BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ----------------0o0-------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO CỦA CAO CHIẾT TỪ THÂN CÂY SÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera) TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MCS - 7 Giảng viên hướng dẫn : TS. PHẠM VĂN PHÚC TS. NGUYỄN VĂN DUY Sinh viên thực hiện : HUỲNH PHÚ HIỀN Mã số sinh viên : 53130508 Khánh Hòa: tháng 6/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----------------0o0-------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO CỦA CAO CHIẾT TỪ THÂN CÂY SÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera) TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MCS - 7 GVHD : TS. PHẠM VĂN PHÚC TS. NGUYỄN VĂN DUY SVTH : HUỲNH PHÚ HIỀN MSSV : 53130508 Khánh Hòa, tháng 06/2015 i LỜI CẢM ƠN Truớc tiên, tôi xin chân thành cảm ơn đến: TS. Phạm Văn Phúc, Phó Truởng phòng, Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc – Trường Đại học KHTN TP. Hồ Chí Minh, người đã trực tiếp huớng dẫn tôi thực nghiệm, tạo mọi điều kiện học tập, hỗ trợ, động viên và truyền đạt nhiều kinh nghiệm quý báu để tôi có thể thực hiện tốt khóa luận này. Tôi xin cảm ơn TS. Nguyễn Văn Duy, Phó viện trưởng, Viện công nghệ sinh học và môi trường, Trường Đại học Nha Trang là người đã truyền những kiến thức kinh nghiệm và đã tận tâm góp ý, chia sẻ cũng như hướng dẫn tôi để hoàn thiện đề tài này. Tôi xin cảm ơn ThS. Phan Lữ Chính Nhân, người trực tiếp hướng dẫn kỹ thuật tất cả các thí nghiệm, cũng như hoàn thành các thí nghiệm trong đề tài. Anh cũng là người luôn chia sẻ, góp ý những suy nghĩ về khoa học và cách làm việc khoa học. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô tại Truờng Ðại học Nha Trang đã luôn quan tâm, chỉ bảo và truyền đạt những kiến thức chuyên môn quý báu làm nền tảng ban đầu vững chắc trong quá trình thực nghiệm nghiên cứu. Xin cảm ơn anh chị cán bộ đang công tác tại Phòng thí nghiệm Nghiên cứu và ứng dụng tế bào gốc – Trường Đại học KHTN TP. Hồ Chí Minh. Cảm ơn chị Ngọc Linh, các anh, chị và các bạn sinh viên đang thực tập tại phòng đã luôn giúp đỡ, ủng hộ tôi trong suốt quá trình thực tập. Xin chân thành cảm ơn! Huỳnh Phú Hiền ii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN .................................................................................................................... i MỤC LỤC ........................................................................................................................ ii ĐẶT VẤN ĐỀ............................................................................................................................. v DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ....................................................................................... vii DANH MỤC BẢNG ...................................................................................................... viii DANH MỤC HÌNH ......................................................................................................... ix CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................................... 1 1.1. SINH HỌC UNG THƯ VÚ ................................................................................... 1 1.1.1. Ung thư vú .................................................................................................................... 1 1.1.2. Phân loại ....................................................................................................................... 1 1.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ ............................................................................ 2 1.1.4. Các giai đoạn phát triển ............................................................................................... 3 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ...................................................... 4 1.2.1. Phẫu thuật ..................................................................................................................... 4 1.2.2. Xạ trị ............................................................................................................................. 4 1.2.3. Hóa trị ........................................................................................................................... 5 1.2.4. Hạn chế ......................................................................................................................... 5 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ ............................................................................................................................... 6 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................................. 6 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới .............................................................................. 7 1.4. XÁO TAM PHÂN .................................................................................................. 8 1.4.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm ............................................................................... 8 1.4.1.1. Nguồn gốc ................................................................................................ 8 1.4.1.2. Phân loại................................................................................................... 8 1.4.1.3. Đặc điểm .................................................................................................. 9 1.4.1.4. Thành phần hóa học .................................................................................. 9 1.4.2. Tình hình nghiên cứu Xáo tam phân .......................................................................... 10 1.5. TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG NUÔI CẤY TẾ BÀO TRONG LĨNH VỰC Y SINH HỌC...................................................................................................................... 11 1.5.1. Giới thiệu nuôi cấy tế bào động vật ............................................................................ 11 1.5.1.1. Đặc điểm của tế bào động vật ................................................................. 11 iii 1.5.1.2. Môi trường nuôi cấy và sự kiểm soát nhiễm ............................................ 12 1.5.2. Ưu, nhược điểm của nuôi cấy tế bào động vật ........................................................... 15 1.5.2.1. Ưu điểm ................................................................................................. 15 1.5.2.2. Nhược điểm ............................................................................................ 15 1.5.3. Sử dụng tế bào nuôi cấy để sàng lọc thuốc ................................................................. 16 1.5.4. Một số phương pháp khảo sát tác động kháng phân bào của hoạt chất tự nhiên ....... 17 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP .............................................................. 18 2.1. VẬT LIỆU ............................................................................................................... 18 2.1.1. Tế bào ......................................................................................................................... 18 2.1.2. Hóa chất ..................................................................................................................... 18 2.1.3. Thiết bị ....................................................................................................................... 20 2.1.4. Dụng cụ....................................................................................................................... 22 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................... 22 2.2.1. Tổng quát nghiên cứu ................................................................................................. 22 2.2.2. Nuôi và bảo quản tế bào ............................................................................................. 22 2.2.3. Phương pháp đếm tế bào với Trypan blue ............................................................... 26 2.2.4. Khảo sát tác động các loại cao chiết khác nhau lên sự tăng sinh của tế bào ung thư MCF-7 ................................................................................................................................ 28 2.2.5. Cách pha cao chiết ...................................................................................................... 31 2.2.6. Xử lý số liệu................................................................................................................ 31 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .................................................................... 32 3.1. 7 KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO MCF ............................................................................................................................. 32 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IC50 CỦA THUỐC THỬ DOXORUBICIN TRÊN DÒNG TẾ BÀO MCF - 7 ............................................................................................................ 34 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IC50 CỦA CAO CHIẾT METHANOL CỦA XÁO TAM PHÂN TRÊN DÒNG TẾ BÀO MCF - 7 ......................................................................... 