TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH- KTNN _*** _ VŨ NGỌC MAI NGHIÊN CỨU MỘT SỐ YẾU TỐ MÔI TRƯỜNG ẢNH HƯỞNG TỚI KHẢ NĂNG SINH CELLULASE TỪ MỘT SỐ CHỦNG NẤM MỐC ĐƯỢC PHÂN LẬP Ở VĨNH PHÚC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Chuyên ngành: Vi sinh vật học Người hướng dẫn khoa học TS Phương Phú Công HÀ NỘI - 2010 LỜI CẢM ƠN Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc tới giảng viên - TS Phương Phú Công hướng dẫn, bảo tận tình, giúp đỡ, tạo điều kiện để em thực hoàn thành tốt luận văn Em xin gửi lời cảm ơn chân thành tới thầy cô môn Vi sinh vật Đồng thời em xin cảm ơn Ban giám hiệu trường ĐHSP Hà Nội 2, khoa Sinh – KTNN, phòng thí nghiệm vi sinh, thư viện tạo điều kiện giúp đỡ để em hoàn thành tốt luận văn tốt nghiệp Ngoài ra, em xin cảm ơn giúp đỡ, động viên bạn bè, gia đình suốt trình làm đề tài Em xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng Sinh viên năm 2010 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng Các kết nghiên cứu, số liệu trình bày khóa luận hoàn toàn trung thực không trùng với kết tác giả khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả năm 2010 MỤC LỤC Lời cảm ơn Lời cam đoan Danh mục từ viết tắt Danh mục hình luận văn Danh mục bảng biểu luận văn Mở đầu CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Cellulose……………………………………………………………… 1.2 Hệ thống cellulase……………………………………………………… 1.3 Cơ chế phân giải cellulose……………………………………………… .8 1.4 Ứng dụng cellulase………………………………………………… 11 1.5 Các nhóm vi sinh vật phân giải cellulose ……………………………… 15 1.5.1 Nấm sợi ……………………………………………………………… 15 1.5.2 Vi khuẩn……………………………………………………………… 16 1.6 Một số yếu tố ảnh hưởng đến sinh tổng hợp cellulase vi sinh vật… 17 1.6.1 Giống vi sinh vật……………………………………………………… 17 1.6.2 Nguồn dinh dưỡng …………………………………………………… 18 1.6.3 Điều kiện nuôi cấy…………………………………………………… 19 CHƯƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu vi sinh vật……………………………………………… 21 2.1.1 Nguyên liệu………………………………………………………… 21 2.1.2 Môi trường…………………………………………………………… .21 2.1.2.1 Môi trường bảo quản giữ giống………………………………… 21 2.1.2.2 Môi trường nuôi cấy………………………………………………… 22 2.1.2.3 Môi trường thử hoạt tính enzyme…………………………………… 22 2.1.3 Hóa chất- thiết bị……………………………………………………… 23 2.1.3.1 Hóa chất…………………………………………………………… 23 2.1.3.2 Thiết bị……………………………………………………………… 23 2.2 Phương pháp nghiên cứu……………………………………………… 23 2.2.1 Phương pháp vi sinh………………………………………………… 23 2.2.2 Phương pháp hóa sinh………………………………………………… 24 2.2.2.1 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp cấy chấm điểm …… 24 2.2.2.2 Xác định hoạt tính enzyme phương pháp khuếch tán môi trường thạch (William, 1983)…………………………………………………24 2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng yếu tố môi trường đến hoạt tính cellulase………………………………………………………………… 25 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose …… 26 3.2 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng M3 M6-1………………………………………………………… 30 3.2.1 Ảnh hưởng pH đến khả sinh cellulase……………………… 30 