BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ----o0o---- HUỲNH THẢO HÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHITIN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP (OLIGOCHITIN) TỪ CHITIN CHIẾU XẠ, CHIẾU XẠ KẾT HỢP ENZYME VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITIN THU ĐƯỢC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Nha Trang, tháng 06 năm 2015 BỘ GIÁO DỤC & ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG KHOA CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM ----o0o---- HUỲNH THẢO HÂN NGHIÊN CỨU TÁCH CHIẾT PHÂN ĐOẠN CHITIN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP (OLIGOCHITIN) TỪ CHITIN CHIẾU XẠ, CHIẾU XẠ KẾT HỢP ENZYME VÀ ĐÁNH GIÁ HOẠT TÍNH SINH HỌC PHÂN ĐOẠN OLIGOCHITIN THU ĐƯỢC ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành : CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM GVHD: ThS. TRẦN VĂN VƯƠNG Nha Trang, tháng 06 năm 2015 i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án này Trước hết em xin gửi lời cảm ơn tới Ban Giám hiệu Trường Đại học Nha Trang, Ban chủ nhiệm khoa Công nghệ Thực phẩm, Phòng Đào tạo sự kính trọng cho em được học tập tại trường trong những năm qua. Sự biết ơn sâu sắc nhất em xin dành cho thầy: Trần Văn Vương – Bộ môn – Trường Đại học Nha Trang đã tài trợ kinh phí, tận tình hướng dẫn động viên em trong suốt quá trình làm đồ án tốt nghiệp này. Đặc biệt xin ghi nhớ tình cảm, sự giúp đỡ của: các thầy cô giáo trong bộ môn Công nghệ Thực phẩm và tập thể cán bộ trong các phòng thí nghiệm- Trung tâm Thực hành Thí nghiệm- Trường Đại học Nha Trang đã giúp đỡ nhiệt tình và tạo điều kiện thuận lợi cho em suốt quá trình thực hiện đồ án này. Cuối cùng em xin cảm ơn gia đình, người thân và các bạn bè đã tạo điều kiện, động viên khích lệ em vượt qua mọi khó khăn trong quá trình học tập vừa qua. Nha Trang, ngày 29 tháng 06 năm 2015 Sinh viên Huỳnh Thảo Hân ii MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG.iii DANH MỤC HÌNH ................................................................................................ iv LỜI MỞ ĐẦU ......................................................................................................... vi CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN ............................. 3 1.1. Tổng quan về chitin. .......................................................................................... 3 1.1.1. Lịch sử hình thành và cấu tạo của chitin ........................................................ 3 1.1.2. Độ kết tinh của chitin ..................................................................................... 7 1.1.3. Tính chất của chitin ........................................................................................ 7 1.2. Tổng quan về oligochitin. .................................................................................. 8 1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin, oligochitin. ....................................... 9 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước ................................................................... 9 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước. ............................................................... 12 1.4. Khả năng ứng dụng của chitin và oligochitin. ................................................ 14 1.4.1. Ứng dụng của chitin. .................................................................................... 14 1.4.2. Ứng dụng của oligochitin ............................................................................. 15 1.5. Tổng quan về phương pháp sản xuất oligochitin và đánh giá hoạt tính.......... 16 1.5.1. Tổng quan về phương pháp hóa học ............................................................ 16 1.5.2. Tổng quan về phương pháp chiếu xạ ........................................................... 18 1.5.3. Tổng quan về phương pháp sinh học ........................................................... 22 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................... 28 2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu ...................................................................... 28 2.1.1. Vật liệu chính ............................................................................................... 