Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Lời cảm ơn Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc, em xin chân thành cảm ơn thầy Nguyễn Khắc Thanh tận tình hớng dẫn giúp đỡ em hoàn thành khoá luận Em xin chân thành cảm ơn thầy cô giáo tổ môn vi sinh vật học toàn thể thầy cô giáo khoa tạo điều kiện giúp đỡ em hoàn thành khoá luận Tôi xin cảm ơn gia đình bạn bè động viên giúp đỡ suốt trình thực khoá luận Xuân Hoà, tháng năm 2009 Sinh viên Bùi Phạm Hoàng Hải Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Mục lục Trang Chơng 1: Phần mở đầu Chơng 2: Tổng quan tài liệu 2.1 Sơ lợc xạ khuẩn .7 2.1.1 Vị trí xạ khuẩn sinh giới 2.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn .7 2.1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn 2.1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn .8 2.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa xạ khuẩn 2.1.2.4 Đặc điểm chi xạ khuẩn Streptomyces 10 2.1.3 Phân bố xạ khuẩn 11 2.1.4 Vai trò xạ khuẩn 11 2.1.5 Phân loại xạ khuẩn 12 2.1.5.1 Sơ lợc lịch sử phân loại xạ khuẩn 12 2.1.5.2 Một số phơng pháp phân loại xạ khuẩn 13 2.1.5.2.1 Dựa vào đặc điểm hình thái tính chất nuôi cấy 13 2.1.5.2.2 Đặc điểm hóa phân loại 14 2.1.5.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hóa 15 2.2 Cellulose Cellulase 16 2.2.1 Cellulose 16 2.2.2 Cellulase .18 Chơng 3: Vật liệu phơng pháp 19 3.1 Vật liệu 19 Đại học s phạm H Nội 2 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải 3.1.1 Nguyên liệu 19 3.1.2 Hoá chất 19 3.1.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu 19 3.1.4 Vi sinh vật kiểm định 19 3.2 Phơng pháp nghiên cứu 20 3.2.1 Phơng pháp lấy mẫu 20 3.2.2 Phơng pháp phân lập đếm số lợng tế bào 20 3.2.3 Phơng pháp bảo quản sử dụng giống 21 3.2.4 Phơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 21 3.2.4.1 Phơng pháp xẻ rãnh thạch .21 3.2.4.2 Phơng pháp khối thạch 21 3.2.5 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc 21 3.2.6 Phơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hoá .21 3.2.6.1 Xác định axitamin đặc trng cho thành tế bào 22 3.2.6.2 Xác định hoạt tính enzim amylase, protease cellulase 22 3.2.6.3 Xác định khả nitrit nitrat hoá 23 3.3 Các môi trờng sử dụng nghiên cứu .22 3.3.1 Môi trờng giữ giống xạ khuẩn 23 3.3.2 Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định 23 3.3.3 Môi trờng phân lập xạ khuẩn 24 3.3.4 Môi trờng xác định khả nitrit nitrat hoá 24 3.3.5 Môi trờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn có khả phân giải cellulose .25 Chơng 4: Kết thảo luận 26 4.1 Kết phân lập xạ khuẩn 26 4.2 Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải 27 4.3 Kiểm tra hoạt tính enzim cellulase cuả xạ khuẩn 29 Chơng 5: Kết luận kiến nghị 31 Kết luận 31 Kiến nghị 31 Tài liệu tham khảo 32 Các chữ viết tắt khoá luận HSKS : Hệ sợi khí sinh HSCC : Hệ sợi chất VSV : Vi sinh vật MT : Môi trờng Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Chơng Phần mở đầu Cellulose thành phần cấu tạo thực vật, có tính bền đàn hồi cao Chính cellulose hợp chất khó phân giải, điều gây nhiều hậu nghiêm trọng Mỗi năm nớc ta có gần 382.500 vỏ cà phê đợc thải ra, so với chế phẩm nông nghiệp khác, chất thải phân huỷ lâu gây ô nhiễm môi trờng Cellulose gặp nhiều bã mía, nớc thải công nghiệp, gỗ công nghiệp, công nghiệp dệt chất thải ngành công nghiệp thực phẩm Hàng năm công nghiệp chế biến hoa nớc ta thải hàng trăm ngàn bã thải Lợng bã thải cha đợc xử lý riêng rẽ mà đợc đổ chung với nguồn rác thải vừa gây lãng phí, vừa gây ô nhiễm môi trờng Nếu lợng bã thải đợc xử lý làm thức ăn gia súc phân bón nguồn lợi lớn Vậy làm để giải vấn đề ? Ngày với tiến khoa học công nghệ có nhiều công trình nghiên cứu việc phân giải cellulose nhằm tận dụng bã thải nông nghiệp, công nghiệp cách triệt để Và xạ khuẩn đất đối tợng đợc sử dụng để phân giải cellulose có hiệu Các chủng xạ khuẩn đất có khả phân giải cellulose mạnh, nhằm tạo chế phẩm enzim có hoạt tính phân giải pectin cellulose Ngoài cách sử dụng xạ khuẩn đất có khả phân giải cellulose, sản phẩm phân bón vi sinh chất lợng cao đợc đời từ phụ phẩm nông nghiệp (bã mía, vỏ cà phê,) Phân bón vi sinh hữu có tác dụng làm tăng suất trồng, tăng độ phì nhiêu đất ức chế nấm bệnh trồng Thị trấn Xuân Hoà nằm thị xã Phúc Yên - Tỉnh Vĩnh Phúc Nơi có diện tích đất trồng trọt lớn Trong khu đất có số Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose cao Để tận dụng khả phân giải cellulose chủng xạ khuẩn định chọn đề tài : Nghiên cứu số chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose đất trồng trọt khu vực xuân hoà Đề tài nhằm giải vấn đề sau: Phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả phân giải cellulose đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà Nghiên cứu đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu Kiểm tra hoạt tính enzim cellulose chủng xạ khuẩn phân lập đợc Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Chơng tổng quan ti liệu 2.1 Sơ lợc xạ khuẩn: 2.1.1 Vị trí xạ khuẩn hệ thống sinh giới Xạ khuẩn (Actinomycetes) nhóm VSV lớn giới Bacteria Chúng thuộc nhóm VSV Gram (+) Theo Krassilnikov (1970) xạ khuẩn (Actinomycetes) đợc tách thành lớp riêng gồm có xạ khuẩn bậc cao (có hệ sợi phát triển, có quan sinh sản riêng) nhóm xạ khuẩn bậc thấp (có hệ sợi phát triển, tế bào có dạng hình que hình cầu) Xạ khuẩn có hệ sợi ngắn nh họ Mycobacteriaceae Actinomycetaceae, hệ sợi dài nh họ Streptomycetaceae Xạ khuẩn đợc Bergey xếp vào riêng Actinomycetales (Bergeys Manual, 1989) thuộc siêu giới nhân sơ (Prokaryota), Giới Bacteria, Ngành Firmicutes, Lớp Actinobacteria, Lớp phụ Actinobacteriaceae Theo hệ thống phân loại nay, xạ khuẩn thuộc nhóm vi sinh vật nhân nguyên thuỷ (Prokaryota) thuộc giới khởi sinh (Monera) hệ thống phân loại giới hay hệ thống phân loại giới xạ khuẩn thuộc giới vi khuẩn chuẩn (Eubacteria) thuộc siêu giới nhân sơ Bộ xạ khuẩn gồm 10 họ: Actinomycetaceae, Actinoplanaceae, Permatophilaceae, Frankiaceae, Micromonosporaceae, Thermomonosporaceae, Micobacteriaceae, Nocarddiceae Streptomycetaceae 2.1.2 Đặc điểm sinh học xạ khuẩn 2.1.2.1 Đặc điểm hình thái xạ khuẩn Tuỳ loại môi trờng mà xạ khuẩn có hình thái khác Trên môi trờng đặc, xạ khuẩn phát triển thành khuẩn lạc Tuỳ theo loài, môi trờng nuôi cấy mà kích thớc màu sắc khuẩn lạc khác nh đỏ, da Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải cam, vàng, nâu, tím, hồng, xám, khuẩn lạc xạ khuẩn thờng chắc, xù xì, có dạng da, dạng nhung tơ, hay dạng màng dẻo thờng có cấu trúc ba lớp: lớp có cấu trúc sợi bền chặt, lớp có cấu trúc tổ ong lớp có cấu trúc tơng đối xốp Cấu trúc khuẩn lạc xạ khuẩn với hớng sinh trởng môi trờng tạo hệ sợi chất (HSCC) mặt môi trờng tạo hệ sợi khí sinh (HSKS) Đờng kính hệ sợi xạ khuẩn thay đổi khoảng 0,2 - 1,0 m đến 2,0 - 3,0 m Đa số xạ khuẩn có hệ sợi phân nhánh mạnh, vách ngăn Màu sắc hệ sợi đa dạng, gặp màu trắng, vàng, da cam, đỏ, nâu, lục, tím, đen, HSCC sinh sắc tố tan nớc dung môi hữu HSKS tận thờng chuỗi bào tử có dạng xoắn, lợn sóng, thẳng, vòng, Đây đặc điểm quan trọng để phân loại xạ khuẩn Các bào tử xạ khuẩn có hình tròn, hình bầu dục, hình que, hay hình trụ, cấu trúc bề mặt bào tử nhẵn (Smooth), có gai (Spinny), khối u (Warty), nếp nhăn (Rugose) hay dạng tóc (Hair-like), hình dạng, kích thớc, cấu trúc bề mặt bào tử tiêu quan trọng để định loại xạ khuẩn Khi nuôi cấy xạ khuẩn môi trờng dịch thể, xạ khuẩn mọc thành dạng màng hay dạng vòng thành bình nuôi cấy, bề mặt môi trờng hay thành dạng bọt kết tủa kiểu vi khuẩn Khi nuôi cấy chìm máy lắc nồi lên men đợc khuấy đảo xạ khuẩn phát triển thành dạng sợi cặn xốp Nhng thờng gặp xạ khuẩn phát triển thành cầu nhỏ chứa đầy môi trờng, kích thớc từ 0,1mm đến - 3mm 2.1.2.2 Cấu tạo xạ khuẩn Xạ khuẩn có cấu tạo tơng đối giống vi khuẩn gồm có thành tế bào, màng tế bào chất, vật chất nhân sơ hạt dự chữ Xạ khuẩn thuộc nhóm VSV Gram (+) Thành tế bào dày khoảng 20 nm có vai trò trì hình dạng hệ sợi bảo vệ tế bào Thành đợc cấu tạo chủ yếu gồm lớp Glucopeptide Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải gồm gốc