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase……………… 32 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase……… 33 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase……………… 34 3.2.5 Ảnh hưởng nguồn cellulose tự nhiên……………………………… 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ…………………………………………….44 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC BẢNG BIỂU TRONG LUẬN VĂN Bảng 1.1 Các thành phần ligno – cellulose enzyme phân giải nấm……………………………………………………………………… .4 Bảng 1.2 Hàm lượng cellulose số nguyên liệu…………………… Bảng 3.1 Các chủng vi sinh vật có khả phân giải cellulose(D-d, cm) 28 Bảng 3.2 Ảnh hưởng pH đến hoạt tính cellulase………………………….31 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase…………………….34 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase…….36 Bảng 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase………… 38 Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn cellulose tự nhiên………………………… 41 DANH MỤC HÌNH TRONG LUẬN VĂN Hình 1.1 Cấu trúc lập thể phân tử cellulose…………………………………… Hình 1.2 Cấu trúc cellulose…………………………………………………… Hình 1.3 Sơ đồ trình thủy phân cellulose theo Erickson, 1973……………… 10 Hình 3.1 Khả sinh cellulase chủng nghiên cứu……………… 29 Hình 3.2 Ảnh hưởng pH đến khả sinh cellulase………………………… 32 Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase………………………… 34 Hình 3.4 Khả sinh cellulase chủng Penicilium M3 AspergillusM5-3 25 0C………………………………………………………………………………… 34 Hình 3.5 Khả sinh cellulase chủng Penicilium M3 Aspergillus M5-3 30 0C………………………………………………………………………………… 35 Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính cellulase………………………….36 Hình 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase………………… 38 Hình 3.8 Khả sinh cellulase chủng Penicilium M3 nguồn nitơ (NH4 )2SO4 NaNO3……………………………………………………………… 39 Hình 3.9 Khả sinh cellulase c chủng AspergillusM5-3 nguồn nitơ (NH4 )2SO4 NaNO3…………………………………………………………………39 Hình 3.10 Khả sinh cellulase chủng A niger M6-1 nguồn nitơ (NH4 )2SO4 NaNO3………………………………………………………………….40 Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn cellulose tự nhiên đến khả sinh cellulase… 41 Hình 3.12 Khả sinh cellulase c chủng Penicillium M3, AspergillusM5-3 A.niger M6-1 vỏ trấu ……………………………………………………… .42 DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT CMC : Carboxylmethyl cellulose M3 : Mẫu M6-1 : Mẫu 6-1 M5-3 : Mẫu 5-3 Cx : Endoglucanase C1 : Exoglucanase CBH : Celobiohydrolase SSA : Vùng bề mặt đặc hiệu (SSA) cellulose Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp MỞ ĐẦU Lý chọn đề tài Từ xa xưa, người biết sử dụng vi sinh vật đời sống hàng ngày Các trình làm rượu, làm dấm, làm tương, muối chua thực phẩm…đều ứng dụng đặc tính sinh học nhóm vi sinh vật Khi khoa học phát triển, biết rõ vai trò vi sinh vật, việc ứng dụng sản xuất đời sống hàng ngày rộng rãi có hiệu lớn [8] Cellulose thành phần chủ yếu màng tế bào thực vật Hàng ngày, hàng giờ, lượng lớn cellulose tích lũy lại đất sản phẩm tổng hợp thực vật thải ra, cối chết đi, cành rụng xuống…Nếu trình phân giải vi sinh vật lượng chất hữu khổng lồ tràn ngập trái đất Trong thiên nhiên, có nhiều nhóm vi sinh vật có khả phân hủy cellulose nhờ có hệ enzyme cellulase ngoại bào như: vi khuẩn( Pseudomonas, Xenllulomonas, Achromobacter, Clostridium.), xạ khuẩn (Streptomyces ).Trong đó, vi nấm nhóm có khả phân giải mạnh tiết môi trường lượng lớn enzyme đầy đủ thành phần, đặc biệt loài nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose mạnh Aspegillus, Mucor, Tricoderma… Cellulase phức hệ enzyme quan trọng ứng dụng rộng rãi nhiều lĩnh vực Trong tương lai, người ta sử dụng cellulase cho hai mục đích chính: - Dùng cellulase trực tiếp phân giải phế thải công nghiệp thực phẩm, phế thải nông nghiệp bổ sung vào thức ăn gia súc công nghệ môi trường - Thủy phân cellulose tạo chất lên men để thu sản phẩm cuối khác Vũ Ngọc Mai K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Đặc biệt, chăn nuôi, biện pháp nâng cao suất vật nuôi nâng cao hiệu suất sử dụng chất dinh dưỡng thức ăn mức cao Để giải nhiệm vụ này, người ta dùng chế phẩm enzyme bổ sung vào phần thức ăn vật nuôi Các enzyme với enzyme có sẵn đường tiêu hóa phân giải chất dinh dưỡng thức ăn giúp cho vật tiêu hóa tốt [13] Cellulase số enzyme thường bổ sung vào thức ăn chăn nuôi gia súc Tuy nhiên, người ta không bổ sung riêng chế phẩm enzyme mà thường bổ sung với enzyme khác amylase, protease, xylase tạo dạng chế phẩm chứa nhiều loại enzyme (multienzyme) Việc bổ sung nhiều loại enzyme giúp vật nuôi hấp thụ tốt nguồn thức ăn khác Từ lâu, người biết đến chủng nấm mốc ứng dụng chúng nhiều lĩnh vực công nghiệp chế biến thực phẩm, công nghiệp dược phẩm, công nghệ môi trường, nông nghiệp Tuy nhiên chưa có nhiều nghiên cứu tập trung vào chủng nấm mốc phân giải cellulose, nguyên nhân tự nhiên có nhiều nhóm vi sinh vật tỏ ưu so với nấm mốc khả sinh cellulase Nhưng xét khả chống chịu pH, khả sử dụng nguồn cacbon, nguồn nitơ nấm mốc tỏ ưu so với nhóm vi sinh vật khác Hàng năm, hoạt động ngành nông nghiệp thải môi trường hàng trăm ngàn phế phẩm, nguyên nhân gây ô nhiễm môi trường Nếu lượng phế phẩm xử lý làm thức ăn gia súc phân bón nguồn lợi lớn.Trên giới Việt Nam, có nhiều nghiên cứu cellulose ứng dụng thức ăn chăn nuôi như: Chu Thị Thanh Bình CS (2002) ứng dụng chủng nấm men chế biến bã thải hoa giàu cellulose làm thức ăn gia Vũ Ngọc Mai K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Kết phù hợp với số nghiên cứu trước đây, chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh khoảng pH= 4,5 - 6,0 ( Đặng Minh Hằng, 1999) 3.2.2 Ảnh hƣởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase Tiến hành nuôi cấy ba chủng Penicillium M3, Aspergillus M5-3 A niger M6-1 tuyển chọn môi trường thích hợp (phần2.1.2.2) Nghiên cứu ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase ba chủng tuyển chọn phương pháp trình bày phần 2.2.2.3 Hoạt tính cellulase dịch phản ứng xác định phương pháp khuếch tán môi trường thạch Kết trình bày bảng 3.3 hình 3.3 Bảng 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase Nhiệt độ M5-3 M3 M6-1 (0C) (D-d,cm) (D-d,cm) (D-d,cm) 25 