28 2.1.2. Vật liệu phụ .................................................................................................. 28 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu .................................................................................... 28 2.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu.................................................... 28 2.3. Phương pháp nghiên cứu ................................................................................. 29 2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ................................................................................. 30 2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu ............................................................................. 36 iii CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ ............................................ 37 3.2. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme ..............................................................................38 3.3. So sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) sản xuất giữa 2 phương pháp và lựa chọn phương pháp sản xuất..... 40 3.4. Lựa chọn phương pháp sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) ............................................................................................................ 41 3.5. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ........................................................................................ 42 3.5.1. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ .............................. 42 3.5.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ... 44 3.5.3. So sánh khả năng chống oxi hóa của các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) giữa hai phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ............................................................................................................ 46 3.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn oiligochitin ....... 49 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN ............................................... 52 4.1. Kết luận ........................................................................................................... 52 4.2. Đề xuất ý kiến.................................................................................................. 52 TÀI LIỆU THAM KHẢO ...................................................................................... 53 PHỤ LỤC I ............................................................................................................. 55 PHỤ LỤC II ........................................................................................................... 59 PHỤ LỤC III .......................................................................................................... 64 iv DANH MỤC NHỮNG TỪ VIẾT TẮT PGS – TS: Phó giáo sư – tiến sĩ HPLC : High Performance Liquid Chromatography DPPH : 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl. LB : Luria Bertami E.coli : Escherichia coli B.cereus : Bacillus cereus S.aureus : Staphylococcus aureus v DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn A ........................................................................................................59 Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn B ........................................................................................................59 Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn C ........................................................................................................59 Bảng 3.4. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn A .......................................................60 Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn B .......................................................60 Bảng 3.6. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn C .......................................................60 Bảng 3.7. So sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin theo hai phương pháp ...................................................................................................................................60 Bảng 3.9. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn B 61 Bảng 3.10. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn C ...................................................................................................................................61 Bảng 3.11. Kết quả đo bước sóng 517 nm của vitamin C ........................................62 Bảng 3.12. Xác định khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo phương pháp chiếu xạ ...............................................................................................................................62 Bảng 3.13. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme phân đoạn A .................................................................................................62 Bảng 3.14. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme phân đoạn B .................................................................................................63 Bảng 3.15. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme phân đoạn C .................................................................................................63 vi Bảng 3.16. Xác định khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme .....................................................................................................63 Bảng 3.17. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn oligochitin ......64 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cấu trúc chitin .............................................................................................4 Hình 1.2. Cấu trúc phân tử chitin trong không gian ...................................................4 Hình 1.3. Cấu tạo chitin và cellulose ..........................................................................5 Hình 1.4. Cấu trúc các dạng mạch chitin ....................................................................6 Hình 1.6. Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin ....................................................16 Hình 1.7. Sơ đồ sản xuất oligochitin .........................................................................17 Hình 1.9. Qui trình xử lí chitin tạo các dẫn xuất của chitin ......................................24 Hình 2.1 Enzyme Hemicellulase ...............................................................................28 Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ ở các liều chiếu xạ khác nhau .................37 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lương thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với enzyme .................................39 Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng hai phương pháp ..........................................................................40 Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn kết quả đo bước sóng 517 nm qua các nồng độ của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ ......................................42 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ ...............................................43 Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn kết quả đo bước sóng 517 nm qua các nồng độ của phân đoạn oligochitin theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ..................................44 Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme .....................45 Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn A giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ...................46 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn B giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ...................47 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn C giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme ...................48 1 LỜI MỞ ĐẦU Giáp xác là nguồn nguyên liệu thủy sản dồi dào chiếm 1/3 tổng sản lượng nguyên liệu thủy sản ở Việt Nam. Trong công nghiệp chế biến thủy sản xuất khẩu, tỷ lệ cơ cấu các mặt hàng đông lạnh giáp xáp chiếm từ 7 - 80% công suất chế biến. Hàng năm, các nhà máy chế biến đã thải bỏ một lượng phế liệu khá lớn (khoảng 70.000 tấn/năm) nguồn phế liệu này là nguyên liệu quan trọng cho công nghiệp sản xuất chitin và các sản phẩm có giá trị cao từ chitin. Chitin là một polymer có trọng lượng phân tử lớn, không tan trong nước nên có nhiều hạn chế cho việc ứng dụng. Vì vậy hiện nay người ta đang có xu hướng nghiên cứu sản xuất các chế