ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC Hà Nội – Năm 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU Chuyên ngành : Hoá Phân Tích Mã số : 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: PGS.TS NGUYỄN VĂN RI Hà Nội – Năm 2015 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm LỜI CẢM ƠN! Sau thời gian học tập nghiên cứu hoàn thành luận văn cao học với đề tài: “Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu” dƣới hƣớng dẫn, bảo PGS.TS Nguyễn Văn Ri thầy cô, anh chị em, bạn môn Hóa phân tích Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin chân thành cảm ơn PGS.TS Nguyễn Văn Ri, ngƣời giao đề tài tận tình dẫn trình hoàn thành luận văn Tôi xin chân thành cảm ơn tất quý Thầy Cô môn hóa Phân tích khoa Hóa học trƣờng Đại học Khoa học Tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt trình làm luận văn Tôi xin chân thành gửi lời cảm ơn đến ThS Nguyễn Công Tuấn – phòng máy HPLC tạo điều kiện giúp đỡ trình hoàn thành luận văn Cuối xin chân thành cảm ơn toàn thể anh chị, bạn phòng thí nghiệm Hoá phân tích, bạn cao học K23 giúp đỡ thời gian thực đề tài Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN! MỞ ĐẦU .1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN .3 1.1 Khái quát chung hợp chất glycoside tim 1.1.1 Cấu tạo, tên gọi 1.1.2 Tác dụng hợp chất glycoside tim 1.1.3 Liên quan cấu trúc tác dụng 1.1.4 Tính chất glycoside tim 10 1.1.5 Phân bố tự nhiên 12 1.1.6 Một số loại thuốc chứa glycoside tim 13 1.2 Khái quát digoxin digitoxin 13 1.2.1 Digoxin 14 1.2.2 Digitoxin .15 1.3 Các phƣơng pháp xác định glycoside tim 15 1.3.1 Phƣơng pháp sắc kí xác định glycoside tim 15 1.3.2 Phƣơng pháp khác xác định glycoside tim 17 1.3.3 Phƣơng pháp chiết tách glycoside tim khỏi mẫu thực 20 1.3.4 Phƣơng pháp định tính định lƣợng .21 CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 23 2.1 Mục tiêu đối tƣợng nghiên cứu 23 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu 23 2.1.2 Đối tƣợng nghiên cứu .23 2.2 Chất chuẩn, hoá chất, thiết bị 24 2.2.1 Chất chuẩn 24 2.2.2 Hoá chất 24 2.2.3 Thiết bị, dụng cụ 24 2.3 Phƣơng pháp phân tích 25 2.3.1 Phƣơng pháp xử lý mẫu 25 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 2.3.2 Phƣơng pháp phân tích 26 2.4 Thực nghiệm 26 2.4.1 Khảo sát điều kiện tối ƣu 26 2.4.2 Xây dựng đƣờng chuẩn 27 2.4.3 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng .27 2.4.4 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 29 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 3.1 Tối ƣu hoá điều kiện chạy sắc ký 30 3.1.1 Van bơm mẫu 30 3.1.2 Cột tách 30 3.1.3 Detector 31 3.1.4 Bƣớc sóng hấp thụ cực đại glycoside tim .31 1.1.5 Khảo sát chọn thành phần pha động tốc độ dòng 32 3.1.6 Khảo sát độ lặp lại thiết bị .39 3.1.7 Điều kiện tối ƣu cho trình phân tích glycoside tim 40 3.2 Đƣờng chuẩn glycoside tim 42 3.2.1 Khảo sát phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất .42 3.2.2 Dựng đƣờng chuẩn 43 3.2.3 Giới hạn phát giới hạn định lƣợng 45 3.3 Đánh giá phƣơng pháp phân tích 46 3.3.1 Đánh giá độ lặp lại phƣơng pháp phân tích 46 3.3.2 Đánh giá hiệu suất thu hồi phƣơng pháp 47 