37 3.4. KHẢO SÁT ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG MCF - 7 KHI XỬ LÝ VỚI CAO CHIẾT METHANOL XÁO TAM PHÂN Ở IC50 ............................................................ 40 3.5. THẢO LUẬN CHUNG ........................................................................................ 43 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ......................................................................................... 45 KẾT LUẬN..................................................................................................................... 45 KIẾN NGHỊ .................................................................................................................... 45 iv TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................... 46 v ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư - một trong những căn bệnh phổ biến và có tỷ lệ tử vong cao trên thế giới cũng như ở Việt Nam. Hiện nay vẫn đang là vấn đề nan giải của y học vì gần như vẫn chưa tìm ra được hoạt chất hay phương pháp điều trị hữu hiệu nhất cho các loại ung thư. Hằng năm, tỷ lệ tử vong/ mắc ở bệnh nhân ung thư trên toàn thế giới là 59,7% và tại Việt Nam số ca tử vong lên đến 82000 ca tương ứng 73,5%. Trong đó, ung thư vú là một trong những bệnh có tỷ lệ tử vong cao nhất. Đa phần người bệnh đến viện khi bệnh đã nặng khiến hiệu quả điều trị thấp, khoảng 35% tử vong. Bộ Y tế cảnh báo, cứ 10 phụ nữ Việt Nam thì 1 người có nguy cơ bị ung thư vú, mỗi năm có thêm 15000 người mắc bệnh này. Đã có nhiều công trình nghiên cứu nhằm điều trị hiệu quả căn bệnh ung thư. Hiện nay, xu hướng sàng lọc thuốc điều trị ung thư từ các loại thực vật đang được quan tâm và phát triển nhiều hơn. Điểm nổi bật của dược liệu tự nhiên là có thể hạn chế những tác dụng phụ từ hóa trị hay xạ trị. Bên cạnh đó, với nguồn nguyên liệu dồi dào sẵn có trong thiên nhiên, dược liệu hứa hẹn sẽ là liệu pháp mới điều trị ung thư. Các nguồn dược liệu quý tập trung nhiều ở khu vực Đông và Nam Châu Á như: Trung Quốc, Việt Nam, Triều Tiên,… Việt Nam nằm ở khu vực nhiệt đới với nguồn tài nguyên về cây thuốc đa dạng và phong phú – tiềm năng cho những dược liệu chứa hoạt chất kháng ung thư. Một trong những dược liệu đã và đang được quan tâm nghiên cứu là Xáo tam phân. Dựa trên những kết quả đã được công bố trước đó về tác dụng của Xáo tam phân trên nhiều loại ung thư (ung thư gan, ung thư vú, …), đề tài này được thực hiện để đánh giá khả năng kháng phân bào của cao chiết từ thân Xáo tam phân (XTP) lên dòng tế bào ung thư vú MCF – 7. Nội dung thực hiện gồm: vi 1. Khảo sát nồng độ gây chết 50% của thuốc chuẩn Doxorubicin lên MCF - 7. 2. Khảo sát nồng độ gây chết 50% của cao chiết XTP trong dung môi Methanol lên MCF - 7. 3. Xây dựng đường cong tăng trưởng, xác định thời gian nhân đôi của tế bào MCF - 7 nuôi cấy bình thường, và MCF – 7 bị tác dụng bởi cao chiết XTP. Từ đó làm tiền đề cho việc nghiên cứu sâu hơn về khả năng kháng ung thư cũng như những hoạt tính sinh học khác của Xáo tam phân. vii DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT ADSC : Adipose tissue-derived stem cells DMEM : Dullbecco’s Modified Eagle Medium DMSO : Dimethylsufoxide EDTA : Muối Ethylenediamine tetraacetic acid disodium FBS : Fetal Bovine Serum ( Huyết thanh bò) IC50 : Concentration Inhibitory (Nồng độ tối thiểu ức chế 50% tế bào) MCF – 7 : Michigan Cancer Foundation 7 MeOH : Methanol OD : Optical density PBS : Phosphate buffered Saline XTP : Xáo tam phân viii DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Kết quả khảo sát đường cong tăng trưởng của tế bào MCF - 7 ..... 32 Bảng 1.2. Kết quả khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào MCF – 7 ........................................................................................ 34 Bảng 1.3. Khảo sát IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân trên dòng tế bào MCF – 7 .................................................................................. 37 Bảng 1.4. Khảo sát đường cong tăng trưởng MCF – 7 khi xử lý với cao chiết Methanol Xáo tam phân ở IC50 ....................................................... 40 Bảng 1.5. Khảo sát tác dụng IC50 của cao chiết trên ADSC .......................... 42 ix DANH MỤC HÌNH Hình 1. Cây xáo tam phân ........................................................................... 9 Hình 2.1. Tế bào MCF – 7 ............................................................................ 18 Hình 2.2. Tủ nuôi tế bào ............................................................................... 21 Hình 2.3. Kính hiển vi điện tử ...................................................................... 21 Hình 2.4. Máy ly tâm ................................................................................... 21 Hình 2.5. Máy đo OD ................................................................................... 21 Hình 2.6. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu .......................................................... 24 Hình 2.7. Tế bào nhuộm với Trypan blue quan sát ...................................... 26 Hình 2.8. Buồng đếm hồng cầu .................................................................... 28 Hình 2.9. Sự biến đổi của MTT dưới tác động của enzyme trong ty thể ....... 29 Hình 3.1. Đồ thị đường cong tăng trưởng của tế bào MCF – 7 ..................... 33 Hình 3.2. Đồ thị khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin ............................ 35 Hình 3.3. Tế bào MCF – 7 khi thử thuốc Doxorubicin theo nồng độ ............ 36 Hình 3.4. Khảo sát IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân trên dòng tế bào MCF - 7 ................................................................................................. 38 Hình 3.5. Tế bào MCF – 7 khi xử lý với cao chiết MeOH XTP theo nồng độ ...... 39 Hình 3.6. Khảo sát đường cong tăng trưởng MCF – 7 khi xử lý cao chiết Methanol Xáo tam phân ở IC50 ..................................................................... 41 Hình 3.7. Thời gian nhân đôi của MCF – 7 nuôi cấy bình thường ................ 41 Hình 3.8. Tế bào ADSC khi xử lý cao chiết Methanol Xáo tam phân ở nồng độ IC50 .......................................................................................................... 43 1 CHƯƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. SINH HỌC UNG THƯ VÚ 1.1.1. Ung thư vú Ung thư vú là một nhóm bệnh làm cho tế bào trong cơ thể thay đổi và phát triển ngoài tầm kiểm soát. Đa số trường hợp, ở một giai đoạn nhất định, các bệnh nhân đều có sự xuất hiện của một hoặc nhiều khối tế bào ung thư được gọi là khối u trong cơ thể, và vị trí khối u hình thành được sử dụng để đặt tên cho căn bệnh ung thư. Ung thư vú bắt đầu từ mô vú, nơi được hình thành từ những tuyến tiết sữa (được gọi là tiểu thùy), các ống dẫn liên kết giữa tuyến tiết và đầu vú (tiểu quản). Các thành phần còn lại của vú được tạo bởi mô mỡ, mô liên kết và mô lympho. Ung thư vú xuất hiện ở cả nam lẫn nữ, tuy nhiên ở nam hiếm gặp hơn [15]. 1.1.2. Phân loại Có nhiều dạng ung thư vú và phổ biến nhất là các dạng: U tiểu quản tại chỗ (Ductal Carcinoma In-Situ – DCIS): đây là dạng phổ biến nhất cả ung thư vú lúc mới bắt đầu, tế bào ung thư được phát hiện bên trong lòng các tiểu quản, chúng chưa phát triển và lan rộng qua thành tiểu quản và chưa xâm nhập mô vú gần đó. Gần như mọi trường hợp mắc phải DCIS đều có thể trị lành. U tiểu thùy tại chỗ (Lobular Carcinoma In-Situ – LCIS): trường hợp này khối u bắt đầu từ các tuyến tạo sữa và chúng cũng không tăng trưởng xuyên qua u thành vách của tuyến. Đa số chuyên gia về ung thư vú đều cho rằng LCIS không phải là ung thư. Tuy nhiên, LCIS lại là một chỉ số về sự 2 gia tăng nguy cơ xâm lấn của ung thư vú, và quả thật phụ nữ bị LCIS sẽ có nguy cơ ung thư vú cao hơn. Ung thư tiểu quản xâm lấn (Invasive Lobolar Carcinoma – IDC): đây là dạng ung thư phổ biến nhất. Cũng giống như DCIS, trường hợp này bắt đầu tại tiểu quản của vú nhưng những tế bào ung thư sẽ tăng trưởng xuyên qua thành tiểu quản và xâm nhập vào mô mỡ của vú, sau đó đi đến các hạch bạch huyết để từ đó chúng có thể theo hệ thống bạch huyến đi khắp nơi trong cơ thể Ung thư tiểu thùy xâm lấn (Invasive Lobular Carcinoma – ILC): tương tự như IDC, nhưng nới bắt đầu của ILC là các tiểu thùy. Ung thư vú dạng viêm (Inflammatory Breast Cancer – IBC): đây là dạng ung thư vú hiếm thấy. Thường gặp nhất là trường hợp không có cục u hoặc ung bướu. IBC làm cho da ở vùng vú có màu đỏ và cảm thấy nóng ấm. Có thể da sẽ dày lên và lỗ chỗ (nhìn giống như vỏ cam). Bầu vú, có thể to hơn, cứng hơn, nhạy cảm với đau, hoặc bị ngứa. Do không có khối u nên sẽ khó phát hiện được IBC từ sớm, làm bệnh dễ dàng lan rộng và gây hậu quả tệ hơn ILC và IDC [16]. Ngoài ra, các thụ thể trên bề mặt tế bào ung thư như ER (Estrogen receptor), PR (Progesterone receptor), và HER2 (hay HER2/neu, thụ thể tăng trưởng biểu mô người – Human Epidermal Growth Factor Receptor 2) còn được sử dụng để phân ung thư vú thành các lớp phụ. Xác định được chính xác các lớp phụ này giúp cho việc chẩn đoán và chữa trị diễn ra thuân lợi hơn [15]. 