BỘ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HỐ CỦA NHÂN TRAN (Adenosma caeruleum R.Br.) VÀ MỘT SỐ DƯỢC LIỆU KHÁC KHỐ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ ĐẠI HỌC KHỐ 50 (1995-2000) Sinh viên thực : Nguyễn Hồng Tuấn Người hướng dẫn : TS Nguyễn Duy Thuần TS Nguyễn Hồng Nơi thực : Bộ mơn Dược Liệu Trường đại học Dược Hà Nội Thời gian thực : 1/ 19ậ9. 5/ 2000 'ý } ‘5ti" -/ Lời cám ơn (ĩ)ấi lòíUị nti tirũễiạ úìí hiêỉ úễt sảu sắ tài r t hủụ ỈÁ Lồi ếm đít eliứỉi thành tồi : & S Qlgxiạễ^L 0)íiij ^/Ítíííiễi rĩcS OtgxtíỊMSL ^ỗ o n q (ìlhữíUị ttạưèi ĩtủ tí'Uừ tiỉịt hưâễiụ ilảíi oỉí ừhí húí) t ê ỉ hoỉiiĩ t h n h U hố lu ă n tết tiụ h iêp Ểiàí/ Cjế)i iiiq gốc superoxyd nhanh chóng enzyme superoxyd dismutase (SOD) phân huỷ, tạo hydroperoxyd (H20 2) theo phản ứng: 2• + • + 2H+ SOD ► H20 + Ở nấc tiểu phân trung gian hydroperoxyd (H20 2), gốc hydroxyl ('OH) Những tiểu phân dễ nhường nhận điện tử Vì người ta gọi chúng tiểu phân có khả phản ứng cao Một số ion kim loại chuyển tiếp: Fe2+,Cu2+ xúc tác cho q trình tạo nhiều gốc hydroxyl phản ứng c v với Ho02 (phản ứng Fenton) 2- + H20 —í—► OH + OH + '0 Các gốc ‘OH có khả phản ứng nhanh với acid béo chưa no tạo hydroperoxyd lipid (LOOH) Sự phân huỷ LOOH tạo gốc : gốc alKoxyl (LO'), gốc peroxyl (LOO ) Những tiểu phân gốc có tính oxy hố mạnh, dễ dàng tương tác với phân tử bên cạnh tạo phân tử Tất tiểu phân chứa oxy có hoạt tính cao ( •, OH, H20 2, LO', LOO' ) gọi dạng oxy hoạt động (DOXHĐ) 2.1.3 Hệ thơng chất chống oxy hố thể: Người ta thấy thể có chất có khả phân huỷ, loại bỏ dạng oxy hoạt động này, chúng gọi chất chống oxy hố (CCOXH) điển hình có thể như: * SOD: xúc tác cho phản ứng phân huỷ gốc 2'' 2- + 2" + 2H+ S°D ►H A + * Glutathionperoxydase (GSH-PO) xúc tác cho phản ứng phân huỷ Ho02 LOOH HOOH + 2GSH ►GSSG + 2H20 LOOH + 2GSH ►GSSG + LOH + H20 * Catalase: xúc tác cho phản ứng phân huỷ H20 2H20 -Ca_talase ►2H2Q + * Vitamin E: loại bỏ gốc peroxyd lipid (LOO) * Vitamin C: phân huỷ ‘OH, H20 * Các protein giữ Fe2+, Cu2+ dạng phức chất (khơng cho Fe2+, Cu2+ trạng thái tự xúc tác cho phản ứng Fenton) Transíerin lacterin (phức hố Fe2+), ceruloplasmin (phức hố Cu2+) Chính nhờ chất chống oxy hố mà việc sản sinh dạng oxy hoạt động trao đổi bình thường để thực chức sinh lý trì cân thích hợp Vì lý đó, sản sinh dạng oxy hoạt động tăng lên, số lượng hoạt tính chất chống oxy hố thể giảm xuống dẫn tới rối loạn q trình trao đổi chất tế bào dẫn tới q trình bệnh lý 2.2.Sự liên quan gốc tự với số q trình bệnh lý [16] 2.2.1 Gốc tự với sơ q trình viêm Khi tác nhân gây viêm ( vi khuẩn, dị vật ) từ ngồi xâm nhập vào thể tế bào bị kích thích phát yếu tố hố ứng động kéo bạch cầu đến làm nhiệm vụ thực bào Khi tiếp xúc với vi