3.4 Phân tích mẫu thực tế .48 KẾT LUẬN .52 TÀI LIỆU THAM KHẢO 52 Tiếng Việt: .53 Tiếng Anh: .53 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm DANH MỤC HÌNH VẼ Hình 3.1: Phổ UV glycoside tim .32 Hình 3.2: Sắc đồ tách glycoside tim tỉ lệ dung môi pha động khác 37 Hình 3.3: Sắc đồ tách glycoside tim tốc độ dòng pha động khác 38 Hình 3.4: sắc đồ digoxin điều kiện tối ƣu 40 Hình 3.5: Sắc đồ digitoxin điều kiện tối ƣu .41 Hình 3.6: Sắc đồ tách chất glycoside tim ở điều kiện tối ƣu 42 Hình 3.8: Đƣờng chuẩn 02 glycoside tim nghiên cứu luận văn 45 Hình 3.9: Sắc đồ mẫu thực 51 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm DANH MỤC BẢNG BIỂU Bảng 1.1: Tên gọi, công thức cấu tạo số glycoside tim [21] Bảng 2.2: Nồng độ dung dịch chuẩn glycoside tim 24 Bảng 3.1: Khảo sát tỉ lệ pha động digoxin 34 Bảng 3.2: Khảo sát tốc độ pha động digoxin 34 Bảng 3.3: Khảo sát tỉ lệ pha động digitoxin .35 Bảng 3.4: Khảo sát tốc độ pha động digitoxin 35 Bảng 3.5: Độ lặp lại thời gian lƣu Glycoside tim 39 Bảng 3.6: Độ lặp lại diện tích píc Glycoside tim 40 Bảng 3.7: Các dung dịch đƣờng chuẩn .44 Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu đƣợc glycoside tim 44 Bảng 3.9: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng Glycoside tim 45 Bảng 3.10: Giới hạn phát giới hạn định lƣợng phƣơng pháp 46 Bảng 3.12: Hiệu suất thu hồi glycoside tim 48 Bảng 3.13: Kết thu đƣợc mẫu 49 Bảng 3.14: Kết thu đƣợc mẫu 49 Bảng 3.15: Kết thu đƣợc mẫu 49 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ CÁI VIẾT TẮT ACN: Acetonitrin DD: dung dịch HPLC: High performance liquid chromatography LC-MS: liquid chromatography – spectrometry LOD: Limit of detection LOQ: Limit of quantity RP-HPLC: Reversed-phase performance liquid chromatography RSD: Relative standard deviation PDA: Photo-diode – array SD: Standard deviation UV: Ultraviolet UV- VIS: Ultraviolet visible Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm MỞ ĐẦU Ra đời từ sớm phƣơng pháp sắc kí lỏng – lỏng đƣợc phát triển mạnh vào cuối kỉ 20 Vào năm 1970, sắc kí đƣợc phát triển mạnh đạt đƣợc thành tựu đáng kể nhƣ tách đƣợc hỗn hợp chất giống nhƣ nguyên tố đất hiếm, ankaloid, hydrocacbon mẫu dầu Ngày nhiều cải tiến đƣợc thực để nâng cao độ nhạy phƣơng pháp, nhƣ sử dụng pha tĩnh mới, detector có độ nhạy cao HPLC (sắc kí lỏng hiệu cao) kỹ thuật thiếu phân tích để quản lí mảng chất phân tích mà phƣơng pháp khác đáp ứng đƣợc Với việc áp dụng đƣợc cho nhiều loại đối tƣợng chất phân tích, từ không phân cực nhƣ: chất thơm PAHs, axit béo, dƣợc phẩm (digoxin, gitoxin, diginatin,…), mẫu sinh học phân tích lâm sàng (theobromine, theophilline, ) đến phân cực nhƣ: axit amin, phenol,…, phƣơng pháp RP – HPLC – UV ( RP – HPLC: sắc kí lỏng hấp phụ pha ngƣợc - Reversed-phase performance liquid chromatography) có độ nhạy tốt, độ chọn lọc cao hiệu tách cao, pic cân đối Thêm vào pha động thƣờng hỗn hợp nƣớc dung môi phân cực nên rẻ tiền, kinh tế Đây phƣơng pháp thành công [6,7] Glycoside tim nhóm chất bắt đầu đƣợc sử dụng y học bác sĩ ngƣời Anh - Withering vào năm 1985, glycoside tim có vị trí quan trọng thuốc điều trị bệnh tim Trong số nhiều