1.1.3. Nguyên nhân và các yếu tố nguy cơ Tuy ung thư vú do sự bất thường trong bộ máy di truyền gây ra, nhưng chỉ có khoảng 5 - 10% bệnh nhân ung thư nhận gene bất thường từ cha 3 hoặc mẹ, bao gồm cả những gene nhạy cảm với ung thư vú như BRCA1 và BRCA2 (Breast Cancer Gene - gen ung thư vú) [9], [15]. Khoảng 60% phụ nữ xuất hiện đột biến gene BRCA1 và BRCA2 sẽ bị ung thư vú vào một khoảng thời gian nào đó trong cuộc sống của họ, cao hơn nhiều so với tỷ lệ 12% ở những phụ nữ bình thường. Bên cạnh đó, việc tồn tại đột biến ở gen BRCA1 và BRCA2 trong cơ thể còn làm cho họ có nguy cơ cao đối với ung thư vú đã được tìm ra như TP53 (gene mã hóa protein ngưng sự tăng sinh của tế bào ung thư) và PTEN/MMCA1 (phosphatase, tensin homologue/ mutated in multiple advanced cancer – một trong những gene ức chế khối u trong cơ thể) [9], ATM (gen sửa chữa DNA), CHEK2 (sản xuất ra protein kinase CHK2 được kích hoạt khi DNA bị tổn thương và liên quan đến việc ngừng chu trình tế bào), CDH1 (sản phẩm của CDH1 là E-cadherin, một loại protein đóng vai trò liên kết các tế bào với nhau để tạo nên cấu trúc mô, phụ nữ bị đột biến CDH1 làm tăng nguy cơ mắc ILC), STK11 (sản xuất ra serine/ threonine kinase 11, là một enzyme ức chế khối u) .Ngoài yếu tố di truyền, ung thư vú còn nhiều yếu tố nguy cơ khác như: tuổi tác, tiền sử sinh sản và chu kỳ kinh nguyệt, việc sử dụng các liệu pháp hormone, phơi nhiễm phóng xạ, việc chụp tia X quá thường xuyên, lượng cồn hấp thu, các tác động vật lý, các chỉ số cơ thể, tiền sử bệnh án liên quan tới vú. 1.1.4. Các giai đoạn phát triển Ung thư vú được chia thành các giai đoạn phát triển khác nhau dựa trên 4 đặc tính: Kích thước khối u; Có hay không sự di căn của khối u; Có hay không sự xuất hiện của khối u ở các hạch lympho; 4 Vị trí di căn của khối u. Căn cứ vào 4 đặc tính trên, hệ thống phân loại ung thư vú đang được sử dụng hiện nay bao gồm hệ thống 4 giai đoạn (từ 0 - IV) và hệ thống TNM (Tumor Nodes Metastasis). 1.2. CÁC PHƯƠNG PHÁP ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Phương pháp điều trị được lựa chọn tùy thuộc vào nhiều yếu tố như: tuổi tác, các căn bệnh đang mắc phải khác, giai đoạn ung thư vú, cơ hội thành công của phương pháp, sức khỏe người bệnh để chịu đựng những phản ứng phụ, điều kiện kinh tế của bệnh nhân… 1.2.1. Phẫu thuật Các dạng phẫu thuật của ung thư vú thường thấy là cắt bỏ u vú và cắt bỏ hạch bạch huyết ở dưới cánh tay. Cắt bỏ u vú còn gọi là phẫu thuật bảo toàn vú. Ưu điểm là có thể giữ lại hầu hết bầu vú. Nhược điểm là phải kết hợp với xạ trị sau phẫu thuật để đạt được hiệu quả cao nhất. Nhìn chungthì có vẻ cắt bỏ vú là cách tốt nhất để tiêu diệt “hoàn toàn” ung thư vú. Hơn 20 năm qua, các cuộc nghiên cứu lớn trên hàng ngàn phụ nữ đã cho thấy được điều này [15]. 1.2.2. Xạ trị Dùng chùm tia năng lượng cao để tiêu diệt tế bào ung thư vú là nguyên tắc cơ bản của xạ trị là dùng tia năng lượng cao. Phương pháp này dùng để tiêu diệt tế bào ung thư còn sót sau khi phẫu thuật. Có 2 cách chính để thực hiện liệu pháp này: chiếu xạ vào vú từ nguồn phát xạ đặt bên ngoài cơ thể (chiếu xạ bằng chùm tia ngoài) và đặt các hạt 5 phóng xạ vào mô vú ở kế cận vùng ung thư (liệu pháp cận phóng xạ) [15], [16]. 1.2.3. Hóa trị Hóa trị là việc sử dụng những chất hóa học làm thuốc để chống lại ung thư có tác dụng làm giảm thiểu kích thước khối u đã di căn. Phương pháp này phối hợp với những phương pháp điều trị khác nhằm đạt được hiệu quả cao nhất. Hóa trị đạt được hiệu quả cao nhất với liều đầy đủ và chu trình hoàn thành đúng thời gian được đưa ra. Hóa trị được thực hiện theo chu kỳ hay chu trình, giữa mỗi chu trình điều trị thường kéo dài nhiều tháng. Các nghiên cứu chỉ ra rằng, trong đại đa số các ca điều trị, việc phối hợp nhiều loại thuốc sẽ có hiệu quả trị liệu tốt hơn là sử dụng riêng lẽ một loại thuốc. Có nhiều sự kết hợp đang được sử dụng, và vẫn chưa thể kết luận rõ ràng sự kết hợp nào sẽ mang lại hiệu quả cao nhất trong điều trị. Các loại thuốc thường được sử dụng trong giai đoạn sớm của bệnh ung thư vú (trừ ung thư vú âm tính HER2) bao gồm: cyclophosphamide, methotretaxe, fluorouracil, doxorubicine (Adriamycin), epirubicin, paclitaxel (Taxol) và docetaxol (Taxotere). Tùy thuộc loại thuốc sử dụng, tá dược có thể được bổ sung từ 3 - 6 tháng [15], [16]. Việc đưa thuốc vào cơ thể có thể truy lùng những tế bào ung thư đã di căn hoặc khối u chưa được phát hiện trong cơ thể. Bên cạnh đó thuốc này có tác dụng phụ lên nhiều khu vực khác nhau, sẽ làm cho bệnh nhân cảm thấy mệt mỏi, khó chịu và dễ bị rụng tóc [16]. 1.2.4. Hạn chế Ngày càng có nhiều loại thuốc được tạo ra, nhưng tỷ lệ tử vong của bệnh nhân ung thư vú vẫn không giảm [15]. Việc sử dụng đơn lẻ từng liệu pháp không thể mang lại hiệu quả cao, đối với những đặc điểm khác nhau 6 của ung thư vú. Trong khi việc kết hợp nhiều liệu pháp với nhau làm cho cơ thể phải chịu nhiều tác dụng phụ như: thay đổi cấu trúc trong cơ thể; mất tính thẩm mỹ…Cho dù sau khi điều trị thành công, với những tác dụng phụ đó, chất lượng sức khỏe bệnh nhân bị thay đổi. Ở Việt Nam đa số các trường hợp ung thư vú được phát hiện khá trễ, nên việc chữa trị tận gốc dường như vô cùng khó khăn. Việc tìm ra phương pháp điều trị mới có hiệu quả hơn luôn là mục tiêu hàng đầu của các nhà khoa học. 1.3. TÌNH HÌNH NGHIÊN CỨU DƯỢC LIỆU TỰ NHIÊN TRONG ĐIỀU TRỊ UNG THƯ Hiện nay thuốc phòng ngừa và chữa trị ung thư từ các nguồn dược liệu thiên nhiên là một vấn đề đang rất được quan tâm trong vài thập kỷ trở lại đây. Nguồn dược liệu này không chỉ bổ sung thuốc cho phương pháp hóa trị, mà còn khắc phục tính chất gây tác dụng phụ của các hóa chất tổng hợp. 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Các hợp chất tự nhiên đóng vai trò rất quan trọng trong hóa trị liệu ung thư. Các thuốc kháng ung thư có nguồn gốc từ tự nhiên đã được nghiên cứu và sử dụng rộng rãi như Vincristine hay Vinblastine từ cây dừa cạn, Silymarin từ cây cúc gai, … Ở Việt Nam, đã có các nghiên cứu khảo sát cây thuốc, cũng như nghiên cứu thành phần và hoạt tính của chúng. Giáo sư Vũ Văn Chuyên cho biết đã tìm được 87 loại cây đặc hiệu chữa ung bướu và 18 cây có tác dụng chữa u ác tính. Những năm gần đây, các chuyên gia về y dược học đã nghiên cứu và đã đưa ra một số chế phẩm (nguồn gốc từ thảo mộc) có tác dụng phòng chống ung thư như: Chế phẩm Phulamin của Học viện Quân y; 7 Chế phẩm Gacvit của Hội ung thư Việt Nam; Chế phẩm Cadef (còn gọi là HTCK) của Viện Công nghệ Sinh Học; Giáo sư dược sỹ Đỗ Tất Lợi cũng đã nghiên cứu và ứng dụng cây Trinh nữ hoàng cung, kết hợp với các bài thuốc 18 vị của y học cổ truyền, trong điều trị ung thư vú, ung thư cổ tử cung, u xơ tiền liệt tuyến,… Một số nơi đã có những thành tựu đáng kể trong lĩnh vực này: như công ty Dược phẩm Trung ương II với thành công về cây Trinh nữ hoàng cung, cây dừa cạn và công ty Dược phẩm Traphaco đã bán ra thị trường biệt dược Cadef là thuốc hỗ trợ điều ung thư nguồn gốc thảo dược, trong đó có thành phần chính được chiết từ cây dừa cạn. Hiện nay, các phương pháp điều trị ung thư chủ yếu là phẫu thuật, xạ trị và hóa trị. Tuy nhiên, các phương pháp này có thể gây ra tác dụng phụ và những bất lợi trên tế bào lành. Vì thế, các nhà khoa học trên thế giới đang hy vọng tìm ra nhiều chất mới có trong cây thuốc thiên nhiên để điều trị ung thư hiệu quả mà không gây tác dụng phụ. 1.3.2. Tình hình nghiên cứu trên thế giới Từ năm 1986, Lương y Nam Hải (Chùa Thầy - Sơn Tây - Trung Quốc) đã nghiên cứu ứng dụng y học cổ truyền để chữa bệnh máu trắng (Leucemie cấp) đạt kết quả khả quan. Trên tạp chí “Let’s Live” số 2/2002 về báo cáo y học của Đại học Harvard xác nhận những người tiêu thụ cà chua nhiều và các hợp chất có trong cà chua hơn 2 lần mỗi tuần có thể làm giảm tỷ lệ ung thư nhiếp hộ tuyến đến 21 - 34%. Lycopene là một cấu chất chính của cà chua (tương đương với carotene của sinh tố A) là một chất dinh dưỡng mạnh có thể phòng chống ung thư nhiếp hộ tuyến, kích xúc tim và nhiều loại ung thư 8 khác. Theo TS. Lester Packer, một vị khảo cứu danh tiếng về sự chống dưỡng khí hóa thuốc Viện Đại học Berkely, California và cũng là đồng tác giả bộ sách “The Antioxidant Miracle” (Sứ chống dưỡng khí hóa kỳ diệu) (John Wiley & Sons, Inc., 1999): “Sự khảo sát trong ống nghiệm đã cho thấy Lycopene là một chất dưỡng khí hóa mạnh hơn chất beta carotene”. Điều này chứng tỏ Lycopene là một vũ khí lý tưởng để chống lại mọi loại ung thư. Tháng 8/2006 các nhà khoa học Ý đã phát hiện một vũ khí mới đầy hứa hẹn cho cuộc chiến chống ung thư: cây tùng lam, một loại cây mọc nhiều ở khu vực Đông Nam Á. Theo các nhà nghiên cứu tại Viện Thí nghiệm cây công nghiệp ở Bologna (Ý), trong cây tùng lam (tên khoa học Isatis tinctoria) có chứa một lượng lớn Glucobrassicin (GBS) một chất có khả năng chống ung thư và hiện được sử dụng như nguồn dược liệu chính để điều chế các chất cần thiết trong một loại thuốc chữa ung thư hiện nay. Các nhà khoa học tin rằng phát hiện này sẽ mở ra một nguồn dược liệu mới dùng để điều chế các loại thuốc ngăn ngừa ung thư, đặc biệt là ung thư vú 1.4. XÁO TAM PHÂN 1.4.1. Nguồn gốc, phân loại và đặc điểm 1.4.1.1. Nguồn gốc Cây Xáo tam phân có tên khoa học là Paramignya trimera (Oliv.) Guillaum [3]; đồng danh là Atalantia trimera Oliv. hay Luvunga monophylla (DC.) Mabb. [10], thuộc họ Cam (Rutaceae), là một trong 7 loài thuộc chi Paramignya được liệt kê có ở Việt Nam. Theo tác giả Phạm Hoàng Hộ trong cuốn sách Cây cỏ Việt Nam, loài thực vật này phân bố ở Bình Dương của Việt Nam và Thái Lan. 1.4.1.2. Phân loại 9 Giới : Plantae Ngành : Tracheophyta Lớp : Magnoligopsida Bộ : Sapindales Phân họ : Rutaceae Chi : Paramignya Loài : Paramignya trimera Hình 1. Cây xáo tam phân 1.4.1.3. Đặc điểm Về đặc điểm hình thái thì đây là một loài dây trườn thân gỗ, vỏ màu nâu vàng; thân dài trên 4 m; đường kính khoảng 10 cm. Thân và cành có nhiều gai nhọn, dài đến 7 - 8 cm. Lá đơn, mọc cách, đôi khi mọc chụm ở đầu cành, phiến dày, mép cong xuống dưới, có hình thuôn hẹp, dài 8 - 12 cm, rộng 1 - 3 cm; lá mọc ở gần gốc có phiến kích thước lớn hơn so với lá ở đoạn trên thân và cành; đầu lá tù hoặc hơi lõm. Phiến lá có mặt trên xanh đậm, mặt dưới nhạt hơn; bên trong có nhiều điểm dầu. Cuống lá ngắn 4 - 6 mm. Gỗ hơi cứng có màu vàng, đối với phần rễ có màu vàng đậm hơn. Các bộ phận của cây có tinh dầu, nhiều nhất ở rễ có mùi thơm dịu rất đặc trưng. 