BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN CÚM A/H5N1 DỰ TUYỂN THỬ NGHIỆM LÂM SÀNG Giảng viên hướng dẫn: TS. Nguyễn Thị Lan Phương Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc Sinh viên thực hiện: Bùi Duy Khánh Mã số sinh viên: 53130691 Khánh Hòa: 2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ---------------o0o--------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÍNH SINH MIỄN DỊCH CỦA VẮC XIN CÚM A/H5N1 DỰ TUYỂN THỬ NGHIỆM LÂM SÀNG GVHD: TS. Nguyễn Thị Lan Phương Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc SVTH: Bùi Duy Khánh MSSV: 53130691 Khánh Hòa, tháng 7 / 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành chương trình học tập và luận văn tốt nghiệp này, tôi xin gởi lời cảm ơn chân thành đến: Ban giám hiệu trường Đại học Nha Trang, tập thể các thầy cô Khoa Công nghệ Sịnh học và Môi trường.Các Thầy Cô giáo đã tận tâm giảng dạy, truyền thụ những kiến thức quý báu trong quá trình học tập và tạo mọi điều kiện giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập. Ban giám đốc Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã cho phép và tạo mọi điều kiện tốt nhất để giúp đỡ tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. TS. Nguyễn Thị Lan Phương, người đã truyền đạt kiến thức, hướng dẫn trực tiếp, giúp đỡ, định hướng và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Ths. Nguyễn Thị Kim Cúc – người đã truyền đạt kiến thức, hướng dẫn trực tiếp, động viên và tận tình giúp đỡ cho tôi trong suốt quá trình học tập và thực hiện đề tài. Ths. Vũ Thị Thu Hương, CN. Nguyễn Thị Bích Thuỷ, CN. Trần Ngọc Nhơn cùng các anh chị em phòng Kiểm định, phòng Chăn nuôi súc vật thí nghiệm đã giúp đỡ, truyền đạt những kinh nghiệm quý báu, động viên, góp ý và tạo mọi điều kiện tốt nhất cho tôi hoàn thành đề tài. Cuối cùng xin gửi những tình cảm thân thương tới gia đình, bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi hoàn thành đề tài này. Xin kính chúc gia đình, các Thầy Cô, bạn bè cùng toàn thể các cô chú, anh chị tại viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế một lời chúc sức khoẻ, thành công và hạnh phúc. Sinh viên Bùi Duy Khánh ii Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của tôi và được sự hướng dẫn khoa học của TS. Nguyễn Thị Lan Phương. Các số liệu, kết quả nêu trong luận văn hoàn toàn trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất kỳ công trình khoa học nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu để phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thực hiện cùng với nhóm nghiên cứu của tổ Miễn dịch, phòng Kiểm định dưới sự hướng dẫn của T.S Nguyễn Thị Lan Phương. Nếu phát hiện bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm về nội dung luận văn của mình. Nha Trang, ngày 15 tháng 6 năm 2015 Tác giả (ký và ghi rõ họ tên) iii TÓM TẮT Giáo viên hướng dẫn: TS. NGUYỄN THỊ LAN PHƯƠNG Ths. NGUYỄN THỊ KIM CÚC Nhằm đánh giá tính sinh miễn dịch trên chuột của vắc xin cúm A/H5N1 thành phẩm dự kiến đưa ra thử nghiệm lâm sàng cho người trong giai đoạn 2/3 ở các liều miễn dịch khác nhau để nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 dùng cho đại dịch. Chúng tôi tiến hành thí nghiệm gây miễn dịch cho chuột nhắt Swiss ở độ tuổi 6 – 8 tuần tuổi qua hai liều tiêm miễn dịch cách nhau 21 ngày. Sau đó thu mẫu huyết thanh chuột đã được nuôi thử nghiệm để thực hiện và xử lí để thực hiện thí nghiệm chuẩn độ kháng thể kháng HA (xác định hiệu giá HAI) của tất cả các mẫu huyết thanh chuột đã được gây miễn dịch. Kết quả chúng tôi thu được. - Vắc xin cúm A/H5N1 tạo được đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt đạt yêu cầu ở 3 liều kháng nguyên khác nhau là 3 µg, 1,5 µg. 0,75 µg sau đủ 2 liều tiêm. - Vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất nhôm hydroxyt tạo được đáp ứng miễn dịch và cao hơn so với vắc xin không hấp phụ tá chất về hiệu giá kháng thể trung bình nhân và tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh trung bình tăng ≥ 4 lần sau đủ 2 liều tiêm. - Vắc xin cúm A/H5N1hấp phụ bảo quản ở 5 ± 30C trong 18 tháng duy trì được đáp ứng miễn dịch đầy đủ sau đủ 2 liều tiêm iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...................................................................................................................i TÓM TẮT...................................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG ......................................................................................................vi DANH MỤC SƠ ĐỒ.................................................................................................... vii DANH MỤC HÌNH .................................................................................................... viii DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................ix ĐẶT VẤN ĐỀ .................................................................................................................1 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU..............................................................................3 1.1. Dịch tễ học bệnh cúm A/H5N1 trên người ........................................................ 3 1.2. Virus cúm và kháng nguyên cúm....................................................................... 4 1.2.1. Lịch sử phân lập ..........................................................................................4 1.2.2. Phân loại và pháp danh ...............................................................................5 1.2.3. Tính chất kháng nguyên ..............................................................................6 1.3. Vắc xin cúm A/H5N1 ........................................................................................ 8 1.3.1. Chiến lược toàn cầu và mục tiêu sản xuất vắc xin cúm đối phó với đại dịch của tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) ............................................................... 8 1.3.2. Tá chất và vắc xin cúm A/H5N1 .................................................................9 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU .....................................18 2.1. VẬT LIỆU ....................................................................................................... 18 2.1.1. Mẫu nghiên cứu .........................................................................................18 2.1.1. Động vật thí nghiệm ..................................................................................18 2.1.2. Sinh phẩm..................................................................................................18 2.1.3. Dung dịch và hóa chất ...............................................................................18 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ ....................................................................................18 2.2. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 19 v 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu ...................................................................................19 2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu ............................................21 2.2.3. Phương pháp đánh giá kết quả nghiên cứu ...............................................26 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN ......................................................................27 3.1 Kết quả nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin cúm IVACFLU- A/H5N1 dự tuyển TNLS giai đoạn 2/3 .................................................................................... 27 3.1.1. Hiệu giá kháng thể kháng HA (HAI) trung bình nhân .............................. 27 3.1.2. Tỷ lệ chuyển đổi hiệu giá kháng thể trung bình nhân so với máu nền và giữa các liều tiêm ...................................................................................................31 3.1.3. Tỷ lệ cá thể có chuyển đổi huyết thanh và phân bố hiệu giá kháng thể....32 3.2. Tính ổn định sinh miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ sau 18 tháng bảo quản ở 5 ±3oC ...................................................................................................... 37 3.2.1. Hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân ..................................................37 3.2.2. Tỷ lệ chuyển đổi kháng thể trung bình nhân so với máu nền của các liều tiêm và giữa các liều tiêm ......................................................................................40 3.3. Biện luận .......................................................................................................... 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .......................................................................................43 4.1. Kết luận ............................................................................................................... 43 4.2. Kiến nghị............................................................................................................. 43 TÀI TIỆU THAM KHẢO ............................................................................................. 44 PHỤ LỤC ......................................................................................................................46 Phụ lục A: .................................................................................................................. 46 Phụ lục B: ................................................................................................................... 48 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1: Số người mắc và tử vong do cúm A/H5N1 theo báo cáo của TCYTTG từ tháng 12/2003 đến tháng 5/2015 ..................................................................................... 4 Bảng 1.2: Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin cúm thành phần IVACFLU-A/H5N1 .......... 17 Bảng 2.1: Thiết kế nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin cúm IVACFLU- A/H5N1 dự tuyển TNLS giai đoạn 2/3 ........................................................................................ 20 Bảng 2.2: Thiết kế nghiên cứu tính ổn định sinh miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 21 Bảng 2.3: Sơ đồ phản ứng ............................................................................................. 25 Bảng 3.1: Hiệu giá kháng thể kháng HA trung bình nhân (GMT) sau liều tiêm thứ nhất ....................................................................................................................................... 27 Bảng 3.2: Hiệu giá kháng thể kháng HA trung bình nhân (GMT) sau liều tiêm thứ hai .................................................................................................................................. 27 Bảng 3.3: Tỷ lệ chuyển đổi hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT) của huyết thanh chuột miễn dịch giữa các liều tiêm, trước và sau tiêm vắc xin .................................... 31 Bảng 3.4: Tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh của liều miễn dịch 3 µg HA/chuột ....................................................................................................................... 32 Bảng 3.5: Phân bố hiệu giá kháng thể HAI của chuột miễn dịch với liều tiêm 3µg HA (%) ................................................................................................................................. 