0,7 1,1 0,6 30 1,2 2,2 1,6 35 1,1 2,0 0,9 40 1,0 1,5 0,8 Vũ Ngọc Mai 33 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.3 Ảnh hưởng nhiệt độ đến hoạt tính cellulase Hình 3.4 Khả sinh cellulase chủng Penicilium M3, AspergillusM5-3 250C Vũ Ngọc Mai 34 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.5 Khả sinh cellulase chủng Penicilium M3, AspergillusM5-3 300C Kết cho thấy ba chủng Penicillium M3, Aspergillus M5-3 A niger M6-1 cho khả sinh tổng hợp cellulase cao nhiệt độ 300C, sau khả sinh tổng hợp cellulase ba chủng giảm dần mức nhiệt độ (400C) Các chủng nấm thường chủng ưa nhiệt nhiệt độ tối ưu cho khả sinh tổng hợp cellulase 300C nhiệt độ khảo sát Những nghiên cứu trước cho thấy, chủng nấm khác sinh tổng hợp cellulase mạnh dải nhiệt độ 310C- 340C (Đặng Minh Hằng, 1999) 3.2.3 Ảnh hƣởng thời gian Chủng nuôi cấy môi trường Czapek- Dox (phần 2.1.2.2) với mức thời gian khác từ 1-5 ngày Sau ngày, lấy dịch nuôi cấy đem li tâm loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính cellulase dịch li tâm Vũ Ngọc Mai 35 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp phương pháp trình bày phần 2.2.2.2 Kết trình bày bảng 3.4 hình 3.6 Bảng 3.4 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase M5-3 M3 M6-1 (ngày) (D-d,cm) (D-d,cm) (D-d,cm) 0.37 0.41 0.35 0.59 0.8 0.6 0.8 0.9 0.68 1.0 1.2 0.9 0.5 0.63 0.63 D-d, cm Thời gian 1.4 1.2 0.8 0.6 0.4 0.2 M5-3 M3 M6-1 (ngày) Thời gian Hình 3.6 Ảnh hưởng thời gian đến hoạt tính cellulase Qua số liệu bảng 3.4 hình 3.6, nhận thấy hoạt tính cellulase ba chủng tăng dần theo thời gian ba chủng đạt giá trị cực đại sau ngày nuôi cấy thứ Qua ngày nuôi cấy thứ 4, hoạt tính ba chủng Vũ Ngọc Mai 36 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp giảm dần sinh trưởng nấm mốc giảm dần, nguồn dinh dưỡng cạn kiệt… Kết phù hợp với nghiên cứu trước chủng nấm sợi ưa nhiệt sinh tổng hợp cellulase mạnh sau 72h - 96h nuôi cấy Cả ba chủng Penicillium M3, Aspergillus M5-3 A niger M6-1 có thời gian khả sinh tổng hợp cellulase tương đương với chủng nấm sợi nghiên cứu Như thời gian nuôi cấy có ảnh hưởng rõ rệt đến khả sinh tổng hợp cellulase ba chủng tuyển chọn 3.2.4 Ảnh hƣởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Để phân giải polysaccarit khó phân giải cellulose tế bào vi sinh vật phải tổng hợp lượng lớn cellulase, trình sinh tổng hợp cần tới lượng lớn nitơ, có chủng sử dụng tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme Vì vậy, việc nghiên cứu ảnh hưởng nguồn nitơ lên khả sinh tổng hợp cellulase chủng nấm mốc để lên men có ý nghĩa quan trọng Ba chủng nấm Penicillium M3, Aspergillus M5-3 A niger M6-1 tuyển chọn nuôi cấy môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1) với nguồn nito sử dụng NaNO3, NaNO2, NH4Cl, (NH4)2SO4 thời gian ngày Sau đó, lấy dịch nuôi cấy đem li tâm loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính cellulase dịch nuôi cấy theo phương pháp trình bày phần 2.2.2.2 Kết trình bày bảng 3.5 hình 3.7 Vũ Ngọc Mai 37 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.5 