1.4.1.4. Thành phần hóa học Hiện nay các nhà khoa học trong cũng như ngoài nước đang tích cực thực hiện những nghiên cứu về thành phần chính xác của Xáo tam phân. 10 Qua khảo sát sơ bộ thì thành phần hóa học của Xáo tam phân có chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, coumarin, ankaloid, triterpenoid và saponin [2], [17]. Flavonoid: có khả năng chống ô xy hóa, có tác dụng bảo vệ cơ thể, ngăn ngừa xơ vữa động mạch, tai biến mạch máu não, lão hóa, thoái hóa gàn, tổn thương do bức xạ. Saponin: có tác dụng thông tiểu, chống viêm, kháng khuản, kháng nấm, ức chế hoạt động của virus,… Alkaloid: có tác dụng lên hệ thần kinh trung ương gây ức chế hoặc kích thích, gây mê tại chỗ, tăng huyết áp, diệt ký sinh trùng, có tác dụng chống ung thư,… Coumarin: có tác dụng chống co thắt, làm giãn nở động mạch vành, chống đông máu, kháng khuẩn… Triterpenoid: có tác dụng lớn trong điều trị bệnh tiểu đường, bệnh xơ gan, viêm gan cấp,… 1.4.2. Tình hình nghiên cứu Xáo tam phân Hiện nay, mặc dù Xáo tam phân với những lời đồn đại của người dân được xem là “Thần dược” và bị khai thác vô y thức, nhưng những nghiên cứu về Xáo tam phân vẫn chưa nhiều ở trong cũng như ngoài nước. Bước đầu các nhà khoa học đã nghiên cứu thành phần hóa học có trong Xáo tam phân. Ngoài việc đánh giá sơ bộ về thành phần hóa học của Xáo tam phân có chứa các hợp chất thuộc nhóm flavonoid, coumarin, ankaloid, triterpenoid và saponin, các nhà khoa học còn tìm ra, phân lập và xác định cấu trúc hóa học 3 hợp chất đó là: ostruthin; 6 - (3,7 dimethyl - 2,6 - octadienyl) 7 - hydroxyl - 8 - methyoxy - 2H - 1 - benzopyran - 2 - one và (2 hydroxyethyl) - 2,2 - dimethyl - 2H - 1 - benzopyran. Trong đó hợp chất 6 - 11 (3,7 dimethyl - 2,6 - octadienyl) - 7 - hydroxyl - 8 - methyoxy - 2H - 1 benzopyran - 2 - one là hợp chất thiên nhiên mới lần đầu tiên được tìm thấy và được đặt tên là Ninhvanin [1],[2]. Xáo tam phân cũng đã được nghiên cứu tác dụng gây độc trên tế bào ung thư. Với nghiên cứu này thì cao chiết methanol, phân đoạn n - hexan và hoạt chất từ Xáo tam phân thể hiện được độc tính trên 5 dòng tế bào ung thư, trong đó phân đoạn n - hexan và hoạt chất thể hiện độc tính ở mức trung bình, lần lượt trên tế bào ung thư gan Hep - G2 (IC50 = 39,61 µg/ ml) và dòng tế bào ung thu cổ tử cung (IC50 = 18,4 µM) [4]. Những nghiên cứu ban đầu về Xáo tam phân cho thấy công dụng và tiềm năng Xáo tam phân trong ngành dược liệu để chữa ung thư là rất cao. 1.5. TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG NUÔI CẤY TẾ BÀO TRONG LĨNH VỰC Y SINH HỌC 1.5.1. Giới thiệu nuôi cấy tế bào động vật 1.5.1.1. Đặc điểm của tế bào động vật Tính bền cơ học yếu do tế bào động vật không có vách, kích thước lại lớn (khoảng 10 µm), nên rất dễ vỡ bởi các lực tác động khi thao tác, do đó cần nhẹ nhàng khi di chuyển các mẫu, thời gian thao tác cần cố gắng sao cho ngắn nhất vì thời gian càng dài tế bào càng lỏng lẻo dễ vỡ. Tăng trưởng và phân chia chậm. Có cơ chế kìm hãm ngược: sự gia tăng nồng độ một chất nào đó trong môi trường sẽ gây ra sự ức chế quá trình tổng hợp và tiết ra ngoài môi trường chính chất đó, đồng thời cũng ức chế cả sự phát triển tế bào, thậm chí làm chết tế bào hàng loạt. Do đó, việc thay mới môi trường sau một thời gian nuôi cấy là rất cần thiết. 12 Hầu hết các tế bào động vật, trừ tế bào máu và một số giai đoạn của tế bào sinh dục, đều cần bám vào giá thể để sống và phát triển, thường là bề mặt rắn. Tuy nhiên, một số dòng tế bào ung thư hoặc dòng tế bào liên tục, sau khi được thuần hóa, có thể sinh trưởng trong trạng thái lơ lửng không cần bám vào nền. Có thể thay đổi kiểu gen và kiểu hình thông qua quá trình dung hợp hai tế bào có nhân khác nhau, hay quá trình biến nạp được thực hiện bởi một virus cảm ứng ung thư hoặc bởi hóa chất. Có thể được bảo quản bằng phương pháp lạnh sâu trong nitơ lỏng (196oC). Ngoài ra, còn một số đặc tính khác như: kém thích nghi với môi trường, nhạy cảm với ion kim loại, đa số đều cần huyết thanh, hormone,… để tăng trưởng và phân chia [5], [12], [14]. 1.5.1.2.Môi trường nuôi cấy và sự kiểm soát nhiễm Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy tế bào động vật là một hỗn hợp rất phức tạp các thành phần dinh dưỡng cùng các chất khác nhau cho tế bào sống và phát triển. Chất dinh dưỡng giữ vai trò tối cần thiết trong nuôi cấy tế bào, chúng là nhân tố quyết định sự thành bại của nuôi cấy tế bào in vitro. Hiện nay, có nhiều loại môi trường đã được nghiên cứu thiết kế để phù hợp với yêu cầu nuôi cấy từng loại tế bào khác nhau [7], như DMEM (Dullbecco), EMEM (H.Eagle), F10 và F12 (R.G.Ham), 199 (R.C.Parker), RPMI – 1640 (G.E.Moore)… Bên cạnh đó còn có các môi trường phối hợp hoặc bổ sung các chất để phù hợp với mục đích nuôi cấy khác nhau (nuôi sơ cấp, nuôi thứ cấp, biệt hóa tế bào,…). 13 Nhìn chung, môi trường nuôi cấy tế bào động vật cơ bản gồm các thành phần chủ yếu: muối vô cơ, hệ đệm, các amino acid, protein, carbohydrate, vitamin, các acid béo và lipid, các yếu tố vi lượng,… Đặc biệt, trong hầu hết các loại môi trường nuôi cấy tế bào động vật cần có huyết thanh vì những vai trò quan trọng của nó (bổ sung chất dinh dưỡng và các nhân tố quan trọng cho tế bào, giúp bất hoạt Trypsin và phục hồi tế bào bị tổn thương khi cấy chuyền, chống sự oxy hóa có thể gây tổn thương tế bào, cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng và tính bám dính của tế bào lên giá đỡ…). Ngoài ra, với những dạng tế bào chuyên biệt có thể thêm các yếu tố bổ sung cần thiết khác [5], [12], [13]. Khi tế bào được nuôi cấy phát triển dày đặc trên bề mặt của bình nuôi cấy (đối với nuôi cấy lớp đơn) hoặc khi môi trường đã suy yếu chất dinh dưỡng (đối với nuôi cấy tế bào ở thể huyền phù) thì tế bào cần phải được cấy chuyền để duy trì khả năng phát triển chúng. Tuy thực hiện cấy chuyền thì mật độ tế bào sẽ giảm xuống nhưng nếu mật độ tế bào được đảm bảo trong khoảng thích hợp (khoảng 104 – 106 tế bào/ml) và lượng môi trường đầy đủ thì chúng có thể phát triển trở lại một cách tối ưu. Vấn đề kiểm soát nhiễm Vấn đề quan trọng phải đương đầu trong nuôi cấy tế bào động vật in vitro là nhiễm (Contamination). Do tế bào động vật có tốc độ phân chia chậm (20 – 24 giờ một chu kỳ) nên chúng dễ bị lấn át bới các vi sinh vật ngoại nhiễm. Đồng thời, chúng cũng bị đe dọa bởi các virus. Các tác nhân nhiễm chủ yếu là bào tử nấm, vi khuẩn, mycoplasma, virus, đôi khi là nhiễm dòng tế bào khác vào mẫu nuôi cấy... Nấm và vi khuẩn phát triển rất nhanh so với tế bào động vật, gây hại nhiều nhưng có thể phát hiện khá dễ dàng. Mycoplasma và virus tương đối 14 khó và tốn kém để xác định vì phải dùng các phương pháp sinh hóa và các kỹ thuật cao như nhuộm huỳnh quang, kính hiển vi điện tử,… Khó khăn nhất là nhiễm dòng tế bào khác. Chúng có thể xảy ra nhiều năm mà không bị phát hiện. Tuy không gây hại nhiều đến tế bào mục tiêu đang nuôi cấy như các tác nhân trên, nhưng sự nhiễm tế bào khác làm ảnh hưởng lớn đến kết quả nghiên cứu cũng như sản phẩm nuôi cấy (đối với nuôi cấy tế bào để sản xuất các hợp chất sinh học hay dùng làm vật liệu cấy ghép). Một khi phát hiện ra mẫu nhiễm, cần nhanh chóng xử lý vô trùng, cách ly, tìm nguyên nhân sự nhiễm để có biện pháp xử lý thích hợp, thậm chí loại bỏ mẫu, tránh nhiễm sang các mẫu còn lại [6],[13]. Vô trùng là yếu tố cực kỳ quan trọng và được lưu ý đặc biệt trong nuôi cấy tế bào động vật. Phòng nuôi cấy tế bào phải được vô trùng đúng phương pháp và môi trường vô trùng trong phòng phải được duy trì. Để đảm bảo vô trùng, các thiết bị vô trùng như đèn UV, màng lọc HEPA, nồi hấp khử trùng, thiết kế “khóa không khí” … được sử dụng. Con người và các không gian thao tác, môi trường, dụng cụ… cần được giữ vô trùng trong suốt quá trình nuôi cấy. Tuyệt đối không mang thức ăn, nước uống vào phòng nuôi cấy tế bào. Riêng với môi trường nuôi, tùy theo tính chất hóa học của các thành phần môi trường, đặc biệt là tính bền nhiệt, nên chọn phương pháp khử trùng phù hợp, mà thường là hấp ướt hoặc lọc bằng milipore [5], [12], [13]. 15 1.5.2. Ưu, nhược điểm của nuôi cấy tế bào động vật 1.5.2.1. Ưu điểm Hệ thống tế bào động vật là “các nhà máy tế bào” thích hợp cho việc sản xuất các phân tử phức tạp và các kháng thể dùng làm thuốc phòng bệnh điều trị hoặc chẩn đoán. Các tế bào động vật đáp ứng được quá trình hậu dịch mã chính xác đối với các sản phẩm protein - sinh dược (biopharmaceutical). Sản xuất các viral vector dùng trong các liệu pháp gen (biến nạp một gen bình thường cao trong tế bào soma mang gen tương ứng bị khuyết để chữa bệnh khiếm khuyết do gen đó gây ra). Các mục đích chính của liệu pháp này là các bệnh ung thư, hội chứng suy giảm miễn dịch (HIV), chứng viêm khớp, các bệnh tim mạch và sơ hóa u nang. Sản xuất các tế bào động vật để dùng làm cơ chất in vitro trong nghiên cứu độc chất học và dược học. Phát triển công nghệ mô, phát sinh cơ quan để sản xuất cơ quan thay thế nhân tạo - sinh học hoặc các dụng cụ trợ giúp như: da nhân tạo để chữa bỏng, mô gan để chữa bệnh viêm gan [5]. 