32 Bảng 3.6: Tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh của liều miễn dịch 1,5 µg HA/chuột ....................................................................................................................................... 33 Bảng 3.7: Phân bố hiệu giá kháng thể HAI của chuột miễn dịch với liều tiêm 1,5 µg HA ....................................................................................................................................... 33 Bảng 3.8: Tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh của liều miễn dịch 0,75 µg HA/chuột ....................................................................................................................................... 34 Bảng 3.9: Phân bố hiệu giá kháng thể HAI của chuột miễn dịch với liều tiêm 0,75 µg HA ................................................................................................................................. 34 Bảng 3.10: Hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân (GMT) huyết thanh chuột miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 bảo quản trong 18 tháng .............................................. 37 Bảng 3.11: Tỷ lệ chuyển đổi kháng thể trung bình nhân của huyết thanh chuột miễn dịch giữa các liều tiêm, trước và sau tiêm vắc xin bảo quản trong 18 tháng ........................ 40 vii DANH MỤC SƠ ĐỒ Sơ đồ 1.1: sản xuất và kiểm định IVACFLU-A/H5N1 ................................................. 15 viii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1: Cấu trúc một virus cúm ................................................................................... 5 Hình 1.2: Cấu trúc virus cúm H5N1 ................................................................................ 6 Hình 2.1: Lấy máu chuột ở mắt. ................................................................................... 22 Hình 2.2: Đọc kết quả phản ứng HAI ............................................................................ 25 Hình 2.3: Kết quả thí nghiệm HAI trên phiến .............................................................. 26 Hình 3.1: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 3 µg HA/chuột ....... 28 Hình 3.2: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 1,5 µg HA/chuột .... 29 Hình 3.3: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 0,75 µg HA/chuột .. 30 Hình 3.4: Biểu đồ phân bố hiệu giá kháng thể của 2 nhóm vắc xin sau liều tiêm thứ nhất ....................................................................................................................................... 35 Hình 3.5: Biểu đồ phân bố hiệu giá kháng thể của 2 nhóm vắc xin sau liều tiêm thứ 2 ..................................................................................................................................... 36 Hình 3.6: Biến thiên GMT trung bình của các vắc xin thử nghiệm ở liều tiêm 3 µg tại T0 và T18 sau 2 liều tiêm .............................................................................................. 38 Hình 3.7: Biến thiên GMT trung bình của các vắc xin thử nghiệm ở liều tiêm 1,5 µg tại T10 và T18 sau liều tiêm ............................................................................................... 39 Hình 3.8: Biến thiên GMT trung bình của các vắc xin thử nghiệm ở liều tiêm 0,75 µg tại T0 và T18 sau 2 liều tiêm ......................................................................................... 39 ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DĐ Châu Âu (E.P) Dược điển Châu Âu DĐVN: Dược điển Việt Nam HA: Haemagglutinin HPAI: High Pathogenic Avian Influenza LPAI: Low Pathogenic Avian Influenza NA: Neuraminidase WHO: World Health Organization TCYTTG: Tổ chức Y tế thế giới MDCK : Tế bào thận chó Madin – Darby CEFs : Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà HAI: Đơn vị hiệu giá kháng thể HA GMT : Hiệu giá kháng thể kháng HA trung bình nhân SA: Sialic acid TCCS: Tiêu chuẩn cơ sở NICBS: National Institute for Biological Standards and Control 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Cúm gia cầm là một bệnh truyền nhiễm nguy hiểm có tốc độ lây lan rất nhanh với tỷ lệ chết cao cho đàn gia cầm bị nhiễm bệnh. Bệnh xảy ra khắp nơi trên thế giới gây thiệt hại nặng nề về kinh tế và có ảnh hưởng lớn đến tình hình kinh tế, chính trị, xã hội,... Bệnh cúm gia cầm có độc lực cao (High Pathogenic Avian Influenza) được tổ chức thú y Quốc Tế (OIE) xếp vào bảng A các bệnh truyền nhiễm cực kỳ nguy hiểm. Theo báo cáo của Tổ chức Y tế Thế giới (TCYTTG), từ trường hợp nhiễm bệnh đầu tiên vào năm 2003 đến tháng 5/2015 tổng số trường hợp mắc cúm A/H5N1 trên toàn thế giới là 826 người, số người chết là 440 người. Tại Việt Nam đã ghi nhận được 127 trường hợp mắc bệnh và trong đó có 64 trường hợp tử vong [20]. Cho đến nay các trường hợp nhiễm virus cúm A/H5N1 trên người cho thấy chỉ xảy ra khi có sự tiếp xúc chặt chẽ giữa người và gia cầm bị bệnh. Tuy nhiên giới chuyên môn vẫn lo lắng về khả năng xuất hiện một chủng virus cúm có khả năng lây trực tiếp từ người sang người tạo ra viễn cảnh đen tối về đại dịch cúm. Các biến chủng như vậy thường xảy ra một cách ngẫu nhiên mà không thể dự đoán trước, chúng rất nguy hiểm vì có thể vượt qua được phản ứng trung hoà của kháng thể tồn lưu trong quần thể người đã được tạo ra do bị nhiễm các chủng virus đang lưu hành trước đó. Do đó phòng chống dịch cúm gia cầm là một trong những chương trình phòng chống dịch bệnh cấp quốc gia. Ngoài các biện pháp về an toàn sinh học trong chăn nuôi như tiêu huỷ đàn gia cầm bị nhiễm bệnh, cấm lưu thông và vận chuyển, tiêu thụ... thì việc sử dụng vắc xin tiêm phòng để tạo ra đáp ứng miễn dịch chủ động chống lại bệnh cúm là một biện pháp hỗ trợ tích cực và không thể thiếu trong việc phòng và hạn chế bệnh, bảo về sức khoẻ cộng đồng. Vắc xin cúm được sản xuất từ thập niên 60 nhưng chỉ tập trung ở các nước Châu Âu và Bắc Mỹ. Với năng lực hiện nay là khoảng trên 300 triệu liều/năm, nếu đại dịch trên người xảy ra chỉ có thể đáp ứng 10% dân số thế giới. Trước tình hình đó, TCYTTG khuyến cáo tất cả các nước, đặc biệt là các quốc gia Châu Á, chủ động nghiên cứu và sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 để có thể kịp thời cung ứng cho nhu cầu bảo vệ sức khoẻ cộng đồng khi xảy ra đại dịch. Hiện nay trên thế giới, nhiều hướng nghiên cứu đang được xúc tiến với mục tiêu là sản xuất được vắc xin cúm A/H5N1 có hiệu quả cao và đảm bảo an toàn khi sử dụng. 2 Trong bối cảnh đó, tại Việt Nam, Viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế đã nghiên cứu và sản xuất thử nghiệm vắc xin cúm A/H5N1 dùng cho người bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi. Từ năm 2006 – 2009 đã thực hiện thành công đề tài nhánh cấp nhà nước “Nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 trên trứng gà có phôi”. Trên cơ sở thành công của đề tài, năm 2007, Viện đã được TCYTTG chọn là một trong các cơ sở nằm trong chiến lượt dự trữ vắc xin cúm đại dịch cho toàn cầu và được tài trợ xây dựng một nhà máy đạt chuẩn GMP – WHO để sản xuất vắc xin với công suất 1 – 3 triệu liều/năm. Vắc xin cúm A/H5N1 trước khi được thử nghiệm trên người, nghiên cứu tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm là một trong những yêu cầu bắt buộc để đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch của vắc xin trên người. Với ý nghĩa đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính sinh miễn dịch vắc xin cúm A/H5N1 dự tuyển thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2/3”. Trong giới hạn của luận văn này đề tài hướng tới những mục tiêu sau: 1. Đánh giá tính sinh miễn dịch trên chuột nhắt của xin cúm A/H5N1 hấp phụ với gel hydroxyt nhôm (Al(OH)3) có đối chứng với vắc xin không hấp phụ cùng hàm lượng kháng nguyên HA tương ứng. 2. Đánh giá tính ổn định sinh miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 bảo quản ở nhiệt độ 5 ± 3oC trong 18 tháng. 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Dịch tễ học bệnh cúm A/H5N1 trên người 1.1. Bệnh cúm được Hippocrates mô tả lần đầu tiên vào năm 412 trước công nguyên tại Hy Lạp là bệnh truyền nhiễm đường hô hấp cấp tính. Bệnh xảy ra theo chu kỳ và thường gây dịch với quy mô khác nhau. Ở vùng ôn đới, các đợt phát dịch thường xảy ra vào mùa đông hàng năm. Ngược lại, ở các vùng nhiệt đới, bệnh cúm xảy ra quanh năm, bùng phát bất ngờ và lan rộng thành các vụ dịch. Trên thế giới, hằng năm, tỉ lệ nhiễm cúm trung bình là 5% - 15% dân số (người lớn 5% - 10%, trẻ em 20% - 30%). Trung bình có 3 – 5 triệu người mắc bệnh nặng, trong đó có 250.000 đến 500.000 trường hợp tử vong. Tỉ lệ mắc bệnh cao nhất ở trẻ em từ 5 đến 9 tuổi, nhưng tỉ lệ phát bệnh nặng và tử vong cao nhất ở người lớn trên 65 tuổi và những người có nguy cơ cao [9, 13, 14, 17]. Đại dịch cúm A đầu tiên được ghi nhận vào năm 1580 ở châu Á. Đến nay đã có ít nhất 3 đại dịch nghiêm trọng xảy ra tại Tây Ban Nha năm 1918 – 1919 do chủng H1N1(khoảng 1/3 dân số thế giới bị nhiễm bệnh và có khoảng 50 triệu đến 100 triệu người tử vong), tại các nước Châu Á năm 1957 – 1958 do chủng H2N2 (khoảng 1 triệu người chết) và tại Hông Kông năm 1968 – 1969 do chủng H3N2 (khoảng 33.800 người chết) [9]. Cúm gia cầm do virus cúm type A (Avian influenza) gây bệnh trên gia cầm và có thể nhiễm cho một số loài động vật có vú trong đó có người. Sự phân loại các chủng cúm gia cầm dựa trên khả năng gây bệnh cao (HPAI) hoặc thấp (LPAI). Các chủng HPAI có độc lực cao và tỉ lệ chết ở đàn bị nhiễm thường lên đến 100%. Các chủng LPAI có độc lực thấp và được xem như tổ tiên của các chủng HPAI [11, 19]. Có nhiều chủng virus gây bệnh cúm gia cầm như H5N1, H3N2, H7N1, H7N9, H9N2,.... Các vụ dịch cúm gia cầm gần đây chủ yếu do virus cúm A/H5N1 gây ra. Chủng này có khả năng gây bệnh cao, lây nhiễm rất nhanh và gây chết trên diện rộng. Nguy hiểm hơn, virus này đã lây nhiễm sang người gây bệnh nặng và có thể dẫn đến tử vong. 4 Bảng 1.1: Số người mắc và tử vong do cúm A/H5N1 theo báo cáo của TCYTTG từ tháng 12/2003 đến tháng 5/2015 [20]. Quốc gia 2003 – 2010 2011 2012 2013 2014 Tổng số 2015 2009 M C M C M C M C M C M C M C M C Azerbaijan 8 5 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 8 5 Bangladesh 1 0 0 0 2 0 3 0 1 1 0 0 0 0 7 1 Cambodia 9 7 1 1 8 8 3 3 26 14 9 4 0 0 56 37 Canada 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 0 0 0 0 1 1 China 38 25 2 1 1 1 2 1 2 2 2 0 4 1 51 31 Djibouti 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Egypt 90 27 29 13 30 15 11 5 4 3 37 14 119 30 329 107 Indonesia 162 134 9 7 12 10 9 9 3 3 2 2 2 2 100 167 Iraq 3 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 2 Lao 2 2 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 2 2 Myanmar 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 0 Nigeria 1 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 1 1 Pakistan 3 1 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 3 1 Thailand 25 17 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 25 17 Turkey 12 4 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 12 4 Viet Nam 112 57 7 2 0 0 4 2 2 1 2 2 0 0 127 64 Tổng số 468 282 48 24 62 34 32 20 39 25 52 22 125 33 826 440 Ghi chú: M (mắc bệnh), C (tử vong). 