phẩm từ chitin nhằm khắc phục các hạn chế của nó. Oligochitin là một sản phẩm được hình thành sau quá trình cắt mạch chitin. Nó có những đặc tính như: khả năng hòa tan trong nước tốt, có hoạt tính sinh học (khả năng chống oxy hóa, khả năng kháng khuẩn), an toàn và còn được ứng dụng trong y học nhằm cải thiện tình trạng thiếu máu, điều hòa huyết áp trong máu, điều hòa lượng cholesterol, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, chống ung thư máu. Ngoài ra, oligochitin còn có khả năng kháng nấm, kháng bệnh cho cây trồng vật nuôi. Oligochitin là một polymer có hoạt tính sinh học và được sản xuất bằng nhiều phương pháp như phương pháp hóa học, sinh học, chiếu xạ và enzyme. Hiện nay, vấn đề liên quan đến khả năng chống oxi hóa và phương pháp sản xuất oligochitin được nhiều người quan tâm, vì vậy tôi làm đề tài: “Nghiên cứu tách chiết phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme và đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn oligochitin thu được”. Nội dung đề tài: 1. Xây dựng quy trình tách chiết các phân đoạn oligochitin từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme. 2. Xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme. 3. Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa của các phân đoạn oligochitin thu được. 2 4. Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn oligochitin thu được. Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 3 phân đoạn oligochitin sản xuất bằng phương pháp chiếu xạ và enzyme để tìm ra phân đoạn có khả năng chống oxi hóa cao nhất. Ý nghĩa khoa học của đề tài: nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của một số phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ và enzyme Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: hiện nay chúng ta đang cần tìm ra phân đoạn oligochitin có khả năng chống oxi hóa được sản xuất theo phương pháp nào có hiệu quả cao để ứng dụng được trong nhiều lĩnh vực. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VỀ CHITIN VÀ OLIGOCHITIN 1.1. Tổng quan về chitin 1.1.1. Lịch sử hình thành và cấu tạo của chitin  Lịch sử hình thành Chitin được Braconnot phát hiện đầu tiên vào năm 1811 [12]. Lần đầu tiên ông phân lập được chitin như một hợp chất không tan trong kiềm của một số loại nấm. Hợp chất do Braconnot phân lập được còn lẫn rất nhiều tạp chất nhưng ông khẳng định đây không phải là gỗ. Năm 1823, Odier đã cô lập được chitin từ cánh cứng của con bọ cánh cứng và cũng phân lập được chitin khi loại khoáng vỏ cua. Từ đó, Odier cho rằng đây là hợp chất cơ bản trong vỏ giáp xác và côn trùng, một chất từ bọ cánh cứng mà ông gọi là chitin hay “chiton”, tiếng Hi Lạp có nghĩa là vỏ giáp, nhưng ông không phát hiện ra sự có mặt của nitơ trong đó. Chitin là chất hữu cơ chủ yếu trong vỏ mai (bộ xương ngoài động vật không xương sống). Theo Richard, chitin được tìm thấy trong lớp vỏ cutin của loài chân đốt. Ngoài ra, chitin còn được tìm thấy trong tế bào ống của loài mực, ở lớp vỏ bao ngoài của loài Bọ cánh cứng, trong lớp vỏ mai của loài giáp xác, trong loài nhện và bướm. Người ta đưa ra các giả thiết khác nhau về sự hiện diện của chitin hoặc cenlulose làm cơ sở cho mối quan hệ phát sinh giữa các nhóm của giống nấm đặc biệt là phycomecetus. Qua phân tích bằng tia X, Frey đã xác nhận rằng chitin và cenlulose không hiện diện đồng thời. Chitin không hiện diện một mình trong lớp vỏ ngoài của loài nấm mà nó được liên kết với những thành phần khác. Lượng chitin được tinh chế từ một số loài nấm thông thường từ 3 - 5%.  Cấu tạo của chitin Chitin là một polymer phổ biến trong tự nhiên, sau cellulose, chúng được tạo ra rất trung bình 20g trong 1 năm/1m2 bề mặt trái đất. Chitin tham gia vào thành phần cấu tạo của vách tế bào nấm, cấu tạo nên bộ khung xương của vỏ tôm, cua, côn trùng, các động vật giáp xác,…Chitin rất ít khi ở dạng tự do mà luôn liên kết với protein ở dạng phức hợp, cacbonat canxi và nhiều hợp chất hữu cơ khác, gây khó khăn cho việc tách chiết. Chitin là một polisacharid được cấu tạo bởi các 4 monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu nối 1,4-glucozit. Công thức phân tử là (C8 H13 O5)n trong đó cacbon chiếm 47,29%, hydro chiếm 6,45% và oxi chiếm 39,37%. Hình 1.1. Cấu trúc chitin Chitin có cấu trúc hóa hoc giống cellulose ngoại trừ nhóm hydroxyl thứ hai trên nguyên tử carbon