loại glycoside tim có tự nhiên digoxin digitoxin đƣợc sử dụng rộng rãi điều trị suy tim sung huyết, loạn nhịp tim đƣợc nghiên cứu nhiều Tuy nhiên các chất glycoside tim thƣờng độc, sử dụng hàm lƣợng cho phép dẫn đến ngộ độc, chí dẫn tử vong cho ngƣời [18] Chính cần xác định xác hàm lƣợng glycoside tim loại thuốc để đƣa vào điều trị đạt hiệu cao không sử dụng liều ảnh hƣởng tới sức khỏe ngƣời tiêu dùng đƣợc trọng Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Yêu cầu đặt phải có phƣơng pháp phù hợp định lƣợng glycoside tim dƣợc liệu, dƣợc phẩm cách nhanh chóng xác Việc ứng dụng phân tích HPLC vào phân tích thuốc dƣợc phẩm đƣợc làm nhiều giới nhƣng Việt Nam tƣơng đối mẻ chƣa có nhiều công trình lĩnh vực Chính lí xin lựa chọn thực đề tài “Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu” Trong đề tài sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector PDA để định lƣợng số glycoside tim dƣợc phẩm dƣợc liệu Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 3.1.7.2 Điều kiện tối ưu cho trình phân tích digitoxin  Cột tách: cột C18 inertsil ODS-3 250mm × 2,1mm × 5µm  Detector :PDA  Bƣớc sóng hấp thụ: 225 nm  Nhiệt độ cột 30oC  Tốc độ dòng 0,7 ml/phút  Thành phần pha động: ACN/H2O 60/40  Thể tích van bơm mẫu: 20 µl Và hình ảnh sắc đồ nó: 7.377 mAU(x10) 225nm4nm (1.00) 8.0 Độ hấp thụ, mAu 7.0 Digitoxin 6.0 5.0 4.0 3.0 5.483 5.764 4.683 4.907 0.0 4.512 3.332 1.0 3.688 2.0 -1.0 0.0 1.0 2.0 3.0 4.0 5.0 6.0 7.0 8.0 9.0 Thời gian, phút Hình 3.5: Sắc đồ digitoxin điều kiện tối ƣu 3.1.7.3 Điều kiện tối ưu cho trình tách hỗn hợp glycoside tim  Cột tách: cột C18 inertsil ODS-3 250mm × 2,1mm × 5µm  Detector :PDA  Bƣớc sóng hấp thụ: 225 nm  Nhiệt độ cột 30oC  Tốc độ dòng 0,7 ml/phút  Thành phần pha động: ACN/H2O 55/45  Thể tích van bơm mẫu: 20 µl Và dƣới sắc đồ điều kiện tối ƣu 41 Bùi Thị Tâm 4.383 mAU(x10) 5.5 225nm,4nm (1.00) 9.224 Luận văn thạc sĩ 5.0 4.5 4.0 3.5 Digitoxin Digoxin 3.0 2.5 2.0 1.5 0.5 0.0 5.689 2.446 1.0 3.445 3.665 4.084 Độ hấp thụ, mAu -0.5 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Thời gian, phút Hình 3.6: Sắc đồ tách chất glycoside tim ở điều kiện tối ƣu 3.2 Đƣờng chuẩn glycoside tim 3.2.1 Khảo sát phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ chất Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ khảo sát qua dung dịch chuẩn glycoside đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc 1000ppm (trình bày bảng 2.1) Các dung dịch đƣợc pha với nồng độ 10, 20, 50, 100, 150, 200, 300, 400 ppm (định mức dung dịch pha động điều kiện tối ƣu) cho glycoside tim Mỗi dung dịch đƣợc bơm lần hệ sắc kí, kết đƣợc biểu diễn hình 3.7: 4000000 3500000 Diện tích pic 3000000 Digoxin 2500000 2000000 1500000 1000000 500000 0 50 100 150 200 250 300 350 Nồng độ chất, ppm 42 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm 6000000 Diện tích pic 5000000 4000000 Digitoxin 3000000 2000000 1000000 0 100 200 300 400 500 Nồng độ chất, ppm Hình 3.7: Sự phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ glycoside tim Qua kết ta thấy, glycoside tim có phụ thuộc diện tích pic nồng độ khác Cụ thể, với digoxin diện tích pic tỉ lệ tuyến tính với nồng độ tới nồng độ khoảng 150pm, nồng độ lớn hơn, diện tích pic không tuyến tính Còn với digitoxin diện tích pic tỉ lệ tuyến tính vào nồng độ khoảng nồng độ rộng (khoảng 200ppm), Lớn nồng độ này, diện tích pic không tuyến tính 3.2.2 Dựng đường chuẩn Chúng dựa vào kết qủa khảo sát phụ thuộc diện tích pic nồng độ mục 3.2.1 để tiến hành dựng đƣờng chuẩn glycoside Các dung dịch đƣờng chuẩn 100 ppm, 70ppm, 50ppm đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc 1000 ppm, dung dịch chuẩn từ 5ppm đến 30 ppm đƣợc pha từ dung dịch chuẩn gốc 100ppm Tất dung dịch đƣờng chuẩn đƣợc pha loãng sử dụng pipetman, định mức 10ml dung môi pha động điều kiện tối ƣu Sau bảng dung dịch đƣờng chuẩn: 43 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm Bảng 3.7: Các dung dịch đường chuẩn C (ppm) DD1 DD2 DD3 DD4 DD5 DD6 DD7 Digoxin 10 20 30 50 70 100 Digitoxin 10 20 30 50 70 100 Mỗi dung dịch đƣờng chuẩn đƣợc bơm hệ sắc ký lần, diện tích pic trung bình thu đƣợc số liệu để dựng đƣờng chuẩn phụ thuộc diện tích pic vào nồng độ Bảng 3.8: Diện tích pic trung bình thu glycoside tim STT Digoxin 103278 202614 403091 613457 1035322 1397073 2020239 Digitoxin 90288 1237266 1809730 180347 361395 565455 898430 Đƣờng chuẩn 02 glycoside tim thể hình 3.8: Digoxin: Y = A + B * X Parameter Value Error 2000000 -Dien tich pic 1500000 A 4880.60534 8278.26228 B 22143.54303 159.63228 1000000 -500000 0 R SD N P -20 40 60 80 100 C (ppm) 0.99984 44 10565.38955 [...]... nguồn cung cấp glycosides tim Trong một số tài liệu [9, 19] và rất nhiều tài liệu khác cho biết trong cây trúc anh đào cũng chứa một số glycoside tim Đây là loại cây đƣợc trồng hoặc mọc hoang rất nhiều ở nƣớc ta 1.1.6 Một số loại thuốc chứa glycoside tim Hiện chỉ còn digoxin và digitoxin đƣợc dùng ở lâm sàng trong điều trị bệnh tim Vì vậy chỉ còn một số loại thuốc chứa hoạt chất Digitoxin và digitoxin... tốt trong cồn, chloroform, … - Tan ít trong nƣớc (1gam/100 lít ở 20oC) - Không tan trong dung môi hữu cơ benzen, ether… Dƣợc tính: Digoxin là một glicozit tim chiết xuất từ cây mao địa hoàng (Digitalis) - Là chất độc bảng A - Có cấu trúc và hiệu ứng tƣơng tự nhƣ digoxin 1.3 Các phƣơng pháp xác định glycoside tim 1.3.1 Phương pháp sắc kí xác định glycoside tim Phƣơng pháp sắc kí để nghiên cứu các glycoside. .. cần phân tích (giá trị x) Trong trƣờng hợp này, các thông số làm việc của máy nhƣ nhiệt độ, tốc độ dòng …phải rất ổn định, các lần bơm mẫu phải có độ lặp lại cao [3,6,7] 22 Luận văn thạc sĩ Bùi Thị Tâm CHƢƠNG 2: THỰC NGHIỆM 2.1 Mục tiêu và đối tƣợng nghiên cứu 2.1.1 Mục tiêu nghiên cứu Phân tích định lƣợng xác định một số glycoside tim trong dƣợc liệu và dƣợc phẩm bằng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu năng... sử dụng cột tách pha đảo (RPHPLC), detector PDA 2.1.2 Đối tượng nghiên cứu Mẫu dƣợc phẩm: Hiện nay trong y học hiện chỉ còn digoxin và digitoxin là hai chất trong nhóm glycoside tim đƣợc dùng ở lâm sàng trong điều trị bệnh tim còn lƣu hành rộng trên thị trƣờng Vì vậy trong nghiên cứu này chúng tôi lựa chọn một số mẫu thuốc có chứa digoxin và digitoxin, các mẫu thuốc này đƣợc mua tại các