1.2. Virus cúm và kháng nguyên cúm 1.2.1. Lịch sử phân lập Năm 1933, Sir Christopher Andrewers, Wilson Smith và Sir Patrick Laidlaw xác định tác nhân gây bệnh cúm và lần đầu tiên phân lập được virus cúm lây bệnh cho người. Năm 1940, Frank Macfarland Burnet nuôi cấy thành công virus cúm trên trứng gà có phôi ở quy mô phòng thí nghiệm. Năm 1941, Geogre K. Hirst xác định virus có khả năng gây ngưng kết hồng cầu và dựa vào đặc điểm này đã xây dựng phương pháp thử nghiệm phát hiện virus cúm. Năm 1955, Sir Christopher Andrewers xác định virus cúm thuộc loài Myxovirus. Sau đó, các nghiên cứu đã chứng minh virus cúm cũng là tác nhân gây bệnh ở lợn và 5 xác định là tác nhân gây đại dịch năm 1918 có liên quan về mặt kháng nguyên với virus cúm lợn, từ đó thiết lập mối quan hệ giữa cúm động vật và cúm người. 1.2.2. Phân loại và pháp danh 1.2.2.1. Phân loại Virus cúm thuộc họ Orthomyxoviride, gồm 3 type A, B, C khác nhau ở kháng nguyên bề mặt, trong đó type A là tác nhân chủ yếu gây các dịch cúm. Type B và C thường gây bệnh nhẹ và lẻ tẻ. Chỉ virus cúm type A mới được phân chia thành các phân type do kháng nguyên thường xuyên biến đổi. Các phân type virus cúm A khác nhau ở hai loại kháng nguyên bề mặt là Haemagglutinin (HA) và Neuraminidase (NA). Hiện nay, người ta đã phát hiện 16 type HA (H1 – H16) và 9 type NA (N1 – N9), như vậy tổ hợp lại thì có khả năng tạo ra 14 phân type cúm A. 1.2.2.2. Hình thái cấu trúc Virus cúm thường có hình cầu. Đường kính trung bình 80 – 120 nm. Lớp vỏ lipoprotein của virus có nguồn gốc từ tế bào bị nhiễm. Trên vỏ có đính hai loại glycoprotein là Haemagglutinin và Neuraminidase, mỗi gai dài khoảng 8 – 10 nm, cách nhau 8 nm. Có khoảng 500 gai HA và 200 gai NA phủ khắp bề mặt virus. Ba loại H1, H2, H3 và 2 loại N1, N2 có ở virus gây bệnh cho người. Thời gian gần đây, các loại H5, H7, H9 (có nguồn gốc từ chim) đã được tìm thấy trong virus gây bệnh cho người [2, 6, 11, 14]. Ngoài ra, bề mặt lớp vỏ còn có các kênh ion khác có chức năng vận chuyển H+. Nằm ngay dưới lớp vỏ lipoprotein là các matrix protein sắp xếp thành một khuôn chứa bên trong là riboprotein và một lượng nhỏ các protein phi cấu trúc. Hình 1.1: Cấu trúc một virus cúm 6 Hình 1.2: Cấu trúc virus cúm H5N1 Virus cúm mang vật liệu di truyền là RNA mạch đơn, sợi đối mã (sợi âm) tồn tại ở dạng các phân đoạn RNA độc lập có kích thước khác nhau và mã hóa cho các protein khác nhau. Mỗi phân đoạn RNA của virus được bao quanh bởi nhiều đơn phân nucleoprotein và được gắn với một phức RNA – polymerase bao gồm Pa, Pb1, Pb2. Toàn bộ cấu trúc này được gọi là ribonucleoprotein [6, 11]. Bộ gen phân nhiều đoạn của virus cúm là nguyên nhân dẫn đến sự thay đổi kháng nguyên liên tục để trở thành chủng virus mới, có hai kiểu thay đổi kháng nguyên là antigen shift và antigen drift. Antigen shift là sự thay đổi di truyền quan trọng do sự tái tổ hợp gen giữa các chủng khác nhau tạo ra. Antigen drift là sự đột biến ngẫu nhiên xảy ra ở gen mã hóa cho HA dẫn đến sự thay đổi của một số acid amin trong protein HA. Bộ gen của virus gồm 8 phân đoạn RNA mã hóa cho 10 loại polypeptide khác nhau [2, 6, 9, 11, 14]. 1.2.3. Tính chất kháng nguyên [3, 7, 22, 23] Hai kháng nguyên quan trọng nhất quyết định độc tính của virus cúm là Haemagglutinin và Neuraminidase.  Haemagglutinin Haemagglutinin (HA) là một glycoprotein có cấu trúc trimer, dạng hình cây mọc nhô ra từ màng lipid của virus với hình dạng hình cầu nằm ở phía ngoài. HA có khả năng gây ngưng kết hồng cầu. HA là kháng nguyên quan trọng nhất quyết định độc tính của virus nhờ khả năng nhận biết và gắn vào thụ thể của tế bào chủ. Khả năng này phụ thuộc vào 2 yếu tố: - Hai dạng phân tử sialic acid (SA) trên thụ thể của tế bào vật chủ: N – acetylneuraminic acid và N – glycolyneuraminic acid. 7 - Hai kiểu liên kết với galactose: liên kết α – 2,6 Gal hay liên kết α – 2,3 Gal trên bề mặt tế bào chủ. HA virus cúm gia cầm có ái lực với liên kết SA α – 2,3 Gal, có nhiều ở các tế bào biểu mô ruột. Ngược lại, HA virus cúm người liên kết với SA α – 2,6 Gal, các tế bào biểu mô của khí quản phần lớn chứa liên kết trên. Vì vậy virus tấn công cơ quan hô hấp của người, gây bệnh nặng và thường dẫn tới tử vong.  Neuraminidase Tương tự HA, Neuraminidase (NA) là một glycoprotein, có dạng nút lồi hình nấm trên bề mặt virus cúm. Nó có một đầu gồm 4 bốn monomer hình cầu trên cùng một mặt phẳng và một vùng kị nước gắn vào màng virus. NA là enzyme có chức năng ngược với HA, nó phân cắt sialic acid bằng cách cắt liên kết glicoside nối nhóm keto của acid sialic với D – galactose hoặc D – galactosamin. Phản ứng này cho phép virus tiến qua lớp niêm dịch để tới các tế bào biểu mô của đường hô hấp trong quá trình nhiễm trùng. Ngoài ra, việc loại bỏ sialic acid của phân tử HA từ các virion mới được tổ hợp giúp phóng thích các hạt virion ra khỏi tế bào nhiễm và gia tăng khả năng nhiễm trùng.  Sự biến đổi kháng nguyên của virus cúm A Thông thường, các phân type virus cúm A lan truyền trong tự nhiên bằng cách ký sinh ở tế bào ruột non của các loài chim di cư và thường không gây bệnh cho các loài này. Tuy nhiên, khi những chủng virus bị đột biến kháng nguyên, chúng có thể trở thành chủng cúm gia cầm có độc tính cao và có thể lây cho người. Sự biến đổi kháng nguyên virus cúm bao gồm hai quá trình: - Đột biến kháng nguyên (antigen drift) Đột biến kháng nguyên là sự chuyển đổi từ từ kháng nguyên HA và NA trong một phân type. Đây là kết quả của việc tích luỹ dẫn các đột biến điểm, dẫn đến sự biến đổi trình tự amino acid và làm thay đổi tính chất kháng nguyên của phân tử. Đột biến kháng nguyên xảy ra ở tất cả các type cúm. - Quá trình chuyển đổi kháng nguyên (antigen shift) Quá trình chuyển đổi kháng nguyên là sự biến đổi hoàn toàn một hay hai protein bề mặt, xảy ra khi gen mã hoá cho phân type này được thay thế bằng gen mã hoá cho một phân type khác. Hiện tượng này là kết quả của quá trình chuyển đổi gen giữa hai chủng virus đồng thời lây nhiễm một tế bào. Hai chủng này, một có thể từ chim lây sang 8 tế bào vật chủ trung gian kết hợp với một chủng cúm ở người lây sang. Sau khi cả hai cùng xâm nhập và nhân lên trong tế bào, khi quá trình lắp ráp các virus có khả năng trộn lẫn giữa các gen mã hoá 2 virus với nhau. Khi xảy ra quá trình chuyển đổi kháng nguyên, virus mới vừa mang gen của virus cúm ở gia cầm vừa mang gen virus cúm ở người. Điều này giúp virus có độc tính của virus cúm gia cầm và có khả năng xâm nhiễm vào cơ thể người. Khi đó, hệ miễn dịch của người thông thường không có khả năng chống đỡ, nếu chủng virus mới này xảy ra khả năng gây bệnh cao và lây trực tiếp từ người sang người thì một đại dịch toàn cầu sẽ xảy ra. Khác với đột biến kháng nguyên, quá trình tái tổ hợp kháng nguyên chỉ xảy ra ở virus cúm A vì virus cúm A gây bệnh cho nhiều loại vật chủ khác nhau. Điều này tạo cơ hội cho quá trình tái tổ hợp bộ gen cho nhiều chủng virus khác nhau tạo nên một virus cúm mới nguy hiểm hơn. Các đại dịch cúm châu Á 1957 (H2N2), cúm Hông Kông (H3N2) là do chủng virus cúm A trải qua quá trình chuyển đổi kháng nguyên gây nên.  Đáp ứng miễn dịch chống virus [10] Đáp ứng miễn dịch chống virus cúm chủ yếu do kháng thể dịch thể tạo ra. Khoảng 1 – 2 tuần sau khi bị nhiễm virus lần đầu, kháng thể kháng HA và NA bắt đầu xuất hiện trong dịch thể, cao nhất vào các tuần thứ 3 – 4. Nếu bị tái nhiễm, đáp ứng miễn dịch sẽ nhanh hơn. Nếu kháng thể kháng HA quyết định khả năng bảo vệ chống virus thì kháng thể kháng NA giúp giảm số lượng virus thoát ra khỏi tế bào bị nhiễm, nhờ đó hạn chế nhiễm. Kháng thể kháng virus cúm có thể tồn tại hàng tháng đến hàng năm phụ thuộc vào từng phân type virus và đối tượng nhiễm. Tuy nhiên ở nhóm đối tượng có nguy cơ cao, vài tháng sau khi được tiêm chủng ngừa, hàm lượng kháng thể giảm dần. Sự hiện diện của kháng thể kháng HA ở độ pha loãng 1/40 trở lên tương đương với khả năng đủ miễn dịch (với những người lớn tuổi là 1/80). 1.3. Vắc xin cúm A/H5N1 1.3.1. Chiến lược toàn cầu và mục tiêu sản xuất vắc xin cúm đối phó với đại dịch của tổ chức Y tế thế giới (TCYTTG) TCYTTG đã khẳng định “Vắc xin cúm là biện pháp phòng ngừa hữu hiệu nhất”. Tạo miễn dịch chống lại bệnh cúm được xem là sự can thiệp thiết yếu đến sức khỏe cộng đồng để kiểm soát cả bệnh cúm mùa và cúm đại dịch. Vì thế phát triển vắc xin cúm là một phần quan trọng của việc chuẩn bị đối phó với đại dịch cúm [17]. 9 Ngày nay, mỗi năm trên thế giới có khả năng sản xuất hơn 300 triệu liều vắc xin cúm mùa 3 thành phần chỉ đủ đáp ứng cho dịch bệnh ở các nước phương Tây, không đủ phạm vi của một đại dịch. Chương trình cúm của TCYTTG đã được thiết lập từ năm 1948, trước nguy cơ bùng phát đại dịch toàn cầu được phát triển thành Chương trình cúm toàn cầu. Trong chương trình này một mạng lưới giám sát cúm toàn cầu đã ra đời (GISN) [15, 16]. Để giải quyết vấn đề trên, TCYTTG đã đưa ra nhiều mục tiêu chiến lược khác nhau, đồng thời làm việc với các chính phủ, các nhà khoa học, các công ty sản xuất thuốc, vắc xin và những nhân vật có ảnh hưởng trên thế giới để đạt được một giải pháp chung nhằm tăng khả năng đáp ứng vắc xin cúm cho đại dịch một cách có hiệu quả, đó là: - Phát triển các loại vắc xin mới. - Kỹ thuật nuôi cấy tế bào có khả năng tăng sản lượng sản xuất - Chiến lược tiết kiệm kháng nguyên, trong đó sử dụng tá chất là mục tiêu chính. 1.3.2. Tá chất và vắc xin cúm A/H5N1 1.3.2.1. Tá chất  Định nghĩa Tá chất (adjuvant) được Ramon định nghĩa lần đầu tiên vào năm 1926, đó là một chất được sử dụng kết hợp với kháng nguyên đặc hiệu để làm tăng đáp ứng miễn dịch của kháng nguyên. Sử dụng tá chất trong sản xuất vắc xin là vấn đề rất được quan tâm vì nhiều lí do. Thứ nhất, bản chất hóa học của kháng nguyên liên quan đến khả năng kích thích hệ thống miễn dịch sinh kháng thể nên một số vắc xin đòi hỏi phải có tá chất để tăng cường khả năng này. Thứ hai, năm 1990, chương trình vắc xin cho trẻ em rất quan tâm đến sử dụng tá chất để tăng cường hiệu lực của các vắc xin hiệu tại và phát triển các vắc xin mới. Ngoài ra, sự tiến bộ trong các lĩnh vực sinh hóa, miễn dịch, tinh chế, kỹ thuật tái tổ hợp và sự hiểu biết về các tác nhân gây bệnh là cơ sở để phát triển và ứng dụng tá chất trong sản xuất vắc xin [7, 12].  Cơ chế hoạt động Tá chất được sử dụng trong sản xuất vắc xin hơn 70 năm qua. Một tá chất trong vắc xin có thể ảnh hưởng đến đáp ứng miễn dịch theo một hoặc nhiều cơ chế sau: 10 - Đưa kháng nguyên vào vị trí thích hợp trong cơ thể. - Lưu giữ và giải phóng kháng nguyên từ vị trí mà nó lắng đọng. - Hoạt hóa các tế bào trình diện kháng nguyên và lympho bào. - Hoạt hóa bổ thể, tăng cường tổng hợp tiết và gắn kết của cytokine. - Mang các epitope của tế bào T đến MHC lớp I và lớp II.  Vai trò - Tăng cường hiệu lực của các peptide tổng hợp hoặc tái tổ hợp nhỏ, có tính kháng nguyên yếu. - Tăng cường tốc độ, sức mạnh và sự tồn lưu đáp ứng miễn dịch cho những kháng nguyên lớn hơn. - Tăng cường đáp ứng miễn dịch với vắc xin ở những người có hệ miễn dịch chưa hoàn chỉnh, miễn dịch kém hoặc những người già yếu. - Điều hòa miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào. - Điều hòa sản xuất kháng thể, số lượng kháng thể, tính đặc hiệu của kháng thể, loại kháng thể ứng với các epitope trên các phức hợp sinh miễn dịch. - Làm giảm hàm lượng kháng nguyên trong vắc xin, nhờ vậy làm giảm sự cạnh tranh kháng nguyên và sự chèn ép epitope đặc hiệu, giảm lượng kháng nguyên trong một liều vắc xin và giảm giá thành sản xuất.  Các loại tá chất - Các loại tá chất cổ điển Ngay từ khi khái niệm tá chất chưa ra đời, nhiều hợp chất tự nhiên hay tổng hợp được sử dụng phối hợp với kháng nguyên với vai trò là một tá chất như tapioca, hợp chất nhôm, hợp chất canxi, xác vi khuẩn ho gà, chitosan,... Hai loại tá chất kinh điển, được sử dụng phổ biến đó là hợp chất nhôm và tá chất Freund [9].  Hợp chất nhôm (Al3+) Hợp chất nhôm (bao gồm hydroxit nhôm Al(OH)3, photphat nhôm AlPO4 hoặc kết hợp cả hai) được sử dụng rộng rãi trong sản xuất nhiều loại vắc xin như: vắc xin uốn ván hấp phụ, vắc xin bạch hầu – ho gà – uốn ván, vắc xin viêm gan A, B và vắc xin dại,... Tá chất nhôm đã trở thành căn cứ để đánh giá các tá chất mới trong vắc xin dùng cho người. Tá chất nhôm khó được tạo ra theo cách tổng hợp hóa lí, điều này ảnh hưởng đến tính đáp ứng miễn dịch. Vì vậy, trong quá trình hấp phụ phải chú ý đến đặc tính hóa 11 lí của kháng nguyên, loại tá chất nhôm, điều kiện hấp phụ và nồng độ tá chất. Không phải tất cả các hợp chất nhôm đều phải có hiệu quả như nhau. Do đó, một dạng pha chế đặc biệt của hydroxit nhôm ( Alhydro gel) đã được khuyến cáo dùng như một tá chất chuẩn.  Tá chất Freund Tá chất Freund là hỗn hợp dịch nước trong dầu, bao gồm 2 loại: tá chất hoàn toàn (FCA) và không hoàn toàn (FIA). FCA có thêm vi khuẩn Mycobacteria tuberculosis hàm lượng khoảng 0.5 mg/ml. Đây là loại tá chất chuẩn, hiệu quả tác dụng mạnh, đã từng được sử dụng rộng rãi trong các vắc xin thử nghiệm trên súc vật. Dầu khoáng kết hợp với xác vi khuẩn lao cùng với chất tạo nhũ (manide monoliate) tạo đáp ứng miễn dịch dịch thể và trung gian tế bào. Tuy nhiên, FCA cũng có thể tạo ra các khối u ở biểu mô, các vết loét khi tiêm dưới da, gây sốt và bệnh tự miễn như thấp khớp. Do đó, loại tá chất này chỉ được sử dụng trên súc vật, không được phép sử dụng trên người. - Các loại tá chất mới Các loại tá chất mới được bắt đầu sử dụng từ những năm 70 bằng cách kết hợp với các tá chất cổ điển để tăng hiệu lực của chúng. Sự phát triển của tá chất mới bắt nguồn từ sự khám phá ra các thành phần tổng hợp có tác dụng hoạt hóa hệ miễn dịch. Tuy nhiên, những thành phần được tiết ra từ vi sinh vật bản thân nó lại không đủ hiệu quả đối với hệ miễn dịch, do đó chúng được kết hợp với thế hệ thứ nhất. Tá chất MF59 là dạng tá chất dầu trong nước bao gồm các hạt dầu có kích thước nhỏ (đường kính từ 120 – 160 nm) đồng nhất và ổn định, các hợp chất này được bao quanh bởi một lớp chất không ion hóa. Trong đó, Squalene là một thành phần dầu tự nhiên của tế bào, được chiết xuất từ gan cá mập. Các nghiên cứu lâm sàng của các sản phẩm bắt đầu từ MF59 và kháng nguyên cho thấy MF59 không chỉ an toàn mà còn tăng cường kích thích đáp ứng miễn dịch với sự giảm thiểu số lượng kháng nguyên sử dụng. Các tá chất do công ty GSK phát triển được sử dụng trong các vắc xin khác nhau, ví dụ: AS03 dùng trong vắc xin cúm, AS04 dùng trong vắc xin ngừa HPV – các tá chất này đã được cấp giấy phép tại châu Âu. Ngoài ra, còn có tá chất RC – 529 và ISS của công ty Dynavax, MF59 + MTP – PE của công ty Chiron và Norvatis,... Các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng của vắc xin cúm cho thấy, các tá chất mới có khả năng làm giảm liều kháng nguyên lớn hơn tá chất nhôm và an toàn trên người. Nhưng hiện nay, các tá chất này còn được sử dụng rất hạn chế do rào cản về bản quyền. 12 Mặc dù không hiệu quả như các tá chất mới nhưng ứng dụng của tá chất nhôm trong nghiên cứu sản xuất vắc xin cúm phòng chống đại dịch như cúm A/H5N1 vẫn đang chiếm ưu thế về tính an toàn, giá thành rẻ và đặc biệt không bị rào cản bản quyền hạn chế [8]. 1.3.2.2. Vắc xin cúm A/H5N1  Phương pháp sản xuất Cả hai vắc xin cúm bất hoạt (IIV) và vắc xin giảm độc lực (LAIV) có thể được sản xuất bằng phương pháp nuôi cấy trên trứng gà có phôi, trên tế bào, trên nguyên bào sợi phôi gà (CEFs) [1].  Nuôi cấy trên trứng gà có phôi Nuôi cấy trên trứng gà có phôi là phương pháp truyền thống, an toàn, tin cậy và đã được sử dụng để sản xuất vắc xin cúm với qui mô công nghiệp trong hơn 60 năm qua. Trứng gà có phôi 9 – 12 ngày tuổi được sử dụng để cấy chủng sản xuất vắc xin. Để sản xuất số liều như nhau, vắc xin IIV cần phải có một lượng trứng tối thiểu gấp 20 lần so với vắc xin LAIV, nhưng không cần phải có trứng SPF như đối với vắc xin LAIV vì có bước bất hoạt. Tất cả những vắc xin LAIV đã được cấp phép đều được sản xuất trên trứng gà SPF có phôi.  Nuôi cấy trên tế bào Có ba dòng tế bào đã được phát triển để sản xuất vắc xin cúm: MDCK (tế bào thận chó Madin – Darby) được phân lập năm 1958 và được sử dụng rộng rãi trong sản xuất vắc xin cho súc vật; Tế bào Vero (tế bào thận khỉ xanh Châu Phi) được dùng để sản xuất vắc xin bại liệt trong hơn 20 năm; và tế bào PER.C6 (tế bào võng mạc người) là tế bào mới được sử dụng trong nuôi cấy tế bào. Các dòng tế bào này có thể nuôi cấy trong môi trường không có huyết thanh và đã được chấp nhận để sản xuất vắc xin cho người.  Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà (CEFs) Sản xuất vắc xin LAIV hoặc IIV bằng CEFs có thể là cách nhanh nhất để mở rộng qui mô sản xuất vắc xin cúm, nhưng điều này chỉ áp dụng đối với những nhà sản xuất đã áp dụng công nghệ này để sản xuất những vắc xin khác với một sự đầu tư vừa phải về kinh phí và thời gian. Tuy nhiên, phương pháp này cũng có những bất lợi như: đòi hỏi phải có trứng sạch SPF, huyết thanh bào thai bê và năng lực sản xuất giới hạn vì rất ít nhà sản xuất đã có sẵn công nghệ này. 13  Chủng sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 đại dịch Mạng lưới giám sát mạng lưới bệnh cúm toàn cầu của TCYTTG đã mô tả đặc điểm của các chủng virus cúm A/H5N1 phân lập được ở người và động vật ở các nước châu Á bị dịch năm 1994 và 2005. TCYTTG khuyến nghị rằng tính kháng nguyên và các đặc tính gen học của các chủng virus cúm H5N1 này phù hợp để sản xuất vắc xin. Trung tâm hợp tác và các phòng thí nghiệm chuẩn của TCYTTG đã phát triển được nhiều chủng virus cúm A/H5N1 tái tổ hợp làm vắc xin dựa trên yêu cầu của một vài tổ chức cấp chứng nhận dược phẩm quốc tế và quốc gia đối với sản xuất vắc xin cúm như chủng A/vietnam/1194/04, A/vietnam/1203/04 và A/hongkong/213/03 [1]. Nhà sản xuất muốn nhận được các chủng nguyên bản này có thể liên hệ với một trong số các địa điểm: Chương trình cúm toàn cầu, Viện quốc gia về tiêu chuẩn và kiểm định sinh học (NIBS) vương quốc Anh, hoặc Trung tâm hợp tác về giám sát thực địa, dịch tể học và kiểm soát bệnh cúm của TCYTTG (Atlanta, Mỹ). Tất cả các phòng thí nghiệm này đã chuẩn bị các chủng vắc xin nguyên bản và các chủng này đang được chứng minh như một “gốc giống” để phát triển vắc xin [1]. Chủng virus nguyên bản sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 được tạo ra bằng kĩ thuật di truyền đảo ngược từ một chủng virus có độc lực cao, ví dụ chủng A/vietnam/1194/2004 (H5N1) và chủng virus cúm A khác có khả năng phát triển tốt trên trứng gà (một đặc tính quan trọng để sản xuất vắc xin), ví dụ chủng A/PR/8/34 (H1N1) hay còn gọi là chủng PR8. Chủng được tạo ra từ 2 chủng trên có chứa các đoạn gen mã hóa cho HA và NA mà không chứa gen quyết định tính độc của chủng thứ nhất và các đoạn gen khác của chủng thứ 2 [1].  Liều kháng nguyên Hiện tại chưa nơi nào đưa ra được một công thức chung cho vắc xin phòng cúm A/H5N1 có hiệu quả về kinh tế. Các cuộc thử nghiệm lâm sàng về vắc xin A/H5N1 đang diễn ra để kiểm chứng các công thức vắc xin khác nhau, kể cả các chất hấp phụ mà về lí thuyết có thể cho phép tăng cường đáp ứng miễn dịch tạo sự bảo vệ thích hợp ở một mức hàm lượng kháng nguyên thấp. Vắc xin cúm A/H5N1 là vắc xin một thành phần. Về lí thuyết một liều vắc xin chỉ cần 15 µg HA. Tuy nhiên liều kháng nguyên đủ tạo ra hiệu lực bảo vệ phụ thuộc vào các yếu tố khác như đối tượng miễn dịch, dạng vắc xin (có hoặc không có tá chất), loại vắc xin, đường đưa kháng nguyên vào cơ thể,.. Cùng với việc xác định liều kháng 14 nguyên và việc phối hợp với tá chất, qui trình miễn dịch vắc xin cúm A/H5N1 đang được nghiên cứu để phù hợp nhất với chiến lược tiết kiệm kháng nguyên. Theo số liệu về các thử nghiệm, vắc xin cúm A/H5N1 có thể tạo ra miễn dịch kém hơn cúm mùa. Năm 2006, nghiên cứu của Treanor và cộng sự trên vắc xin cúm tiểu phần sản xuất từ chủng A/Vietnam/1194/04 (H5N1) cho thấy cần hai liều vắc xin không tá chất, mỗi liều chứa 90 µg HA mới tạo ra kháng thể bảo vệ. Kết quả nghiên cứu của Link và cộng sự năm 2006 cho thấy, 78% người tham gia thử nghiệm có huyết thanh dương tính với hai liều vắc xin toàn thân tinh khiết, mỗi liều chứa 10 µg HA, hấp phụ với tá chất Al(OH)3. Như vậy, đối với vắc xin cúm A/H5N1 tiểu phần hay toàn thân tinh khiết để tạo ra mức miễn dịch bảo vệ thì cần liều kháng nguyên HA lớn hơn so với vắc xin toàn virus [1].  Qui trình miễn dịch cho người và đường tiêm Qui trình miễn dịch cho người của vắc xin cúm A/H5N1 được khuyến cáo hiện nay là hai mũi tiêm bắp cách nhau ít nhất 20 ngày đối với vắc xin toàn thân bất hoạt. Đối với vắc xin giảm độc lực thì chỉ cần 1 liều duy nhất [1]. TCYTTG khuyến cáo các nhà sản xuất cần tiếp tục nghiên cứu qui trình miễn dịch phù hợp cho từng loại vắc xin cúm mới. 1.3.2.3. Sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 tại IVAC Khi dịch cúm A/H5N1 xảy ra năm 2005, IVAC đã chủ động tiếp cận công nghệ và tranh thủ sự hỗ trợ tài chính, công nghệ của nhà nước, TCYTTG và các tổ chức quốc tế để nghiên cứu sản xuất và thiết lập cơ sở sản xuất vắc xin cúm nói chung và cúm đại dịch nói riêng theo hướng công nghệ trứng gà có phôi và ở qui mô công nghiệp. Hiện tại, IVAC đã thành công trong việc thiết lập dây chuyền sản xuất vắc xin cúm đạt tiêu chuẩn GMP – WHO ở quy mô 1.500.000 liều/năm, cũng như thành công bước đầu trong thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 1 đối với vắc xin cúm A/H1N1/09 (2013) và A/H5N1 (2014) tạo nền tảng quan trọng để sản xuất vắc xin cúm A/H5N1, chuẩn bị sản phẩm cho thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2/3. IVACFLU –A/H5N1 là tên của loại vắc xin phòng bệnh cúm A/H5N1, được sản xuất theo công nghệ nuôi cấy trên trứng gà có phôi trên dây chuyền đạt chuẩn WHOGMP có công suất 1,5 triệu liều vắc xin/năm. Đây là dạng vắc xin toàn hạt virus tinh khiết, bất hoạt bằng formalin, có tá chất hydroxyt nhôm, không có chất bảo quản, tinh khiết hạt virus bằng máy siêu ly tâm liên tục Alfa Wassermann; sử dụng chủng NIBRG- 15 14, có nguồn gốc từ chủng A/Vietnam/1194/2004 (A/H5N1), do Viện NIBSC-Vương Quốc Anh cung cấp, được phép của WHO. Sơ đồ 1.1: Sản xuất và kiểm định IVACFLU-A/H5N1 ẤP TRỨNG GÂY NHIỄM - EID50 chủng sản xuất - Giám sát vi sinh - Thể tích chủng gây nhiễm NUÔI CẤY LÀM LẠNH - Giám sát vi sinh CẮT VỎ TRỨNG - Tỉ lệ loại bỏ GẶT DỊCH NIỆU - OD, pH, HA, Protein, EID50 - Endotoxin, bioburden, SRID LY TÂM, LỌC TRONG - OD, pH, HA, EID50 - Endotoxin, bioburden SIÊU LY TÂM PHÂN ĐOẠN - HA, Protein, EID50 BẤT HOẠT - Hiệu lực bất hoạt (RIV) LY GIẢI - Sucrose, formalin - HA, Endotoxin, bioburden LỌC VÔ TRÙNG - Hàm lượng HA (SRID) 16 LỌC VÔ TRÙNG NƯỚC CỐT - Protein, formalin, sucrose - SRID, Ovalbumin, vô trùng - Endotoxin, HA, RIV. HẤP PHỤ Alhydrogel ĐÓNG ỐNG - Vô trùng - Endotoxin BAO BÌ- ĐÓNG GÓI VẮC XIN THÀNH PHẨM - Kiểm tra vật lý - Protein - Hàm lượng aluminum NHẬP KHO SINH PHẨM - SRID, Endotoxin - Vô trùng, pH - Thể tích, Nhận dạng HA XUẤT XƯỞNG - An toàn chung, nhận dạng  Công thức thành phần vắcxin cúm IVACFLU- A/H5N1 Trong 1 liều 0,5 ml vắc xin cúm IVACFLU – A/H5N1 gồm có: - Kháng nguyên bề mặt của virus cúm (Hemagglutinin): 15 g hoặc 30 g - Tá chất Al(OH)3: 0,6 mg - Dung dịch đệm PBS pH =7,2: vừa đủ 0,5ml 17  Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin cúm IVACFLU- A/H5N1 Bảng 1.2: Tiêu chuẩn chất lượng