elsevier Science (USA) 65 Johannes, S.-M Tschen (2003), Control of plant pathogenic fungus Rhizoctonia solani by microorganisms, Department of Botany, National Chung Hsing University, Taiwan, Republic of China 66 Jones, J.P., J.B Jones, and W Miller (1982), Fusarium wilt on tomato, Fla Dept Agric & Consumer Serv., Div of Plant Industry Plant Pathology Circular No 237 67 Kansas State University (2002) Fusarium wilt of watermelon, Ned tisserat Extension Specialist, Plant Pathology 68 Keith Seifert (1996), “Fusarium Interactive Key”, Fuskey, Agriculture - Agri Food Canada, pp 17-21 69 Kelman A (1997), “One Hundred and one Years of Research on Bacterial Wilt”, Bacterial Wilt Disease, Springer, INRA editions, pp1-6 70 Kimura N (1990), “Bacillus subtilic strain and prevention of aflatoxin Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………100 contamination in cereals and nuts”, U.S Patent NO 4.931.398 71 Loeffler, W., Tschen, J S.-M., Vanittanakom, N., Kugler, M., Knorpp, E., Hsieh, T -F and Wu, T.-G (1986), “Antifungal effects of bacilysin and fengymycin from Bacillus subtilis F-29-3 A comparison with activities of other Bacillus antibiotics”, Journal of Phytopathology 115, pp 204-213 72 Martin Alexander (1976), Introduction to Soil Microbiology, Printed in the United States of America 73 Nelson, P.E, Tousoun, T.A and W.F.O Marassas (1983), Fusarium speciesAn illustrated manual for identification, The Pennsylvania State University Press, London, England 74 Onkar D.Dhingra, James B.Sinclair (1995), Basic plant pathology methods, Lewis Publishers, CRC Press, Inc, Printed in the United States of America 75 Opgenorth D.C and Endo R.M (1983), “Evidence that Antagonistic Bacteria Suppress Fusarium Wilt of celery in Neutral and Alkaline Soil”, The America Phytopathological Society, USA, Vol 73, No.5, pp 703-707 76 Phillip Chung (2002), Fusarium Wilt Disease in Watermelon, Canteloupe and Honeydew Melons, Rural Agricultural Development Authority, Hope gardens, Kingston 6, Jamaica 77 Prior P H., Allen C., Elphinstone J.(1997), Bacterial Wilt Disease Molecular and Ecological Aspects, Springer, INRA editions 78 Robertson, Hamish (2005), "Citrullus lanatus (Watermelon, samma)." Museums Online South Africa Retrieved Mar 15 79 University of California (2005), UC IPM Pest Management Guidelines: Cucurbits Fusarium Wilt (Watermelon), UC ANR Publication 3445 80 University of Illinois (1988), Fusarium Wilt of Watermelon and Muskmelon, Reports on Plant Disease, RPD No 904 81 Raabe, R.D., I.L Conners, and A.P Martinez (1981), Checklist of plant Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………101 diseases in Hawaii: including records of microorganisms, principally fungi, found in the state, Hawaii Institute of Tropical Agriculture and Human Resources (CTAHR), Information Text Series 022 313 pp 82 Rifai M.A (1974), A Revision of the genus Trichoderma, Herberium Bogoriense, Bogor, Java, Indonesia 83 Richard M Riedel, Sally A Miller, Randall C Rowe (1996), Fusarium Wilt of Vine Crops, FactSheet Extention, HYG-3113-96 84 Roger Shivas, Dean Beasley, John Thomas, Andrew Geering, Ian Riley (2005), Management of plant pathogen Collection, Commonwealth of Australia 85 Rupela