1.5.2.2. Nhược điểm Mặc dù tiềm năng của nuôi cấy tế bào động vật là rất lớn, nhưng việc nuôi cấy một số lượng lớn tế bào động vật thì thường gặp một số nhược điểm sau: Các tế bào động vật có kích thước lớn hơn và cấu trúc phức tạp hơn các tế bào vi sinh vật. Tốc độ sinh trưởng của tế bào động vật rất chậm so với tế bào vi sinh vật. vì thế, sản lượng của chúng rất thấp và việc duy trì điều kiện nuôi cấy vô trùng trong một thời gian dài thường gặp nhiều khó khăn hơn. 16 Các tế bào được bao bọc bởi màng huyết tương, mỏng hơn nhiều so với thành tế bào dày thường thấy vi sinh vật và tế bào thực vật, và kết quả là chúng rất dễ bị biến dạng và bị vỡ. Nhu cầu dinh dưỡng của tế bào động vật chưa được xác định một cách đầy đủ và môi trường nuôi cấy thường đòi hỏi bổ sung huyết thanh máu rất đắt tiền. Tế bào động vật là một phần của mô đã tổ chức (phân hóa) hơn là một cơ thể đơn bào như vi sinh vật. Hầu hết các tế bào động vật chỉ sinh trưởng khi được gắn lên một bề mặt. Tuy kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật gặp nhiều khó khăn và hạn chế nhưng nó có một tiềm năng ứng dụng rất lớn [5]. 1.5.3. Sử dụng tế bào nuôi cấy để sàng lọc thuốc Như đã biết, một loại thuốc muốn được dùng để điều trị bệnh trước khi được phép lưu hành phải trải qua nhiều khảo sát để đảm bảo hiệu quả tác dụng cũng như mức độ an toàn của nó, trong đó giai đoạn khảo sát trên các động vật có một ý nghĩa rất quan trọng. Thông thường, những khảo sát này đòi hỏi một thời gian dài và tốn kém, đồng thời không phải lúc nào cũng áp dụng được cho con người… Vì vậy, xu hướng sử dụng tế bào nuôi cấy in vitro làm mô hình khảo sát ngày càng phát triển, nhất là khi người ta có khả năng nuôi cấy hầu hết mọi loại tế bào nhờ các kỹ thuật hiện đại. Nhờ kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có thể nghiên cứu để tìm ra nhiều loại thuốc, trị các loại bệnh hiện nay chưa có thuốc đặc trị, đặc biệt là thuốc trị ung thư. Dược chất trước hết được khảo sát trên in vitro dựa trên một số phương pháp như MTT, Trypan Blue, Clonogenic, … thông qua kỹ thuật nuôi cấy tế bào, với các dòng tế bào ung thư nói riêng và trên các dòng tế bào nói chung. Từ các khảo sát in vitro, có thể kết luận về khả năng tác dụng của dược chất. Sau đó, 17 chúng sẽ tiếp tục được khảo sát trên in vivo, mà bước đầu là trên các động vật mô hình (model animal) để đảm bảo mức độ an toàn của dược chất. Cuối cùng là khảo sát trên một vài người bệnh tình nguyện trước khi được phép lưu hành. Nhờ kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật mà quá trình khảo sát rút ngắn hơn, ít phức tạp hơn. Đặc biệt, kỹ thuật nuôi cấy tế bào động vật có vai trò rất quan trọng trong nghiên cứu dược chất trị một số bệnh chỉ biểu hiện ở người mà không có ở trên động vật [8], [11]. 1.5.4. Một số phương pháp khảo sát tác động kháng phân bào của hoạt chất tự nhiên Hiện nay có khá nhiều phương pháp để khảo sát tác động kháng phân bào của các hoạt chất tự nhiên như : Phương pháp Trypan Blue (Trypan Blue exclusion assay) Phương pháp MTT (MTT assay) Phương pháp SRB (SRB assay) Phương pháp Clonogenic (Clonogenic assay) Phương pháp Xcelligence (Xcelligence assay) Tuy nhiên, trong đề tài này sẽ sử dụng phương pháp MTT để đánh giá tác động kháng phân bào bởi những ưu điểm như: Có tính ứng dụng cao, áp dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực khác nhau. Sự đo lường chính xác thông qua phép đo quang phổ. Thuốc thử an toàn, không kích hoạt chất phóng xạ bằng tay. Dễ sử dụng, thao tác đơn giản và nhanh, sử dụng những thiết bị hầu như có sẵn trong các phòng thí nghiệm. Lưu trữ thuận lợi. 18 CHƯƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1. VẬT LIỆU 2.1.1. Tế bào Dòng tế bào ung thư vú MCF-7 Dòng tế bào xuất xứ từ một phụ nữ da trắng 69 tuổi bị ung thư vú di căn vào năm 1970, cung cấp bởi Viện ung thư Quốc Gia Hoa Kỳ (NCI Frederick, MD, USA); được mua từ A TC C bảo quản và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm Tế bào gốc - trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp. Hồ Chí Minh. Tế bào ung thư vú MCF-7, được thể hiện trên hình 2.1. Hình 2.1. Tế bào MCF – 7 2.1.2. Hóa chất a. Dùng để chiết xuất cao chiết Xáo tam phân Methanol (J. T. Baker, Hoa Kỳ). Nước cất. 19 b. Dùng trong nuôi cấy tế bào Môi trường nuôi cấy Dòng tế bào được nuôi trường DMEM (Dullbecco’s Modified Eagle Medium) bổ sung huyết thanh bò 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/l và streptomycin 50 mg/l) (ký hiệu: DMEM/ F12/ 10% FBS/ 1% anti). Tế bào được cấy chuyền khi phát triển bao phủ bề mặt bình nuôi cấy khoảng 70 - 80%. Dung dịch đệm PBS (-) 1X Dung dịch đệm PBS (-) là dung dịch muối được sử dụng để rửa tế bào. Dung dịch PBS (-) dùng trong nuôi cấy tế bào không chứa ion Ca2+ và Mg2+ được gọi là PBS (-). Dung dịch Trypsin/EDTA Trypsin là một protease có tác dụng thủy phân các protein liên kết giữa các tế bào với nhau và các protein giúp tế bào bám lên bề mặt bình Roux. EDTA (muối disodium của ethylenediamintetra-acetic acid) có vai trò bắt các ion Ca2+ làm tăng tính ổn định của tế bào, làm tế bào dính chặt vào đáy bình Roux hơn. Trypsin/EDTA là dung dịch dùng để tách tế bào ra khỏi đáy bình Roux và làm cho chúng rời nhau ra, sử dụng trong thao tác cấy chuyền và bảo quản tế bào. Ngoài ra, dung dịch Trypsin/EDTA còn được sử dụng để rửa tế bào NCI-H460. Dung dịch Trypan blue 0,4% (w/v) (Cambrex) Trypan blue là một dẫn xuất của toluidine, là thuốc nhuộm được sử dụng để nhuộm chọn lọc mô hay tế bào chết. Ở những tế bào sống, màng tế bào còn nguyên vẹn nên Trypan blue không có khả năng thấm qua màng. Ở những tế 20 bào chết, màng bị tổn thương nên Trypan blue đi qua và nhuộm màu xanh. Tế bào sống và chết sẽ được phân biệt dưới kính hiển vi quang học qua màu nhuộm. Dimethyl sulphoxide (DMSO) DMSO là dung môi lưỡng tính (dipolar aprotic solvent), nó vừa có tính phân cực như các dung môi hữu cơ thông thường: alcol, ester, ketone chlorinate và những hydrocarbon thơm, vừa có tính phân cực như nước. Ngoài ra, nó còn ổn định với hầu hết acid và bazơ như: hydroxide, alkoxide, ammonium và các amon. Đây là tính đa dụng của DMSO khi được sử dụng làm dung môi. Ngoài ra, DMSO còn có khả năng mang thuốc xuyên qua màng tế bào. Thuốc thử chuẩn Doxorubicin Doxorubicin là một kháng sinh thuộc nhóm anthracyclin gây độc tế bào được phân lập từ môi trường nuôi cấy Streptomyces peucetius var. caecius. Hiện nay, Doxorubicin được tổng hợp từ daunorubicin. Doxorubicin kích ứng mạnh các mô và có thể gây hoại tử mô, ví dụ trong trường hợp tiêm ra ngoài mạch máu. Hoạt tính sinh học: doxorubicin gắn vào DNA làm ức chế các enzym cần thiết để sao chép và phiên mã DNA. Doxorubicin gây gián đoạn mạnh chu kỳ phát triển tế bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân, nhưng thuốc cũng tác dụng trên các giai đoạn khác của chu kỳ phát triển tế bào. Vì thế, doxorubicin được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu về các dòng tế bào ung thư vú. 2.1.3. Thiết bị Tủ an toàn sinh học cấp II ESCO (Singapore). 21 Tủ nuôi tế bào (37°C, 5% CO2) C150 Binder (Đức) (hình 2.2). Nồi hấp tiệt trung (autoclave) HV 85 Hirayama (Nhật Bản). Kính hiển vi soi ngược Axiovert 40 C Zeiss (Đức). Kính hiển vi quang học Primo Star Zeiss (Đức) (hình 2.3) . Tủ lạnh GS-S402S LG (Hàn Quốc). Hình 2.2. Tủ nuôi tế bào Hình 2.3. Kính hiển vi quang học Hình 2.4. Máy ly tâm Hình 2.5. Máy đo OD Máy ly tâm Allegra X-15R Centrifuge Beckman Coulter - Hoa Kỳ (hình 2.4). Máy đo OD (Multimode detector-microplate reader) DTX 880 Beckman Coulter (Hoa Kỳ) (hình 2.5). 22 Bể ổn nhiệt (Water Bath) Memmert ® Excellent WNE7. 2.1.4. Dụng cụ Buồng đếm Neubauer và lamelle (Marienfeld, Đức). Bình Flask nuôi cấy tế bào T25, T75 ( Corning, Hoa Kỳ). Đĩa 96 giếng (SPL Lifesciences, Hàn Quốc). Bình duran 50 ml, 100 ml, 250 ml, 500 ml (Schott, Đức). Falcon 15 ml, 50 ml (Corning, Hoa Kỳ). Eppendorf 1,5 ml (Eppendorf, Đức). 2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Tổng quát nghiên cứu Tổng quát nghiên cứu được thể hiện trên hình 2.6 2.2.2. Nuôi và bảo quản tế bào Mục đích: Duy trì dòng tế bào MCF – 7 cung cấp cho thí nghiệm. Quy trình đông lạnh tế bào Hút bỏ môi trường cũ có trong flask nuôi tế bào. Tráng PBS để làm sạch Flask, sau đó hút bỏ. Cho 0,5 ml Trypsin vào Flask để tách tế bào, ủ trong vòng 3 phút ở tủ ấm. Cho 1ml môi trường DMEM vào để bất hoạt Trypsin. Cho tất cả vào falcon 15 ml. Tráng lại flask bằng PBS, rồi cho vào falcon. Ly tâm falcon 2500 vòng/ phút trong 5 phút. 23 Lọc lấy cặn, thêm vào falcon 0,5 ml môi trường DMEM, huyền phù và cho vào cryotube. 24 Tế bào đối chứng ADSC Tế bào ung thư MCF-7 Nuôi cấy tế bào Khảo sát đường cong tăng trưởng Khảo sát thuốc thử Doxorubicin - Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng. Mật độ 1000 tế bào/ giếng. - Thực hiện bằng phương pháp đo MTT sau 24h mỗi lần đo trong 8 ngày. - Độ lặp lại thí nghiệm là 3 lần. - Xây dựng được đường cong tăng trưởng. - Xác định thời gian nhân đôi. Khảo sát cao chiết Methanol Xáo tam phân - Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng. Mật độ 1000 tế bào/ giếng. - Nồng độ thuốc khác nhau: 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125 µM - Thực hiện bằng phương pháp đo MTT sau 48h xử lý thuốc. Độ lặp lại thí nghiệm là 3 lần. Xác định nồng độ IC50 của thuốc - Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng. Mật độ 1000 tế bào/ giếng. - Nồng độ cao chiết khác nhau: 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/ 100µl. - Thực hiện bằng phương pháp đo MTT sau 48h xử lý thuốc. Độ lặp lại thí nghiệm là 3 lần. Xác định nồng độ IC50 của cao chiết Nuôi cấy tế bào ở đĩa 96 giếng. Mật độ 1000 tế bào/ giếng Đánh giá tác động cao chiết ở nồng độ IC50 - Xây dựng được đường cong tăng trưởng. - Xác định thời gian nhân đôi. So sánh kết quả 2 thí nghiệm Hình 2.6. Sơ đồ tổng quát nghiên cứu 25 Thêm 0,5ml môi trường đông lạnh vào cryotube một cách từ từ từng giọt Ủ cryotube ở 4°C trong 30 phút, sau đó ủ trong -20°C trong 3 - 4 tiếng, sau đó để ở -80°C trong 12 tiếng, cuối cùng đem vào cất trong Nitơ lỏng (180°C). Quy trình giải đông tế bào Chuyển cryotube chứa tế bào từ bình nitơ lỏng hay tủ -80°C lập tức vào water bath ở 36 - 38°C, đến khi dịch còn chút tinh thể bằng 1/10 tổng thể tích thì đem vào tủ ATSH. Huyền phù dịch tế bào trong cryotube đều tay và nhẹ nhàng, cho vào falcon 15 ml, bổ sung môi trường giải đông một cách từ từ để tránh gây sốc tế bào với tỉ lệ 1:1 hoặc 1:2 so với thể tích môi trường. Ly tâm ở 200 vòng/ phút trong 5 phút, lọc thu cặn. Thêm môi trường và huyền phù đề tay một cách nhẹ nhàng. Cấy tế bào vào các Flask nuôi tế bào. Nuôi trong tủ nuôi tế bào ở 37°C, 5% CO2. Sau 4 tiếng quan sát tế bào dưới kính hiển vi đánh giá sức khỏe của tế bào. Thay môi trường. Quy trình thay môi trường Hút bỏ môi trường cũ ra khỏi Flask. Tráng PBS để làm sạch Flask, sau đó hút bỏ. Thêm môi trường mới vào mỗi Flask (Flask T25 2,5 ml, Flask T75 7,5 ml). Nuôi trong tủ nuôi tế bào. Quy trình cấy chuyền Hút bỏ môi trường cũ có trong flask nuôi tế bào. 26 Tráng PBS để làm sạch Flask, sau đó hút bỏ. Cho 0,5 ml Trypsin vào Flask để tách tế bào, ủ ở tủ ấm trong 3 phút. Cho 1 ml môi trường DMEM vào để bất hoạt Trypsin. Cho tất cả vào falcon 15 ml. Tráng lại Flask bằng PBS, rồi cho vào falcon. Ly tâm falcon 2500 vòng/phút trong 5 phút. Lọc lấy cặn, cho vào falcon lượng môi trường DMEM cần thiết cho số lượng Flask cấy chuyền, huyền phù đều tay. Cho vào các Flask, đem quan sát tế bào dưới kính hiển vi. Nuôi tế bào trong tủ nuôi tế bào. 2.2.3. Phương pháp đếm tế bào với Trypan blue Mục đích và nguyên tắc Hình 2.7. Tế bào nhuộm với Trypan blue quan sát trong buồng đếm hồng cầu Phương pháp này sử dụng thuốc nhuộm Trypan blue để nhuộm tế bào nhằm phân biệt tế bào sống và tế bào chết, quan sát trong buồng đếm hồng 27 cầu. Trypan blue là thuốc nhuộm màu xanh dương chỉ có khả năng đi xuyên qua màng tế bào đã mất tính bán thấm. Do đó, khi dịch huyền phù tế bào được hòa trộn chung với Trypan blue, những tế bào sống có màng còn nguyên vẹn không hấp thụ được Trypan blue nên tế bào sẽ có hình dạng tròn, sáng và không bắt màu xanh. Ngược lại, những tế bào chết màng bị hư tổn, sẽ hấp thu thuốc nhuộm và có màu xanh khi quan sát dưới kính hiển vi (hình 2.7). Thí nghiệm được tiến hành như sau: Lau sạch bề mặt buồng đếm hồng cầu và lamelle với cồn 70%. Phải đảm bảo buồng đếm sạch, khô, không dính vết, dấu tay hoặc nước. Đặt lamelle bao phủ toàn bộ bề mặt vùng đếm của buồng đếm. Pha loãng dịch huyền phù tế bào (thu từ bước huyền phù tế bào trong cấy chuyền) 2 lần với Trypan blue bằng cách trộn 25 µl dịch huyền phù tế bào với 25 µl Trypan blue 0,4%. Chú ý : Khi sử dụng buồng đếm hồng cầu, lượng tế bào tối đa cho 1mm2 ô đếm là 50 - 100 tế bào. Pha loãng tế bào nếu cần thiết để thu được dịch huyền phù tế bào đồng nhất. Chuyển dịch tế bào đã huyền phù trong Trypan blue vào cạnh buồng đếm, bơm nhẹ, dịch tế bào sẽ tự dàn đều trên bề mặt buồng đếm dưới lamelle phủ nhờ lực mao dẫn. Quan sát tế bào dưới kính hiển vi, vật kính 10X. Đếm tế bào ở 4 ô ở góc (A, B, C, D) và ô trung tâm (E) trong buồng đếm hồng cầu (hình 2.8). Mỗi ô lớn này được chia làm 16 ô nhỏ hơn. Tế bào trong các vùng đếm này nên được phân bố đều, không đóng cục. Nếu tế bào không phân bố đều, rửa buồng đếm và làm lại. Các tế bào sống sẽ sáng rõ (không được nhuộm), các tế bào chết sẽ bị nhuộm xanh. 28 Hình 2.8. Buồng đếm hồng Chú ý : Đếm các tế bào ở bên trong, chạm giữa đường kẻ trên và bên trái hình vuông. Không đếm những tế bào chạm giữa đường kẻ ở dưới và bên phải hình vuông. Công thức tính mật độ tế bào M = (A/5) × 104 × độ pha loãng Với: M: mật độ tế bào (tế bào/ml); A: số tế bào đếm được trong 5 ô lớn. 2.2.4. Khảo sát tác động các loại cao chiết khác nhau lên sự tăng sinh của tế bào ung thư MCF-7 Quy tắc phương pháp MTT MTT là phương pháp so màu để đo hoạt động của enzyme làm biến đổi muối tetrazolium (MTT) có màu vàng, 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl), 2,5diphenyl tetrazolium bromide, thành formazan có màu tím, nhằm xác định số lượng tế bào sống trong các nghiên cứu về sự tăng trưởng và độc tính tế bào. Phương pháp dựa trên sự cắt đứt muối tetrazolium màu vàng (MTT) thành sản phẩm formazan màu xanh hòa tan bởi các enzyme trong ty thể. Lượng formazan tạo thành tỷ lệ với số tế bào sống hiện diện trong suốt quá trình tiếp xúc với MTT. Phương pháp MTT là phương pháp thực hiện nhanh, thuận tiện 29 và kinh tế nên nó là một phương pháp phổ biến để định lượng các tế bào sống trong nuôi cấy. Tuy nhiên, các thông số khác nhau được xác định có thể tác động đến sự biến dưỡng của tế bào và các yếu tố khác khiến hoạt động chuyên biệt của MTT biến đổi và làm sai lệch kết quả. Do đó, cần thiết lập các thông số để kiểm soát phù hợp cho mỗi dòng tế bào hoặc mỗi cách xử lý thuốc để tối ưu hóa điều kiện phân tích và giảm thiểu các tác động xấu. Các thông số này bao gồm: xác định mật độ tế bào thích hợp, môi trường nuôi cấy, nồng độ tối ưu và thời gian tiếp xúc với MTT, dinh dưỡng của môi trường nuôi cấy, kiểm soát các tác động xử lý thuốc có thể ảnh hưởng đến sự biến dưỡng tế bào. Bằng cách kiểm soát những thông số quan trọng này, phương pháp MTT cung cấp số lượng tế bào ống chính xác và tin cậy. Hình 2.9. Sự biến đổi của MTT dưới tác động của enzyme trong ty thể Thực hiện: Xây dựng đường cong tăng trưởng theo phương pháp MTT Chọn Flask có mật độ tế bào cao, tách tế bào bằng Trypsin- EDTA 0,25%. Ly tâm và thu cặn tế bào. Xác định mật độ tế bào trong dịch huyền phù bằng buồng đếm Neubauer. Điều chỉnh mật độ tế bào của dịch huyền phù khoảng 104 tế bào/ ml và cấy vào các giếng của đĩa 96 giếng, mỗi giếng 100 µl. Cần đảm bảo huyền 30 phù thật đều để số lượng tế bào trong các giếng đều nhau. Đặt đĩa vào tủ nuôi 37°C, 5% CO2. Sau 24h, thêm vào 10 µl MTT vào 3 giếng của từng ngày, ủ trong tủ nuôi. Sau 4h hút hết toàn bộ dung dịch có trong 3 giếng ra ngoài và thêm vào 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút. Đo OD và thu số liệu trên máy đo OD DTX 880. Thực hiện trong 8 ngày liên tiếp. Xây dựng đường cong tăng trưởng. Khảo sát thuốc thử chuẩn Doxorubicin trên dòng tế bào MCF – 7 Thực hiện song song cùng thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng của dòng tế bào MCF - 7 là thí nghiệm khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào MCF - 7. Cũng như thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng, thì mật độ tế bào của dịch huyền phù cũng là 104 tế bào/ ml, mỗi giếng được cấy 100 µl dịch. Đến ngày thứ 3 bắt đầu thay môi trường có bổ sung thuốc thử Doxorubicin với các nồng độ khác nhau 2; 1; 0,5; 0,25; 0,125; 0,0625; 0,03125 µM vào lần lượt các giếng tương ứng, mỗi nồng độ lặp lại 3 lần. Lúc này, mật độ tế bào có trong mỗi giếng sẽ khoảng 5 x 104 tế bào/ ml. Thêm 10 µl MTT vào mỗi giếng cần đo, ủ trong tủ nuôi trong vòng 4h. Sau đó hút toàn bộ dịch có trong các giếng ra ngoài và thêm 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút. Đo OD bằng máy đo DTX 880. Đánh giá kết quả. Khảo sát ảnh hưởng của cao chiết lên sự tăng sinh tế bào 31 Thực hiện tạo dịch huyền phù tế bào có mật độ 5×104 tế bào/ ml. Cấy vào mỗi giếng trong đĩa 96 giếng 100 µl dịch huyền phù tế bào, đặt đĩa vào tủ nuôi 37°C, 5% CO2 cho các tế bào ổn định. Sau 24h thay môi trường cũ bằng môi trường mới chứa cao chiết theo nồng độ 100; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,125 μg/ μl môi trường nuôi. Thêm 10µl MTT vào mỗi giếng cần đo, ủ trong tủ nuôi trong vòng 4h. Sau đó hút toàn bộ dịch có trong các giếng ra ngoài và thêm 100 µl DMSO để hòa tan tinh thể MTT, lắc 50 vòng/ phút trong vòng 10 phút. Đo OD bằng máy đo DTX 880. Đánh giá kết quả. 2.2.5. Cách pha cao chiết Cao chiết Methanol của Xáo tam phân được phòng thí nghiệm khoa Hóa – Trường Đại học KHTN TP. Hồ Chí Minh cung cấp. Cao chiết được pha trong dung môi DMSO, sau đó pha theo các nồng độ 100; 50; 25; 12,5; 6,25 và 3,125 μg/ 100 μl môi trường nuôi. 2.2.6. Xử lý số liệu Các số liệu và kết quả thí nghiệm sẽ được phân tích và xử lý bằng chương trình Excel của bộ phần mềm Microsoft Office 2013. Mỗi thí nghiệm được lặp lại 3 lần, độ tin cậy 95% 32 CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. KẾT QUẢ XÂY DỰNG ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG CỦA TẾ BÀO MCF - 7 Trong quá trình hoạt hóa và nhân sinh khối dòng tế bào, nhận thấy các tế bào nuôi trong các Flask khoảng 4 - 5 ngày sẽ phát triển dày đặc, cần phải cấy chuyền. Do đó, khoảng thời gian khảo sát được chọn là 8 ngày. Dịch huyền phù được cấy vào các giếng khảo sát có nồng độ 104 tế bào/ml, mỗi giếng được cấy 100 µl dịch. Sau 24 giờ, quan sát các giếng dưới kính hiển vi để đánh giá mật độ phát triển của tế bào; sau đó, bắt đầu tiến hành thử nghiệm mật độ tế bào bằng phương pháp MTT. Thực hiện 3 giếng cho mỗi ngày khảo sát. Kết quả khảo sát được trình bày trong bảng 1.1 Bảng 1.1. Kết quả khảo sát đường cong tăng trưởng của tế bào MCF - 7 Ngày khảo sát Chỉ số OD 540 nm Độ lệch Ngày chuẩn khảo sát Chỉ số OD 540 nm Độ lệch chuẩn 1 0,019 0,001 5 0,366 0,015 2 0,066 0,003 6 0,502 0,021 3 0,092 0,003 7 0,722 0,035 4 0,253 0,013 8 1,110 0,035 33 0.001 0.001 0.001 Giá trị OD 540 nm 0.001 0.001 0.001 0.001 0.001 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 Thời gian nuôi cấy (ngày) Hình 3.1. Đồ thị đường cong tăng trưởng của tế bào MCF – 7 Từ kết quả khảo sát, cho thấy thời gian để tế bào ổn định là khoảng 2 ngày. Sự khác biệt về mật độ tế bào của ngày thứ 1, ngày thứ 2 so với ngày 0 (ngày cấy tế bào vào đĩa) là không có ý nghĩa thống kê. Sau 2 ngày, quần thể bắt đầu đi vào pha tăng trưởng. Thời gian nhân đôi là 30,456 giờ. Quần thể tế bào phát triển ổn định đến ngày thứ 8, thì mật độ đã khá đầy giếng. Nếu tiếp tục nuôi, tế bào sẽ bong ra và chết nguyên nhân do ức chế tiếp xúc. Đường cong tăng trưởng (theo hình 3.1) là cơ sở để chọn thời điểm bắt đầu khảo sát. Theo kết quả có được từ khảo sát đường cong tăng trưởng thì thời điểm bắt đầu khảo sát tác động của cao chiết là ngày thứ 3 sau khi cấy tế bào vào giếng. Vào thời điểm ngày thứ 3 thì mật độ tế bào vào khoảng 5 x 104 tế bào/ ml. 34 3.2. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IC50 CỦA THUỐC THỬ DOXORUBICIN TRÊN DÒNG TẾ BÀO MCF - 7 Thực hiện song song cùng thí nghiệm xây dựng đường cong tăng trưởng của dòng tế bào MCF – 7 là thí nghiệm khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào MCF – 7. Sau 48 giờ, thử nghiệm MTT và đưa ra chỉ số IC50 của thuốc thử chuẩn Doxorubicin (bảng 1.2). Bảng 1.2. Kết quả khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào MCF – 7 (*: môi trường không chứa Doxorubicin) Nồng độ Doxorubicin Chỉ số OD Độ lệch (µM) 540 nm chuẩn 2 0,084 0,004 77,05 1 0,102 0,004 72,13 0,5 0,132 0,006 63,93 0,25 0,151 0,005 58,74 0,125 0,162 0,005 55,74 0,0625 0,184 0,009 49,73 0,03125 0,265 0,011 27,60 0* 0,366 0,015 0,00 % tế bào ức chế 35 090 077 080 072 % Tế bào bị ức chế 070 059 064 060 056 050 040 050 030 028 020 010 000 000 0 0,5 1 1,5 Nồng độ Doxorubicin (µM) 2 2,5 Hình 3.2. Đồ thị khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào MCF - 7 Qua thí nghiệm khảo sát này cho đồ thị trên hình 3.2 là cơ sở cho việc đánh giá việc kháng phân bào với nguyên nhân là do thuốc, % tế bào bị ức chế tăng dần theo nồng độ (nồng độ thấp nhất là 0,03125 µM với 27,6% tế bào bị ức chế, nồng độ cao nhất là 2 µM với 77,05% tế bào bị ức chế). Trên hình 3.3. thể hiện mật độ tế bào bị co tròn và bong tróc ra khỏi bề mặt bình nuôi cấy (sau khi thử nghiệm với thuốc thử chuẩn Doxorubicin) giảm dần theo tỷ lệ thuận với nồng độ giảm dần của thuốc thử chuẩn. Thí nghiệm cũng đã chỉ ra được chỉ số IC50 đối với dòng tế bào MCF - 7 của thuốc thử chuẩn Doxorubicin là 0,07 µM. Từ đây sẽ là cơ sở để đánh giá hoạt tính gây độc của cao chiết từ Xáo tam phân lên dòng tế bào ung thư vú MCF - 7. 36 a. b. c. d. e. f. g Hình 3.3. Tế bào MCF – 7 khi thử thuốc Doxorubicin theo nồng độ Trong đó: 37 a. 2 µM; b. 1 µM; c. 0,5 µM; d. 0,25 µM; e. 0,125 µM; f. 0,0625 µM; g. 0,03125 µM. 3.3. KẾT QUẢ KHẢO SÁT IC50 CỦA CAO CHIẾT METHANOL CỦA XÁO TAM PHÂN TRÊN DÒNG TẾ BÀO MCF - 7 Sau khi thực hiện thí nghiệm khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin thì tiến hành thí nghiệm khảo sát IC50 của cao chiết Methanol từ Xáo tam phân trên dòng tế bào MCF - 7 để đánh giá hoạt tính gây độc lên tế bào MCF - 7. Thí nghiệm này được thực hiện tương tự khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin trên dòng tế bào MCF - 7. Vì thời gian để dòng tế bào MCF - 7 đi vào pha tăng trưởng là vào khoảng ngày thứ 3, tương đương với mật độ tế bào là 5 x 103 tế bào/giếng. Do đó, ở thí nghiệm này sẽ cấy vào mỗi giếng với mật độ là 5 x 104 tế bào/ ml. Các nồng độ thử cao: 100; 50; 25; 12,5; 6,25; 3,125 µg/ 100 µl. Sau 48 giờ, thử nghiệm MTT và đưa ra chỉ số IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân (bảng 1.3). Bảng 1.3. Khảo sát IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân trên dòng tế bào MCF – 7 (*: môi trường không chứa cao chiết Methanol XTP) Nồng độ cao chiết Methanol XTP (µg/ 100 µl) Chỉ số OD 540 nm Độ lệch chuẩn % TB ức chế 100 0,036 0,001 88,82 50 0,049 0,002 86,23 25 0,172 0,006 51,86 12,5 0,251 0,012 29,52 38 6,25 0,289 0,011 18,45 3,125 0,317 0,014 10,78 0* 0,353 0,013 0 0,351 0,015 0,57 Môi trường chứa % tế bào bị ức chế 0.1% DMSO 100 090 080 070 060 050 040 030 020 010 000 089 086 052 030 018 011 0 20 40 60 80 100 120 Nồng độ cao chiết MeOH Hình 3.4. Khảo sát IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân trên dòng tế bào MCF - 7 Khi khảo sát cao chiết Methanol Xáo tam phân trên dòng tế bào MCF – 7 tế % tế bào bị ức chế tăng dần với nồng độ cao chiết cao dần. Với % tế bào ức chế thấp nhất là 10,78% ở nồng độ 10 µg/ 100 µl, và % tế bào ức chế cao nhất là 88,82% ở nồng độ 100 µg/ 100 µl (hình 3.4). Trên hình 3.5. thể hiện mật độ tế bào bị co tròn và bong tróc ra khỏi bề mặt bình nuôi cấy (sau khi thử nghiệm với cao chiết MeOH XTP) giảm dần theo tỷ lệ thuận với nồng độ giảm dần của cao chiết. Với kết quả từ thí nghiệm, tìm được IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân lên dòng tế bào MCF - 7 đó là 23,96 µg/ 100 µl, từ kết quả của thí nghiệm này sẽ khảo sát sự tăng trưởng của tế bào MCF - 7 khi được nuôi 39 trong môi trường có nồng độ IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân. Từ đó đánh giá được khả năng gây độc lên tế bào MCF - 7 của cao chiết này. a. b. c. d. e. f. Hình 3.5. Tế bào MCF – 7 khi xử lý với cao chiết MeOH XTP theo nồng độ Trong đó: a. 100 µg/ 100 µl; b. 50 µg/ 100 µl; c. 25 µg/ 100 µl; d. 12,5 µg/ 100 µl; e. 6.25 µg/ 100 µl; f. 3,125 µg/ 100 µl 40 3.4. KHẢO SÁT ĐƯỜNG CONG TĂNG TRƯỞNG MCF - 7 KHI XỬ LÝ VỚI CAO CHIẾT METHANOL XÁO TAM PHÂN Ở IC50 Thí nghiệm này nhằm đánh giá khả năng gây độc lên dòng tế bào MCF - 7 của cao chiết Methanol Xáo tam phân. Dịch huyền phù để cấy vào các giếng có mật độ tế bào là 104 tế bào/ ml. Khảo sát sự tăng trưởng của tế bào MCF - 7 trong 5 ngày liên tiếp bằng phương pháp MTT, thử nghiệm lặp lại 3 lần. Sau khi cấy 24 giờ, tế bào bắt đầu bám dính vào bề mặt bình nuôi cấy thì bắt đầu thay môi trường có bổ sung nồng độ IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân. Mỗi ngày sau khi đo MTT đều phải thay môi trường có bổ sung nồng độ IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân. Bảng 1.4. Khảo sát đường cong tăng trưởng MCF – 7 khi xử lý với cao chiết Methanol Xáo tam phân ở IC50 Ngày Chỉ số OD 540 nm Độ lệch chuẩn 1 0,026 0,001 2 0,034 0,001 3 0,058 0,002 4 0,093 0,003 5 0,108 0,003 Giá trị OD 540 nm 41 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 Đối chứng 0.000 0.000 0 1 0.000 Xử lý cao chiết XTP 0.000 0.000 0.000 0.000 0.000 2 3 4 Thời gian nuôi cấy (ngày) 5 6 Hình 3.6. Khảo sát đường cong tăng trưởng MCF – 7 khi xử lý cao chiết Methanol Xáo tam phân ở IC50 40,2 45 40 Thời gian (giờ) 35 30,456 30 25 20 15 10 5 0 MCF-7 MCF - 7 IC50 Hình 3.7. Thời gian nhân đôi của MCF – 7 nuôi cấy bình thường và MCF – 7 nuôi cấy trong môi trường nồng độ IC50 của cao chiết Thời gian nhân đôi của tế bào MCF - 7 khi được ủ với nồng độ IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân đó là 40,2 giờ. Kết quả cho thấy với nồng độ IC50 này thì cao chiết có khả năng ức chế khả năng phân bào của tế bào MCF - 7 (thời gian nhân đôi của MCF – 7 để đối chứng như hình 3.6 là 30,456 giờ). Kết quả khảo sát tác dụng cao chiết Xáo tam phân ở nồng độ IC50 trên dòng tế bào ADSC 42 Mặc dù có thể xác định rằng cao chiết Methanol của Xáo tam phân có khả năng kháng phân bào đối với dòng tế bào MCF - 7 nhưng liệu cao chiết này có tác dụng lên tế bào bình thường không. Do đó, thí nghiệm này được tiến hành để tìm ra câu trả lời. Tế bào được chọn để thử nghiệm đó là tế bào biểu mô mỡ ADSC, với mật độ tế bào của dịch huyền phù là 5 x 104 tế bào/ml. Sau 24 giờ, tế bào sẽ bám vào bề mặt đĩa nuôi cấy, thay môi trường có bổ sung nồng độ IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân. Sau 48 giờ kể từ khi thay môi trường, bắt đầu đánh giá mật độ tế bào bằng phương pháp MTT. Bảng 1.5. Khảo sát tác dụng IC50 của cao chiết trên ADSC Nồng độ cao chiểt MeOH XTP % ADSC bị ức chế Trung bình % Lần 1 Lần 2 Lần 3 ADSC bị ức chế 23,96 10,94 9,35 9,34 9,88 Không cao chiết 0 0 0 0 (µg/ 100 µL) 43 Hình 3.8. Tế bào ADSC khi xử lý cao chiết Methanol Xáo tam phân ở nồng độ IC50 Kết quả cho thấy cao chiết Methanol không có ảnh hưởng nhiều với tế bào biểu mô mỡ ADSC (hình 3.8) vì phần trăm tế bào bị ức chế ở nồng độ IC50 của cao chiết MeOH XTP là 9,88% không đáng kể (theo bảng 1.5). 3.5. THẢO LUẬN CHUNG Hiện nay nguồn dược liệu tự nhiên đang được quan tâm như một phương pháp điều trị thay thế cho phương pháp hóa trị. Với sự tối ưu hơn hóa chất tổng hợp trong điều trị ung thư, nên tiềm năng của nguồn dược liệu tự nhiên hiện nay là rất lớn. Xáo tam phân là nguồn dược liệu có nhiều tiềm năng trong điều trị ung thư thông qua những nghiên cứu đã có nhưng chưa nhiều về thành phần hóa học, về tính gây độc của cao chiết trên một số dòng ung thư và chưa được thực hiện nghiên cứu về hoạt tính kháng phân bào của cao chiết Xáo tam phân lên dòng tế bào ung thư MCF – 7. 44 Với những kết quả đã có và được biểu diễn trên các đồ thị, cho thấy rõ rằng cao chiết Methanol của Xáo tam phân có khả năng kéo dài thời gian tăng sinh của tế bào MCF – 7 (thời gian nhân đôi bình thường của MCF – 7 là 30,456 giờ nhanh hơn nhiều khi cho tế bào MCF – 7 tác dụng với nồng độ IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân là 40,2 giờ). Thí nghiệm cũng thể hiện được tế bào không bị ức chế bởi dung môi DMSO mà chỉ bị ức chế bởi cao chiết Methanol Xáo tam phân. Cao chiết Methanol của Xáo tam phân có tính đặc hiệu đối với dòng tế bào ung thư vú MCF – 7 khi kết quả thí nghiệm khảo sát nồng độ IC50 của cao chiết trên dòng tế bào đối chứng, trong thí nghiệm này tế bào đối chứng là dòng tế bào ADSC thì cao chiết không ảnh hưởng đến dòng tế bào ADSC. Bước đầu cho thấy cao chiết Methanol từ Xáo tam phân tác động hiệu quả lên tế bào ung thư vú hơn so với tế bào thường. Tuy nhiên, để có nhận định chính xác hơn nữa cần có những thử nghiệm trên nhiều dòng tế bào thường khác nhau. Kết quả của các thí nghiệm là hợp lý so với trước đây đã có những nghiên cứu về cao chiết từ rễ Xáo tam phân (ở đề tài này thực hiện cao chiết từ thân Xáo tam phân) của Viện dược liệu, đánh giá rằng chúng có khả năng gây độc tính trên 5 dòng tế bào ung thư: ung thư gan (Hep-G2), ung thư đại tràng (HTC116), ung thư vú (MDA MB231), ung thư buồng trứng (OVCAR8), và ung thư tử cung (Hela). 45 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Từ những kết quả khảo sát, có thể kết luận chung như sau: Cao chiết Methanol Xáo tam phân, có tác dụng kháng phân bào đối với dòng tế bào MCF – 7 với nồng độ IC50 = 23,96 µg/µl. Cao chiết có tác dụng kháng phân bào đối với dòng tế bào MCF – 7, độc tính đối với dòng tế bào này là trung bình. Cao chiết ít có ảnh hưởng đối với những dòng tế bào bình thường (trong thí nghiệm này là tế bào ADSC). KIẾN NGHỊ Qua những kết quả khảo sát, cho thấy rõ được tiềm năng của Xáo tam phân trong việc tìm nguồn dược liệu mới chữa bệnh ung thư. Cần có những nghiên cứu sâu hơn về thành phần hóa học, cũng như những khả năng gây độc lên các dòng tế bào ung thư khác nhau (như ung thư gan, ung thư vú, ung thư phổi ,…), tác dụng trên tế bào như chu kỳ tế bào, chết theo chu trình (appotosis), biểu hiện gen,…. Ngoài ra, cũng đưa ra những biện pháp bảo vệ và phát triển nguồn giống để việc nghiên cứu thuận lợi hơn. 46 TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT [1] Phạm Huy Bách., Nguyễn Thị Bích Thu, Nguyễn Minh Khởi (2013), Phân lập và định lượng Ostruthin trong dược liệu xáo tam phân thu hái tại Việt Nam, Tạp chí Dược liệu, 18 (3), tr. 173-179. [2] Nguyễn Mạnh Cường, Hồ Việt Đức, Nguyễn Văn Tài, Phạm Ngọc Khanh, Vũ Thị Hà, Trần Thu Hường, Nguyễn Duy Nhất (2013), Bước đầu nghiên cứu thành phần hóa học của cây xáo tam phân họ Rutaceae, Tạp chí Hóa học, 51 (3), tr. 292-296. [3] Phạm Hoàng Hộ (2003), Cây cỏ Việt Nam, NXB Trẻ, TP. Hồ Chí Minh. [4] Nguyễn Minh Khởi., Phạm Thị Nguyệt Hằng, Đỗ Thị Phương (2013), Nghiên cứu độc tính cấp, tác dụng bảo vệ gan và tác dụng gây độc tế bào ung thư của Xáo tam phân, Tạp chí Dược liệu, 18 (1), tr. 14-20. [5] Phan Kim Ngọc, Phạm Văn Phúc (2006), Công nghệ Sinh học Người và Động vật, NXB Giáo dục, Hà Nội. [6] Lê Quý Ngưu, Trần Như Đức (1995), Thuốc trị bệnh từ cây cỏ hoang dại, NXB Thuận Hóa, Huế. TÀI LIỆU TIẾNG NƯỚC NGOÀI [7] Dahab, R.A., Afifi, F. (2007), Antiproliferative activity of selected medical plants of Jordan against a breast adenocarcinoma cell line (MCF-7), Scientia Pharmaceutica, 75, pp. 121- 136. [8] George, H.F (1999), Theory and problem biology, Mc Graw Hill, USA. [9] Kubista, E. (2001), Breast cancer: figures and facts, Wien Med Wochenschr, 151 (21-23), pp. 548-51. 47 [10] Mabberley, D.J. (1998), Australian Ciatreae with notes on other Aureantioideae (Rutaceae). Telopea, Australia. [11] Margaret, A.S., Ian Freshney, R., Mary, G.F. (1992), Culture of human cervical epithelial cells, Deparrtment of Pathology, University of Cambridge, UK. [12] Masters, J.R.W., Palsson, B. (1998), Human cell culture, Kluwer Academic Publishers, USA. [13] Masters, J.R.W. (2000), Animal Cell Culture: A Practical Approach, Oxford University Press, USA. [14] Simon, P.L. (2003), Cancer cell culture Methods and Protocols, Human Press. [15] American Cancer Society (2013), Breast Cancer Facts and Figures 2011 – 2012, American Cancer Society, USA. [16] American Cancer Society (2013), If You Have Breast Cancer, American Cancer Society, USA. [17] Van Tang Nguyen, Quan Van Vuong, Mecheal. C. Bowyer, Ian A.Van Altena, Christopher J. Scarlett (2015), Phytochemicals and antioxidant capacity of Xao tam phan (Paramignya trimera) root as affected by various solvents and extraction methods, Industrial Crop sand Products, 67, 192-200. [...]... [1],[2] Xáo tam phân cũng đã được nghiên cứu tác dụng gây độc trên tế bào ung thư Với nghiên cứu này thì cao chiết methanol, phân đoạn n - hexan và hoạt chất từ Xáo tam phân thể hiện được độc tính trên 5 dòng tế bào ung thư, trong đó phân đoạn n - hexan và hoạt chất thể hiện độc tính ở mức trung bình, lần lượt trên tế bào ung thư gan Hep - G2 (IC50 = 39,61 µg/ ml) và dòng tế bào ung thu cổ tử cung (IC50... 2.1.1 Tế bào Dòng tế bào ung thư vú MCF- 7 Dòng tế bào xuất xứ từ một phụ nữ da trắng 69 tuổi bị ung thư vú di căn vào năm 1 970 , cung cấp bởi Viện ung thư Quốc Gia Hoa Kỳ (NCI Frederick, MD, USA); được mua từ A TC C bảo quản và nuôi cấy tại phòng thí nghiệm Tế bào gốc - trường Đại Học Khoa Học Tự Nhiên Tp Hồ Chí Minh Tế bào ung thư vú MCF- 7, được thể hiện trên hình 2.1 Hình 2.1 Tế bào MCF – 7 2.1.2 Hóa... trưởng của tế bào MCF – 7 33 Hình 3.2 Đồ thị khảo sát IC50 của thuốc thử Doxorubicin 35 Hình 3.3 Tế bào MCF – 7 khi thử thuốc Doxorubicin theo nồng độ 36 Hình 3.4 Khảo sát IC50 của cao chiết Methanol Xáo tam phân trên dòng tế bào MCF - 7 38 Hình 3.5 Tế bào MCF – 7 khi xử lý với cao chiết MeOH XTP theo nồng độ 39 Hình 3.6 Khảo sát đường cong tăng trưởng MCF – 7 khi xử lý cao chiết. .. tăng trưởng MCF – 7 khi xử lý cao chiết Methanol Xáo tam phân ở IC50 41 Hình 3 .7 Thời gian nhân đôi của MCF – 7 nuôi cấy bình thư ng 41 Hình 3.8 Tế bào ADSC khi xử lý cao chiết Methanol Xáo tam phân ở nồng độ IC50 43 1 CHƯƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 SINH HỌC UNG THƯ VÚ 1.1.1 Ung thư vú Ung thư vú là một nhóm bệnh làm cho tế bào trong cơ thể thay đổi và phát triển ngoài tầm... quan trọng của nó (bổ sung chất dinh dưỡng và các nhân tố quan trọng cho tế bào, giúp bất hoạt Trypsin và phục hồi tế bào bị tổn thư ng khi cấy chuyền, chống sự oxy hóa có thể gây tổn thư ng tế bào, cải thiện tính tan của các chất dinh dưỡng và tính bám dính của tế bào lên giá đỡ…) Ngoài ra, với những dạng tế bào chuyên biệt có thể thêm các yếu tố bổ sung cần thiết khác [5], [12], [13] Khi tế bào được... bào ở giai đoạn phân bào S và giai đoạn gián phân, nhưng thuốc cũng tác dụng trên các giai đoạn khác của chu kỳ phát triển tế bào Vì thế, doxorubicin được sử dụng nhiều trong các nghiên cứu về các dòng tế bào ung thư vú 2.1.3 Thiết bị Tủ an toàn sinh học cấp II ESCO (Singapore) 21 Tủ nuôi tế bào (3 7 C, 5% CO2) C150 Binder ( ức) (hình 2.2) Nồi hấp tiệt trung (autoclave) HV 85 Hirayama (Nhật Bản) Kính... chế phẩm (nguồn gốc từ thảo mộc) có tác dụng phòng chống ung thư như: Chế phẩm Phulamin của Học viện Quân y; 7 Chế phẩm Gacvit của Hội ung thư Việt Nam; Chế phẩm Cadef (còn gọi là HTCK) của Viện Công nghệ Sinh Học; Giáo sư dược sỹ Đỗ Tất Lợi cũng đã nghiên cứu và ứng dụng cây Trinh nữ hoàng cung, kết hợp với các bài thuốc 18 vị của y học cổ truyền, trong điều trị ung thư vú, ung thư cổ tử cung, u xơ... là thuốc trị ung thư Dược chất trước hết được khảo sát trên in vitro dựa trên một số phương pháp như MTT, Trypan Blue, Clonogenic, … thông qua kỹ thuật nuôi cấy tế bào, với các dòng tế bào ung thư nói riêng và trên các dòng tế bào nói chung Từ các khảo sát in vitro, có thể kết luận về khả năng tác dụng của dược chất Sau đó, 17 chúng sẽ tiếp tục được khảo sát trên in vivo, mà bước đầu là trên các động... xuất hiện của một hoặc nhiều khối tế bào ung thư được gọi là khối u trong cơ thể, và vị trí khối u hình thành được sử dụng để đặt tên cho căn bệnh ung thư Ung thư vú bắt đầu từ mô vú, nơi được hình thành từ những tuyến tiết sữa ( ược gọi là tiểu thùy), các ống dẫn liên kết giữa tuyến tiết và đầu vú (tiểu quản) Các thành phần còn lại của vú được tạo bởi mô mỡ, mô liên kết và mô lympho Ung thư vú xuất... 2.1.2 Hóa chất a Dùng để chiết xuất cao chiết Xáo tam phân Methanol (J T Baker, Hoa Kỳ) Nước cất 19 b Dùng trong nuôi cấy tế bào Môi trường nuôi cấy Dòng tế bào được nuôi trường DMEM (Dullbecco’s Modified Eagle Medium) bổ sung huyết thanh bò 10%, dung dịch kháng sinh và kháng nấm 1% (penicillin 50,000 units/l và streptomycin 50 mg/l) (ký hiệu: DMEM/ F12/ 10% FBS/ 1% anti) Tế bào được cấy chuyền khi ... 0o0 ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH KHÁNG PHÂN BÀO CỦA CAO CHIẾT TỪ THÂN CÂY SÁO TAM PHÂN (Paramignya trimera) TRÊN DÒNG TẾ BÀO UNG THƯ VÚ MCS - GVHD : TS PHẠM VĂN PHÚC TS... Methanol Xáo tam phân dòng tế bào MCF - Khi khảo sát cao chiết Methanol Xáo tam phân dòng tế bào MCF – tế % tế bào bị ức chế tăng dần với nồng độ cao chiết cao dần Với % tế bào ức chế thấp 10 ,78 %... dòng tế bào MCF - thuốc thử chuẩn Doxorubicin 0, 07 µM Từ sở để đánh giá hoạt tính gây độc cao chiết từ Xáo tam phân lên dòng tế bào ung thư vú MCF - 36 a b c d e f g Hình 3.3 Tế bào MCF – thử