khuẩn dị vật bạch cầu mọc giả túc, bao lấy chúng Khi màng bao quanh khép kín, bạch cầu có tăng đột ngột chuyển hố tiêu thụ oxy để sinh HọOọ, 'OH nhằm tiêu huỷ tác nhân Để bảo vệ mình, bạch cầu sinh nhiều chất chống oxy hố SOD, GSH, GSH-PO, Catalase Song có 10% bạch cẩu bị chết DOXHĐ mà sinh Khi bạch cầu bị phân huỷ, gốc tự oxy ngồi, cơng vào tế bào xung quanh gây tổn thương, làm cho đáp ứng kích thích tế bào khu vực xảy mạnh Các gốc tự giải phóng ngoại bào góp phần tạo nên tượng sưng, nóng, đỏ, đau biểu viêm 2.2.2 Gốc tự với bệnh tim mạch Bệnh tim mạch thường bệnh người già Bởi già DOXHĐ tăng, CCOXH giảm Chính chuyển dịch cân DOXHĐ với CCOXH làm cho lượng gốc tự có nhiều khả oxy hố hạt lipoprotein tỷ trọng thấp (LDL) Các hạt LDL bị oxy hố khơng trạng thái tự nhiên, khơng vai trò cung cấp cholesterol cho tế bào, trở thành chất lạ bị đại thực bào hay bạch cầu thực bào Khi trầm lắng xuống thành mạch, hạt LDL bị oxy hố, bị bạch cầu hay đại thực bào ăn theo chế sinh gốc tự lớn dần, phát triển thành đám tế bào bọt Và từ đám tế bào bọt phát triển thành mảng vữa xơ thành mạch Thành mạch tích tụ nhiều tế bào bọt, phình to dần, làm hẹp dần lòng động mạch Khi lòng động mạch bị thu hẹp tới 70%-80% so với bình thường lúc máu lưu thơng tới tổ chức khơng đủ nhu cầu Đặc biệt động mạch vành, bắt đầu xuất co thắt ngực dẫn tới nhồi máu tim Hiện tượng mảng vữa xơ bong ra, lang thang theo dòng máu bít mao mạch đường di chuyển, gây tắc mạch, dẫn đến nhũn não tai biến mạch máu não Q trình nhồi máu, nhũn não., máu khơng cung cấp đủ lượng máu so với nhu cầu Thời gian máu khơng cung cấp đủ lượng máu theo u cầu gây tình trạng thiếu máu cục (TMCB) Người ta thấy TMCB tắc mạch hay chèn ép thành mạch gây Hiện tượng thời, lâu Khi dòng máu lưu thơng lại đưa tới gọi tưới máu trở lại (TMTL) Người ta thấy gốc tự oxy tăng lên nhanh thời gian TMCB đặc biệt tăng vọt lên TMTL Chính gia tăng gốc tự TMCB & TMTL (hay xảy phẫu thuật, chống, sốc ) Nhỏ giọt dịch chiết lên giấy lọc, để khơ hơ lên miệng lọ amoniac đặc, thấy màu vàng đậm hon lên Phản ứng dương tính * Định tính tanin: Cho vào ống nghiệm gam dược liệu, thêm 10 ml nước cất, đun sơi trực tiếp phút Lọc qua giấy lọc gấp nếp Dịch lọc làm phản ứng sau: - Phản ứng với gelatin 1% Cho lml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm giọt dung dịch gelatin 1%, khơng thấy xuất bơng trắng Phản ứng âm tính - Phản ứng với dung dịch FeCl3 5% Cho lml dịch lọc vào ống nghiệm, thêm giọt dung dịch FeCl3 5%, lắc thấy xuất tủa xanh * Định tính glycosid tim: - Cho vào bình nón dung tíchlOOml khoảng 10 gam dược liệu, thêm 80ml cồn 25° Ngâm 24 giờ, gạn lấy dịch chiết Loại tạp dung dịch chì acetat 30% dư Lọc bỏ tủa, dịch lọc cho vào bình gạn lắc kỹ lần với