O.P., Gopalakrishnan S., Krajewski M., Sriveni M (2003), “A novel method for the identification and enumeration of microorganisms with potential for suppressing fungal plant pathogens”, Biol Fertil Soils, Verlag (39), pp 131-134 86 Sauer J.D (1993), Historical geography of crop plants- a select roster, CRC Press, Boca Raton, Florida 87 Smith, I.M., J Dunez, D.H Phillips, R.A Lelliott, and S.A Archer, eds (1988), European handbook of plant diseases, Blackwell Scientific Publications Oxford, 583 pp 88 Smith J., Putnam A., Nair M (1990), “In vitro control of Fusarium diseases of Asparagus officinalis L with a Streptomyces or its polyene antibiotic, faerifungin”, Journal of Agricultural and Food Chemistry, Michigen State University, USA, 38(8), pp 1729-1733 89 Trigalet (2002), “Biological control of bacterial wilt caused by Pseudomonas solanacearum”, Journal of General Plant Pathology, 68, pp 125-231 90 Tschen, J S.-M (1987), “Control of Rhizoctonia solani by Bacillus subtilis”, Tansactions of the Mycological Socity of Japan 28, pp 483-493 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………102 91 Tschen, J S.-M and Lee, Y.-Y (1985), “Isolation of an antibiotic of a hyperparasite of fungi”, Gliocladium deliquescens, Chinese Bioscience 25, pp 19-25 92 Tschen, J S.-M and Kou, W.-L (1985), “Antibiotic inhibition and control of Rhizoctonia solani by Bacillus subtilis”, Plant Protection Bulletin (Taiwan, R.O.C.) 27, pp 93-101 93 Tsutomu Hattori (1973), Microbial Life in the soil an introduction, Tohoku University, Sendai, Japan 94 "Watermelon- Wikipedia, the encyclopedia" 2006, (http://en.wikipedia.org/wiki/watermelon) 95 Wu, W S., Liu, S D., Chang, Y C and Tschen, J S.-M (1986), “Hyperparasitic relationships between antagonists and Rhizoctonia solani”, Plant Proction Bulletin 28, pp 91-100 96 http://www.faostat.fao.org PHỤ LỤC Phụ lục Môi trường nuôi cấy vi sinh vật Môi trường khoai tây - ñường - agar (PDA): ðây môi trường tốt cho phân lập phát triển nấm Rửa khoai tây (không gọt vỏ) Cắt khoai tây thành miếng nhỏ luộc khoảng giờ, sau ñó lọc khoai tây nước luộc rây (hoặc vải màn) vứt bỏ phần bã ñi Có thể dùng máy xay sinh tố ñể xay nát hỗn hợp Hòa tan ñường dextrose (glucose) agar vào lít nước máy với nước lọc khoai tây Hấp khử trùng 121°C 20 phút Môi trường PDA Khoai tây 200 g Dextrose (glucose) 20 g Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………103 Agar 20 g Nước máy lít Môi trường agar - nước máy (TWA): môi trường phổ biến ñể phân lập nhiều loài nấm Trộn agar nước hấp 121°C 20 phút Môi trường TWA Agar 20 g Nước máy lít Môi trường Carnation leaf agar (CLA): môi trường dễ dàng quan sát nhận biết bào tử nấm Lá cẩm chướng ñược khử trùng tia gamma bổ sung vào môi trường có thành phần agar nước máy ñã ñược khử trùng 121°C 20 phút Môi trường King B - agar (KBA): ðây môi trường tốt ñể phân lập vi khuẩn hại nói chung ñặc biệt Erwinia spp ðiều chỉnh pH ñến 7,2 hấp khử trùng 121°C 25 phút Môi trường KBA Proteose peptone 20 g Glycerol 10 g K2HPO4 (khan) 1,5 g MgSO4.7H2O 1,5 g Agar 15 g Nước cất lít Môi trường Nutrient agar (NA): Là môi trường ñược sử dụng ñể nuôi cấy vi khuẩn ðiều chỉnh pH ñến 7,4 hấp khử trùng 121°C 15 phút Môi trường NA Chất chiết nấm men 3g Peptone 5g Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………104 NaCl 5g Agar 15 g Nước cất lít Môi trường Sucrose peptone agar (SPA): Là môi trường thích hợp cho phát triển nhiều loại vi khuẩn, sử dụng ñể phân lập vi khuẩn hại ðiều chỉnh pH 7,2 – 7,4 hấp khử trùng 121°C 15 phút Môi trường SPA Sucrose 20 g Peptone 5g K2HPO4 (khan) 0,5 g MgSO4.7H2O 0,25 g Agar 12 g Nước cất lít Môi trường Czapeck: Là môi trường thích hợp cho phát triển nhiều loại nấm, sử dụng ñể phân lập nấm ñối kháng Môi trường Czapeck Saccharosa 30 g NaNO3 2g KCl 0,5g FeSO4 0,01g K2HPO4 1g MgSO4.7H2O 0,5 g Agar 12 g Nước cất lít Môi trường Triphenylytetrazolium Caseinhydrolysate agar (TTC agar): Là môi trường sử dụng ñể phân lập vi khuẩn hại ðiều chỉnh pH 7,0 hấp khử trùng Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………105 121°C 15 phút Bổ sung 2,3,4 Triphenylytetrazolium 0,05g (Sau hấp môi trường) Môi trường TTC agar Glucose 5g Peptone 10 g Caseinhydrolysate 1g 2,3,4 Triphenylytetrazolium 0,05g Agar 12 g Nước cất lít Môi trường King : ðây môi trường tốt ñể phân lập, nuôi cấy vi khuẩn ñối kháng ðiều chỉnh pH ñến 7,2 hấp khử trùng 121°C 25 phút Môi trường King Peptone 5g Glycerin 10 g K2HPO4 0,5 g MgSO4.7H2O 0,5 g Agar 15 g Nước cất lít Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………106 Phụ lục Phương pháp phân lập tác nhân gây bệnh * Phương pháp khử trùng mặt phân lập nấm bệnh Phương pháp giúp loại bỏ ký sinh gây bệnh phát triển tốt ñặt ñiều kiện thích hợp Các Bước tiến hành sau: - Rửa mẫu bệnh vòi nước - Dùng cồn 70% rửa mẫu bệnh có nấm phụ sinh bám - Cắt lấy mô thực vật sạch, mẫu bệnh khô nên nhúng vào nước cất vô trùng làm mềm lại - Cho mảnh mô vừa cắt vào dung dịch khử trùng (HgCl2, 0,1%) thời gian từ 2-3 phút tùy thuộc vào vật liệu - Lấy mảnh mô rửa lại nước cất vô trùng (tất ñều phải tiến hành ñiều kiện vô trùng) - ðặt mảnh mô vào môi trường TWA (môi trường aga + nước cất) quan sát hàng ngày phát triển nấm bệnh (Chú ý sau cấy xong, ñặt ngược ñĩa Petri ñể tránh ñọng nước bề mặt môi trường cấy nuôi cấy 25°C) - Khi nấm ñã phát triển dài ra, cách mô bệnh 1-2 cm, lấy phần ñầu sợi nấm cấy truyền sang môi trường thích hợp (PDA, Czapeck) - Quan sát nấm gây bệnh kính hiển vi * Phương pháp phân lập vi khuẩn gây bệnh Các Bước tiến hành sau: - Rửa phần bị bệnh vòi nước chảy ñể loại bỏ ñất, bụi sinh vật lẫn tạp - Khử trùng cách nhúng mẫu bệnh thật nhanh vào dung dịch natri hypochlorite 10%, sau ñó rửa lại nước vô trùng - Cắt vết bệnh thành mẩu nhỏ phần mô bệnh mô khỏe, sau ñó ñặt mẫu lên lam kính tiệt trùng ñã nhỏ sẵn giọt nước vô trùng ðối với mô bệnh dày nên dùng que cấy dao cấy xé nhỏ sau ñặt vào giọt nước vô trùng Dùng lamen vô trùng ñặt lên miếng mẫu bệnh kiểm tra Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………107 kính hiển vi với ñộ phóng ñại 400 lần Nếu vết bệnh vi khuẩn gây nên ta nhìn thấy ñám vi khuẩn chuyển ñộng từ vết cắt Khi nhìn thấy dịch vi khuẩn chuyển ñộng từ vết cắt, bỏ lamen dùng que cấy vi khuẩn với ñầu que cấy hình vòng tròn cấy dịch vi khuẩn lên môi trường agar thích hợp - Cấy vi khuẩn cách dùng que cấy vi khuẩn chứa dịch vi khuẩn vạch vạch lên bề mặt agar cho phân lập ñược khuẩn lạc riêng biệt - ðĩa phân lập nên ñặt ngược ñể tránh ñọng nước bề mặt môi trường