vắc xin cúm một thành phần IVACFLU-A/H5N1 Chỉ tiêu TT Tiêu chuẩn (1 liều) Phương pháp 1 Thể tích Đo thể tích 2 Hình dạng bên ngoài Quan sát bằng mắt Tài liệu áp dụng Vô khuẩn Cấy trực tiếp 0,5 ml + 10% Phần nước ở trên là dịch trắng mờ, phần cặn màu trắng sữa. Sau khi lắc nhẹ tạo thành huyền dịch đồng nhất, không lẫn chất lạ khó hòa tan Không có sự phát triển của vi khuẩn và nấm sau 14 ngày 4 pH Đo điện thế điện cực 6,5-7,5 TCCS 5 Hàm lượng kháng nguyên HA SRID ≥ 15µgHA hoặc ≥30µgHA TCCS 3 TCCS TCCS DĐVN IV, 2009 6 Nhận dạng HA SIRD Ngưng kết với kháng huyết thanh đặc hiệu 7 Endotoxin Thử nghiệm LAL ≤ 100EU WHO- TRS 927, 2005 DĐ Châu Âu 2008 E.P 2008 8 Protein tổng số Lowry cải tiến ≤ 100 µg E.P 2008 9 Hàm lượng chất Chuẩn độ 3+ hấp phụ Al (mg) Complexon ≤ 1,25 DĐVN IV, 2009 10 An toàn chung Toàn bộ chuột sống khỏe mạnh, lên cân DĐVN IV, 2009 Thử trên chuột nhắt và chuột lang 18 Chương 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Mẫu nghiên cứu - Sản phẩm nghiên cứu tính sinh miễn dịch: lô 010215 và 010215B (15µg HA/liều); lô 040215 và 040215B (30 µg HA/liều). - Sản phẩm nghiên cứu tính ổn định sinh miễn dịch: lô 010813, 020813 và 030813 (15µg HA/liều) được bảo quản ở 5 ± 30C trong 18 tháng. - Dung dịch PBS dùng làm chứng âm. 2.1.1. Động vật thí nghiệm Chuột nhắt trắng Swiss, trọng lượng 20 – 22 g (IVAC) có nguồn gốc từ trại chăn nuôi động vật thí nghiệm Suối Dầu (IVAC). Chuột có độ tuổi từ 6 – 8 tuần được phân bố đều ngẫu nhiên vào các hộp. Mỗi hộp được gắn nhãn chứa đầy đủ thông tin. Trong mỗi hộp chuột, từng con được đánh 2 dấu trên thân để phân biệt theo từng nhóm và từng chuột. Trong suốt thời gian cách ly và thời gian thí nghiệm chuột, chuột được nuôi trong điều kiện phòng nuôi khép kín, có kiểm soát môi trường và điều kiện vi khí hậu. 2.1.2. Sinh phẩm Kháng nguyên cúm A/H5N1 bất hoạt hoặc chủng virus cúm có hiệu giá 160 HA bảo quản trong điều kiện -80oC. Khi sử dụng kháng nguyên được chuẩn độ và pha loãng thành dung dịch kháng nguyên chuẩn 8 HA/50 µl hoặc 4 HA/25 µl. 2.1.3. Dung dịch và hóa chất - Đệm PBS 0,01 M, pH 7,2 - Đệm PBS có 0,5% BSA - Dung dịch hồng cầu ngựa đậm đặc - Dung dịch hồng cầu ngựa 1% trong đệm PBS/BSA - Dung dịch Trypsin 0,4 % trong PBS - Dung dịch Periodat Kali 1/90 M - Dung dịch Glycerin 0,6 % - Nước muối sinh lý (NaCl 0,85 %) 2.1.4. Thiết bị và dụng cụ - Nồi cách thủy 56oC (Julabo) - Tủ ấm 37oC (Woerden) - Máy li tâm (Micro Centaur) 19 - Tủ lạnh 2 – 8 oC (Sharp) - Cân điện tử hiện số có độ chính xác 0,001 Gram (Satorius) - Pipet Pasteur (BioHit) - Micro – pipete (BioHit) - Multi channel micro – pipete (BioHit) - Đầu tips (BioHit) - Máng nhựa (Nunc) - Micronic tube (greiner) - Phiến chữ 96 giếng chữ V (Nunc) - Tubely tâm15ml (BioHit) 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Thiết kế nghiên cứu Nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin dự tuyển thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2/3 được thực hiện đối với hai loại vắc xin IVACFLU - A/H5N1 hấp phụ hydroxyt nhôm, lô số 010215 (loại 15 µg HA/ 0,5 ml) và 040215 (loại 30 µg HA/ 0,5 ml). Nghiên cứu sử dụng hai loại vắc xin IVACFLU - A/H5N1 tương ứng không hấp phụ với hydroxyt nhôm lô số 010215/B (loại 15 µg HA/ 0,5 ml) và 040215/B (loại 30 µg HA/ 0,5 ml) để đối chứng. Tính ổn định sinh miễn dịch được tiến hành đối với các lô vắc xin 010813, 020813, 030813 có hàm lượng kháng nguyên 15 µg HA/liều, bảo quản ở nhiệt độ 5 ± 3oC. Nghiên cứu được tiến hành tại các thời điểm vắc xin được bảo quản 6 tháng, 12 tháng, 18 tháng ở nhiệt độ 5 ± 3oC. Thực hiện phân nhóm chuột: Mỗi một lô vắc xin cần 3 nhóm chuột nhắt tương ứng với 3 nồng độ vắc xin được miễn dịch, mỗi nhóm gồm 16 con (tổng cộng 48 chuột cho 1 vắc xin). Trong mỗi nghiên cứu đều có một nhóm chứng âm gồm 8 chuột tiêm PBS. Mỗi một chuột của 1 nhóm ở các nồng độ tương ứng được tiêm bắp 2 lần vào ngày 0 và ngày 21. Chuột được lấy máu từng con vào các ngày -1 đến -3 (Máu nền – M0), ngày 21 (Máu 1 – M1) và ngày 35 (Máu 2 – M2). Tóm tắt của hai nghiên cứu được chỉ ra ở hai bảng 2.1 và 2.2 dưới đây: 20 Bảng 2.1: Thiết kế nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin cúm IVACFLU - A/H5N1 dự tuyển TNLS giai đoạn 2/3. Nhóm SL chuột chuột/ Vắc xin Độ Liều µg Ngày Ngày pha tiêm/chuột HA/chuột tiêm lấy máu 0, 21 0, 21, 35 nhóm 1 16 2 010215 1 3 16 1/2 1,5 3 16 1/4 0,75 4 16 1 3 5 16 1/2 1,5 6 16 1/4 7 16 8 010215B 040215 0,1ml 0,75 1/2 3 16 1/4 1,5 9 16 1/8 0,75 10 16 1/2 3 11 16 1/4 1,5 12 16 1/8 0,75 13 8 040215B PBS 21 Bảng 2.2: Thiết kế nghiên cứu tính ổn định sinh miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1. Nhóm SL chuột chuột/ Vắc xin Độ Liều µg Ngày Ngày pha tiêm/chuột HA/chuột tiêm lấy máu 0, 21 0, 21, 35 nhóm 1 16 2 010813 1 3 16 1/2 1,5 3 16 1/4 0,75 4 16 1 3 5 16 1/2 6 16 1/4 0,75 7 16 1 3 8 16 1/2 1,5 9 16 1/4 0,75 10 16 020813 030813 0,2ml 1,5 PBS 2.2.2. Các phương pháp sử dụng trong nghiên cứu 2.2.2.1. Tiêm miễn dịch Tiêm miễn dịch cho chuột được thực hiện qua hai liều tiêm cách nhau 21 ngày, các chuột sẽ được đánh dấu trước khi tiêm. Liều tiêm 0,1ml vắc xin hoặc giả dược theo đường tiêm dưới bắp đùi. 2.2.2.2. Phương pháp lấy máu thu huyết thanh miễn dịch Mỗi chuột được lấy máu 3 lần.  Lần thứ nhất (M0) hay còn gọi là máu nền được lấy trước khi tiêm miễn dịch từ 0 đến 3 ngày.  Lần thứ hai (M1) vào ngày thứ 21 (3 tuần sau liều thứ nhất).  Lần thứ ba (M2): ngày 35 (2 tuần sau liều thứ hai). Thể tích mỗi lần lấy máu từ 0,5 đến 0,8 ml. Phương pháp lấy máu: dùng pipet pasteur thủy tinh lấy máu. Đưa nhẹ nhàng đầu pipet vào khóe mắt chuột (dưới con ngươi), vào động mạch khoé mắt, xoáy nhẹ để máu từ từ chảy vào trong pipet pasteur. Khi đủ lượng máu cần lấy, rút pipet ra và cho máu vào tube nhựa đã ghi rõ thông tin. 22 Hình 2.1: Lấy máu chuột ở mắt. Máu sau khi được lấy sẽ được để trong tủ ấm 30 phút. Sau đó cho vào tủ lạnh 2 – 80C trong 1,5 – 2 giờ để thu được lượng huyết thanh tối đa. - Ly tâm tube máu ở 13000 vòng / 5 phút. - Thu huyết thanh cho vào microtube được ghi đầy đủ thông tin. - Bảo quản huyết thanh ≤ -200C cho đến khi chuẩn độ. 2.2.2.3. Phương pháp chuẩn độ kháng thể HA (phương pháp ức chế ngưng kết hồng cầu)  Nguyên tắc: - Kháng nguyên HA của virus cúm có khả năng gây ngưng kết hồng cầu của một số loại động vật máu nóng như gà, gà tây, ngựa,.... - Huyết thanh chứa kháng thể đặc hiệu HA sẽ ức chế khả năng này, ngăn không cho HA ngưng kết hồng cầu, phản ứng này xảy ra ngược với phản ứng ngưng kết hồng cầu nên được gọi là phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu. Dựa vào phản ứng này để xác định hiệu giá kháng thể HA hay được gọi là thử nghiệm HAI. - Huyết thanh chứa kháng thể kháng HA được pha loãng bậc 2 thành các độ pha khác nhau trên phiến 96 giếng, đáy chữ V. Sau đó bổ sung kháng nguyên HA chuẩn. Sau thời gian phản ứng (30 phút), bổ sung thêm dung dịch hồng cầu ngựa 1%. Phản ứng dương tính nếu kháng thể ức chế hoạt động của HA làm cho hồng 23 cầu không bị ngưng kết. Ngược lại, phản ứng âm tính khi kháng nguyên không bị ức chế và gây ngưng kết hồng cầu. - Đơn vị hiệu giá kháng thể HA (HAI) là nghịch đảo độ pha loãng cao nhất của huyết thanh vẫn còn ức chế hồng cầu và không gây ngưng kết hồng cầu hoàn toàn.  Xử lí huyết thanh - Mỗi mẫu huyết thanh được xử lý lặp trong 2 ống riêng biệt. - Cho vào mỗi ống 0,1 ml huyết thanh và 0,1 ml trypsin 0,4%. Ủ hỗn hợp ở 56oC trong 30 phút. - Lấy hỗn hợp ra, để nguội ở nhiệt độ phòng sau đó bổ sung 0,3 ml kali periodat 1/90M, để tiếp 15 phút ở nhiệt độ phòng. - Bổ sung 0,5 ml dụng dịch glyxeryl 0,6% trong nước muối sinh lý. - Như vậy huyết thanh đã được xử lý và pha loãng 1/10. - Huyết thanh đã xử lý được dùng làm phản ứng HAI (có thể bảo quản ở tủ lạnh 20oC).  Chuẩn độ kháng nguyên - Lấy 3 hàng A, B và C trên phiến chuẩn độ 96 giếng. Cho vào mỗi giếng 50 µl đệm PBS. Hàng A và B dùng để chuẩn độ kháng nguyên, hàng C dùng làm chứng hồng cầu. - Thêm vào giếng A1 và B1 mỗi giếng 50 µl kháng nguyên cần chuẩn độ. Trộn đều. - Chuyển 50 µl từ A1,B1 sang A2,B2. Trộn đều. Tiếp tục chuyểnnhư thế cho đến A12,B12. Loại bỏ 50 µl của A12,B12 - Thêm 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào tất cả các giếng. Lắc đều. Để ở nhiệt độ phòng trong 60 phút. - Đọc kết quả: o Dương tính (+) : hồng cầu ngưng kết. o Âm tính (-) : hồng cầu không ngưng kết. o Hiệu giá ngưng kết hồng cầu của kháng nguyên là giá trị nghịch đảo của độ pha loãng cao nhất của kháng nguyên mà vẫn còn gây ngưng kết hồng cầu. o Điều kiện để phản ứng có giá trị tin cậy: chứng hồng cầu âm tính. - Sau khi đọc kết quả ghi nhận hiệu giá HA của dung dịch kháng nguyên để làm căn cứ pha kháng nguyên thành dung dịch có 8 HA (ví dụ có chuẩn độ hiệu giá là 1280. 24 Để pha thành dung dịch 8 HA/50 µl sẽ pha loãng 160 lần: 1280:8 = 160:1. Tức là pha 1 ml kháng nguyên + 159 ml đệm PBS).  Kiểm tra kháng nguyên 8 HA - Cho vào tất cả các giếng 50 µl PBS vào tất cả ở hàng A, B và C trong phiến. - Cho 50 µl kháng nguyên vừa pha vào 2 giếng A1 B1 trộn đều, hút lấy 50 µl từ A1 B1 sang 2 giếng A2 B2, trộn đều. Tiếp tục pha loãng bậc hai đến hai giếng A6 B6. Bỏ 50 µl ở A6 B6. Như vậy là kháng nguyên đã được pha loãng bậc 2 từ độ pha 1/2 đến 1/64. - Cho 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào tất cả các giếng ở 3 hàng A, B và C. - Lắc đều và để yên trong 60 phút. - Đọc kết quả: dung dịch kháng nguyên có 8 HA khi: o Chứng hồng cầu: không ngưng kết (âm tính). o Các giếng A1 B1 đến A3 B3: hồng cầu ngưng kết (phản ứng dương tính ở độ pha 1/8 kháng nguyên và gây ngưng kết hồng cầu). o Các giếng A4 B4 đến A6 B6: hồng cầu không ngưng kết. - Nếu dung dịch kháng nguyên không đạt yêu cầu 8 HA thì phải pha lại và kiểm tra đến khi đạt được nồng đồ kháng 8 HA.  Phản ứng ức chế ngưng kết hồng cầu (HI) xác định kháng thể HAI - Các mẫu huyết thanh đã được xử lí và pha loãng 1/10 sẽ được phân bố vào các giếng, mỗi mẫu được phân bố 2 cột từ cột 1 – 10, như vậy 1 phiến sẽ được 5 mẫu, cột 11 – 12 sẽ là chứng kháng nguyên và chứng hồng cầu. - Cho 25 µl PBS vào tất cả các giếng trừ các giếng ở hàng A. - Cho 50 µl huyết thanh thử đã xử lí tương ứng vào tất cả các giếng ở hàng A. - Pha loãng bậc 2 bằng cách chuyển 25 µl từ A vào hàng tiếp sau trộn đều và lần lượt đến hàng H rồi hút bỏ 25 µl. Như vậy huyết thanh đã được pha loãng bậc 2 từ độ pha 1/10 (hàng A) đến 1/1280 (hàng H), mỗi giếng chứa 25 µl. - Cho 25 µl kháng nguyên 8 HA vào tất cả các giếng có huyết thanh đã pha loãng trong phiến. - Lắc đều và để yên trong 30 phút. - Thêm vào tất cả các giếng này 50 µl hồng cầu ngựa 1% để trong 60 phút để xem kết quả. - Cột 11 và 12 làn chứng hồng cầu và chứng kháng nguyên chia làm 2 ở hàng E. 25 o Từ hàng E đến H làm chứng hồng cầu: 50 µl hồng cầu, 50 µl PBS. o Từ hàng A đến D làm chứng kháng nguyên: 50 µl PBS vào tất cả các giếng, cho 50 µl kháng nguyên vào hàng A và pha loãng bậc 2 đến hàng D, thêm 50 µl hồng cầu ngựa 1% vào lắc đều và để yên trong 60 (nên thêm cùng lúc với mẫu để đọc kết quả cùng lúc). Bảng 2.3: Sơ đồ phản ứng: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 1/10 A HT1 HT1 HT2 HT2 HT3 HT3 HT4 HT4 HT5 HT5 KN KN 1/20 B KN KN 1/40 C KN KN 1/80 D KN KN 1/160 E HC HC 1/320 F HC HC 1/640 G HC HC 1/1280 H HC HC Đọc kết quả: - Dương tính (+): kháng nguyên bị ức chế không gây ngưng kết hồng cầu. - Âm tính (-): kháng nguyên không bị ức chế và gây ngưng kết hồng cầu. - Chưng hồng cầu: hồng cầu không bị ngưng kết. - Chưng kháng nguyên: hồng cầu phải ngưng kết đến hàng C (độ pha loãng 1/8). - Hiệu giá ức chế ngưng kết hồng cầu của huyết thanh là giá trị ngược của độ pha loãng cao nhât của huyết thanh mà vẫn còn gây ức chế ngưng kết hồng cầu hoàn toàn. Âm tính (-) Dương tính (+) Hình 2.2: Đọc kết quả phản ứng HAI 26 Hình 2.3: Kết quả thí nghiệm HAI trên phiến. 