hiệu thuốc ở... 10Avp, đèn SPD-M10A, vòng nạp mẫu 20 l Các điều kiện chạy máy và xử lí mẫu đều đƣợc khảo sát và tối ƣu hoá trƣớc khi phân tích mẫu 1.3.4 Phương pháp định tính và định lượng - Phương pháp phân tích định tính: Nguyên tắc của các phép phân tích định tính là dựa vào một yếu tố đặc trƣng của tín hiệu tƣơng ứng với mỗi cấu tử để nhận diện chúng Trong sắc kí lỏng ngƣời ta sử dụng yếu tố đặc trƣng là thời gian... genin, và đều có tác dụng chống suy tim Vị trí C3 nối với một hoặc nhiều phân tử đƣờng(ose), không có tác dụng dƣợc lý nhƣng ảnh hƣởng đến dƣợc động học của thuốc [9] 1.2 Khái quát về digoxin và digitoxin Trong số rất nhiều loại glycoside tim có tác dụng mạnh lên tim thì digoxin và digitoxin là hai hoạt chất hiện nay đƣợc dùng phổ biến nhất trong điều trị bệnh tim (suy tim sung huyết và loạn nhịp tim) ,... [9] 1.3.3 Phương pháp chiết tách các glycoside tim ra khỏi nền mẫu thực Trƣớc khi mẫu thực đƣợc đƣa vào hệ HPLC để phân tích cho ra hàm lƣợng các glicoside có trong mẫu thì phải đƣợc đồng nhất, chuyển từ các trạng thái khác nhau về dạng lỏng trong dung môi phù hợp để khi đƣa vào cột tách có khả năng hấp thụ và rửa giải qua cột Trong bài báo của F.erni và R.W.Frei phân tích một số glicoside tim trong thuốc... tục cho vào bể siêu âm trong 5 phút và li tâm ở 1400rpm trong 5 phút Phần dung dịch ở trên đƣợc chuyển sang một ống nghiệm và cho bay hơi trong chân không Chất rắn thu đƣợc đƣợc hoà tan trong 0,1ml methanol và phân tích bởi micro – HPLC [24] Nhóm tác giả Federica Pellati, Renato Bruni, Maria Grazia Bellardi, Assunta Bertaccini, Stefania Benvenuti đã đƣa ra quy trình chiết một số glycoside tim trong đó... Digoxine nativelle Pháp 3 Mẫu 3 DioxineQualy 0,25mg Việt Nam Mẫu dƣợc liệu: Nhƣ đã đề cập trong phần tổng quan, nguồn dƣợc liệu có chứa glycoside tim mà phân bố nhiều ở nƣớc ta đó chính là cây trúc anh đào Để góp phân vào việc tìm tòi nghiên cứu tìm nguồn nguyên liệu làm thuốc chữa bệnh, chúng tôi quyết định chọn mẫu dƣợc liệu là lá trúc anh đào Lá cây đƣợc hái vào tháng 3 năm 2015, tại đƣờng trong khu đô... kí để nghiên cứu các glycoside tim rất đƣợc quan tâm, vì: thứ nhất các glycoside tim là các hợp chất có hoạt tính sinh học đƣợc sử dụng ngày càng gia tăng trong thuốc, thứ hai, chúng còn đƣợc nghiên cứu về cấu trúc và thể tích lƣu trong sắc kí Hơn nữa điều kiện tối ƣu tách các glycoside cũng đƣợc quan tâm F.erni và R.W.Frei đã đƣa ra quy trình tách các glycoside tim trong thuốc bởi sắc kí pha ngƣợc, ... tài Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu Trong đề tài sử dụng phƣơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) ghép nối detector PDA để định lƣợng số glycoside tim dƣợc... Tâm LỜI CẢM ƠN! Sau thời gian học tập nghiên cứu hoàn thành luận văn cao học với đề tài: Nghiên cứu phương pháp định lượng số glycoside tim dược phẩm dược liệu dƣới hƣớng dẫn, bảo PGS.TS Nguyễn... HỌC TỰ NHIÊN - BÙI THỊ TÂM NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP ĐỊNH LƢỢNG MỘT SỐ GLYCOSIDE TIM TRONG DƢỢC PHẨM VÀ DƢỢC LIỆU Chuyên ngành : Hoá Phân Tích Mã số : 60440118 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC