TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN ******** PHẠM NGỌC ANH NGHIÊN CỨU PHƢƠNG PHÁP LƢU TRỮ VÀ BẢO QUẢN IN VITRO GIỐNG KHOAI MÔN –SỌ KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Kỹ thuật Nông nghiệp Ngƣời hƣớng dẫn khoa học TS.Vũ Ngọc lan HÀ NỘI, 2014 Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN LỜI CẢM ƠN Trƣớc hết xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS Vũ Ngọc Lan giảng viên trƣờng Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội tận tình hƣớng dẫn truyền đạt cho phƣơng pháp nghiên cứu khoa học kinh nghiệm học thật quý báu trình thực khóa luận Đồng thời, xin cảm ơn toàn thể thầy cô giáo khoa Sinh – KTNN Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Hà Nội 2, tạo điều kiện cho đƣợc tiếp thu kiến thức chuyên môn chuyên ngành Kĩ thuật Nông nghiệp Nhân dịp này, cho phép đƣợc bày tỏ lòng biết ơn tới ngƣời thân gia đình, bạn bè cổ vũ, động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập thực luận văn Trong trình làm khóa luận tốt nghiệp cố gắng nhƣng chắn tránh đƣợc thiếu sót Vì vậy, kính mong nhận đƣợc ý kiến đóng góp quý thầy cô bạn Một lần nữa, xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 06 tháng năm 2014 Sinh viên Phạm Ngọc Anh Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN LỜI CAM ĐOAN Để đảm bảo tính trung thực khóa luận tốt nghiệp, xin cam đoan: Khóa luận tốt nghiệp: “Nghiên cứu ph ng ph p u gi v o qu n in vitro gi ng ho i m n – sọ” công trình nghiên cứu cá nhân tôi, thực dƣới hƣớng dẫn TS.Vũ Ngọc Lan – Đại Học Nông Nghiệp Hà Nội Các kết thu đƣợc luận văn trung thực chƣa công bố nghiên cứu khoa học trƣớc Hà Nội, Ngày 06 tháng năm 2014 Sinh viên Phạm Ngọc Anh Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT 2,4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BA : 6-Benzyladenine BAP : N6-Benzyl aminopurine CT : Công thức DC : Đối chứng IAA : Indole-3-acetic-acid MS : Murashige and Skoog NAA : Naphthalene acetic acid PP333 : Paclobutrazol TDZ : Thiadiazuron TE : Dịch chiết khoai môn – sọ TB : Trung bình B9 : Daminozide Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Lý chọn đề tài Mục đích mục tiêu 2.1 Mục đích 2.2 Yêu cầu 3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học 3.2 Ý nghĩa thực tiễn CHƢƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung khoai môn – sọ (Colocasia esculenta) 1.1.1 Nguồn gốc 1.1.3 Phân bố 1.2 Các phƣơng pháp bảo tồn 1.3 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ 1.3.1 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ Việt Nam 11 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG ,VẬT LIỆU VÀ 13 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 13 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu 13 2.2 Địa điểm thời gian nghiên cứu 13 2.2.1 Địa điểm 13 2.2.2 Thời gian nghiên cứu 13 2.3 Thiết bị dụng cụ thí nghiệm 13 2.3.1 Các trang thiết bị 13 2.3.2 Môi trƣờng dùng thí nghiệm 14 2.4 Phƣơng pháp nội dung nghiên cứu 16 2.5 Các tiêu theo dõi 19 2.6 Phƣơng pháp xử lí số liệu 19 CHƢƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 20 3.1 Ảnh hƣởng HgCl2 đến khả tạo nguồn mẫu khoai môn – sọ in vitro 20 3.2 Ảnh hƣởng môi trƣờng đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro 21 Sau tiến hành thí nghiệm thu đƣợc kết nhƣ sau: 22 3.3 Ảnh hƣởng hàm lƣợng saccaroza đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro 23 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro 25 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng saccaroza đến khả tạo củ khoai môn – sọ in vitro 27 Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN 3.6 Ảnh hƣởng quang chu kì khác đến khả tạo củ khoai môn – sọ in vitro 28 3.7 Ảnh hƣởng chất kìm hãm sinh trƣởng đến khả hình thành củ 30 TÀI LIỆU THAM KHẢO 33 MỘT SỐ HÌNH ẢNH 35 Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Phân bố khoai môn – sọ giới năm gần Bảng 3.1: Ảnh hƣởng HgCl2 0,1% đến hiệu khử trùng 20 Bảng 3.2: Ảnh hƣởng môi trƣờng đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro 22 Bảng 3.3: Ảnh hƣởng hàm lƣợng saccaroza đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro 24 Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến thời gian cấy khoai môn – sọ in vitro 26 Bảng 3.5: Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến khả hình thành củ giống TH1 27 Bảng 3.6: Ảnh hƣởng thời gian chiếu sáng đến khả hình thành củ giống TH1 29 Bảng 3.7: Ảnh hƣởng chất kìm hãm sinh trƣởng đến hình thành củ giống TH1 30 Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Khoai môn, khoai sọ (Colocasia esculenta (L.) Schott) thuộc họ Ráy (Araceae) có lịch sử trồng trọt lâu đời giữ vai trò quan trọng sản xuất lƣơng thực nƣớc nông nghiệp nghèo, chậm phát triển Đây loại trồng lấy củ quan trọng, không nguồn lƣơng thực nƣớc quần đảo Thái Bình Dƣơng mà nguồn lƣơng thực, thực phẩm nhiều quốc gia giới tập trung Châu Phi, Tây Ấn Độ, Nam Mỹ Châu Á Trên giới khoai môn – sọ xếp thứ 14 số trồng với khoảng 12 triệu đƣợc sản xuất toàn cầu từ khoảng triệu với suất trung bình 6,5 tấn/ha (FAOSTAR 2010) Tuy nhiên, năm gần đây, nhờ tiến vƣợt bậc ngành trồng lúa nƣớc nên đảm bảo an toàn lƣơng thực nƣớc mà xuất nƣớc Thực tế làm ảnh hƣởng không nhỏ đến sản xuất có củ nói chung khoai môn – sọ nói riêng nƣớc ta Nguồn tài nguyên khoai môn – sọ nƣớc ta bị lãng quên Các giống địa phƣơng dần biến cách nhanh chóng nghiên cứu di truyền, chọn giống, bảo tồn nguồn gen loại trồng nƣớc ta [2] Mặt khác, diện tích trồng khoai môn – sọ giảm dần thoái hóa giống Các giống sử dụng bị nhiễm bệnh nhƣ bệnh sƣơng mai (P colocasiae, P palmirora, P citrophthora, P capsici) Việc nhân giống bảo tồn nguồn gen giống khoai môn – sọ đặc sản gặp nhiều khó khăn giống địa phƣơng cho suất không cao, thời gian sinh trƣởng dài dễ bị sâu bệnh Nguồn giống thiếu hạn chế lớn để trồng đại trà với quy mô lớn [6] Để hạn chế tác hại bệnh, nguồn gen khoai môn – sọ đòi hỏi cần phải có nguồn gen kháng bệnh phong phú đa dạng di truyền vùng Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN vùng khác nhau, nƣớc ta với nƣớc khác Việc mô tả đánh giá đa dạng di truyền quỹ gen khoai môn – sọ cung cấp số thông tin cần thiết biến dị di truyền có vât liệu nghiên cứu Những thông tin thu đƣợc đƣợc sử dụng hữu ích công tác chọn tạo giống khoai môn – sọ Tại Việt Nam nghiên cứu sử dụng thị phân tử (RAPD SSR) để đánh giá đa dạng di truyền giống khoai môn – sọ khiêm tốn, có dự án hợp tác Trung tâm Tài nguyên thực vật đƣợc tiến hành Ứng dụng Công nghệ Sinh học, cụ thể sử dụng phƣơng pháp RAPD phân tích mẫu giống ít, việc ứng dụng phƣơng pháp SSRs thí nghiệm hầu nhƣ chƣa thực Việc nuôi cấy giữ khoai môn – sọ in vitro gặp khó khăn, thời gian giữ giống thấp nên tốn công sức cấy chuyển Khi số lần cấy chuyển tăng lên thƣờng dễ xảy biến dị soma ảnh hƣởng không tốt cho việc bảo quản giống Ngoài kích thƣớc khoai môn – sọ in vitro lớn gây khó khăn định cấy chuyển chúng Việc bảo tồn lƣu giữ nguồn gen nuôi cấy in vitro ngày đƣợc quan tâm Khoai môn – sọ cho thu củ, củ thực phẩm nguyên liệu cung cấp cho ngành dƣợc đồng thời củ hình thức để giống phổ biến, củ thuộc loại giàu dinh dƣỡng, nên khó lƣu giữ, bảo quản củ làm giống Xuất phát từ yêu cầu thực tế tiến hành đề tài: “Nghiên cứu ph ng ph p u gi v o qu n in vitro gi ng khoai môn – sọ ” Mục đích mục tiêu 2.1 Mục đích Xác định đƣợc phƣơng pháp khử trùng mẫu đạt hiệu cao ảnh hƣởng số chất điều tiết sinh trƣởng tự nhiên đến giai đoạn nuôi cấy lƣu giữ bảo quản in vitro giống khoai môn – sọ Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN 2.2 Yêu cầu - Xác định phƣơng pháp khử trùng mẫu đạt hiệu cao nhất, tạo số lƣợng lớn nguồn vật liệu ban đầu phục vụ nghiên cứu giống khoai môn – sọ - Xác định ảnh hƣởng số chất điều tiết sinh trƣởng tự nhiên đến giai đoạn nuôi cấy lƣu giữ bảo quản in vitro giống khoai môn – sọ Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài 3.1 Ý nghĩa khoa học Cung cấp số sở lý thuyết cho lƣu trữ, bảo quản in vitro loài khoai môn – sọ 3.2 Ý nghĩa thực tiễn Bổ sung sở để lƣu trữ, bảo quản giống khoai môn – sọ cung cấp nguồn củ giống chất lƣợng cao số lƣợng lớn cho sản xuất đại trà Phạm Ngọc Anh K36C – Sinh KTNN trƣờng White có chiều cao thấp nhất, sau 12 tuần nuôi cấy, chiều cao trung bình khoảng 2,4 cm Sau cấy môi trƣờng B5 có tốc độ tăng trƣởng trung bình 0,2 cm/tuần, giảm 28,3% so với tốc độ tăng trƣởng chiều cao cấy môi trƣờng MS Về số lá/cây, tƣơng tự tăng trƣởng chiều cao cây, tốc độ tăng trƣởng số giống nghiên cứu cấy môi trƣờng dinh dƣỡng B5 White thấp so với môi trƣờng dinh dƣỡng MS Tốc độ tăng trƣởng số đạt 0,6 lá/tuần cấy môi trƣờng MS, đạt 0,3 lá/tuần cấy môi trƣờng B5 0,2 lá/tuần cấy môi trƣờng White Về trạng thái cây, khoai môn – sọ in vitro tất giống nghiên cứu cấy môi trƣờng dinh dƣỡng MS mẫu có trạng thái sinh trƣởng nhanh, tốt (thân mập, xanh đậm, to) Khi cấy môi trƣờng dinh dƣỡng B5 trạng thái tất giống nghiên cứu mức trung bình Khi cấy môi trƣờng dinh dƣỡng White giống khoai môn – sọ nghiên cứu có trạng thái sinh trƣởng (chồi gầy, yếu, nhỏ xanh chuyển sang vàng), sau 12 tuần nuôi cấy đỉnh có tƣợng chết lụi (ngọn bị thui đen) 3.3 Ảnh hƣởng hàm lƣợng saccaroza đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro Kết thí nghiệm đƣợc cụ thể hoá bảng sau: Phạm Ngọc Anh 23 K36C – Sinh KTNN Bảng 3.3: Ảnh hƣởng hàm lƣợng saccaroza đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro Sau tuần nuôi cấy Sau 12 tuần nuôi cấy Số lá/chồi (lá) Số chồi hình thành (Chồi) Chiều cao chồi (cm) Số lá/chồi (lá) Số chồi hình thành (Chồi) 2,0 1,3 12,1 7,3 4,6 *** 1,5 1,1 10,5 6,4 6,3 ** 1,5 1,1 5,6 4,2 4,4 * Chiều cao chồi (cm) CT Hình thái chồi Ghi chú: ***: Chồi mập, to, xanh đậm, nhiều **: Chồi nhỏ, bé, xanh nhạt, *: Chồi nhỏ, bé, xanh nhạt chuyển sắc vàng, Sự vắng mặt đƣờng làm giảm vấn đề nhiễm môi trƣờng cấy cho phép tăng trƣởng cách tự dƣỡng điều kiện in vitro nồng độ CO2 mật độ ánh sáng tăng lên Nhƣng đƣờng lại đóng vai trò cung cấp nguồn cacbon hữu cho trình sinh lý mẫu nuôi cấy mô thực vật Các kết nghiên cứu cho biết nồng độ đƣờng môi trƣờng từ - 3% thích hợp cho sinh trƣởng in vitro nhiều đối tƣợng trồng khác Bên cạnh vai trò cung cấp hidrat cacbon đƣờng có tác dụng làm tăng nồng độ môi trƣờng có nồng độ cao Do đó, nồng độ đƣờng cao làm tăng áp suất thẩm thấu môi trƣờng nuôi cấy gây ảnh hƣởng đến trình hút nƣớc, hút khoáng từ làm giảm sinh trƣởng Từ số liệu thu đƣợc bảng 3.3 cho thấy sinh trƣởng phát triển khoai môn – sọ môi trƣờng có nồng độ đƣờng cao có xu Phạm Ngọc Anh 24 K36C – Sinh KTNN hƣớng giảm so với đối chứng Nồng độ đƣờng cao tỷ lệ nghịch với khả tăng chiều cao cây, số lá, đồng nghĩa với làm chậm sinh trƣởng hay tăng khoảng thời gian cấy chuyển Nồng độ đƣờng 20 g/l (công thức đối chứng) nồng độ đƣợc coi thích hợp cho sinh trƣởng phát triển khoai môn - sọ in vitro, cung cấp đủ lƣợng hidrat cacbon nhân tạo cần thiết cho Nồng độ đƣờng 30g/l ngƣỡng nồng độ thích hợp cho sinh trƣởng khoai môn – sọ in vitro Các tiêu sinh trƣởng chiều cao, số mức cao, giảm không đáng kể so với đối chứng Tốc độ tăng trƣởng chiều cao chồi trung bình 0,88 cm/tuần giảm 87,3% tốc độ tăng trƣởng chiều cao chồi cấy công thức đối chứng Tốc độ tăng trƣởng số trung bình đạt 0,53 lá/tuần giảm 88.33% so với đối chứng Số chồi/cây trung bình đạt 6,3 chồi, cao so với đối chứng Nhƣ vậy, nồng độ đƣờng 30g/lít bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng hạn chế sinh trƣởng phần khoai môn – sọ in vitro Công thức có nồng độ đƣờng 30 g/lít bổ sung vào môi trƣờng nuôi cấy có tác dụng hạn chế sinh trƣởng mạnh đến độ gia tăng chiều cao, số Tốc độ tăng trƣởng chiều cao, số trung bình tƣơng ứng 0,47 cm/tuần 0,35 lá/tuần, 46,63% 57,57% so với tốc độ tăng trƣởng công thức đối chứng Về số chồi/cây giảm so với đối chứng từ 0,1 – 0,3 chồi Trạng thái sinh trƣởng chồi giống số 15 mức trung bình, mọc nhiều rễ, có khả đẻ nhánh, thân yếu Điều hoàn toàn không phù hợp với mục đích trì sinh trƣởng chậm 3.4 Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro Kết thí nghiệm cụ thể hoá bảng sau đây: Phạm Ngọc Anh 25 K36C – Sinh KTNN Bảng 3.4: Ảnh hƣởng nồng độ NaCl đến thời gian cấy khoai môn – sọ in vitro Sau tuần nuôi cấy Chiều CT cao chồi (cm) Sau 12 tuần nuôi cấy Số chồi Số lá/chồi hình (lá) thành Chiều cao chồi (Chồi) (cm) Số chồi Số lá/chồi hình (lá) thành Hình thái chồi (Chồi) 1,9 1,2 12,3 7,3 4,9 *** 1,9 1,0 10,5 5,5 2,1 *** 1,8 1,0 4,5 4,6 1,5 *** 1,5 1,0 3,2 3,7 1,1 ** Ghi chú: ***: Chồi mập, to, xanh đậm, nhiều **: Chồi nhỏ, bé, xanh nhạt, Kết cho thấy môi trƣờng bổ sung NaCl, tốc độ tăng trƣởng khoai môn – sọ chậm, chiều cao chồi số thấp Về số chồi trạng thái chồi tốt: Trong môi trƣờng có bổ sung NaCl, khoai môn – sọ hầu nhƣ không phân chồi, sau 12 tuần nuôi cấy số chồi/cây đạt từ 1,1 – 2,1 chồi thấp điều kiện cấy nhân 2,8 chồi Trạng thái CT mập, xanh khoẻ Nồng độ NaCl 1,2 g/l nồng độ thích hợp sinh trƣởng chậm khoai môn – sọ nồng độ có hiệu bảo quản sinh trƣởng chậm tốt Tốc độ tăng trƣởng chiều cao trung bình nồng độ NaCl 1,2 g/l 0,38 cm/tuần, cao nồng độ 1,5 g/l 0,11 cm/tuần, thấp nồng độ 0,9 g/l 0,5 cm/tuần giảm 37,07% so với tốc độ tăng trƣởng chiều cao điều kiện cấy nhân thông thƣờng Về số chồi/cây, Phạm Ngọc Anh 26 K36C – Sinh KTNN nhìn chung phát triển thân mà hầu nhƣ khả đẻ nhánh Tuy trạng thái sinh trƣởng chồi giống nghiên cứu tốt, đảm bảo mập, xanh to Ở nồng độ NaCl 1,5 g/l khoai môn – sọ sinh trƣởng phát triển chậm Tốc độ tăng trƣởng chiều cao số thấp, trung bình đạt 0,26 cm/tuần 0,31lá/tuần, giảm 25,37% 50,82% tốc độ tăng trƣởng chiều cao, số tƣơng ứng công thức đối chứng Cây sinh trƣởng cằn cỗi, nhỏ có mầu xanh vàng, khả sinh chồi thấp Nhƣ vậy, nồng độ NaCl có tác dụng hạn chế sinh trƣởng khoai môn – sọ mạnh nhƣng nồng độ thích hợp mục đích bảo quản sinh trƣởng chậm 3.5 Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng saccaroza đến khả tạo củ khoai môn – sọ in vitro Chúng tiến hành thí nghiệm thu đƣợc kết qua bảng sau: Bảng 3.5: Ảnh hƣởng nồng độ đƣờng đến khả hình thành củ giống TH1 Chỉ tiêu Nồng độ đƣờng Tỷ lệ mẫu hình thành Khối lƣợng TB (%) củ (%) củ (g) CT1 30 100 0,3 CT2 60 100 1,0 CT3 90 100 3,1 CT4 120 100 1,8 CT5 150 100 1,3 CT Việc xác định hàm lƣợng đƣờng chất điều tiết sinh trƣởng bổ sung vào môi trƣờng tạo củ in vitro bƣớc quan trọng Đây Phạm Ngọc Anh 27 K36C – Sinh KTNN nguồn dinh dƣỡng tích lũy để tạo củ Sự tăng nồng độ đƣờng saccaroza môi trƣờng nuôi cấy có ảnh hƣởng rõ rệt đến hình thành củ in vitro nồng độ đƣờng cao trình tích luỹ vào củ in vitro mạnh mẽ Củ khoai môn – sọ chứa hàm lƣợng cacbon hydrat cao nên việc bổ sung đƣờng điều cần thiết để tạo nguyên liệu tích lũy cho hình thành củ Trong thí nghiệm sử dụng môi trƣờng môi trƣờng MS + g/l agar Cây đủ tiêu chuẩn đƣợc cấy sang môi trƣờng MS, sau tuần, có rễ hoàn chỉnh, bổ sung dung dịch đƣờng vô trùng với nồng độ khác nhau, đặt điều kiện ánh sáng phòng thí nghiệm Qua bảng 3.5 ta có giống TH1 khối lƣợng trung bình củ tăng dần từ 0,3 – 3,1 nồng độ đƣờng tăng dần từ 30 – 90 nhƣng nồng độ đƣờng tiếp tục tăng lên đến 150 g/l khối lƣợng củ giảm 1,3 g Vậy khối lƣợng củ cao 3,1 g nồng độ đƣờng 90 g/l, gấp 12,96 lần công thức đối chứng 30 g/l saccaroza (0,3 g/củ) tăng 1,7 – 3,1 lần so với công thức thí nghiệm khác Tại tất công thức hình thành củ mà thấy xuất chồi nhỏ củ Qua kết thí nghiệm khẳng định nồng độ đƣờng ban đầu có vai trò quan trọng đến khả hình thành củ in vitro khoai môn – sọ Nhƣ vậy, nồng độ đƣờng thích hợp để giống TH1 hình thành củ in vitro 90 g/l 3.6 Ảnh hƣởng quang chu kì khác đến khả tạo củ khoai môn – sọ in vitro Kết thí nghiệm hai giống sau 12 tuần theo dõi đƣợc ghi lại bảng sau: Phạm Ngọc Anh 28 K36C – Sinh KTNN Bảng 3.6: Ảnh hƣởng thời gian chiếu sáng đến khả hình thành củ giống TH1 CT Tỷ lệ mẫu hình thành củ % Khối lƣợng TB củ (g) CT2 100 1,1 CT3 100 1,7 Chúng ta biết ánh sáng yếu tố sinh lý tác động mạnh đến trồng thông qua quang chu kỳ Ngƣời ta vân dụng quang chu kỳ để điều khiển hoa số (cúc, hồng, long…) Với có củ ánh sáng có ảnh hƣởng lớn đến việc hình thành củ ống nghiệm Ví dụ khoai tây, việc tạo củ in vitro đƣợc tiến hành với môi trƣờng bổ sung đƣờng saccaroza nồng độ cao điều kiện tối hoàn toàn khoai môn – sọ ánh sáng ảnh hƣởng nhƣ Vì tiến hành thí nghiệm nghiên cứu ảnh hƣởng ánh sáng đến khả tạo củ giống TH1 với thời gian chiếu sáng khác giờ/ ngày, giờ/ ngày, 16 giờ/ ngày Trong thí nghiệm sử dụng môi trƣờng môi trƣờng MS + g/l agar Cây đủ tiêu chuẩn đƣợc cấy sang môi trƣờng MS Sau tuần điều kiện phòng, có rễ hoàn chỉnh, bổ sung dung dịch đƣờng vô trùng với nồng độ 90 g/l đặt điều kiện khác Qua bảng số liệu ta nhận thấy: Ánh sáng có ảnh hƣởng lớn đến khả hình thành củ khoai môn – sọ Khi thời gian chiếu sáng ngày tăng lên (0 – 16 sáng/ngày) khối lƣợng củ tăng lên từ – 1,7 g Mặt khác điều kiện tối hoàn toàn củ không hình thành đƣợc Mặc dù nồng độ đƣờng môi trƣờng cao nhƣng tích lũy đủ dinh dƣỡng để hình thành củ, lóng thân kéo dài mà không phình củ, quang hợp, sắc tố diệp lục thân giảm trầm trọng, sau 30 ngày phát triển cao yếu, sắc tố diệp lục mất, chuyển thành Phạm Ngọc Anh 29 K36C – Sinh KTNN màu trắng Nhƣng điều kiện chiếu sáng tỷ lệ hình thành củ 100% mà kích thích phát triển thân, lá, rễ, màu sắc đậm Đây nguyên nhân dẫn đến hấp thu dinh dƣỡng tốt từ hình thành củ tốt Nhƣ vậy, thời gian chiếu sáng thích hợp cho việc tạo củ khoai môn – sọ 16 sáng/ngày 3.7 Ảnh hƣởng chất kìm hãm sinh trƣởng đến khả hình thành củ Tiến hành thí nghiệm sau tháng theo dõi có kết đƣợc trình bày bảng sau: Bảng 3.7: Ảnh hƣởng chất kìm hãm sinh trƣởng đến hình thành củ giống TH1 Thời gian CT phình củ (ngày) Tỷ lệ mẫu hình thành củ (%) Khối Khối lƣợng lƣợng trung bình trung bình củ củ (g) (g) Khối Số củ lƣợng trung trung bình bình củ (g) mẫu CT1 32 100 1,5 1,5 CT2 27 100 2,4 2,4 CT3 27 100 2,0 2,0 CT4 32 100 0,6 0,6 CT5 30 100 0,8 0,2 1,0 0,6 Thí nghiệm đƣợc bố trí giống TH1 Cây đủ tiêu chuẩn đƣợc cấy sang môi trƣờng MS Sau tuần điều kiện phòng, có rễ hoàn chỉnh, bổ sung dung dịch đƣờng vô trùng với nồng độ 90g/l điều kiện chiếu sáng 16/24h có bổ sung thêm chất kìm hãm sinh trƣởng theo Phạm Ngọc Anh 30 K36C – Sinh KTNN công thức khác Chất kìm hãm sinh trƣởng Alar(B9) Qua bảng số liệu nhận thấy: Chất kìm hãm sinh trƣởng có ảnh hƣởng lớn đến hình thành củ, thời gian phình củ, chất lƣợng củ nhƣ hình thành củ Trên giống TH1: Khối lƣợng củ trung bình lớn CT2 với nồng độ g/l chất kìm hãm sinh trƣởng 2,4 g tăng gấp 1,6 lần so với công thức đối chứng thời gian phình củ nhanh 27 ngày Cũng thời gian phình củ CT3 với nồng độ g/l nhiên công thức khối lƣợng trung bình củ nhỏ so với CT2 có 2,0 g Còn công thức thí nghiệm khối lƣợng trung bình củ nhỏ so với công thức đối chứng Tại hầu hết công thức thí nghiệm không cho thấy hình thành củ mà xuất chồi nhỏ củ Duy CT5 với nồng độ g/l có xuất củ nhƣng khối lƣợng củ nhỏ gây khó khăn cho trình bảo quản Cũng qua bảng số liệu ta thấy CT CT cho khối lƣợng trung bình củ tăng cao nhƣ thời gian phình củ sớm so với đối chứng có ý nghĩa mặt thống kê Khi xem xét công thức khác biệt thông kê độ tin cậy 95% nhƣng nên sử dụng CT vừa tốn hóa chất nhƣng đem lại hiệu so với CT Nhƣ vậy, khoai môn – sọ TH1 môi trƣờng tạo củ ta cần sử dụng g/l chất kìm hãm sinh trƣởng alar đem lại hiệu cao Phạm Ngọc Anh 31 K36C – Sinh KTNN CHƢƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận - Sử dụng HgCl2 0,1% (7 phút) + HgCl2 0,1% (1 phút) kép với thời gian hợp lý thu đƣợc lƣợng mẫu mẫu sống cao - Các môi trƣờng dinh dƣỡng B5, White có tác dụng hạn chế sinh trƣởng phát triển khoai môn – sọ in vitro - Sử dụng nồng độ đƣờng cao môi trƣờng nuôi cấy nhằm mục đích trì sinh trƣởng chậm có hiệu không cao thời gian bảo quản chất lƣợng chồi bảo quản - Việc bổ sung NaCl vào môi trƣờng nuôi cấy có hiệu vấn đề trì sinh trƣởng chậm khoai môn – sọ in vitro Trong nồng độ NaCl 1,5 g/l thích hợp vừa đảm bảo đƣợc hạn chế tăng trƣởng chiều cao vừa đảm bảo trạng thái chồi tốt với số lá/cây cao thích hợp cho việc nhân nhanh cần thiết - Nồng độ đƣờng ban đầu có vai trò quan trọng đến khả hình thành củ in vitro khoai môn – sọ Nồng độ đƣờng thích hợp để giống hình thành củ in vitro 90 g/l - Thời gian chiếu sáng thích hợp cho việc tạo củ khoai môn – sọ 16 sáng/ngày Đối với khoai sọ môi trƣờng tạo củ ta cần sử dụng g/l chất kìm hãm sinh trƣởng alar đem lại hiệu cao Kiến nghị Nghiên cứu sử dụng môi trƣờng tạo củ giống khoai môn – sọ khác tạo nguyên liệu cho nhân nhanh in vitro đƣa sản xuất tạo củ giống bệnh Nghiên cứu tìm chế độ bảo quản củ khoai môn – sọ in vitro để chủ động sản xuất giống khoai môn – sọ bệnh Phạm Ngọc Anh 32 K36C – Sinh KTNN TÀI LIỆU THAM KHẢO Nguyễn Phùng Hà (2001), Đ nh gi c c gi ng có v c c gi ng có h mở rộng s n xuất củ tập đo n ho i m n – sọ s điểm sinh th i miền Bắc Việt N m, Luận án tiến sỹ Mai Thạch Hoành (2006), Chọn tạo v nhân gi ng có củ NXB Nông Nghiệp Mai Thạch Hoành, Nguyễn Công Vinh (2003), Gi ng v ỹ thuật thâm c nh có củ NXB Nông Nghiệp Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Đinh Thế Lộc (2005), Cây có củ v ỹ thuật thâm canh, NXB Lao động xã hội Nguyễn Thị Ngọc Huệ, Nguyễn Văn Viết (2004), Tài nguyên di truyền khoai môn – sọ Việt N m, NXB Nông nghiệp Nguyễn Thị Loan (2008), Nghiên cứu nhân nh nh in vitro ho i m n – sọ (Co oc si escu ent ), Khoá luận tốt nghiệp Nguyễn Thị Nga (2008), B ớc đầu nghiên cứu nh h ởng củ ti G mm nguồn Co60 đến chồi in vitro t i sinh từ chồi đỉnh củ s gi ng ho i môn – sọ đị ph ng, Luận văn thạc sĩ trƣờng ĐHSP Hà Nội Uông Thị Thảo (2007), Nghiên cứu nhân gi ng in vitro ho i sọ, Khoá luận tốt nghiệp Phạm Xuân Văn (2008), Nghiên cứu đặc điểm hình thái nhân nhanh in vitro kho i m n sọ (Co oc si escu ent ), Khoá luận tốt nghiệp 10 Đỗ Năng Vịnh (2005), C ng nghệ tế o thực vật ứng dụng, NXB Nông nghiệp – Hà Nội 11 Duong Tan Nhut¸Nguyen Thi Dieu Huong, Dinh Van Khiem, 2003 Study on tissue culture and its correlative factor of Colocasia esculenta Scientia Horticulture 101, pp 207 – 212 12 Deo, Pradeep C and Tyagi, Anand P and Taylor, Mary and Becker, Douglas K and Harding, Robert M, 2009 Improving taro (Colocasia esculenta var esculenta) production using biotechnological approaches Phạm Ngọc Anh 33 K36C – Sinh KTNN South Pacific Journal of Natural Science, 27, pp 6-13 13 H Chand, M N Pearson & P H Lovell (1998), Rapid vegetative multiplication Colocasia esculenta (L.) Schott (taro) pp 223 – 226 CÁC WEBSITE TRUY CẬP www.bioversityinternational.org3 http://aob.oxford journal.org/cyr/content/short http://www.fao.org8 www.baovecaytrong.com Phạm Ngọc Anh 34 K36C – Sinh KTNN MỘT SỐ HÌNH ẢNH Hình Ảnh hưởng nồng độ NaCl đến thời gian cấy chuyển khoai môn – sọ in vitro CT3 CT2 CT1 Hình Ảnh hưởng hàm lượng saccaroza đến thời gian cấy chuyển khoai môn - sọ in vitro Phạm Ngọc Anh 35 K36C – Sinh KTNN 60 g/l 90 g/l 120 g/l 150 g/l Hình Ảnh hưởng nồng độ đường đến khả tạo củ in vitro giống TH1 Phạm Ngọc Anh 36 K36C – Sinh KTNN 16/24h 0/24h 8/24h Hình Ảnh hưởng thời gian chiếu sáng đến hình thành củ giống TH1 Hình Ảnh hưởng chất kìm hãm sinh trưởng đến khả hình thành củ giống TH1 Phạm Ngọc Anh 37 K36C – Sinh KTNN [...]... sinh trƣởng cho Phạm Ngọc Anh 11 K36C – Sinh KTNN hệ số nhân giống môn sọ tốt nhất, với nồng độ TDZ là 1,5mg/l, hệ số nhân môn – sọ có thể đạt 16,1 lần sau 10 tuần nuôi cấy đối với giống khoai – sọ Hoà Bình, 18,6 lần đối với giống khoai môn tím và 14,3 lần đối với giống khoai sọ vàng Phạm Ngọc Anh 12 K36C – Sinh KTNN CHƢƠNG 2 ĐỐI TƢỢNG ,VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Nghiên. .. Trong nghiên cứu về vấn đề bảo tồn nguồn gen khoai môn – sọ của Hiroko Takagi và cộng sự (2005) thì việc bảo tồn in vitro đƣợc tiến hành trên môi trƣờng có hàm lƣợng đƣờng cao: MS + 120 g/l saccarose Phạm Ngọc Anh 10 K36C – Sinh KTNN 1.3.2 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ tại Việt Nam Đối với nƣớc ta việc nghiên cứu nhân giống cây khoai môn – sọ bằng công nghệ tế bào hiện nay còn chƣa đƣợc nghiên. .. đầu nghiên cứu bảo tồn Insitu cho nguồn gen cây có củ này Nguồn gen khoai môn – sọ đƣợc bảo tồn khá tốt trong các vƣờn gia đình và tại một số vùng có truyền thống sản xuất khoai môn – sọ nhƣ huyện Yên Thuỷ và Đà Bắc tỉnh Hoà Bình, huyện Nho Quan tỉnh Ninh Bình, huyện Thuận Châu tỉnh Sơn La, huyện Tràng Định tỉnh Lạng Sơn và huyện Thạch An tỉnh Cao Bằng…[5] 1.3 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn. .. khoai môn – sọ 1.3.1 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ trên thế giới Để tiến hành nuôi cấy khoai môn – sọ, ngƣời ta thƣờng sử dụng củ khoai môn – sọ để làm mẫu Củ khoai môn – sọ là bộ phận sử dụng chủ yếu, chúng nằm trong đất nên thƣờng dễ bị nấm bệnh tấn công Cũng chính vì vậy việc vào mẫu nuôi cấy cũng đã gặp không ít khó khăn S Seetohul và D Puchooa đã tiến hành các thí nghiện vào mẫu với... 2,4-D, 40 - 50 g/l sucrose, 1 mg/l biotin Phôi thành thục và nảy mầm sau khi đƣợc nuôi trong môi trƣờng chứa 0.05 mg/l BA, 0.1 mg/l IAA [12] Theo dự án bảo tồn in vitro nguồn gen khoai môn – sọ của FAO, nguồn gen khoai môn – sọ đƣợc bảo tồn in vitro trên môi trƣờng cơ bản: MS + 1 mg/l BA + 0,2 mg/l α NAA (pH: 5,5 – 5,8) Ngoài ra việc bảo tồn in vitro khoai môn – sọ còn đƣợc tiến hành trên các môi trƣờng... cây Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng của các nồng độ NaCl đến thời gian cấy chuyển cây khoai môn – sọ in vitro Với mục đích bảo quản nguồn giống khoai môn – sọ bằng phƣơng pháp duy trì sinh trƣởng chậm, chúng tôi tiến hành nghiên cứu bổ sung NaCl vào Phạm Ngọc Anh 17 K36C – Sinh KTNN môi trƣờng nuôi cấy nhằm hạn chế sự tăng trƣởng của cây và xác định nồng độ NaCl thích hợp trên giống TH1, với nền... cấy mô để nhân giống và bảo quản nguồn gen cây khoai môn – sọ Đây là biện pháp lƣu giữ những nguồn gen miền núi hoặc các dạng hoang dại khó lƣu giữ trên đồng ruộng Hiện nay, phƣơng pháp nuôi cấy mô đƣợc xem nhƣ là một công cụ quan trọng để nhân giống sạch bệnh, bảo quản dài hạn nguồn gen và cũng là phƣơng tiện để trao đổi giống đối với những cây nhân giống vô tính trong đó có khoai môn – sọ Ở Solomons,... nghiên cứu nhiều Tuy nhiên, trong những năm gần đây do nhận thấy giá trị của cây khoai môn – sọ mà vấn đề nghiên cứu nhân nhanh đang nhận đƣợc sự quan tâm rất lớn Đã có nhiều các công trình nghiên cứu với các kết quả công bố về bƣớc đầu trong nhân giống khoai môn – sọ bằng nuôi cấy mô tế bào: Công trình nghiên cứu của Phân Viện sinh học Đà Lạt (2003)… Để phục tráng giống và làm sạch bệnh của các dòng, giống. .. 27,80 mg/l - Thiamine (B1) 10,00 mg/l - Pyridoxine HCl 0,10 mg/l - Nicotinic acid (B5) 1,00 mg/l 100,00 mg/l - Myo-Inositol 2.4 Phƣơng pháp nội dung nghiên cứu Tiến hành 7 thí nghiệm theo dõi và thu thập số liệu, tổng kết đánh giá Thí nghiệm 1: Nghiên cứu ảnh hưởng của HgCl2 đến khả năng tạo nguồn mẫu sạch khoai môn – sọ in vitro Vật liệu khởi đầu để tiến hành thí nghiệm là củ giống khoai sọ trắng với 5... phƣơng pháp bảo tồn Công tác bảo tồn nguồn gen khoai môn – sọ trên thế giới có từ lâu nhƣng chỉ đƣợc quan tâm chú ý nhiều bắt đầu từ những năm 1990 tới nay Bảo quản, lƣu giữ chủ yếu là bảo quản Exsitu dƣới dạng tập đoàn nguồn gen trên đồng ruộng, trồng trong chậu vại tại các cơ quan nghiên cứu [4] Ngoài phƣơng pháp bảo quản và nhân giống trên đồng ruộng, các nhà khoa học còn tiến hành sử dụng phƣơng pháp ... hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ 1.3.1 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ giới Để tiến hành nuôi cấy khoai môn – sọ, ngƣời ta thƣờng sử dụng củ khoai môn – sọ để làm mẫu Củ khoai. .. nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ 1.3.1 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ giới 1.3.2 Tình hình nghiên cứu in vitro khoai môn – sọ Việt Nam 11 CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG ,VẬT LIỆU VÀ ... lần giống khoai môn tím 14,3 lần giống khoai sọ vàng Phạm Ngọc Anh 12 K36C – Sinh KTNN CHƢƠNG ĐỐI TƢỢNG ,VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu Nghiên cứu giống khoai sọ trắng