N-Acetylglucosamine liên kết với N - Acetylmuramic (hoặc N Glycolylmuramic ví dụ nh chi Micromonospora) Căn vào kết cấu hoá học chia thành tế bào xạ khuẩn thành nhóm sau: Nhóm (TypeI): có chứa L - Diaminopimelic (L - ADP) glycine Gồm có chi Streptomyces, Streptoverticillium, Chairia, Nocardioider Nhóm (TypeII): Có chứa Meso - Diaminopimelic (Meso - ADP) glycine Gồm chi Micromospora, Actinoplans, Ampullariella, Dactilosporangium Nhóm (TypeIII): Có chứa Meso - Diaminopimelic (Meso - DAP) Gồm có Actinomadura, Actinobigfida, Dermatophilus, Geodermatophilus, Nocardiopsis, Micronobispora, Nhóm (Type IV): Có chứa Meso - Diaminopimelic (Meso - DAP) Gồm có Nocardia, Oerskovia, Promicromonospora, Pseudonocardia, Rhodococcus, Mycrobacterium, 2.1.2.3 Đặc điểm sinh lý, sinh hoá xạ khuẩn Xạ khuẩn nhóm thể dị dỡng, chúng sử dụng đờng, rợu, axít hữu cơ, lipit, prôtêin nhiều hợp chất khác để làm nguồn cacbon Còn nitrat, nitrit, muối amôn, urê, axit amin, pepton, cao men, cao thịt, để làm nguồn nitơ loài khác khả hấp thụ hợp chất khác Phần lớn xạ khuẩn VSV hiếu khí, a ẩm, nhiệt độ thích hợp cho sinh trởng phát triển 25 - 300C Đa số xạ khuẩn phát triển tốt môi trờng có PH 6,8 - 7, số có khả phát triển tốt môi trờng kiềm Xạ khuẩn nhóm vi khuẩn Gram (+), đặc biệt khác với sinh vật khác nhóm nhân sơ có tỉ lệ G+X cao (>70%), vi khuẩn thấp (25 - 45 %) Đại học s phạm H Nội K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Một đặc điểm đáng lu tâm xạ khuẩn chúng không bền vững mặt di truyền thờng xảy xếp lại phân tử ADN Điều gây tính đa dạng hình thái, tính chất sinh lí, sinh hoá xạ khuẩn (khả đồng hoá nguồn cacbon, khả đồng hoá nguồn nitơ, hoạt tính kháng sinh, tính kháng thuốc, khả phân giải cellulose,) 2.1.2.4 Đặc điểm chi xạ khuẩn Streptomyces Chi Streptomyces có số lợng loài mô tả lớn nhất, chi có HSKS, HSCC phát triển phân nhánh, khuẩn lạc thờng không lớn, đờng kính khuẩn lạc từ 1-5 mm Khuẩn lạc dạng da, mọc đâm sâu vào chất, bề mặt khuẩn lạc thờng đợc phủ HSKS dạng nhung, dày HSCC không thấm nớc Chuỗi bào tử đợc tạo thành cuống sinh bào tử, chúng thẳng, lợn sóng xoắn Bề mặt bào tử nhẵn, xù xì, có lông có gai Xạ khuẩn có khả tạo thành loại sắc tố khác nhau, sắc tố nhuộm màu HSKS, HSCC, nhuộm màu môi trờng Các loài thuộc chi Streptomyces có cấu tạo thành giống thành vi khuẩn Gram dơng, vi sinh vật hiếu khí, kị dỡng Nhiệt độ sinh trởng tối u từ 25-30 0C, pH tối u : 6,5-8,0 Một số loài sinh trởng nhiệt độ cao thấp (xạ khuẩn a nhiệt xạ khuẩn a lạnh) Bên cạnh đặc điểm hình thái, nuôi cấy xạ khuẩn thuộc chi có đặc điểm hoá phân loại sau: Type thành tế bào: Type I dạng LL-DAP glixin Type Peptidoglucan: A3 Axit béo: Mạch thẳng bão hoà, đồng phân nhánh 15-17C với số lợng số lợng lớn axit phân nhánh 16 Ciso 15-17 Canteiso Dạng menaquinon: MK-9 (H6), MK-9 (H9) Dạng photpholipit: PII Không có axit mycolic Đại học s phạm H Nội 10 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Chơng vật liệu phơng pháp 3.1 Vật liệu 31.1 Nguyên liệu: Các mẫu đất lấy từ đất trồng trọt thuộc khu vực Xuân Hoà - Thị xã Phúc Yên - Tỉnh Vĩnh Phúc 3.1.2 Hoá chất Các hoá chất: KH2P04, MgSO4 7H20, NH4Cl, KN03, NaN03, (NH4)2SO4, NH4NO3, NaCl, NaOH, HCl, FeSO4 7H20, CaC03, Tinh bột tan, cao nấm men, pepton, thạch, Cazein, CMC (Cacboxyl Methyl Cellulose), cao thịt, 3.1.3 Máy móc thiết bị nghiên cứu - Tủ ấm vi sinh (Heaeus - Đức) - Tủ sấy (Heaeus - Đức) - Nồi hấp (TOMY Nhật) - Máy li tâm (Shorwall super T21 Mỹ) - Máy đo PH (MP200R Thụy Sĩ) - Cân điện tử (Precisa XT 320M Thụy Sĩ) - Giấy sắc kí loại chạy chậm hãng Whatsman - Kính hiển vi quang học 3.1.4 Vi sinh vật kiểm định Các chủng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ): Vi khuẩn (VK): Bacillus subtilis, Escherichia coli, Salmonella typhimurium Staphylococcus aureus Nấm: Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae Nấm mốc: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum, Mucor sp, Penicillium sp Đại học s phạm H Nội 19 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải 3.2 Phơng pháp