chlorbrm lần 20 ml, gạn lấy dịch chlororm vào cốc thuỷ tinh Bốc cách thuỷ đến khơ Cắn hồ tan cồn 90°, dịch chiết cồn để làm phản ứng định tính glycosid tim - Phản ứng Legan Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm giọt dung dịch Natri nitroprasiat 1% vài giọt dung dịch NaOH 10% để đảm bảo kiềm dư, khơng thấy xuất màu hồng Phản ứng âm tính - Phản ứng Baljet Cho lml dịch chiết vào ống nghiệm, thêm 0,5ml thuốc thử picrosodic, khơng thấy xuất màu đỏ da cam Phản ứng âm tính - Phản ứng Liberman: Cho lml dịch chiết dược liệu vào ống nghiệm, cách thuỷ thành cắn Cho tiếp vào 0,5 ml anhydric acetic Lắc tan hết cắn Đặt nghiêng ống nghiệm 45° Cho thêm đồng lượng acid sulíuric đặc (0,5 ml) theo thành ống nghiệm, để dịch lỏng ống nghiệm chia thành lớp Ở lớp chất lỏng khơng thấy xuất vòng tím đỏ Phản ứng âm tính V * Định tính saponin: 24 - Cho giọt dịch chiết cồn vào ống nghiệm có 5ml nước, lắc mạnh 15 giây, có cột bọt cao cm vòng 15 phút Phản ứng dương tính - Phản ứng với H2S04 đậm đặc: Nhỏ giọt H2S04 đậm đặc lên cốc sứ chứa cặn dịch chiết cồn, thấy xuất màu tím đỏ Phản ứng dương tính Kết định tính nhóm chất nhân trần tóm tắt bảng 3: Bảng 3: Kết định tính nhóm chất nhân trần Stt Tên nhóm chất Alcaloid Phản ứng Thuốc thử Mayer Thuốc thử Dragendoff Thuốc thử Bouchardat Acid picric Glycosid tim Phản ứng Liberman Phản ứng Legal Flavonoid - - - - Phản ứng Cyanidin +++ Dung dịch NaOH +++ Dung dịch F e 35% +++ Phản ứng với NH3 +++ Phản ứng Bortraeger Coumarin Phản ứng mở vòng lacton ++ Phản ứng huỳnh quang ++ Phản ứng diazohố + Phản ứng với gelatin Khơng - Antraglycosid Tanin Khơng - Kết luận - Phản ứng Baljet Kết - - Dung dịch FeCl3 5% + Có Khơng Có Khơng Acid hữu Phản ứng với N2C03, giải phóng C02 ++ Có Saponin Phản ứng tạo bọt + Có Phản ứng với H2S04đậm đặc + 25 Ký hiệu: +++ Phản ứng dương tính rõ + Phản ứng dương tính rõ ++ Phản ứng dương tính vừa - Phản ứng âm tính ♦ Nhận xét: Qua phản ứng định tính sơ bộ, chúng tơi thấy nhân trần ngồi tinh dầu biết có chứa nhiều ílavonoid coumarin, saponin, từ hướng nghiên cứu chúng tơi đánh giá hoạt tính chống oxy hố Aavonoid 4.2.2 Quy trình chiết tách Flavonoid từ nhân trần: 500 gam dược liệu sấy 60-65°C tủ sấy giờ, đem thái tán nhỏ thành bột Sau bột dược liệu chiết cách thủy hồi lưu cồn 80° 2500ml x3 lần, lần Dịch chiết cất thu hồi đến khi khoảng 50% đem cách thuỷ thành cao dược liệu, hồ cao nước cất đem chiết bình gạn dung mơi phân cực khác Quy trình thực mơ tả sơ đồ [20] 26 Sơ đồ 1: Quy trình chiết tách Fỉavonoid từ nhân trần 27 ♦ Nhận xét: Dịch chiết ete, dịch chiết chloroform, dịch chiết ethylacetat, dịch chiết nước lại đem thử phản ứng định tính chúng tơi thấy Aavonoid chủ yếu có mặt dịch chiết ethylacetat 4.2.3 sắc