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase M5-3 M3 M6-1 (D-d,cm) (D-d,cm) (D-d,cm) NaNO3 1.7 2.1 1.5 NaNO2 0.8 1.6 0.9 NH4Cl 1.4 1.8 1.3 (NH4)2SO4 1.1 2.0 1.2 Nguồn nitơ Hình 3.7 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase Qua kết bảng số liệu, nhận thấy ba chủng có khả sử dụng nhiều nguồn nitơ NaNO3 nguồn nitơ tốt cho ba chủng sinh tổng hợp cellulase Điều phù hợp với nhiều nghiên cứu cho nitrat nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp cellulase nhiều nấm sợi Aspergillus, Trichoderma Vũ Ngọc Mai 38 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.8 Khả sinh cellulase chủng Penicilium M3 nguồn nitơ (NH4)2SO4 NaNO3 Hình 3.9 Khả sinh cellulase chủng AspergillusM5-3 nguồn nitơ (NH4)2SO4 NaNO3 Vũ Ngọc Mai 39 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.10 Khả sinh cellulase chủng A niger M6-1 nguồn nitơ (NH4)2SO4 NaNO3 3.2.5 Ảnh hƣởng nguồn cellulose tự nhiên Nguồn cacbon có ảnh hưởng lớn đến khả tạo sinh khối sinh enzyme nấm Nó có vai trò chất kích thích nấm sinh tổng hợp cellulase Do đó, tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng nguồn cellulose tự nhiên đến khả sinh cellulase ba chủng nấm tuyển chọn Chủng Penicillium M3, Aspergillus M5-3 A niger M6-1 nuôi cấy môi trường Czapek- Dox thích hợp (phần 2.1.2.1) với nguồn cacbon sử dụng lõi ngô, vỏ trấu, vỏ lạc thời gian ngày Sau lấy dịch nuôi cấy đem li tâm loại bỏ sinh khối Xác định hoạt tính cellulase dịch nuôi phương pháp trình bày phần 2.2.2.2 Kết trình bày bảng 3.6 hình 3.11 Vũ Ngọc Mai 40 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Bảng 3.6 Ảnh hưởng nguồn cellulose tự nhiên Nguồn M5-3 M3 M6-1 cellulose (D-d,cm) (D-d,cm) (D-d,cm) Lõi ngô 1.3 1.8 0.7 Vỏ trấu 1.9 2.2 1.7 Vỏ lạc 0.8 2.0 0.9 Hình 3.11 Ảnh hưởng nguồn cellulose tự nhiên đến khả sinh cellulase Vũ Ngọc Mai 41 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp Hình 3.12 Khả sinh cellulase chủng Penicillium M3, AspergillusM5-3 A niger M6-1 vỏ trấu Trong thực tế, có nhiều chủng vi sinh vật có hoạt tính phân giải cellulose hòa tan (CMC) lại khả phân giải nguồn cellulose tự nhiên phân giải Nhưng kết nghiên cứu cho thấy, ba chủng tuyển chọn có khả phân giải nguồn chất tự nhiên để sinh cellulase Vỏ trấu nguồn cellulose tự nhiên tốt cho phát triển sinh tổng hợp enzyme ba chủng nấm Điều thuận lợi cho việc lựa chọn nguồn cacbon rẻ tiền để lên men thu enzyme ứng dụng thức ăn gia súc Kết giông kết nghiên cứu trước đây, chủng Vũ Ngọc Mai 42 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh môi trường có nguồn cacbon tự nhiên (Đặng Minh Hằng,1999; Hoàng Quốc Khánh et al., 2003) Vũ Ngọc Mai 43 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kết luận 1.1 Từ 30 chủng nấm mốc có khả tổng hợp cellulase phòng thí nghiệm vi sinh, Khoa Sinh – KTNN, trường ĐHSP Hà Nội phân lập từ mẫu rác thải, cành gỗ, cây, rơm rạ mục, đất mùn Vĩnh Phúc, tuyển chọn chủng M3, M5-3 M6-1 có khả sinh tổng hợp cellulase cao 1.2 Chúng tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hóa đặc tính sinh học ba chủng M3, M5-3 M6-1 Định loại đến chi đặt tên Penicillium M3 ( Samson ctv 1995), Aspergillus M5-3, A niger M6-1 ( Raper & Fennell, 1965) 1.3 Tiến hành nghiên cứu số yếu tố môi trường ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase hai chủng M3, M5-3, M6-1 rút điều kiện môi trường nuôi cấy tốt cho trình sinh tổng hợp cellulase hai chủng là: - pH thích hợp pH= - Nhiệt độ thích hợp 300C - Thời gian nuôi cấy: ngày - Nguồn nitơ tốt NaNO3 - Nguồn cellulose tự nhiên thích hợp vỏ trấu Kiến nghị 2.1 Kết bước đầu cho thấy ba chủng nghiên cứu có nhiều khả sản sản xuất cellulase 2.2 Tiếp tục nghiên cứu đặc tính lý, hóa enzyme cellulase ba chủng tuyển chọn dùng việc ứng dụng sản xuất cellulase phế phụ phẩm nông nghiệp Việt Nam, để bổ sung vào thức ăn chăn nuôi Qua giá Vũ Ngọc Mai 44 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội Khóa luận tốt nghiệp trị kinh tế phế phục phẩm nông nghiệp nâng cao, góp phần cải thiện kinh tế cho người nông dân, đồng thời làm giảm ô nhiễm môi trường Vũ Ngọc Mai 45 K32D Sinh - KTNN TÀI LIỆU THAM KHẢO A Tài liệu tiếng việt Chu Thị Thanh Bình, Nguyễn Lân Dũng, Lương Thị Thùy Dương Phân lập, tuyển chọn nghiên cứu chủng nấm men có khả phân giải cellulose nhằm ứng dụng xử lý bã thải hoa làm thức ăn chăn nuôi Trung tâm Công nghệ Sinh học, Đại học Quốc gia Hà Nội 2.Tăng Thị Chính, Lý Kim Bằng, Lê Gia Hy; 1999 - Nghiên cứu sản xuất cellulase số chủng vi sinh vật ưu nhiệt phân lập từ bể ủ rác Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ sinh học Toàn quốc Nxb Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội; tr 790 - 797 Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng; 1992 - Hóa sinh học Nxb Giáo dục; tr 80 - 81 Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo; 1991 - Điều kiện sinh khối nấm sợi Aspergillus hennebergii TH 386 môi trường xốp sắn ngô, tạp chí nông nghiệp công nghiệp thực phẩm Nguyễn Lân Dũng; 1994 - Nghiên cứu khả phân giải cellulose số chủng vi sinh vật phân lập Việt Nam Báo cáo Hội nghị Khoa học ủy ban Khoa học kĩ thuật nông nghiệp Nguyễn Lân Dũng; 1976 - Góp phần nghiên cứu cải tiến cấu thức ăn chăn nuôi lợn; Báo cáo Hội nghị Khoa Học; Trường Đại học Tổng Hợp Nguyễn Lân Dũng; 1976 - Một số phương pháp nghiên cứu vi sinh vật Tập 1-2-3; Nxb Khoa học Kỹ thuật Hà Nội; tr 325 - 347 Nguyễn Thành Đạt; 1999 - Cơ sở sinh học vi sinh vật Nxb Giáo dục Nguyễn Lân Dũng, Nguyễn Thế Hòa, Nguyễn Anh Bảo, Lê Chí Công; 1993- Nghiên cứu khả tích lũy sinh khối chủng Aspergillus hennbergii TH 386 môi trường nuôi cấy dịch thể chứa bột sắn sống, tạp chí Sinh học; tr 3-7 10 Nguyễn Thành Đạt, Nguyễn Duy Thảo, Vương Trọng Hào; 1990 - Thực hành vi sinh vật Nxb Giáo dục 11 Đặng Minh Hằng; 1999 - Nghiên cứu yếu tố ảnh hưởng đến khả sinh tổng hợp cellulase số chủng vi sinh vật để xử lý rác Báo cáo khoa học, Hội nghị Công nghệ Sinh học toàn quốc Nxb Khoa học Kỹ thuật; tr 333 - 339 12 Nguyễn Đức Lượng, Cao Tường, Nguyễn Ánh Tuyết, Lê Thị Thủy Tiên, Tạ Thu Hằng, Huỳnh Ngọc Anh, Nguyễn Thúy Hương, Phan Thị Huyền, Công nghệ enzym, Nxb Đại học Quốc