2.2.3. Phương pháp đánh giá kết quả nghiên cứu So sánh trước và sau tiêm vắc xin, nếu có sự tăng hiệu giá kháng thể cho thấy có đáp ứng miễn dịch đối với vắc xin:  Xác định hiệu giá trung bình nhân (GMT) của huyết thanh chuột miễn dịch sau liều tiêm thứ nhất (sau 21 ngày) và sau liều tiêm thứ 2 (sau 35 ngày). Theo qui ước quốc tế đối với các mẫu huyết thanh âm tính đều được qui ước có hiệu giá kháng thể bằng 5 HAI.  Xác định tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh thông qua đánh giá động lực kháng thể giữa máu 1 và máu 2 so với máu nền (M1/M0 và M2/M0), giữa máu 2 và máu 1 (M2/M1). Theo qui định quốc tế về miễn dịch huyết thanh học, vắc xin tạo được đáp ứng miễn dịch khi động lực kháng thể tăng gấp ≥ 4 lần so với trước đó. So sánh đáp ứng miễn dịch (hiệu giá kháng thể trung bình nhân và động lực kháng thể) của chuột miễn dịch với vắc xin bảo quản trong 18 tháng và đáp ứng miễn dịch của vắc xin sau sản xuất 6 tháng ở nhiệt độ 5 ± 30C. 27 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ BIỆN LUẬN 3.1 Kết quả nghiên cứu tính sinh miễn dịch của vắc xin cúm IVACFLU- A/H5N1 dự tuyển TNLS giai đoạn 2/3 3.1.1. Hiệu giá kháng thể kháng HA (HAI) trung bình nhân Bảng 3.1: Hiệu giá kháng thể kháng HA trung bình nhân (GMT) sau liều tiêm thứ nhất Liều miễn dịch Lô vắc xin Hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân (n = 16) 3 µg 1,5 µg 0,75 µg Lô 010215 30,84 25,93 16,81 Lô 040215 35,12 36,68 20,88 Trung bình 32,98 31,30 18,45 Lô 010215B 12,96 10,44 8,78 Lô 040215B 12,96 10,00 12,41 Trung bình 12,96 10,22 10,59 Sau liều tiêm thứ nhất đã có sự đáp ứng miễn dịch ở tất cả các độ pha (liều miễn dịch) mặc dù hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT) không cao nhưng sự thay đổi về huyết thanh miễn dịch so với máu nền (tất cả đều âm tính hay bằng 5 HAI ở tất cả chuột được miễn dịch). Bảng 3.1 cho thấy ở liều miễn dịch 0,75 µg HA/chuột tạo được đáp ứng kháng thể trung bình nhân từ 8,7 HAI - 20,88 HAI. Bảng 3.2: Hiệu giá kháng thể kháng HA trung bình nhân (GMT) sau liều tiêm thứ hai Liều miễn dịch Lô vắc xin Hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân (n = 16) 3 µg 1,5 µg 0,75 µg Lô 010215 207,49 153,22 113,14 Lô 040215 198,70 167,08 134,54 Trung bình 203,09 160,15 123,84 Lô 010215B 70,25 56,57 47,57 Lô 040215B 76,61 59,07 45,55 Trung bình 73,43 57,82 45,56 Sau liều tiêm thứ hai, hiệu giá kháng thể trung bình nhân ở tất cả các liều miễn dịch và ở tất cả các vắc xin nghiên cứu đề cho thấy tăng đáng kể so với sau liều thứ nhất. Kết quả cũng cho thấy ở các vắc xin hấp phụ tá chất đáp ứng kháng thể trung bình nhân hầu hết đều cao hơn so với vắc xin đối chứng không hấp phụ tương ứng ở các liều miễn 28 dịch 3 µg, 1,5 µg và 0,75 µg. Hiệu giá kháng trung bình nhân của các lô vắc xin hấp phụ cao hơn từ gấp 2 đến gấp 3 lần vắc xin không hấp phụ sau khi tiêm đủ 2 liều vắc xin. Phân tích hiệu giá kháng thể trung bình nhân tương ứng với các liều miễn dịch sau liều tiêm thứ nhất và thứ 2 được chỉ ra ở các hình 3.1, 3.2 và 3.3. Hiệu giá kháng thể trung bình vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 3 µg/liều Hiệu giá KT 200 150 hấp phụ 100 không hấp phụ 50 0 Thời gian 0 10 20 30 40 Hình 3.1: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 3 µg HA/chuột. Với liều miễn dịch 3 µg HA/chuột, hiệu giá kháng thể GMT đạt trung bình 203,09 HAI đối với vắc xin hấp phụ và đạt trung bình 73,43 HAI đối với vắc xin không hấp phụ (bảng 3.2). Như vậy có sự khác biệt về đáp ứng giữa vắc xin hấp phụ và vắc xin không hấp phụ sau cả 2 liều tiêm (M1 và M2). Vắc xin hấp phụ có hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân cao gấp 2,54 lần ở M1 và gấp 2,76 lần ở M2 so với vắc xin không hấp phụ. 29 Hiệu giá kháng thể trung bình vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 1,5 µg/liều 200 Hiệu giá KT 180 160 140 120 100 hấp phụ không hấp phụ 80 60 40 20 Thời gian 0 0 10 20 30 40 Hình 3.2: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 1,5 µg HA/chuột Hình 3.2 cho thấy ở liều miễn dịch 1,5 µg HA/chuột, hiệu giá kháng thể GMT đạt trung bình 160,15 HAI đối với vắc xin hấp phụ và đạt 57,82 HAI đối với vắc xin không hấp phụ. Như vậy tương tự như với liều 3 µg HA/chuột có sự khác biệt về đáp ứng giữa vắc xin hấp phụ và vắc xin không hấp phụ. Ở liều miễn dịch 1,5 µg HA/chuột, vắc xin hấp phụ có hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân cao gấp 3,06 lần ở M1 và gấp 2,77 lần ở M2 so với vắc xin không hấp phụ. 30 Hiệu giá kháng thể trung bình vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 0,75 µg/liều 200 Hiệu giá KT 180 160 140 120 100 hấp phụ không hấp phụ 80 60 40 20 Thời gian 0 0 10 20 30 40 Hình 3.3: GMT trung bình của vắc xin ở nồng độ kháng nguyên 0,75 µg HA/chuột. Hiệu giá kháng thể trung bình nhân của liều miễn dịch 0,75 µg HA/chuột nhìn chung thấp hơn so với 2 liều miễn dịch 1,5 µg HA và 3 µg HA. Tuy nhiên giữa vắc xin hấp phụ và không hấp phụ vẫn có sự chênh lệch khá nhiều, vắc xin hấp phụ có hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân cao gấp 1,74 lần ở M1 và gấp 2,72 lần ở M2 so với vắc xin không hấp phụ. 31 3.1.2. Tỷ lệ chuyển đổi hiệu giá kháng thể trung bình nhân so với máu nền và giữa các liều tiêm Bảng 3.3: Tỷ lệ chuyển đổi hiệu giá kháng thể trung bình nhân (GMT) của huyết thanh chuột miễn dịch giữa các liều tiêm, trước và sau tiêm vắc xin Vắc xin 010215 010215B (không hấp phụ) 040215 040215B (không hấp phụ) Liều (µg HA/chuột) 3 1,5 0,75 3 1,5 0,75 3 1,5 0,75 3 1,5 0,75 M2/M0 M1/M0 M2/M1 47,26 30,64 22,63 14,05 11,31 9,51 38,05 36,44 28,10 15,32 11,81 9,11 6,17 5,19 3,36 2,59 2,09 1,76 7,03 7,34 4,18 2,59 2,00 2,48 7,66 5,91 6,73 5,42 5,42 5,42 5,42 4,97 6,73 5,91 5,91 3,67 Bảng 3.3 cho thấy tỷ lệ chuyển đổi kháng thể trung bình nhân tăng gấp ≥ 4 lần đạt yêu cầu ở tất cả các liều miễn dịch của vắc xin hấp phụ và không hấp phụ khi so sánh trước và sau tiêm đủ 2 liều (M2/M0), nhưng tỷ lệ tăng của vắc xin hấp phụ cao hơn so với vắc xin không hấp phụ. Thêm vào đó khi so sánh tiêu chí này giữa M2/M1 và M1/M0 cho thấy vắc xin hấp phụ có đáp ứng tốt hơn hẳn so với vắc xin không hấp phụ. Kết quả chỉ ra ở bảng 3.3 cũng cho thấy đối với vắc xin hấp phụ ở liều miễn dịch 3 µg HA/chuột, biến thiên về tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh sau liều 2 (M2) có đáp ứng cao gấp 6.54 so với liều 1(M1) và cao gấp 42,65 lần so với máu nền (M0). Biến thiên về tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh trung bình nhân ở liều miễn dịch 1,5 µg HA/chuột cho thấy sau liều 2 (M2) đáp ứng cao gấp 5,44 so với liều 1 (M1) và cao gấp 35,4 lần so với máu nền (M0). Biến thiên về tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh trung bình nhân ở liều miễn dịch 0,75µg HA/chuột cho thấy sau liều 2 (M2) đáp ứng cao gấp 6,73 so với liều 1(M1) và cao gấp 25,36 lần so với máu nền (M0). 32 3.1.3. Tỷ lệ cá thể có chuyển đổi huyết thanh và phân bố hiệu giá kháng thể 3.1.3.1. Tỷ lệ cá thể có chuyển đổi huyết thanh ≥ 4 lần  Liều miễn dịch 3 µg/chuột Bảng 3.4: Tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh của liều miễn dịch 3 µg HA/chuột Tỷ lệ (%) số cá thể có chuyển đổi huyết thanh tăng gấp ≥ 4 lần Vắc xin hấp phụ Vắc xin đối chứng không hấp phụ 010215 040215 TB 010215B 040215B TB Sau liều 1 93,75 100 96,87 68,75 65,75 67,25 Sau liều 2 100 100 100 100 100 100 Ở liều miễn dịch 3 µg HA/chuột, sau liều tiêm thứ nhất tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh tăng ≥ 4 lần của vắc xin hấp phụ là 96,87 %, trong khi đó ở vắc xin đối chứng không hấp phụ tỷ lệ này là 67,25 %. Sau liều tiêm thứ 2, 100 % chuột miễn dịch (16 con) đều có chuyển đổi huyết thanh miễn dịch tăng ≥ 4 lần so với trước đó.  Liều miễn dịch 1,5 µg/chuột Bảng 3.5: Tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh của liều miễn dịch 1,5 µg HA/chuột Tỷ lệ (%) số cá thể có chuyển đổi huyết thanh Vắc xin hấp phụ Vắc xin đối chứng không hấp phụ 010215 040215 TB 010215B 040215B TB Sau liều 1 87,5 100 93,75 62,5 62,5 62,5 Sau liều 2 100 100 100 100 100 100 Ở liều miễn dịch 1,5 µg HA/chuột, sau liều tiêm thứ nhất tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh miễn dịch tăng ≥ 4 lần của vắc xin hấp phụ là 93,75 %, trong khi đó ở vắc xin đối chứng không hấp phụ tỷ lệ này là 62,5 %. Sau liều tiêm thứ 2, có 100 % chuột miễn dịch (16 con) đều có chuyển đổi huyết thanh miễn dịch tăng ≥ 4 lần. 33  Liều miễn dịch 0,75 µg/chuột Bảng 3.6: Tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh của liều miễn dịch 0,75 µg HA/chuột Tỷ lệ (%) số cá thể có chuyển đổi huyết thanh Vắc xin hấp phụ Vắc xin đối chứng không hấp phụ 010215 040215 TB 010215B 040215B TB Sau liều 1 100 93,75 96,87 50 68,75 59,37 Sau liều 2 100 93,75 96,87 100 100 100 Ở liều miễn dịch 0,75 µg HA/chuột, sau liều tiêm thứ nhất tỷ lệ số cá thể có chuyển đổi huyết thanh của vắc xin hấp phụ là 96,87 %, trong khi đó ở vắc xin đối chứng không hấp phụ tỷ lệ này là 59,37 % Sau liều tiêm thứ 2, tỷ lệ này là 96,87 % ở vắc xin hấp phụ và 100 % ở vắc xin không hấp phụ. 3.1.3.2. Phân bố hiệu giá kháng thể Phân bố hiệu giá kháng thể HAI của chuột miễn dịch ở các liều tiêm 3, 1,5 và 0,75 µg HA được chỉ ra ở bảng 3.7, 3.8 và 3.9. Bảng 3.7: Phân bố hiệu giá kháng thể HAI của chuột miễn dịch với liều tiêm 3 µg HA (%) Vắc xin hấp phụ Hiệu giá HAI 010215 Vắc xin đối chứng không hấp phụ 040215 010215B M1 (%) 040215B M1 M2 M1 M2 M2 (%) M1 (%) M2 (%) (%) (%) (%) < 40 43,75 0 31,25 0 81,25 0 75 0 ≥ 40 đến 56,25 12.5 68,75 12,5 18,75 81,25 25 62,5 0 81,25 0 75 0 18,75 0 37,5 0 6,25 0 12,5 0 0 0 0 (%) < 160 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 34 Bảng 3.8: Phân bố hiệu giá kháng thể HAI của chuột miễn dịch với liều tiêm 1,5 µg HA (%) Vắc xin hấp phụ Hiệu giá HAI 010215 M1 Vắc xin đối chứng không hấp phụ 040215 010215B M2 (%) M1 (%) M2 (%) M1 (%) 040215B M2 (%) M1 (%) (%) M2 (%) < 40 37,5 0 25 0 93,75 18,25 100 6,25 ≥ 40 đến 72,5 31,25 75 18,25 6,25 62,5 0 81,25 0 62,5 0 81,25 0 25 0 12,5 0 6,25 0 0 0 0 0 0 < 160 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 Bảng 3.9: Phân bố hiệu giá kháng thể HAI của chuột miễn dịch với liều tiêm 0,75 µg HA (%) Vắc xin hấp phụ Hiệu giá HAI 010215 M1 (%) Vắc xin đối chứng không hấp phụ 040215 M2 010215B M1 (%) M2 (%) M1 (%) M2 (%) (%) 040215B M1 M2 (%) (%) < 40 93,75 0 68,75 0 93,75 18,75 100 18,75 ≥ 40 đến 6,25 56,25 31,25 37,5 6,25 75 0 68,25 0 43,75 0 62,5 0 6,25 0 0 0 0 0 0 0 0 0 0 < 160 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 Từ các kết quả ở các bảng 3.7, 3.8 và 3.9 ta có thể vẽ được đồ thì phân bố hiệu giá kháng thể như sau: 35 Liều tiêm 3 µg 0% Liều tiêm 3 µg 0% 0% 0% 22% 37% 63% 78% ≥ 40 đến < 160 < 40 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 Liều tiêm 1,5 µg 0% ≥ 40 đến < 160 < 40 Liều tiêm 1,5 µg 6%0% 0% 34% 66% 94% ≥ 40 đến < 160 < 40 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 Liều tiêm 0,75 µg 0% ≥ 40 đến < 160 < 40 Liều tiêm 0,75 µg 0% 3% 0% 0% 19% 81% < 40 ≥ 40 đến < 160 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 A - Vắc xin hấp phụ 97% < 40 ≥ 40 đến < 160 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 B – Vắc xin không hấp phụ Hình 3.4: Biểu đồ phân bố hiệu giá kháng thể của 2 nhóm vắc xin sau liều tiêm thứ nhất. 36 Liều tiêm 3 µg 9% 0% 13% Liều tiêm 3 µg 0% 0% 28% 72% 78% ≥ 40 đến < 160 < 40 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 ≥ 40 đến < 160 < 40 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 Liều tiêm 1,5 µg Liều tiêm 1,5 µg 6% 0% 0% 31% 24% 63% 59% < 40 ≥ 40 đến < 160 ≥ 160 đến < 640 ≥ 40 đến < 160 < 40 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 Liều tiêm 0,75 µg 0% 17% Liều tiêm 0,75 µg 3% 0% 0% 20% 47% 53% 77% < 40 ≥ 40 đến < 160 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 A – Vắc xin hấp phụ < 40 ≥ 40 đến < 160 ≥ 160 đến < 640 ≥ 640 B – vắc xin không hấp phụ Hình 3.5: Biểu đồ phân bố hiệu giá kháng thể của 2 nhóm vắc xin sau liều tiêm thứ 2. 