alpha trên phân tử cellulose được thay thế bằng nhóm acetomaide [5]. Cũng nhờ vào cấu trúc này mà việc ứng dụng của chitin vào xử lý nước thải nhả in nhuộm là một việc rất có triển vọng. Hình 1.2. Cấu trúc phân tử chitin trong không gian 5 Trong tự nhiên chitin tồn tại ở cả động vật và thực vật. Trong thế giới động vật chitin là thành phần có cấu trúc quan trọng của một số động vật không xương sống như: côn trùng, nhuyễn thể, giáp xác và giun tròn. Trong thế giới thực vật chitin có ở tế bào nấm Zygemycethers và một số tảo Chlorophiceae. Động vật thủy sản đặc biệt là cua, ghẹ, tôm là nguồn nguyên liệu tiềm năng sản xuất chitin, từ đó sản xuất các sản phẩm khác từ chúng. Công thức cấu tạo của chitin và cellulose: Hình 1.3. Cấu tạo chitin và cellulose Công thức phân tử của chitin: (C8 H13 O5)n Trong đó n thay đổi là do từng loại nguyên liệu Ở tôm thẻ chân trắng n= 400 - 500 Ở tôm hùm n= 700 - 800 Ở cua n= 500 - 600 Phân tử lượng chitin Mchitin = (203.09)n [6]. Chitin là một polysaccharide chứa đạm không độc hại, có khối lượng phân tử lớn. Cấu trúc của chitin là một tập hợp các phần tử liên kết nhau bởi các cầu nối glucozit và hình thành một mạng các sợi tổ chức. Chitin rất hiếm tồn tại ở trạng thái tự do, hầu như luôn liên kết bởi các cầu nối đẳng trị với protein, CaCO3 và các hợp chất hữu cơ khác trong vỏ tôm, cua, ghẹ [6]. 6 Chitin cũng có màu trắng giống cellulose, chitin có tính kị nước cao (đặc biệt đối với α-chitin), không tan trong nước trong kiềm, trong các acid loãng và các dung môi hữu cơ như ete, rượu. Tính không tan của chitin là do cấu trúc chặt chẽ, có liên kết trong và liên phân tử mạnh mẽ thông qua các nhóm hydroxyl và acetamin. Tuy nhiên, cần lưu ý là β-chitin, không giống như α-chitin, có tính trương nở với nước cao. Cấu trúc các dạng trên xuất phát từ nguồn chiết rút chitin, chitin từ tôm, cua có dạng α-chitin, chitin từ mực có dạng β-chitin. Ba dạng chitin nêu trên có sự khác nhau về tính hydrat hóa, kích thước của mỗi đơn vị cấu trúc và số mạch chitin trong mỗi đơn vị cấu trúc, α-chitin có độ kết tinh cao nhất và ở dạng rắn chắc và các mạch chitin xếp song song nhưng ngược chiều nhau, β-chitin bao gồm các mạch chitin song song cùng chiều, có độ kết tinh thấp, tính hydrat hóa cao, γchitin sắp xếp cứ 2 mạch song song cùng chiều thì lại có một mạch ngược chiều. Trong tự nhiên, α-chitin có mặt nhiều nhất và thường rất cứng trong khi 2 loại kia thì tạo nên tính dẻo, dai cấu trúc hóa học của chitin với các liên kết hidro nối phân tử giữa các phân tử đường trong chitin rất chặt chẽ vì vậy làm cho phân tử chitin có độ rắn chắc cao và khó hòa tan. Hình 1.4. Cấu trúc các dạng mạch chitin γ, β-chitin do mắt xích ghép lại với nhau theo kiểu song song (β-chitin) và hai song song một ngược chiều (γ-chitin), giữa các lớp không có loại liên kết hydro. Dạng β-chitin cũng có thể chuyển sang dạng α-chitin nhờ quá trình acetyl hóa cho cấu trúc tinh thể bền vững hơn. Dạng β tồn tại ít nó được tìm ra trong protein của mực ống, còn dạng γ thì rất hiếm. Vì thế mà người ta thường thủy phân dạng αchitin do nó tồn tại nhiều và phổ biến. 7 1.1.2. Độ kết tinh của chitin Chitin có cấu trúc tinh thể rắn chắc so với polymer sinh học khác, chitin có độ kết tinh cao và biến đổi theo từng loại chitin được chiết rút từ nguồn nguyên liệu khác nhau. Phổ nhiễu xạ tia X của α-chitin từ vỏ tôm và β-chitin từ xương mực cho thấy mẫu α-chitin có vòng nhiễu xạ mạnh, ở vòng trong thì không có tính hydrat hóa mạnh, trong khi mẫu β-chitin có vòng tương tự nhưng yếu hơn và có tính hydrat hóa mạnh. 1.1.3. Tính chất của chitin Chitin là một polysaccharide có tính kiềm, bền trong môi trường kiềm nhưng kém bền trong môi trường acid. Dựa vào tính chất này người ta đã sản xuất glucosamine bằng phương pháp hóa học từ chitin bằng cách đun nóng chitin trong acid HCl đậm đặc ở nhiệt độ cao, chitin sẽ bị thủy phân hoàn toàn, tạo thành 88,5% D-Glucosamin và 12,5% acid acetic [6]. Khi đun nóng chitin trong dung dịch kiềm đặc, chitin bị mất gốc acetyl tạo thành chitosan. Dựa vào đặc tính này người ta đã sản xuất chitosan từ chitin. Chitin NaOH 40 - 50% chitosan Phản ứng ester hóa: Chitin tác dụng với HNO3 đậm đặc cho sản phẩm chitin nitrat. Chitin tác dụng với ahydrit trong pyridin. Dioxan và N,N-dimetylanilin cho sản phẩm chitin sunfonat. Chitin ở dạng tinh