nghiên cứu 3.2.1 Phơng pháp lấy mẫu Mẫu đất đợc lấy ngẫu nhiên vị trí khác Lấy mẫu đất lớp đất mặt (0,1 - 0,2cm) đất sâu (10 cm) Dùng dụng cụ vô trùng lấy mẫu đất lớp đất mặt (0,1 0,2cm) đất sâu (10 cm) vị trí ngẫu nhiên Đựng mẫu đất vào túi nilon vô trùng, buộc kín miệng túi, đánh số, ghi độ sâu lấy mẫu sau mẫu đất đợc bảo quản, vận chuyển phòng thí nghiệm để tiến hành phân lập 3.2.2 Phơng pháp phân lập đếm số lợng tế bào Dùng dụng cụ vô trùng lấy 1gam đất cho vào bình nớc muối sinh lý vô trùng 99 ml, lắc đều, pha loãng 102 lần Tiếp tục hút 1ml dịch huyền phù cho vào ống nghiệm chứa 9ml nớc muối sinh lí vô trùng, lắc đều, pha loãng 103 lần Dùng pipet vô trùng hút 0,2 ml dịch huyền phù độ pha loãng 103 lần nhỏ lên bề mặt môi trờng Gause I, Czapek tinh bột tan, chuẩn bị hộp petri Trang dịch đất lên mặt môi trờng, nuôi tủ ấm 280C300C Sau - 14 ngày mang hộp petri quan sát, đếm số lợng khuẩn lạc xạ khuẩn Từ tính số lợng xạ khuẩn 1gam đất theo công thức: M = ( X + 2X ) ì b / V (CFU ) Trong : M : Tổng số xạ khuẩn 1gam đất X : Số khuẩn lạc mọc lên từ độ pha loãng 2X : Độ lệch bình phơng trung bình b: Độ pha loãng nuôi cấy V: Thể tích dịch huyền phù dùng để phân lập CFU: Đơn vị hình thành khuẩn lạc (Colony Forming Unit) Đại học s phạm H Nội 20 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải 3.2.3.Phơng pháp bảo quản sử dụng giống Dùng que cấy vô trùng tách xạ khuẩn từ khuẩn lạc riêng rẽ sang ống môi trờng thạch nghiêng Gause I chuẩn bị sẵn Sau - 14 ngày nuôi cấy, lấy kiểm tra loại bỏ ống nhiễm sau tách loại xạ khuẩn sang ống khác, cuối thu đợc ống giống Các ống giống đợc bảo quản tủ lạnh 40C Cấy truyền định kì tháng lần Trớc tiến hành nghiên cứu đặc điểm sinh lý - hoá sinh cần phải hoạt hoá chủng xạ khuẩn cấy truyền giữ giống 3.2.4 Phơng pháp quan sát hình thái xạ khuẩn 3.2.4.1 Phơng pháp xẻ rnh thạch Cấy xạ khuẩn lên môi trờng dinh dỡng hộp petri cách trải dày que trang Dùng dao vô trùng xẻ rãnh thạch hộp petri Đặt hai kính vô trùng lên bờ rãnh thạch vừa xẻ, đậy nắp hộp petri để vào tủ ấm 280 300C 14 ngày Lấy quan sát chụp ảnh cuống sinh bào tử, hệ sợi dới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 -1000 lần 3.2.4.2 Phơng pháp khối thạch Đổ môi trờng Gause I vô trùng vào hộp petri cho thành lớp mỏng (1 - 1,5mm) Đổ khô môi trờng, dùng khoan nút chai ( = 0,9mm) khoan khối thạch Đặt khối thạch lên lam kính vô trùng chuẩn bị sẵn, đặt hộp petri vô trùng (trong hộp petri có cục ẩm) Cấy xạ khuẩn lên khối thạch Đặt vào tủ ấm 280 - 300C - 14 ngày Quan sát hệ sợi cuống sinh bào tử dới kính hiển vi quang học độ phóng đại 400 1000 lần 3.2.5 Quan sát đặc điểm khuẩn lạc Nuôi cấy xạ khuẩn môi trờng Gause I thạch đĩa thạch nghiêng Quan sát hình thái mô tả màu sắc khuẩn lạc xạ khuẩn theo thang màu chuẩn Bondarsev (1954), qua sơ phân nhóm xạ khuẩn 3.2.6 Phơng pháp nghiên cứu đặc điểm sinh lí, sinh hoá Đại học s phạm H Nội 21 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải 3.2.6.1 Xác định axit amin đặc trng cho thành tế bào Nuôi cấy xạ khuẩn môi trờng dịch thể Gause I Gause II, ngày nhiệt độ 280 -300C máy lắc với tốc độ 200 - 220 vòng/phút Li tâm thu sinh khối sấy khô nhiệt độ 400C Rửa sinh khối nớc cất cồn làm khô nhiệt độ 280 C Cân 10 mg sinh khối sấy khô, bổ sung 1ml dung dịch HCl 1N nút kín thuỷ phân nhiệt độ 600C vòng Dịch đợc đun cách thuỷ để loại HCl bổ sung thêm nớc cất đến PH đạt tới 5,6 6,0 Chấm 20 m dịch lên giấy sắc kí chạy hệ dung môi mêtanol: H20: HCl 6N: Pirimidin = 40:13:2:5 17giờ Để giấy khô tự nhiên hình dung dịch ninhydrin 0,5% aceton, sấy khô 800C Dạng LL - DAP có vệt màu vàng chanh dạng m - DAP có vệt màu xanh chạy chậm LL - DAP 3.2.6.2 Xác định hoạt tính enzim amylase, protease cellulase Cấy chấm điểm xạ khuẩn môi trờng thạch đĩa có chất tơng ứng Sau ngày thử hoạt tính enzim thuốc thử đặc trng đo vòng phân giải (D-d,mm) với D: vòng phân giải chất, d: đờng kính xạ khuẩn Xác đinh hoạt tính enzim protease môi trờng thạch chứa 1% tinh bột tan tinh bột sắn Thuốc thử lugol Xác định hoạt tính enzim