nuôi cấy nhiệt ñộ 25-28oC - Cấy truyền khuẩn lạc riêng rẽ, tốt lên loại môi trường ñể ống nghiệm Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………108 Phụ lục Phân loại nấm bệnh phương pháp sinh học phân tử * Hỗn hợp phản ứng PCR theo Sugita Nakase 10X Buffer 10µl dNTP mixture 16µl Mồi xuôi 2µl Mồi ngược 2µl TaqTm 1.2 µl Mẫu ADN ( 50 ng) µl Nước cất ñến 100µl * Kiểm tra sản phẩm PCR ñiện di ðun tan 1% agaroza (dung dịch 50X TAE: 2ml, nước cất: 98 ml, agaroza: 1g) ñể ấm, ñổ vào khuôn, ñợi cho nguội ñặt gel vào máy ñiện di, ngập 300ml dung dịch X TAE Trộn µl dung dịch 6X loading buffer với µl mẫu trộn ñều, nhỏ vào giếng Chạy ñiện di dòng ñiện chiều với ñiện 100V, cưòng ñộ dòng ñiện 80 mA 30 phút, bỏ ngâm dung dịch EtBr (nồng ñộ 0,5 µl/ml) 20 phút vớt Quan sát máy soi gel * Bộ kit QIA (Invitrogen, ðức ) + Thêm dung dịch PB vào mẫu theo thể tích 3:1 Trộn ñều, ñưa vào cột, ly tâm 13.000 v/p 30 giây + ðổ bỏ dịch phía cột + Bổ sung 500 µl PE lên cột Ly tâm 13.000 v/p 30 giây + ðổ bỏ dịch cột + Ly tâm tiếp 13.000 v/p phút + Chuyển cột sang ống eppendoft + Thêm 30µl nước ðể nhiệt ñộ phòng phút + Ly tâm13.000 v/p phút + Lấy dịch phía Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………109 * Bộ kít ABI PRISM Cycle sequencing ñệm 5X sequence (Perkin-Elmer Applied Biosystem) với hỗn hợp phản ứng sau : Terminator Ready Reaction Mix µl Mẫu ADN sau PCR 200 ng/ml Mồi µl Nước cất ñủ ñến 20µl *Tinh sản phẩm cho sequencing: Mẫu ñược chuyển sang ống eppendoft 1,5 ml Thêm 5ml EDTA 1,25 M, thêm 60 ml ethanol 100% Trộn thật nhẹ nhàng Giữ nhiệt ñộ phòng 15 phút Ly tâm 15.000 v/ph 15 phút ðổ bỏ dịch phía Rửa 100 ml ethanol 70% Ly tâm 15.000 v/ph 10 phút Làm khô mẫu băng máy cô quay chân không 3-5 phút Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………110 Phụ lục Số lượng mẫu ñất ñược thu thập, phân lập STT ðịa ñiểm lấy mẫu Nguồn gốc mẫu Số lượng mẫu Bắc Giang (Yên Dũng, 16 ðất trồng dưa hấu 37 ðất trồng dưa hấu 12 ðất trồng dưa hấu, ớt, cà Tân Yên) Hòa Bình (Lạc Thuỷ, Yên Thủy, Lạc Sơn, Kim Bôi ) Hải Dương (Gia Lộc) chua, rau Vĩnh Phúc (Mê Linh, Yên 29 Lạc, Vĩnh Tường, Tam ðất trồng dưa hấu, rau màu ðảo) Hà Tây (Thường Tín) 16 ðất trồng rau màu cà chua, khoai tây, hành Tổng số 110 Trường ðại học Nông nghiệp Hà Nội – Luận văn thạc sỹ khoa học Nông nghiệp ………………………111 [...]... biện pháp sinh học trong phòng chống bệnh hại cây trồng nói chung, cây dưa hấu nói riêng ở ñiều kiện Vi t Nam chúng tôi tiến hành ñề tài: "Nghiên cứu bệnh héo rũ dưa hấu và vi sinh vật ñối kháng với ký sinh gây bệnh ở một số tỉnh phía Bắc" 2 Mục tiêu của ñề tài - Xác ñịnh mức ñộ thiệt hại và triệu chứng do bệnh héo rũ gây ra trên cây dưa hấu - Xác ñịnh nguyên nhân chủ yếu gây bệnh héo rũ cây dưa hấu góp... ñịnh hướng cho vi c xây dựng các biện pháp phòng trừ bệnh hiệu quả ở các vùng trồng dưa hấu phía Bắc - Xác ñịnh ñược một số vi sinh vật ñối kháng với ký sinh gây bệnh làm cơ sở khoa học cho vi c nghiên cứu, sản xuất chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh 3 Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ñề tài - Cung cấp số liệu, thông tin làm cơ sở cho những nghiên cứu tiếp theo về bệnh héo rũ trên dưa hấu - Xác ñịnh... những chủng vi sinh vật ñối kháng với tác nhân gây