ký giấy Phân tích hỗn hợp Flavonoid sắc ký lớp mỏng * Dịch chấm sắc ký: Hồ tan cắn ílavonoid tồn phần từ dịch chiết ethylacetat metanol vào ống nghiệm * Khai triển sắc ký giấy hệ dung mơi: Hệ I: Acid acetic - nước (15 : 85) Hệ III: Acid acetic - nước ( 60 : 40) * Khai triển sắc ký lóp mỏng hệ dung mơi: Hệ II: n-buthanol - acid acetic - nước (4 : : 5) Hệ IV: ethylacetat bão hồ nước * Các thuốc thử: Hơi amoniac, dung dịch A1C13 3%/ethanol ' Kết bảng sơác L Bảng Kết sắc kỷ chiềỉavonoid tồn phần %iấy, hệ dung mơi khác Thứ tự vết Rf hệ dung mơi Hệ I Hệ II Hệ III Hê IV 0.42 0.014 0.083 0.1 0.16 0.54 0.07 0.178 0.24 0.64 0.21 0.25 0.44 0.43 0.78 0.38 0.64 0.54 0.5 0.64 0.62 0.72 28 Hiện màu với thuốc thử uv u v /n h u v / d 2AlCl3 vàng vàng vàng vàng vàng vàng vàng vàng đậm vàng đậm Tím Tím Tím Tím Tím Tím Tím Tím Tím Tím Tím Tím Sơ đồ Sắc ký chiều giấy với hai hệ dung mơi Ký hiệu màu Màu tím Màu vàng Chiều 1: Acid acetic: H20 (15:85) Chiều 2: n-Butanol: acid acetic: H20 (4:1:5) Thuốc thử màu: A1C133%/ etanol * Nhận xét: Kết khảo sát sắc ký chiều chiều cho thấy dịch chiết ethylacetat có vết chất có vết đặc trưng Aavonoid ( cho màu vàng với thuốc thử AICI3) 4.2.4 Phân lập Flavonoid sắc ký cột phối hợp vói sắc ký giấy chê hố * Phân lập Flavonoid sắc ký cột - Chuẩn bị Flavonoid tồn phần chất hấp phụ Flavonoid tồn phần (dịch chiết ethylacetat) cách thuỷ hết dung mơi ethylacetat, trộn với lượng cellulose thành bột tơi khơ - Chuẩn bị cột: 29 Chất hấp phụ cellulose cho vào cột có kích thước 2x30 cm tương ứng với lượng Flavonoid tồn phần cần tách 500 mg Tỷ lệ cellulose Flavonoid tồn phần 50:1 Sau cho phần bột chuẩn bị vào cột lên bề mặt cột cellulose, chiếm khoảng 1-1,5 cm Phủ nhẹ lên bề mặt lớp mỏng bột cellulose - Khai triển cột rửa giải cột Phản hấp phụ hệ cồn ethylic 20°, 40°, 60°, 80°, cồn tuyệt đối Hứng 13 phân đoạn, đem chạy sắc ký giấy với hệ dung mơi acid aceic: H20 (15:85) để thử sơ bộ, tính Rf từ gộp phân đoạn 5-10 *Chế hố sắc ký giấy Phân đoạn 5-10 đem chế hố sắc ký giấy (Whatman N°4) với hệ acid acetic: H20 (15:85) cắt lấy vết có R 1=0,43 Giấy sắc ký sau cắt đem phản hấp phụ metanol Dịch metanol để bay tự nhiên thu chất tinh thể hình kim màu vàng đặt tên FA] Kiểm tra sắc ký giấy sắc ký lớp mỏng với hệ dung mơi khác cho vết, chứng tỏ FA, tách dược đạt độ tinh khiết cần thiết 4.2.5 Nhận dạng FAj * Tính chất: Tinh thể hình kim màu vàng, tan metanol, etanol, ethylacetat Rf hệ dung mơi acid acetic-nước (15:85) 0,24, Rf hệ dung mơi n-butanol-acid acetic-nước (4:1:5) 0,64, Rf hệ dung mơi acid acetic-nước (60:40) 0,21 , Rf hệ dung mơi ethylacetat bão hồ nước 0,25 * Phổ tử ngoại: Có hai đỉnh đặc trưng băng II X = 267,77 nm băng I X = 335,55 nm ( với I - II = 67 nm) cho thấy FAị đặc trưng Aavon * Phổ hổng ngoại: có đỉnh 3400 cm^chỉ có mặt nhóm ceton, có đỉnh 2351,9 cm'1, 2087 cm'1, 1841,9 cm ',1651,4 cm ',1455,2 crrV1 đặc trưng cho có mặt nhóm (OH) 30 Hình Phổ tử ngoại chất FAj AB£ A p c , ABS NM m ĩm m 11 1540•'! 