thể, màu trắng ngà không định hình, không tan trong nước, trong acid loãng, kiềm, chitin khó hòa tan trong thuốc thử Schweizei Sapranora. Điều này có thể do nhóm acetamit (-NHCOCH3) ngăn cản sự tạo thành phức chất cần thiết. Chitin hòa tan trong dung dịch đặc nóng của các muối: thioxianat Liti (LiSCN), thioxianat Canxi Ca(SCN)2 tạo thành dung dịch keo. Chitin có khả năng hấp thu tia hồng ngoại có bước sóng 884 – 890 cm-1 [6]. Chitin ổn định với các chất chống oxy hóa khử như: Thuốc tím (KMnO4), oxy già (H2O2), nước Javen (NaClO) hay Clorua vôi Ca(ClO)2… từ đó lợi dụng tính chất này người ta sử dụng các chất oxy hóa để khử màu cho chitin [6]. 8 Chitin là một vật liệu chứa cả 2 nhóm chức –OH và –NH2 cho liên kết với enzyme, có cấu trúc siêu lỗ, có khả năng hấp thụ tốt, dễ tạo màng. Chitin có cấu trúc mạng tinh thể chặt chẽ, không chỉ có các liên kết hydro hình thành trong chuỗi mà còn có giữa các lớp với nhau trong mạng tinh thể. Chitin là một polymer kỵ nước, độ trương thấp, diện tích bề mặt tiếp xúc nhỏ và bền về mặt hóa học. Dựa vào đặc tính này, gần đây có rất nhiều nghiên cứu cố định enzyme trên chitin, chủ yếu bằng phương pháp hấp phụ và liên kết cộng hóa trị qua cầu nối glutaradehyt. Tuy nhiên, do tính chất kị nước nên bề mặt tiếp xúc của enzyme cố định và cơ chất rất hạn chế. Vì vậy hoạt tính của ezyme cố định trên chitin thường rất thấp [1]. Chitin hòa tan được trong dung dịch acid đậm đặc như HCl, H3PO4, dimethylacetamide chứa 5% lithium chloride. Chitin tương đối ổn định với các chất chống oxi hóa khử, thuốc tím, oxy già, nước gia ven (NaOCl), hay Ca(ClO)2...lợi dụng tính chất này người ta sử dụng màu cho chitin. Chitin khó tan trong thuốc thử Schwweizel sapranora. Điều này có thể do nhóm acetamit (-NHCOOCH3) ngăn cản sự tạo thành phức chất cần thiết. 1.2. Tổng quan về oligochitin Oligochitin là đoạn mạch polymer của N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucozit. Oligochitin được tạo thành qua quá trình thủy phân/cắt mạch bằng phương pháp hóa học, phương pháp sinh học, phương pháp chiếu xạ bằng bức xạ năng lượng cao như γ hoặc chùm điện tử gia tốc. Oligochitin là một saccharide, được kết hợp bởi các monosaccharide từ 2 – 10 trong cấu trúc của chitin. Oligochitin có khối lượng phân tử thấp, nó có khả năng hòa tan tốt trong nước và là một chất có tính sinh học cao. Oligochitin được xem như một thực phẩm chức năng, có khả năng chống nấm mốc, vi khuẩn, chống oxy hóa lipid, chống ung thư, chống bướu, chống bệnh tim mạch [6]. 9 Công thức cấu tạo của oligochitin: Hình 1.5. Công thức cấu tạo của oligochitin Oligochitin có dạng bột màu trắng hoặc hơi vàng, không mùi, vị đặc biệt. chúng có khả năng tan tốt trong nước, độ nhớt thấp, phân tử lượng nhỏ và dễ kết tinh, có hoạt tính sinh học cao như: Cải thiện thiếu máu, bệnh gan, điều hòa huyết áp trong máu, điều hòa lượng Cholesterol, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, chống ung thư máu,…Ngoài ra, oligochitin còn có khả năng kháng nấm, kháng bệnh cho cây trồng vật nuôi. 1.3. Tình hình nghiên cứu và sản xuất chitin, oligochitin 1.3.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Nước ta là nước có ngành chế biến thủy sản khá phát triển nên các phế phẩm từ thủy sản đang là vấn đề được quan tâm rất lớn đối với các công ty chế biến. Các phế phẩm từ đầu tôm, mai mực, mai ghẹ nếu thải ra môi trường sẽ làm ô nhiễm nặng, mà trong các phế phẩm đó có một lượng lớn chitin nếu được xử lí thu hồi chitin thì không những vấn đề môi trường được giải quyết mà còn kiếm được một nguồn lợi nhuận cao từ phế phẩm thủy sản.Vì vậy, việc nghiên cứu sản xuất chitin, oligochitin và ứng dụng của chúng rất phổ biến và được quan tâm. Tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất oligochitin còn là một vấn đề khá mới mẻ, mới bắt đầu được quan tâm và đi vào nghiên cứu. Ở nước ta, trường Đại học Nha Trang bắt đầu nghiên cứu tách chiết chitin từ năm 1978 với quy trình của cô Đỗ Minh Phụng nhưng chưa có ứng dụng trong sản xuất cụ thể. Gần đây với yêu cầu bức bách trong xử lí phế phẩm từ thủy sản, trước những thông tin kỹ thuật mới về chitin, chitosan cũng như tiềm năng thị trường của chúng đã thúc đẩy các nhà khoa học bắt tay vào 10 nghiên cứu hoàn thiện quy trình sản xuất chitin, đồng thời nghiên cứu quá trình thủy phân chitin tạo các sản phẩm mới