bệnh héo rũ dưa hấu, mở ra triển vọng phát triển kiểm soát sinh học bệnh héo rũ trong sản xuất ðóng góp vào lý luận và thực tiễn về khả năng sử dụng vi sinh vật ñối kháng như một tác nhân sinh học trong công tác bảo vệ thực vật - Góp phần vào ñịnh hướng cho vi c nghiên cứu, phát triển các sản phẩm sinh học sử dụng trong vi c hạn chế bệnh héo rũ gây ra trên... chế bệnh héo rũ gây ra trên cây dưa hấu nói riêng và cây trồng nói chung 4 ðối tượng, phạm vi và ñịa ñiểm nghiên cứu - ðối tượng nghiên cứu: Bệnh héo rũ trên cây dưa hấu và vi sinh vật ñối kháng tác nhân gây bệnh héo rũ - Phạm vi nghiên cứu: Nghiên cứu cơ bản trong phòng thí nghiệm, thí nghiệm nhà lưới - ðịa ñiểm nghiên cứu: ðề tài ñược thực hiện tại Bộ môn Vi sinh vật - Vi n Thổ nhưỡng Nông hoá Trường... dụng các vi sinh vật ñối kháng là một trong những hướng chính của biện pháp sinh học trừ bệnh hại cây trồng, Trong tự nhiên, hiện tượng ñối kháng nhau rất phổ biến ở các vi sinh vật ñất Vi sinh vật ñối kháng là nhóm vi sinh vật rất quan trọng của hệ vi sinh vật ñất Chúng là những yếu tố sinh thái mạnh quyết ñịnh sự hình thành và phát triển hệ vi sinh vật ở vùng rễ cây trong ñất Vi sinh vật ñối kháng vùng... liệu về cơ sở khoa học của biện pháp sinh học trừ bệnh hại cây trồng (Baker, 1985)[49] Ở trong nước các sản phẩm sinh học, chế phẩm vi sinh vật phòng trừ bệnh cây trồng ñã ñược nghiên cứu từ nhiều năm nay, có ý nghĩa quan trọng trong vi c bảo vệ môi trường và phát triển nền nông nghiệp bền vững Do vậy, nghiên cứu về vi sinh vật ñối kháng vi sinh vật gây bệnh héo rũ dưa hấu kết hợp với một số phương pháp... Vi sinh vật ñối kháng là một hoặc một nhóm các vi sinh vật có quan hệ ñối kháng với một hoặc một nhóm vi sinh vật khác ðó là mối quan hệ tương tác giữa các vi sinh vật trong cùng môi trường sống, một hoặc một nhóm vi sinh vật này bị một hoặc một nhóm vi sinh vật khác kìm hãm sự phát triển hoặc bị tiêu diệt thông qua các sản phẩm trao ñổi chất ñộc hại của chúng như chất kháng sinh, axit hữu cơ, enzym,... TÀI LIỆU VÀ CƠ SỞ KHOA HỌC CỦA ðỀ TÀI 1.1 Cơ sở khoa học của ñề tài Cây trồng nói chung, dưa hấu nói riêng bị nhiều loài vi sinh vật gây hại Vi sinh vật gây hại xâm nhập vào cây và gây nên rối loạn sinh lý ở cây, làm cây bị huỷ hoại từng phần hoặc gây nên ảnh hưởng toàn bộ cây, làm cây giảm năng suất hoặc chết không cho thu hoạch Vi sinh vật gây hại sống ở dưới ñất thường xâm nhập vào cây gây nên triệu... ñã chỉ ra vi khuẩn gây héo bí xanh là do Erwinia tracheiphila chứ không phải do vi khuẩn Ralstonia solanacearum gây ra Vi khuẩn Erwinia tracheiphila có thể gây bệnh cho các cây họ bầu bí như bí ngô, dưa chuột, dưa hấu 1.3.3 Bệnh héo rũ cây dưa hấu Theo Chris Gunter (2005)[55] bệnh héo rũ dưa hấu do nấm ñược phát hiện ñầu tiên ở một vài nơi thuộc miền Nam Ấn ðộ Nấm gây bệnh cây dưa hấu không lan ra cả... bệnh sẽ giảm sự gây bệnh Ngăn chặn nguồn bệnh bởi các vi sinh vật ñối kháng là kết quả của một hoặc một số cơ chế phụ thuộc vào hoạt tính ñối kháng Sự tác ñộng trực tiếp ñối với nguồn bệnh bao gồm sự cạnh tranh xâm lấn về nơi cư trú, cạnh tranh về nguồn dinh dưỡng các bon và nitơ, sản sinh ra các chất ức chế mầm bệnh như kháng sinh, axit HCN phá huỷ sự phát triển nguồn bệnh, hoặc ký sinh vi sinh vật