protease môi trờng chứa 5% bột sữa tách bơ * Môi trờng thử hoạt tính protease: Lấy 500ml H20 bổ sung 18g thạch, hấp 1210C 30phút (1) Lấy 500ml H20 hoà tan với 5g bột sữa, hấp 800C lần để nguội hấp 800C lần 2, để nguội đến 400C (2) Sau hấp xong (1) (2), đổ (1) vào (2) để loại phần vẩn đục ra, lắc tan đổ môi trờng bình thờng Đại học s phạm H Nội 22 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Xác định hoạt tính enzim cellulose môi trờng chứa 0,5% bột giấy CMC, thử thuốc thử lugol 3.2.6.3 Xác định khả nitrit nitrat hoá Nuôi cấy xạ khuẩn ống nghiệm chứa môi trờng lỏng Gause I với KNO3 thay (NH4)2SO4 (thử hoạt tính nitrit hoá) KNO2 (thử hoạt tính nitrat hoá) Cho giọt dịch nuôi cấy vào sứ lõm, thêm vào giọt thuốc thử Griss I giọt Griss II Khi có mặt muối nitrit dịch có màu đỏ môi trờng có mặt nitrat dịch có màu trắng 3.3 Các môi trờng sử dụng nghiên cứu 3.3.1 Môi trờng giữ giống xạ khuẩn Môi trờng (MT) Gause I: Tinh bột tan: 20g FeSO4: 0,01g K2HPO4: 0,5g Thạch: 20g MgSO4: 0,5g Nớc cất: 1lit KNO3: 0,5g PH: 6.5 MT Gause II: Cao thịt: 3g Thạch: 20g Pepton: 5g Nớc cất: 1lit Glucose: 10g PH : 6,5 3.3.2 Môi trờng nuôi cấy vi sinh vật kiểm định MT nuôi cấy vi khuẩn: MT MPA Cao thịt: 5g Thạch: 20g Pepton: 5g Nớc cất: 1lit NaCl: 5g PH : 6,5 MT nuôi cấy nấm mốc: Saccharose: 30g MgSO4: 0,5g NaNO3: 3g FeSO4: 0,01g Đại học s phạm H Nội 23 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải KH2PO4: 0,5g Thạch: 20g KCl: 0,5g Nớc cất: 1lít MT nuôi cấy nấm men: MT Hanxen Glucose: 5g Thạch: 12-20g Pepton: 5g Nớc cất: 1lít KH2PO4: 3g PH: 6,5 MgSO4.7H2O: 2g 3.3.3 Môi trờng phân lập xạ khuẩn MT Czapeck-tinh bột: Tinh bột tan: 20g CaCO3: 3g KCl: 0.5g FeSO4.7H2O: 0.01g MgSO4.7H2O: 0.5g Thạch: 20g NaNO3: 3g Nớc cất: 1lít K2HPO4: 1g PH: 6.5 MT Czapeck-glucose: Glucose: 30g FeSO4.7H2O: 0.01g KCl: 0.5g Thạch: 20g CaCO3: 3g Nớc cất: 1lít MgSO4.7H2O: 0.5g PH: 7.0 NaNO3: 3g K2HPO4: 1g Nguồn cacbon: Glucose, saccharose, innositol, malnitol, malnose, maltose, lactose, cellulose Thanh trùng đèn cực tím 30 phút lọc qua phễu lọc vi khuẩn bổ sung vào môi trờng lúc nóng 3.3.4 Môi trờng xác định khả nitrit nitrat hoá MT nitrit hoá: (NH4)2SO4: 2g FeSO4: 0.1g K2HPO4: 1g CaCO3: 1g Đại học s phạm H Nội 24 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải MgSO4.7H2O: 0.5g Nớc cất: lít NaCl: 2g Glucose: 20g MT nitrat hoá: NaNO2: 1g FeSO4: 0.1g K2HPO4: 0.5g NaCO3: 1g MgSO4.7H2O: 0.3g Nớc cất: lít NaCl: 0.2g Glucose: 20g 3.3.5 Môi trờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn có khả phân giải cellulose Môi trờng 1: Pepton: 5g Nớc cất: 1000ml Cao thịt bò: 3g PH: 6.8-7.0 NaCl: 5g Thạch: 20g Môi trờng 2: Glucoza: 1g Nớc chiết đất: 100ml K2HPO4: 0.5g Nớc cất: 900ml Thạch: 20g PH: 6.5-7.0 (Chuẩn bị nớc chiết đất: 1Kg đất + lít nớc Hấp khử trùng 30 phút nồi hấp Bổ sung thêm 1g CaCO3 lọc lấy nớc trong) Đại học s phạm H Nội 25 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Chơng Kết v thảo luận Khi tiến hành môi trờng nuôi cấy để kiểm tra xạ khuẩn đất có khả phân giải cellulose, xác định đợc nhóm xạ khuẩn chi Streptomyces đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà có khả phân giải cellulose mạnh 4.1 K ết phân lập xạ khuẩn Từ mẫu đất lấy từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà, tiến hành phân lập xạ khuẩn chi Streptomyces Mẫu đất đợc pha loãng 103 nớc muối sinh lý vô trùng Môi trờng phân lập môi trờng Gause I môi trờng Czapek-tinh bột, nớc chiết đất Mỗi mẫu đất đợc phân lập hộp petri khác ( hộp chứa môi trờng Gause I, hộp chứa môi trờng Czapek-tinh bột) Mục đích nhằm sơ kiểm tra môi trờng sinh trởng chủ yếu Kết phân lập đợc trình bày bảng Bảng : Kết phân lập xạ khuẩn chi Streptomyces từ mẫu đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà Độ sâu Số chủng phân lập đợc Số tế bào(CFU/g) 14 5,27.102 23 9,85.102 Đất mặt (0,1-0,2cm) Đất sâu (10cm) Từ bảng cho thấy : Số lợng xạ khuẩn chi Streptomyces tính trung bình 1g đất bề mặt (0,1-0,2cm) so với số lợng xạ khuẩn tính trung bình 1g lớp đất sâu (10cm) Kết giống