3.'/’43.64 :i 72 ■ ?.36 ■ ?,vĩ7.773 220 000 c;■ >fi 2Z.l>«5 vyy) I M píỹmvTíY ỉ i n n O ’ 3a»i»p H.UTK/TurU} B «Ỉ5W M^ Si>v 180 smi 0BS Bạs&ì Ịne 170! „ J?ÍISÍL 450.00 $1 z.mm ị \ wmj/ 40«m NM M LíTbeỉ H.ore 3tfổ.B0 „ I B.B883 “> 2.53BB 'PỘaỊỊS sriĩlriri Etitstì ÚÍM Ịte-scỡìe om Ụse X)-•£-.q.rapỊMẹs cnrsor , IracR t s l.opg Hình phổ hồng ngoại chất FAj 3kt 3[...]... uralensis) Ngoài những tác dụng và công dụng cổ truyền, gần đây nhân trần được các nhà nghiên cứu quan tâm nhiều đến hoạt tính chống oxy hoá, bảo vệ tế bào gan dưới dạng hỗn hợp dịch chiết nước của nhân trần và tảo[10] 2.5 Những kết quả đã nghiên cứu về thành phần hoá học của cây nhân trần (Adenosma caeruleum) Theo một số tài liệu[ 11,15] trong nhân trần có saponin tritecpic, Aavon, acid nhân thơm,... thuốc nghiên cứu: - Tất cả đều có tác dụng chống oxy hoá phù hợp với kết quả sàng lọc bằng Screening tets [6] và đều là các vị thuốc âm dược - Hiệu lực chống oxy hoá của nhân trần theo kết quả trên là cao nhất và hiệu lực chống oxy hoá của mạch môn là thấp nhất Để tìm hiểu sâu hơn về nhóm chất có hoạt tính COXH chúng tôi chọn nhân trần, vị thuốc có COXH mạnh nhất trong số các dược liệu nghiên cứu 4.2 Nghiên. .. dược liệu nghiên cứu 4.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của các nhóm hoạt chất tách ra từ nhân trần 21 4.2.1 Định tính một sô nhóm hợp chất trong cây nhân trần * Định tính alcaloid: Cho khoảng 3 gam nguyên liệu vào bình nón dung tích 100 ml, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch NH4OH 1/2 N Sau 30 phút thì cho chloroíòrm vào, đậy kín Ngâm 12 giờ, gan dịch chloroform vào bình gạn Sau đó lắc kỹ với dung... khác nhau; Acid acetic - nước (15 : 8 5) (hệ I); n-buthanol - acid acetic - nước ( 4 : 1 : 5) (hệ II); acid acetic - nước ( 60 : 4 0) (hệ III); ethylacetat bão hoà nước (hệ IV); Các thuốc thử: Hơi amoniac, dung dịch FeCl3 3%/ethanol 16 IV.THựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 4.1 Khảo sát hoạt độ chống oxy hoá của nước sắc của các dược liệu nghiên cứu: 4.1.1 Xác định hoạt độ chống oxy hoá theo phương pháp đo quang: •... người ta đã tách được các polyphenol đa vòng chống oxy hoá [21] - Các polyphenol được chiết từ dịch chiết lá chè xanh có tác dụng làm tăng hoạt tính chống oxy hoá của các enzym có tác dụng chống oxy hoá [12] - Các curcuminoid chiết từ thân rễ của một số loài thuộc họ Zingiberaceae có hoạt tính chống oxy hoá khá mạnh.