Gia Tp.Hồ Chí Minh 13 Th.s Đỗ Hữu Phương; Đặc san khoa học kỹ thuật thức ăn chăn nuôi, số 3/2004 14 Nguyễn Xuân Thành, Lê Văn Hưng, Phạm Văn Toản; 2003 - Công nghệ vi sinh vật sản xuất nông nghiệp xử lý môi trường, Nxb Nông nghiệp 15 TS.Trần Cẩm Vân; Giáo trình Vi sinh vật học môi trường Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội; tr - 63 B Tài liệu tiếng anh 16 Hrmova M, Fincher GB; 2009 - Plant and microbial enzymes involved in the depolymerisation of (1,3)-β-D-glucans and related polysaccharides In: Chemistry, Biochemistry and Biology of (1,3)-β-D-Glucans and Related Polysaccharides, Academic Press, Elsevier Inc., San Diego, USA, 677 pp, 16 color plates (Bacic T, Fincher GB, Stone BA, eds), pp 119-170 17 Robert A Samson, John I Pitt; 2000 - Integration of modern taxonomic methods for Penicillium and Aspergillus classification, p: 83- 113 18 Raper Fennell ; 1965 - The Genus Aspergillus, The williiams & Wikins Company 428 E Preston street Baltimore, Md 21202 U.S.A, 570pp C Tài liệu internet 19 http://d.violet.vn/uploads/resources/562/529259/Enzime/Chuong9.pdf 20 http://www.sinhhocvietnam.com/forum/showthread.php?t=1839 21 http://www.vcn.vnn.vn/PrintPreview.aspx?ID=3596 [...]... đích nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose - Nghiên cứu ảnh hưởng của một số điều kiện nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase của các chủng nấm mốc đã được tuyển chọn 3 Đối tƣợng và phạm vi nghiên cứu Lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục được lấy ở một số nơi như: Xuân Hoà, huyện Yên Lạc, thành phố Vĩnh Yên (Vĩnh Phúc) được sử dụng để phân lập các chủng. .. luận tốt nghiệp CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Tuyển chọn các chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose Theo các phương pháp nghiên cứu như trên chúng tôi đã phân lập được 30 chủng nấm mốc có khả năng tổng hợp cellulase, kết quả này cho thấy các chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose ở Vĩnh Phúc khá là đa dạng Hoạt tính cellulase của các chủng được trình bày ở bảng sau: Bảng 3.1 Các chủng. .. ở nhiều chủng 1.6.3 Điều kiện nuôi cấy *Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ có ảnh hưởng tới sinh tổng hợp enzyme của các loài nấm khác nhau Nhiệt độ tối thích cho sinh trưởng của đa số nấm mốc trên môi trường Vũ Ngọc Mai 20 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp rắn là 250C÷400C Nhiệt độ dưới 250C hoặc trên 400C nấm mốc phát triển chậm, thời gian nuôi kéo dài, giảm khả năng sinh tổng... sinh tổng hợp enzyme *Ảnh hưởng của pH môi trường Khi nuôi cấy vi sinh vật bằng phương pháp bề mặt thì pH môi trường ít bị thay đổi trong quá trình nuôi do môi trường có dung lượng đệm cao và hàm ẩm thấp Tuy nhiên pH ban đầu của môi trường có ảnh hưởng không nhỏ đến sự phát triển của vi sinh vật cũng như sự tạo thành enzyme của vi sinh vật Trong một số trường hợp pH không chỉ ảnh hưởng đến lượng enzyme... dụng một số chủng vi sinh vật phân hủy cellulose được phân lập từ lá cây mục, đất mùn, gỗ cây mục, rơm rạ mục [được lấy ở một số nơi như: Xuân Hòa, huyện Yên Lạc, thành phố Vĩnh Yên (Vĩnh Phúc) ] trong phòng thí nghiệm Vi sinh, Khoa Sinh- KTNN, Trường ĐHSP Hà Nội 2 2.1.1 Nguyên liệu - Lõi ngô,vỏ trấu, vỏ lạc được sấy khô và nghiền nhỏ - Carboxylmethyl cellulose (CMC) 2.1.2 Môi trƣờng 2.1.2.1 Môi trường. .. trong khi tạo Cx ít hơn so với một số loại nấm khác 1.6 Một số yếu tố ảnh hƣởng đến sinh tổng hợp cellulase của vi sinh vật 1.6.1 Giống vi sinh vật Như chúng ta đã biết, có nhiều nhân tố ảnh hưởng đến sự tạo thành enzyme và hoạt tính của nó trong quá trình nuôi cấy vi sinh vật Đặc tính sinh Vũ Ngọc Mai 18 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp lí - sinh hóa và hoạt tính của nó trong... Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D-d, cm) Với D: là đường kính vòng phân giải d : là đường kính lỗ đục 2.2.2.3 Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính của cellulase + Xác định ảnh hưởng của pH lên hoạt tính của cellulase Cho cellulase phản ứng với CMC trong 30 phút trong các dung dịch đệm (dung dịch NaOH 1N và HCl 1N) có pH khác nhau từ 2-7 Xác định hoạt tính cellulase theo... còn ảnh hưởng đến cả chủng loại enzyme được tổng hợp *Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy Thời gian nuôi cấy ảnh hưởng rất lớn đến sự tạo thành enzyme Thời gian thích hợp để tổng hợp cellulase của A.niger từ 4 đến 7 ngày, còn đối với T.reesei từ 5 đến 9 ngày Vũ Ngọc Mai 21 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt nghiệp CHƢƠNG 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu và vi sinh. .. thông dụng khác của phòng thí nghiệm Vi sinh Khoa SinhKTNN, trường ĐHSP Hà Nội 2 2.2 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1 Phƣơng pháp vi sinh * Hoạt hóa các vi sinh vật Các vi sinh vật được giữ trong môi trường thạch nghiêng thích hợp mỗi loại ở 40C trong tủ lạnh Khi nhận được các giống vi sinh vật, hoạt hóa giống cấy lên bề mặt môi trường mới trong hộp petri Sau khi vi sinh vật phát triển thành khuẩn lạc riêng... vi sinh vật phân huỷ cellulose 4 Ý nghĩa khoa học của đề tài 4.1 Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu nhằm đi sâu, tìm hiểu hình thái, đặc điểm sinh lý, sinh hoá chủng nấm mốc có khả năng phân giải cellulose 4.2 Ý nghĩa thực tiễn Hi vọng các chủng được lựa chọn sẽ có triển vọng ứng dụng trong việc xử lý phế phẩm nông nghiệp làm thức ăn gia súc Vũ Ngọc Mai 3 K32D Sinh - KTNN Trường ĐHSP Hà Nội 2 Khóa luận tốt ... 3.2.2 Ảnh hưởng nhiệt độ đến khả sinh cellulase …………… 32 3.2.3 Ảnh hưởng thời gian nuôi cấy đến khả sinh cellulase …… 33 3.2.4 Ảnh hưởng nguồn nitơ đến khả sinh cellulase …………… 34 3.2.5 Ảnh hưởng. .. nghiên cứu - Phân lập, tuyển chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose - Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng nấm mốc tuyển chọn Đối tƣợng phạm vi nghiên. .. chọn chủng nấm mốc có hoạt tính phân giải cellulose …… 26 3.2 Ảnh hưởng số điều kiện nuôi cấy đến khả sinh cellulase chủng M3 M6-1………………………………………………………… 30 3.2.1 Ảnh hưởng pH đến khả sinh cellulase ……………………