với kết phân lập loại vi khuẩn khác Điều giải thích tác động yếu tố là: ánh sáng, nhiệt độ Đại học s phạm H Nội 26 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải lớp đất mặt thờng có cờng độ chiếu sáng liên tục mạnh với tia cực tím có khả diệt khuẩn mạnh Đồng thời nhiệt độ cao với trời ma trôi phần xác hữu làm giảm phần độ màu mỡ lớp đất bề mặt lớp đất sâu (10cm) cờng độ ánh sáng yếu, nhiệt độ tơng đối ổn định, xác hữu đợc tích tụ phân giải dới tác động nhiều nhóm VSV trung gian tạo thành chất hữu trung gian hàm lợng oxy hoà tan cao, thuận lợi cho sinh trởng phát triển xạ khuẩn 4.2 Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu Nuôi cấy xạ khuẩn môi trờng Gause I, Gause II, Crapeck-tinh bột, Crapeck-glucose, ISP2, ISP4, ISP6, theo dõi khả sinh trởng, hình dạng khuẩn lạc, màu sắc HSKS, màu sắc HSCC Kết thể bảng 2: Bảng 2: Đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng xạ khuẩn nghiên cứu XK Môi trờng Kh nng sinh Hình dng Mu sc h Mu sc h trng khun lc si khí sinh si c cht 50% hi hng Cz- TB +++ Gồ gề nht 50% xám chì Cz- G +++ Nt 75% hng nht Da cam lc bn Nt 50% hng N9 GI +++ Nt ISP4 ++ nh nt G II + nh Nt ISP2 +++ To hn 80% xám chì ISP6 +++ Nt Nt Đại học s phạm H Nội 27 nht Kém phát trin Nt Vng lc Vng nht Da cam lc bn Nt K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp 138 027 Đ144 Bùi Phạm Hong Hải Kém phát Cz- TB + Bt Cz- G + Bt Nt Nt GI ++ Nt Nt Nt ISP4 ++ Bt Xám tím Da cam m G II +++ Bt Nt Nt ISP2 +++ Bt Nt Nt ISP6 +++ Bt Nt Nt Cz- TB ++ Bt Vng hi xám Cz- G +++ Nt Nt Nt GI +++ Nt Nt Nt ISP4 ++ Nt G II +++ Nt Vng hi xám ISP2 +++ Nt Nt Nt ISP6 +++ Nt Nt Nt Cz- TB ++ Bt Trắng Cz- G + Bt GI + Nt ISP4 + Nt G II +++ Nt ISP2 +++ ISP6 +++ Đại học s phạm H Nội 28 trin Kém phát triển Phát triển Vng lc Da cam thm Trng Da cam thm Trắng vàng nt Phát triển Phát triển nt nt Vàng xám Vàng oliu nhạt thẫm nt nt nt Nt Nt Vàng xám K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải G II +++ ISP2 +++ ISP6 +++ +: Sinh trởng yếu ++: Sinh trởng trung bình Nt Trng Bp, bin Trng, xanh chng da tri Nt Nt Gn trng Gn trng Nt +++: Sinh trởng tốt Qua bảng nhận thấy có thay đổi rõ rệt màu sắc hệ sợi khí sinh loại môi trờng gen quy định tính trạng nằm plasmide nên dễ bị biến đổi giúp xạ khuẩn thích nghi cao với môi trờng Các chủng sinh trởng tốt môi trờng có chứa nitơ hữu nh Gause II, ISP2, ISP6 Một số sinh trởng tốt môi trờng chứa nitơ khoáng nh Gause I, Crapeck-tinh bột, Crapeck-glucose, ISP4 Nh khả thu nhận sử dụng nguồn nitơ chủng xạ khuẩn khác Ngoài yếu tố sắt ảnh hởng lớn đến sinh trởng nh trờng hợp chủng NĐ9 Chủng NĐ9 sinh trởng tốt môi trờng chứa sắt nh Crapeck-tinh bột, Crapeck-glucose, Gause I, ISP2, ISP6 sinh trởng yếu môi trờng không chứa sắt nh Gause II, ISP4 Do sắt vào enzim feređoxindase, gây hô hấp hiếu khí mạnh làm cho hệ sợi khí sinh phát triển tốt Sự sinh trởng NĐ9 cần nhân tố sinh trởng vitamin cao malt cao nấm men nên môi trờng ISP2 ISP6 chúng sinh trởng tốt 4.3 Kiểm tra hoạt tính enzim cellulase xạ khuẩn Tôi tiến hành kiểm tra hoạt tính enzim ngoại bào chủng Streptomyces phân lập phơng pháp chấm điểm môi trờng Gause I có thay đổi nguồn C N Kết đợc thể bảng sau: Đại học s phạm H Nội 29 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Bảng Hoạt tính cellulase chủng xạ khuẩn chi Streptomyces phân lập đợc Mức độ hoạt tính Tổng Số Yếu chủng 37 Trung bình Mạnh Rất mạnh CMC BG CMC BG CMC BG CMC BG 17 18 10 12 100% 5.40% 0% 21.60% 18.92% 45.94% 48.65% 27.06% 32.43% Qua kết thu đợc thấy rằng: 100% chủng xạ khuẩn có khả sinh enzim cellulase CMC BG, chứng tỏ chủng Streptomyces phân lập đợc có khả sinh enzim endo - glucanase (Cx) exo - glucanase (C1) Điều giải thích nguồn cacbon hữu đất chủ yếu cellulose tự nhiên, có mức độ kết tinh cao khó phân giải Để thích ứng với điều kiện đó, xạ khuẩn chi Streptomyces đất phải thích nghi với hệ enzim tơng ứng exo - glucanase tách đơn vị cellobiose khởi đầu không khử chuỗi cellobiose Tóm lại khả sinh enzym ngoại bào chủng xạ khuẩn chi Streptomyces phân lập từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà tốt Điều giúp chúng tận dụng tốt nguồn dinh dỡng môi trờng để sinh trởng, phát triển Đồng thời có ý nghĩa lớn mặt sinh thái giúp cho việc phân huỷ nhanh hợp chất khó tiêu thụ đất (xác thực vật, động vật) thành chất đơn giản dễ hấp thụ, làm nguồn thức ăn nhiều loài động vật, thực vật Đại học s phạm H Nội 30 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Chơng KếT LUậN V kiến ngh Kết luận Từ mẫu đất lấy từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà-Thị xã Phúc YênTỉnh Vĩnh Phúc, tiến hành phân lập tuyển chọn xạ khuẩn thu đợc kết nh sau: a Đã phân lập tuyển chọn đợc 37 chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces b Nghiên cứu đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces dựa vào khả sinh trởng, hình dạng khuẩn lạc, màu sắc HSKS, màu sắc HSCC c Các chủng xạ khuẩn phân lập đợc có khả sinh enzim ngoại bào tốt Đặc biệt khả phân giải cellulose mạnh (với CMC 17 chủng, với bột giấy(BG) 18 chủng) Đây u lớn xạ khuẩn Kiến nghị Qua trình nghiên cứu xin đa số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu thành phần loài độ đa dạng xạ khuẩn chi Streptomyces nói riêng loài xạ khuẩn khác nói chung - Nghiên cứu thêm khả sinh chất kháng sinh xạ khuẩn chi Streptomyces có đất trồng trọt nhằm tìm loại kháng sinh quý nhóm xạ khuẩn - Tiếp tục nghiên cứu khả phân giải cellulose tự nhiên chi xạ khuẩn nhằm ứng dụng vào việc chế biến thức ăn gia súc, phân bón vi sinh cao cấp Đại học s phạm H Nội 31 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Ti liệu tham khảo Nguyễn Lân Dũng, 1997, Nguyễn Đình Quyến, Phạm Văn Ty, Vi sinh vật học, nhà xuất Giáo dục, trang: 38-42 Nguyễn Thành Đạt, 1999, Cơ sở vi sinh vật học, tập I, NXB Giáo dục, trang: 44-47, 67 Kiều Hữu ảnh, 1999, Giáo trình vi sinh vật học công nghiệp, NXB khoa học kĩ thuật Hà Nội, trang: 167-172 Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng, 2001, Sinh học vi sinh vật, nhà xuất Giáo dục, trang: 243-255 Trần Khánh Ngọc, 2003, Sơ nghiên cứu số Streptomyces có hoạt tính mạnh phân lập từ mẫu đất rừng ngập mặn huyện Thái Thụy tỉnh Thái Bình, khoá luận tốt nghiệp, trang: 3-14, 21-24 Phan Cự Nhân, Nguyễn Minh Công, Đặng Hữu Lanh, 1999, Cơ sở di truyền học, nhà xuất Giáo dục, trang: 99-135 Nguyễn Thị Thu, 2005, Nghiên cứu đặc điểm sinh học khả sinh chất kháng sinh số chủng Streptomyces phân lập từ rừng ngập mặn Việt Nam, luận văn tốt nghiệp, trang: 5-9, 14-16, 20-29, 37-62 Vũ Hồng Kim, 1997, Nghiên cứu Streptomyces kháng sinh chống nấm nhóm polyen phân lập từ đất tỉnh Sơn La, luận văn thạc sĩ sinh học, trang: 530, 46-49 Biền Văn Minh, 2002, Nghiên cứu khả sinh chất kháng sinh số chủng xạ khuẩn phân lập từ đất Bình Trị Thiên, luận văn tiến sĩ sinh học, trang: 3-14, 32-52 10 Vơng Trọng Hào, 1986, Nghiên cứu số chủng xạ khuẩn thuộc nhóm Hồng phân lập Việt Nam, luận án phó tiến sĩ sinh học, trang: 23-54 Đại học s phạm H Nội 32 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải 11 Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thị Trân Châu, Nguyễn Thanh Huyền, Lê Đình Lơng, Đoàn Xuân Mợu, Phạm Văn Ty, 1997, Một số phơng pháp nghiên cứu vi sinh vật, trang: 325-347 Đại học s phạm H Nội 33 K31B Sinh [...]... kiểm tra xạ khu n trong đất có khả năng phân giải cellulose, chúng tôi đã xác định đợc nhóm xạ khu n chi Streptomyces trong đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà có khả năng phân giải cellulose mạnh 4.1 K ết quả phân lập xạ khu n Từ các mẫu đất lấy từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà, tôi đã tiến hành phân lập xạ khu n chi Streptomyces Mẫu đất đợc pha loãng 103 trong nớc muối sinh lý vô trùng Môi trờng phân lập... 2.1.3 Phân bố của xạ khu n Xạ khu n là nhóm vi sinh vật phân bố rộng rãi trong tự nhiên Xạ khu n có thể phân lập từ đất , nớc, không khí, bùn, rác Đặc biệt trong đất xạ khu n chiếm số lợng rất lớn (Kuster, 1986) Theo Waksman thì trong đất xạ khu n chiếm 9 % - 45 % tổng số các VSV Và trong một gam đất có chứa tới 29000 - 