37 Phân tích về phân bố hiệu giá kháng thể cho thấy sau liều tiêm thứ nhất đáp ứng ở cả 3 liều miễn dịch 3, 1,5 và 0,75 µg HA/chuột ở mức < 160 HAI ở vắc xin hấp phụ và < 40 HAI ở nhóm vắc xin không hấp phụ. Sau liều tiêm thứ 2, phân bố hiệu giá kháng thể tập trung ở mức từ ≥ 160 HAI đến < 640 HAI ở vắc xin hấp phụ và đạt ≥ 40 HAI đến < 160 HAI ở vắc xin không hấp phụ. 3.2. Tính ổn định sinh miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ sau 18 tháng bảo quản ở 5 ±3oC 3.2.1.Hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân Bảng 3.10: Hiệu giá kháng thể HAI trung bình nhân (GMT) huyết thanh chuột miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 bảo quản trong 18 tháng. Vắc xin Liều (µgHA) Hiệu giá kháng thể trung bình nhân (HAI) T0 (Vắc xin sau sản xuất) T18 tháng (Vắc xin bảo quản ở 5±3oC trong 18 tháng) 010813 020813 030813 M0 M1 M2 M0 M1 M2 3 5 29,54 236,29 5 25,94 198,7 1,5 5 23,78 134,54 5 16,82 95,14 0,75 5 20 103,75 5 8,05 80 3 5 30,84 198,7 5 19,15 167,08 1,5 5 32,21 160 5 16,82 113,14 0,75 5 17,56 108,34 5 16,1 67,27 3 5 33,64 190,27 5 19,15 174,48 1,5 5 24,84 121,26 5 17,56 105,56 0,75 5 22,78 91,9 5 16,1 67,27 Kết quả xác định hiệu giá kháng thể HAI của vắc xin bảo quản ở 5 ± 3 oC trong 18 tháng cho thấy vắc xin vẫn giữ được khả năng tạo đáp ứng miễn dịch khá tốt. Sau liều tiêm thứ nhất ở tất cả các liều miễn dịch của các lô vắc xin đều tạo được đáp ứng với hiệu giá trung bình nhân ở liều miễn dịch thấp nhất (0,75 µg HA/ chuột) đạt 8,05 HAI và ở liều miễn dịch cao nhất (3 µg HA/ chuột) đạt 25,94 HAI. Sau liều tiêm thứ 2, đáp ứng tạo được 67,27 HAI ở liều miễn dịch 0,75 µg HA/ chuột và 198,7 HAI ở liều miễn dịch 3 µg HA/ chuột. 38 So sánh kết quả của vắc xin bảo quản ở 5 ± 3oC trong 18 tháng với vắc xin sau sản xuất cho thấy đáp ứng miễn dịch kháng thể trung bình nhân (GMT) thấp hơn hẳn ở tất cả các liều tiêm 3 µg, 1,5 µg và 0,75 µg (hình 3.6, 3.7 và 3.8). Hiệu giá KT Liều tiêm 3 µg HA 200 150 T0 100 T18 50 0 0 10 20 30 40 Thời gian Hình 3.6: Biến thiên GMT trung bình của các vắc xin thử nghiệm ở liều tiêm 3 µg tại T0 và T18 sau 2 liều tiêm. . 39 Hiệu giá KT Liều tiêm 1,5 µg HA 200 150 100 T0 T18 50 0 0 10 20 30 40 Thời gian Hình 3.7: Biến thiên GMT trung bình của các vắc xin thử nghiệm ở liều tiêm 1,5 µg tại T0 và T18 sau 2 liều tiêm. Hiệu giá KT Liều tiêm 0,75 µg HA 200 150 100 T0 T18 50 0 0 10 20 30 40 Thời gian Hình 3.8: Biến thiên GMT trung bình của các vắc xin thử nghiệm ở liều tiêm 0,75 µg tại T0 và T18 sau 2 liều tiêm 40 3.2.2. Tỷ lệ chuyển đổi kháng thể trung bình nhân so với máu nền của các liều tiêm và giữa các liều tiêm Bảng 3.11: So sánh tỷ lệ chuyển đổi kháng thể trung bình nhân của huyết thanh chuột miễn dịch giữa các liều tiêm, trước và sau tiêm của vắc xin bảo quản trong 18 tháng với vắc xin sau sản xuất. Vắc xin Liều T0 tháng (vắc xin sau sản xuất) T18 tháng (vắc xin bảo quản ở 5 ± 3oC trong 18 tháng) (µg HA) 010813 020813 030813 M2/ M1/ M2/ M2/ M1/ M2/ M0 M0 M1 M0 M0 M1 3 47,26 5,91 8,00 39,74 5,19 7,66 1,5 26,91 4,76 5,66 19,03 3,36 5,66 0,75 20,75 4,00 5,19 16 1,61 9,94 3 39,74 6,17 6,44 33,42 3,83 8,72 1,5 32 6,44 4,97 22,63 3,36 6,73 0,75 21,67 3,51 6,17 13,45 3,22 4,18 3 38,05 6,73 5,66 34,9 3,83 9,11 1,5 24,25 4,97 4,88 21,11 3,51 6,01 0,75 18,38 4,56 4,03 13,45 3,22 4,18 Kết quả bảng 3.11 cho thấy tỷ lệ chuyển đổi kháng thể trung bình nhân tăng gấp ≥ 4 lần của các lô vắc xin ở các liều tiêm và hai thời điểm T0 và T18 tháng đều đạt yêu cầu khi so sánh trước và sau khi tiêm đủ 2 liều tiêm (M2/M0). Mặc dù có sự sụt giảm cả về GMT và tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh so với T0 nhưng có thể khẳng định vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ bảo quản ở 5 ± 30C trong 18 tháng vẫn có khả năng tạo đáp ứng miễn dịch. Điều đó có nghĩa hiệu lực của vắc xin vẫn duy trì tốt khi giữ vắc xin ở nhiệt độ bảo quản trong 18 tháng (có hiệu lực). Điều này cũng được thấy rõ khi so sánh tiêu chí này giữa M1/M0 thì cho thấy thời điểm T0 luôn cho kết quả cao hơn thời điểm T18. 41 3.3. Biện luận Hiện nay, liều kháng nguyên có hiệu lực bảo vệ cho nguời đối với vắc xin cúm A/H5N1 chưa được xác định. Vì năng lực sản xuất của thế giới còn hạn chế nên việc xác định liều kháng nguyên thích hợp đủ khả năng tạo đáp ứng miễn dịch bảo vệ (huyết thanh có hiệu giá kháng thể ≥ 40 HAI) là vấn đề rất cấp thiết. Vai trò của tá chất trong việc giảm liều kháng nguyên và tăng sản lượng sản xuất được chú trọng nhằm tăng năng lực sản xuất, đáp ứng đủ vắc xin cho nhu cầu bảo vệ sức khoẻ của cộng đồng trước nguy cơ đại dịch cúm bùng phát. WHO khuyến cáo các nhà sản xuất, các nhà khoa học chủ động sản xuất vắc xin cúm đại dịch và nghiên cứu liều vắc xin thích hợp cho vắc xin mình sản xuất. Các nhà sản xuất trên thế giới đã thử nghiệm nhiều liều gây miễn dịch khác nhau trên nhiều loại vắc xin khác nhau. Kết quả thử nghiệm còn gây nhiều tranh cãi và một số còn trái ngược nhau. Các báo cáo tổng hợp kết quả nghiên cứu đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 đã được thực hiện tại viện Vắc xin và Sinh phẩm Y tế như: “Đáp ứng miễn dịch trên súc vật thí nghiệm của vắc xin cúm A/H5N1 dùng cho người sản xuất thử nghiệm tại IVAC” Nguyễn Thị Hoài Thu (2006), “Đánh giá đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt của vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất hydroxyt nhôm Al(OH)3 dùng cho người” Nguyễn Thị Thu Phương (2012),... đều cho thấy đáp ứng miễn dịch của vắc xin hấp phụ đều cao hơn vắc xin không hấp phụ. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cho thấy khả năng sinh miễn dịch của vắc xin hấp phụ cao hơn nhiều lần so với vắc xin không hấp phụ, phù hợp với các nghiên cứu trước đây tại Viện Vắc xin. Mắc dù nghiên cứu ở các liều miễn dịch khác nhau, vắc xin hấp phụ cho kết quả đáp ứng GMT cao gấp 4 đến 8 lần so với vắc xin không hấp phụ. Trong kết quả nghiên cứu cho thấy hiệu quả đáp ứng kháng thể trung bình nhân (GMT) và tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh trên ngưỡng qui định (40 HAI) đạt yêu cầu ở tất cả các liều kháng nguyên sau hai liều tiêm của vắc xin hấp phụ. Đây là một trong những căn cứ để đề xuất liều kháng nguyên thích hợp trên người. Các kêt quả này cũng là tiền đề để thúc đẩy phát triển ứng dụng của tá chất vào trong vắc xin nhằm giảm hàm lượng kháng nguyên đưa vào từ đó nâng cao khả năng sản xuất vắc xin. 42 Nghiên cứu tính ổn định để dự kiến hạn sử dụng (self life) của vắc xin là một trong những yêu cầu bắt buộc đối với tất cả các vắc xin mới phát triển, trong đó có vắc xin cúm A/H5N1. Đánh giá tính ổn định sinh miễn dịch là nghiên cứu đầu tiên và có thể nói là duy nhất hiện nay đối với vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất nhôm. Kết quả bước đầu của nghiên cứu cho thấy vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ khá bền vững khi bảo quản ở 5 ± 30C trong 18 tháng khi vắc xin vẫn duy trì được đáp ứng đầy đủ về GMT cũng như tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh tăng ≥ 4 lần sau đủ 2 liều tiêm. Các kết quả này là cơ sở đề xuất hạn sử dụng của vắc xin là 24 tháng. Điều này có ý nghĩa rất lớn trong chiến lược tiết kiệm kháng nguyên và dự trữ vắc xin đại dịch. Hiện nay nghiên cứu tính ổn định sinh miễn dịch vẫn đang được tiến hành. Trong giới hạn của luận văn, chúng tôi chỉ thực hiện được nghiên cứu với vắc xin bảo quản trong 18 tháng ở nhiệt độ 5 ± 30C. 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận 1 - Vắcxin cúm A/H5N1 tạo được đáp ứng miễn dịch trên chuột nhắt đạt yêu cầu ở 3 liều kháng nguyên khác nhau là 3 µg, 1,5 µg. 0,75 µg sau đủ 2 liều tiêm. 2 - Vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ tá chất nhôm hydroxyt tạo được đáp ứng miễn dịch và cao hơn so với vắc xin không hấp phụ tá chất về hiệu giá kháng thể trung bình nhân và tỷ lệ chuyển đổi huyết thanh trung bình tăng ≥ 4 lần sau đủ 2 liều tiêm. 3 - Vắc xin cúm A/H5N1hấp phụ bảo quản ở 5 ± 30C trong 18 tháng duy trì được đáp ứng miễn dịch đầy đủ sau đủ 2 liều tiêm. 4.2. Kiến nghị 1 - Kết quả nghiên cứu là một phần cơ cấu trong hồ sơ sản phẩm (IB) để đề xuất với bộ Y tế thử nghiệm lâm sàng vắc xin cúm A/H5N1 do Viện vắc xin và Sinh phẩm y tế sản xuất 2 - Tiếp tục đánh giá tính ổn định sinh miễn dịch của các lô vắc xin cúm A/H5N1 hấp phụ bảo quản ở 5 ± 30C trong 24 tháng và 30 tháng để đề xuất hạn sử dụng của vắc xin. 44 TÀI TIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT. 1. Bộ khoa học công nghệ (2006), Nghiên cứu quy trình sản xuất vắc xin cúm A/H5N1 bất hoạt dùng cho người bằng kỹ thuật nuôi cấy trên tế bào vẻo và trên trứng gà có phôi, thuyết minh đề tài nghiên cứu cấp nhà nước, thành phố Hồ Chí Minh. 2. Lê Văn Hiệp (2007) “vắc xin cúm A/H5N1 nào cho người Việt Nam”, tạp chí Y học Dự phòng, tập XVII số 3 (88), tr.11 – 13. 3. Lê Chính Huy (2001), vi sinh y học, Nhà xuất bản y khoa, Hà Nội. 4. Đinh Duy Khánh (1995), Nghiên cứu một số chế phẩm sinh học dùng trong việc chuẩn đoán cúm và xác định tuýp virus cúm, luận án Phó Tiến Sĩ Khoa học sinh học, Hà Nội. 5. Lê Thị Hoài Thu (2006), Đáp ứng miễn dịch trên súc vật thí nghiệm của vắc xin cúm A/H5N1 dùng cho người sản xuất thử nghiệm tại viện vắc xin Nha Trang, Luận án tốt nghiệp cử nhân khoa học, Khoa sinh học, Đại học Khoa học tự nhiên, TP Hồ Chí Minh. 6. Đặng Đức Trạch (1982), vi sinh vật y học, Nhà xuất bản Y học, Hà Nội. 7. Phạm Văn Ty (2005), Virus học, Nhà xuất bản Giáo dục, Hà Nội, Tr. 205 – 213. 8. Nguyễn Thu Vân, Hoàng Thuỷ Nguyên, Đỗ Thuỷ Ngân (2006) “đánh giá an toàn và đáp ứng miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 (FLUVAX) trên động vật thực nghiệm”, tạp chí Y học thực hành, số 7 tr.3 – 4. 9. Huỳnh Thị Thanh Xuân (2007), Xây dựng quy trình hấp thụ tá chất AL(OH)3 trong sản xuất vắc xin cúm A/H5N1, luận văn thạc sĩ sinh học khoa sinh học, Đại học Đà Lạt. 10. Phạm Văn Ty (2001), miễn dịch học, nhà xuất bản Đại học Quốc gia Hà Nội. TÀI LIỆU TIẾNG ANH 11. Bernd Sebastian Kamps and Gustavo Reyes – Teran (2006), Influenza 2006. Influenza 2006, Flying Publisher, German. 12. Lutz Gurtler (2006), Virology of Human Injfluenza, Influenza report 2006, Flying Publisher, German, pp.87 – 91. 13. Oliver Wyman (2007), Influenza Vaccine strategies for broad lobal access: Key Finding and project Methodllogy, PATH. 45 14. Ortrud Werner and Timm C. Harder (2006), Avian Influenza, Influenza Report 2006, Flying Publisher, German, pp.48 – 86. 15. Stephens Korsman (2006), Vaccines, Influenza Report 2006, Flying Publisher, German, pp.127 – 149. 16. WHO (2005), “WHO guidelines on the use of Vaccine and Antivirals during Influenza Pandemic”, Geneva, pp.1 – 25. 