[19] • Khi nghiên cứu CCOXH ở nhiều họ thực vật khác nhau Macximôp [24] đã thu được kết... lượng ) thừa Phải chăng quá trình oxy hoá mạnh và hiện tượng dương thịnh, nhiệt thịnh theo y học cổ truyền là một Do vậy sự có mặt phổ biến các CCOXH trong thuốc âm dược là có cơ sở khoa học • Những năm gần đây một số nhà nghiên cứu đã chú ý đến khả năng chống oxy hoá của nhân trần ( Adenosma caeruleum R .Br họ Hoa mõm chó Scrophulariaceae) là một vị thuốc vị đắng, tính bình, hơi hàn quy kinh bàng quang... Steroid Kinchia đã nghiên cứu hoạt tính chống oxy hoá của một số steroid: Glucosid của hecogenin, diosgenin, sarsasapogenin, neotigogenin, các đổng đẳng íurostan của chúng trong một số cây thuộc chi: Agave, Digitalis, Solanum Tác giả đã xử lý kết quả bằng phương pháp thống kê và cho thấy tất cả các glycosid thí nghiêm đều có hoạt tính chống oxy hoá ở mức độ khác nhau [23] • Các chất khác - Từ lá cây... dương tính rất rõ + Phản ứng dương tính rõ ++ Phản ứng dương tính vừa - Phản ứng âm tính ♦ Nhận xét: Qua các phản ứng định tính sơ bộ, chúng tôi đã thấy trong nhân trần ngoài tinh dầu như đã biết còn có chứa nhiều ílavonoid cùng một ít coumarin, saponin, từ đó hướng nghiên cứu của chúng tôi là đánh giá hoạt tính chống oxy hoá của Aavonoid 4.2.2 Quy trình chiết tách Flavonoid từ cây nhân trần: 500 gam dược. .. có chất chống oxy ho ) Hoạt độ chống oxy hoá được biểu thị bằng giá trị phần trăm MDA bị ức chế ở mẫu thử so với mẫu đối chứng Ở Việt Nam phương pháp này được áp dụng rộng rãi GS Đàm Trung Bảo và TS Nguyễn Quang Thường cùng một số tác giả đã đo HĐCOXH của một số thuốc chống viêm, thuốc bảo vệ gan, thuốc chống lão hoá Nhưng khi áp dụng phương pháp này làm thực nghiệm trên nhiều loại dược liệu khác nhau,... có chất chống oxy hoá màu vàng sẽ bị mất khi để ngoài không khí 6-12 giờ do bị oxy hoá Dựa vào đó, ta chỉ việc chấm dịch chiết dược liệu lên bản sắc ký và khai triển với hệ dung môi thích hợp, sau đó để khô dung môi và phun dung dịch dầu gấc lên, để 6-12 giờ nếu trên nền bản sắc ký có một hoặc nhiều vết màu vàng chứng tỏ có chất chống oxy hoá, nếu không có màu vàng coi như không có chất chống oxy hoá ... LUẬN VÀ ĐỂ NGHỊ • 5.1 Kết luận Thực hiên đề tài Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hố nhân trần (Adenosma caeruleum R .Br. ) số dược liệu khác chúng tơi có kết luận sau: • Đã nghiên cứu khả chống oxy. .. hoạt tính COXH chúng tơi chọn nhân trần, vị thuốc có COXH mạnh số dược liệu nghiên cứu 4.2 Nghiên cứu hoạt tính chống oxy hố nhóm hoạt chất tách từ nhân trần 21 4.2.1 Định tính sơ nhóm hợp chất nhân. .. phần nghiên cứu phương pháp khả chống oxy hố thuốc vị thuốc dùng y học dân tộc chúng tơi thực thực đề tài: “NGHIÊN CỨU HOẠT TÍNH CHỐNG OXY HỐ CỦA NHÂN TRAN {Adenosma caeruleum R .Br. ) VÀ MỘT s ố DƯỢC