24.000.000 mầm xạ khu n Tuy nhiên tuỳ các vùng đất khác nhau trên thế giới mà có sự... đổi lớn về số lợng xạ khu n trong đất Số lợng xạ khu n ở miền Nam bán cầu bao giờ cũng cao hơn miền Bắc bán cầu Ngoài ra số lợng xạ khu n trong đất còn phụ thuộc vào mức độ canh tác, độ phì nhiêu của đất, mức độ che phủ của thực vật, Đất giàu dinh dỡng, hữu cơ , khoáng thì có nhiều xạ khu n hơn so với đất nghèo dinh dỡng Trong một gam đất canh tác có thể phân lập đợc 5.000.000 CFU/g xạ khu n Đất vùng... chủng xạ khu n phân lập đợc có khả năng sinh enzim ngoại bào khá tốt Đặc biệt là khả năng phân giải cellulose mạnh (với CMC 17 chủng, với bột giấy(BG) là 18 chủng) Đây là một u thế lớn của xạ khu n 2 Kiến nghị Qua quá trình nghiên cứu tôi xin đa ra một số kiến nghị sau: - Tiếp tục nghiên cứu về thành phần loài và độ đa dạng của xạ khu n chi Streptomyces nói riêng và các loài xạ khu n khác nói chung - Nghiên. .. đất nghiên cứu cần phải chú ý tới các điều kiện nh thành phần lớp đất, sinh cảnh, thời điểm lấy mẫu, độ ẩm, nhiệt độ, 2.1.4 Vai trò của xạ khu n Xạ khu n là một trong nhiều loại VSV có ý nghĩa quan trọng trong tự nhiên bởi vai trò tích cực trong việc tham gia vào các quá trình chuyển hoá những hợp chất trong đất, nớc Xạ khu n có khả năng sinh chất kháng sinh, có 60% - 70% xạ khu n phân lập từ đất có. .. dinh dỡng có số lợng xạ khu n ít hơn, dao động trong khoảng 10.000 - 100.000 CFU/g Xạ khu n là nhóm VSV a trung tính hay kiềm yếu, do đó sự phân bố của xạ khu n trong đất còn phụ thuộc vào độ PH của đất ở các đất có độ PH trung tính hoặc hơi kiềm thì có mật độ xạ khu n cao hơn so với các vùng đất có độ PH quá kiềm hoặc quá axit (chua) Đồng thời số lợng xạ khu n còn phụ thuộc vào các thời điểm trong năm... đất lấy từ đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà-Thị xã Phúc YênTỉnh Vĩnh Phúc, chúng tôi đã tiến hành phân lập và tuyển chọn xạ khu n thu đợc kết quả nh sau: a Đã phân lập và tuyển chọn đợc 37 chủng xạ khu n thuộc chi Streptomyces b Nghiên cứu về đặc điểm hình thái và nuôi cấy của 4 chủng xạ khu n thuộc chi Streptomyces dựa vào khả năng sinh trởng, hình dạng khu n lạc, màu sắc HSKS, màu sắc HSCC c Các chủng. .. cứu thêm về khả năng sinh chất kháng sinh của xạ khu n chi Streptomyces có trong đất trồng trọt nhằm tìm ra những loại kháng sinh quý của nhóm xạ khu n này - Tiếp tục nghiên cứu khả năng phân giải cellulose tự nhiên của các chi xạ khu n nhằm ứng dụng vào việc chế biến thức ăn gia súc, phân bón vi sinh cao cấp Đại học s phạm H Nội 2 31 K31B Sinh Khoá luận tốt nghiệp Bùi Phạm Hong Hải Ti liệu tham khảo... trờng Gause I, Czapek tinh bột tan, đã chuẩn bị trong các hộp petri Trang đều dịch đất lên mặt môi trờng, nuôi trong tủ ấm 280C300C Sau 7 - 14 ngày mang các hộp petri ra quan sát, đếm số lợng khu n lạc xạ khu n Từ đó tính số lợng xạ khu n trong 1gam đất theo công thức: M = ( X + 2X ) ì b / V (CFU ) Trong đó : M : Tổng số xạ khu n trong 1gam đất X : Số khu n lạc mọc lên từ độ pha loãng này 2X : Độ lệch... Hồng Kim, 1997, Nghiên cứu Streptomyces kháng sinh chống nấm nhóm polyen phân lập từ đất tỉnh Sơn La, luận văn thạc sĩ sinh học, trang: 530, 46-49 9 Biền Văn Minh, 2002, Nghiên cứu khả năng sinh chất kháng sinh của một số chủng xạ khu n phân lập từ đất Bình Trị Thiên, luận văn tiến sĩ sinh học, trang: 3-14, 32-52 10 Vơng Trọng Hào, 1986, Nghiên cứu một số chủng xạ khu n thuộc nhóm Hồng phân lập ở Việt ... Hải chủng xạ khu n có khả phân giải cellulose cao Để tận dụng khả phân giải cellulose chủng xạ khu n định chọn đề tài : Nghiên cứu số chủng xạ khu n có khả phân giải cellulose đất trồng trọt khu. .. tra xạ khu n đất có khả phân giải cellulose, xác định đợc nhóm xạ khu n chi Streptomyces đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà có khả phân giải cellulose mạnh 4.1 K ết phân lập xạ khu n Từ mẫu đất. .. khu vực xuân hoà Đề tài nhằm giải vấn đề sau: Phân lập tuyển chọn chủng xạ khu n có khả phân giải cellulose đất trồng trọt khu vực Xuân Hoà Nghiên cứu đặc điểm hình thái nuôi cấy chủng xạ khu n