17. WHO (2006), “WHO recommendations for Influenza vaccine composition”, Geneva. 18. WHO (2007), Weekly epidemiological record, No.47, Geneva, pp. 409 – 416. 19. World Health Organization (2005), WHO guidance on development of influenza vaccinereference viruses by reverse genetics, Geneva. TÀI LIỆU INTERNET 20. http://www.who.int/influenza/human_animal_interface/H5N1_cumulative_tabl e_archives/en/ 21. http://www.ykhoa.net/chuyende/cum/benhcum/01benhcum06.htm 22. http://tusach.thuvienkhoahoc.com/wiki/Virus_c%C3%BAm_v%C3%A0_b%E1 %BB%87nh_c%C3%BAm_gia_c%E1%BA%A7m 46 PHỤ LỤC Phụ lục A: Bảng kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể HAI của thử nghiệm tính sinh miễn dịch của vắc xin cúm A/H5N1 thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2/3. H5N1 (CT PHASE II/III) Mous Dose e ID IVACFLUA/H5N1/030215B M0 M1 M2 (D-2) (D21) (D35) IVACFLUA/H5N1/030215 M0 M1 M2 (D-2) (D21) (D35) IVACFLUA/H5N1/050215B M0 M1 M2 (D-2) (D21) (D35) IVACFLUA/H5N1/050215 M0 M1 M2 (D-2) (D21) (D35) 1 5 20 80 5 20 80 5 20 40 5 40 160 2 5 20 80 5 20 320 5 5 40 5 40 80 3 5 20 160 5 10 320 5 5 40 5 40 160 4 5 5 80 5 40 160 5 40 160 5 40 160 5 5 40 80 5 40 160 5 40 160 5 20 80 6 5 5 40 5 20 320 5 10 80 5 20 160 7 5 5 40 5 40 320 5 10 40 5 20 320 8 5 40 160 5 80 640 5 5 40 5 40 640 9 5 5 40 5 80 160 5 5 40 5 80 160 10 5 40 80 5 80 160 5 20 160 5 20 160 11 5 10 40 5 80 160 5 40 160 5 40 160 12 5 10 40 5 40 320 5 5 40 5 20 640 13 5 10 80 5 10 80 5 40 160 5 80 160 14 5 20 160 5 5 160 5 20 160 5 40 320 15 5 5 40 5 20 160 5 10 80 5 40 320 16 5 20 80 5 80 320 5 10 80 5 40 160 5 12,96 70,25 5 30,84 207,4 5 12,96 76,60 5 35,12 198,7 1 5 5 20 5 40 160 5 5 40 5 20 80 2 5 5 40 5 10 80 5 10 80 5 20 160 3 5 10 80 5 40 160 5 20 80 5 20 320 4 5 20 160 5 40 640 5 5 40 5 80 160 5 5 10 80 5 40 320 5 20 80 5 20 80 6 5 5 20 5 5 80 5 20 40 5 40 160 7 5 20 80 5 40 160 5 5 160 5 80 320 8 5 10 40 5 80 160 5 10 40 5 40 160 9 5 20 80 5 40 80 5 20 40 5 40 160 10 5 20 40 5 40 320 5 10 160 5 40 320 11 5 10 40 5 20 160 5 10 80 5 40 160 12 5 5 20 5 40 160 5 20 80 5 40 160 13 5 20 40 5 20 80 5 5 20 5 40 160 14 5 5 80 5 40 160 5 5 40 5 40 320 15 5 5 160 5 20 160 5 20 40 5 40 80 16 5 40 160 5 5 80 5 5 80 5 40 160 5 10,44 56,56 5 25,93 153,2 5 10 59,07 5 36,68 167,0 3µg GMT 1,5 µg GMT 47 0,75 µg GMT 1 5 10 40 5 20 160 5 10 40 5 20 160 2 5 10 40 5 20 80 5 5 20 5 40 160 3 5 5 20 5 20 160 5 5 20 5 40 160 4 5 5 80 5 20 320 5 5 20 5 40 160 5 5 20 40 5 5 80 5 20 80 5 20 80 6 5 20 80 5 10 80 5 5 40 5 20 40 7 5 5 20 5 40 160 5 20 80 5 5 160 8 5 5 40 5 20 80 5 20 80 5 20 80 9 5 5 40 5 20 80 5 10 40 5 40 160 10 5 20 40 5 40 160 5 20 80 5 10 320 11 5 5 20 5 40 160 5 20 40 5 80 80 12 5 10 80 5 5 80 5 40 80 5 5 160 13 5 5 80 5 20 80 5 20 40 5 20 80 14 5 20 40 5 20 80 5 20 80 5 20 320 15 5 20 80 5 10 80 5 20 40 5 20 80 16 5 5 160 5 10 160 5 5 40 5 20 320 5 8,78 47,56 5 16,81 113,1 5 12,41 45,55 5 20,88 134,5 48 Phụ lục B: Bảng kết quả kiểm tra hiệu giá kháng thể của thử nghiệm kiểm tra tính ổn định của vắc xin cúm A/H5N1 sau thời gian bảo quản 18 tháng trong nhiệt độ 5 ± 30C. 3 Gian đoạn sau sản xuất (T0): H5N1 (CT PHASE I Dose Mouse ID 3 µg 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 GMT 1,5 1 µg 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 GMT IVACFLU-A/H5N1 GIAI ĐOẠN I (T0) 10813 20813 30813 M0 (D-2) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 M1 (D21) 40 20 10 10 80 40 40 40 20 20 80 10 40 20 40 80 29,53 20 40 40 20 10 40 80 20 40 5 20 10 80 10 20 40 M2 (D35) 640 160 160 320 320 80 160 320 640 160 320 80 640 160 160 320 236,29 160 160 320 80 160 40 160 320 160 80 80 160 320 160 160 40 M0 (D-2) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 M1 (D21) 40 20 80 20 40 10 80 40 40 20 80 40 40 20 20 10 30,84 40 80 40 10 40 40 20 40 40 80 10 40 20 40 40 20 M2 (D35) 160 160 320 160 160 80 320 640 160 320 640 320 160 160 80 80 198,69 160 640 80 80 320 160 160 320 160 320 80 160 80 160 160 80 M0 (D-2) 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 M1 (D21) 40 20 40 80 40 20 20 40 40 40 80 20 20 40 40 20 33,63 10 40 40 40 40 40 10 10 20 40 40 10 20 80 10 40 5 23,78 134,54 5 32,20 160 5 24,83 M2 (D35) 160 320 160 640 160 160 160 160 320 160 320 160 160 160 160 80 190,27 40 320 320 160 80 320 80 160 160 80 160 80 80 80 80 lost sampl e 121,25 49 0,75 ug GMT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 20 5 40 40 20 20 10 40 20 10 10 20 20 20 40 40 160 20 160 160 80 160 40 160 80 40 80 160 160 160 160 160 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 20 10 40 5 20 40 20 10 10 20 40 40 20 40 10 40 160 80 320 80 80 320 160 40 80 80 320 160 80 160 40 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 40 40 20 40 40 10 20 40 10 20 40 20 10 20 5 20 103,74 5 17,56 108,34 5 22,77 80 80 80 320 80 80 160 160 80 80 20 80 320 80 40 lost sampl e 91,89 4 Thời điểm sau sản xuất 18 tháng: IVACFLU-A/H5N1 GIAI ĐoẠN I (2013) - 18 THÁNG H5N1 (CT 10813 20813 PHASE I Dose Mouse M0 M1 M2 M0 M1 ID (D-2) (D21) (D35) (D(D21) 2) 3 µg 1 5 80 320 5 10 2 5 20 320 5 10 3 5 40 160 5 20 4 5 10 320 5 20 5 5 40 320 5 20 6 5 5 160 5 20 7 5 10 160 5 5 8 5 20 320 5 40 9 5 10 160 5 20 10 5 40 320 5 20 11 5 40 160 5 10 12 5 40 160 5 20 13 5 40 320 5 40 14 5 80 40 5 40 15 5 20 160 5 40 16 5 40 160 5 20 5 25,93 198,69 5 19,15 1,5 1 5 40 160 5 10 µg 2 5 20 40 5 5 30813 M2 (D35) M0 (D-2) M1 M2 (D21) (D35) 320 40 160 160 160 80 40 320 160 320 80 160 320 320 320 320 167,08 80 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 40 20 20 20 20 20 10 20 10 20 5 20 20 40 20 40 19,15 10 320 80 160 160 160 160 40 320 160 320 80 160 160 320 160 640 174,48 80 40 5 20 160 50 0,75 µg 3 4 5 6 5 5 5 5 20 20 20 40 160 160 40 160 5 5 5 5 40 40 40 20 160 320 320 160 5 5 5 5 40 20 80 5 160 160 320 40 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 GMT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 GMT 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 20 20 10 80 20 10 10 5 5 10 16,81 5 5 10 10 5 5 10 10 5 20 5 5 20 5 40 5 8,05 80 80 160 320 160 40 80 40 80 80 95,13 20 40 20 160 80 80 40 160 20 80 160 80 160 80 160 160 73,36 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 40 5 20 40 5 20 5 10 40 20 16,81 10 20 5 40 40 10 20 20 80 5 10 5 40 20 40 5 16,10 160 40 80 160 40 160 40 160 160 160 113,13 80 40 20 160 80 40 80 80 320 20 80 40 160 80 160 10 64,41 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 5 40 10 10 40 20 5 5 40 20 20 17,56 10 40 10 20 40 20 20 5 40 10 10 5 40 40 20 10 16,81 160 80 80 160 80 40 40 160 160 x 105,56 40 80 40 160 160 40 160 40 160 40 80 40 80 80 80 20 67,27 [...]... sản xuất vắc xin với công suất 1 – 3 triệu liều/năm Vắc xin cúm A/ H5N1 trước khi được thử nghiệm trên người, nghiên cứu tính sinh miễn dịch trên động vật thí nghiệm là một trong những yêu cầu bắt buộc để đánh giá khả năng tạo đáp ứng miễn dịch c a vắc xin trên người Với ý ngh a đó, chúng tôi tiến hành đề tài: “Nghiên cứu tính sinh miễn dịch vắc xin cúm A/ H5N1 dự tuyển thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2/3”... c a luận văn này đề tài hướng tới những mục tiêu sau: 1 Đánh giá tính sinh miễn dịch trên chuột nhắt c a xin cúm A/ H5N1 hấp phụ với gel hydroxyt nhôm (Al(OH)3) có đối chứng với vắc xin không hấp phụ cùng hàm lượng kháng nguyên HA tương ứng 2 Đánh giá tính ổn định sinh miễn dịch c a vắc xin cúm A/ H5N1 bảo quản ở nhiệt độ 5 ± 3oC trong 18 tháng 3 Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU Dịch tễ học bệnh cúm A/ H5N1. .. thử nghiệm, vắc xin cúm A/ H5N1 có thể tạo ra miễn dịch kém hơn cúm m a Năm 2006, nghiên cứu c a Treanor và cộng sự trên vắc xin cúm tiểu phần sản xuất từ chủng A/ Vietnam/1194/04 (H5N1) cho thấy cần hai liều vắc xin không tá chất, mỗi liều ch a 90 µg HA mới tạo ra kháng thể bảo vệ Kết quả nghiên cứu c a Link và cộng sự năm 2006 cho thấy, 78% người tham gia thử nghiệm có huyết thanh dương tính với hai... với hai liều vắc xin toàn thân tinh khiết, mỗi liều ch a 10 µg HA, hấp phụ với tá chất Al(OH)3 Như vậy, đối với vắc xin cúm A/ H5N1 tiểu phần hay toàn thân tinh khiết để tạo ra mức miễn dịch bảo vệ thì cần liều kháng nguyên HA lớn hơn so với vắc xin toàn virus [1]  Qui trình miễn dịch cho người và đường tiêm Qui trình miễn dịch cho người c a vắc xin cúm A/ H5N1 được khuyến cáo hiện nay là hai mũi tiêm... Hiện tại ch a nơi nào đ a ra được một công thức chung cho vắc xin phòng cúm A/ H5N1 có hiệu quả về kinh tế Các cuộc thử nghiệm lâm sàng về vắc xin A/ H5N1 đang diễn ra để kiểm chứng các công thức vắc xin khác nhau, kể cả các chất hấp phụ mà về lí thuyết có thể cho phép tăng cường đáp ứng miễn dịch tạo sự bảo vệ thích hợp ở một mức hàm lượng kháng nguyên thấp Vắc xin cúm A/ H5N1 là vắc xin một thành phần Về...ix DANH MỤC CÁC TỪ VIẾT TẮT DĐ Châu Âu (E.P) Dược điển Châu Âu DĐVN: Dược điển Việt Nam HA: Haemagglutinin HPAI: High Pathogenic Avian Influenza LPAI: Low Pathogenic Avian Influenza NA: Neuraminidase WHO: World Health Organization TCYTTG: Tổ chức Y tế thế giới MDCK : Tế bào thận chó Madin – Darby CEFs : Nuôi cấy trên nguyên bào sợi phôi gà HAI: Đơn vị hiệu giá kháng thể HA GMT : Hiệu giá kháng... vắc xin khác nhau, ví dụ: AS03 dùng trong vắc xin cúm, AS04 dùng trong vắc xin ng a HPV – các tá chất này đã được cấp giấy phép tại châu Âu Ngoài ra, còn có tá chất RC – 529 và ISS c a công ty Dynavax, MF59 + MTP – PE c a công ty Chiron và Norvatis, Các nghiên cứu thử nghiệm lâm sàng c a vắc xin cúm cho thấy, các tá chất mới có khả năng làm giảm liều kháng nguyên lớn hơn tá chất nhôm và an toàn trên... sản xuất vắc xin cúm A/ H5N1 đại dịch Mạng lưới giám sát mạng lưới bệnh cúm toàn cầu c a TCYTTG đã mô tả đặc điểm c a các chủng virus cúm A/ H5N1 phân lập được ở người và động vật ở các nước châu Á bị dịch năm 1994 và 2005 TCYTTG khuyến nghị rằng tính kháng nguyên và các đặc tính gen học c a các chủng virus cúm H5N1 này phù hợp để sản xuất vắc xin Trung tâm hợp tác và các phòng thí nghiệm chuẩn c a TCYTTG... lưu đáp ứng miễn dịch cho những kháng nguyên lớn hơn - Tăng cường đáp ứng miễn dịch với vắc xin ở những người có hệ miễn dịch ch a hoàn chỉnh, miễn dịch kém hoặc những người già yếu - Điều h a miễn dịch dịch thể và miễn dịch qua trung gian tế bào - Điều h a sản xuất kháng thể, số lượng kháng thể, tính đặc hiệu c a kháng thể, loại kháng thể ứng với các epitope trên các phức hợp sinh miễn dịch - Làm giảm... Endotoxin BAO BÌ- ĐÓNG GÓI VẮC XIN THÀNH PHẨM - Kiểm tra vật lý - Protein - Hàm lượng aluminum NHẬP KHO SINH PHẨM - SRID, Endotoxin - Vô trùng, pH - Thể tích, Nhận dạng HA XUẤT XƯỞNG - An toàn chung, nhận dạng  Công thức thành phần vắcxin cúm IVACFLU- A/ H5N1 Trong 1 liều 0,5 ml vắc xin cúm IVACFLU – A/ H5N1 gồm có: - Kháng nguyên bề mặt c a virus cúm (Hemagglutinin): 15 g hoặc 30 g - Tá chất Al(OH)3: ... thử nghiệm lâm sàng giai đoạn vắc xin cúm A/ H1N1/09 (2013) A/ H5N1 (2014) tạo tảng quan trọng để sản xuất vắc xin cúm A/ H5N1, chuẩn bị sản phẩm cho thử nghiệm lâm sàng giai đoạn 2/3 IVACFLU A/ H5N1. .. HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC -o0o - ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐÁNH GIÁ TÍNH SINH MIỄN DỊCH C A VẮC XIN CÚM A/ H5N1 DỰ TUYỂN THỬ NGHIỆM LÂM SÀNG... số liệu thử nghiệm, vắc xin cúm A/ H5N1 tạo miễn dịch cúm m a Năm 2006, nghiên cứu Treanor cộng vắc xin cúm tiểu phần sản xuất từ chủng A/ Vietnam/1194/04 (H5N1) cho thấy cần hai liều vắc xin không