có ứng dụng cao trong sản xuất và thực phẩm, cũng như đời sống. Hiện nay, có nhiều cơ sở đang nghiên cứu sản xuất chitin trong đó Trung tâm Chế biến Trường Đại học Nha Trang là nơi sản xuất chitin có chất lượng cao. Ở miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp Thủy sản Hà Nội sản xuất chitin và ứng dụng của nó. Ở miền Nam, trung tâm Công nghệ Sinh học và Sinh học Thủy sản phối hợp với một số cơ quan khác như: Đại học Y dược Hồ Chí Minh, Phân viện Khoa học Việt Nam, viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam… đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin trong các lĩnh vực nông nghiệp, y dược. Năm 2003 một dự án sản xuất thử nghiệm chitin đã hoàn thành tại trường Đại học Nha Trang. Trường Đại học Nha Trang đã chuyển giao công nghệ sản xuất chitin cho một số cơ sở sản xuất. Sản phẩm chitin của Trung tâm Chế biến Thủy sản của Trường Đại học Nha Trang đang có uy tín cao, sản phẩm bắt đầu ứng dụng mạnh mẽ vào một số cơ sở sản xuất và được đưa đi chào hàng ở Thái Lan. Sản phẩm chitin của trường Đại học Nha Trang đã góp phần giảm nhập khẩu chitin từ nước ngoài. Năm 2005 Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất olygosaccharide từ chitin – chitosan bằng phương pháp hóa học. Hiện nay công nghệ đã được hoàn thiện, sản phẩm đang tiếp tục được sản xuất tuy nhiên năng suất còn nhỏ. Năm 2006 Trần Thị Luyến triển khai sản xuất olygosaccharide bằng enzyme. Đây là một hướng nghiên cứu mới, cần được tiếp tục nghiên cứu trên nhiều đối tượng enzyme khác nhau. Một số quy trình sản xuất chitin và oligosaccharide ở trong nước Quy trình sản xuất chitin của xí nghiệp thủy sản Hà Nội Nguyên liệu là vỏ tôm khô hoặc tươi được loại bỏ hết tạp chất, xử lí tách khoáng lần 1 trong dung dịch HCl 4% trong thời gian τ = 24 giờ ở nhiệt độ phòng với tỉ lệ w/v = ½. Sau đó vớt ra rửa trung tính và dùng NaOH 2% để tách protein lần 1 với tỉ lệ w/v = ½, ở nhiệt độ t0 = 90 - 950C trong thời gian τ = 3 giờ. Sau đó 11 rửa trung tính và khử khoáng lần 2 cũng bằng HCl 4% với tỉ lệ w/v = ½, ở nhiệt độ phòng trong thời gian τ = 24 giờ và đem rửa trung tính. Để tách protein lần 2 ta ngâm trong dung dịch NaOH 2% với tỷ lệ ½ ở nhiệt độ t0 = 90 - 950C sau 3 giờ vớt ra và rửa trung tính rồi tiến hành khử khoáng lần 3 giống 2 lần trên. Sản phẩm đem phơi hoặc sấy khô ta thu được chitin [6]. Ưu điểm: Chitin thu được có độ trắng cao mặc dù không có công đoạn tẩy màu. Nhược điểm: Tốn hóa chất. Thời gian sản xuất kéo dài, nồng độ hóa chất sử dụng cao, thời gian xử lí dài làm cắt mạch polymer trong môi trường acid dẫn đến độ nhớt giảm. Hóa chất độc hại ảnh hưởng tới môi trường. + Quy trình của Đỗ Minh Phụng – Đại học Nha Trang (1980) Nguyên liệu là vỏ tôm khô, được xử lý sạch không lẫn tạp chất được đem đi khử khoáng bằng HCl 6N với tỷ lệ w/m = 1/2,5, ở nhiệt độ phòng, sau 48 giờ vớt ra và rửa trung tính. Tiếp theo ngâm trong NaOH 8% ở nhiệt độ to = 100oC trong thời gian τ = 2 giờ với tỷ lệ w/m = 1/2,5 để khử protein, sau đó vớt ra và rửa trung tính. Tiến hành tẩy màu bằng KMnO4 1% trong môi trường H2SO4 10% trong 60 phút ,sau đó đem rửa sạch và tiếp tục tẩy màu bằng Na2SO3 1,5% trong thời gian 15 phút rồi vớt ra rửa sạch ta thu được chitin [6]. Ưu điểm: Sản phẩm có chất lượng khá tốt, chitin có màu sắc đẹp. Nhược điểm: Sử dụng nhiều chất oxy hóa do đó ảnh hưởng đến độ nhớt của sản phẩm, thời gian xử lý dài [4]. + Quy trình sử dụng enzyme papain sản xuất chitosan của PGS - TS Trần Thị Luyến Vỏ tôm khô được xử lý trong điều kiện: Dung dịch HCl 10% với tỷ lệ w/m = 1/10, ở nhiệt độ phòng trong thời gian 5 giờ. Nguyên liệu vỏ tôm tươi được xử lý tương tự nhưng với tỷ lệ w/m = 1/5. Sau đó tiến hành rửa sạch và khử protein bằng enzyme papain theo phương pháp bổ sung dung dịch 13% papain vào khối vỏ tôm đạt tỷ lệ w/m = 1/5, dùng HCl điều chỉnh pH về 5 – 5,5 và nâng nhiệt độ lên 70 - 80oC trong thời gian 4 giờ. Sau đó rửa sạch, làm khô ta thu được sản phẩm chitin [3]. 12 1.3.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Năm 1859 nhờ vào phát minh đầu tiên của Rouget khi đun sôi chitin trong dung dịch HCl đậm đặc. Và về sau đã có nhiều công trình nghiên cứu về chitin và các sản phẩm thủy phân từ chitin [12]. Shigermase cùng cộng tác viên (1944) đã cho rằng liozyme có khả năng thủy phân chitin- chitosan rất tốt trong điều kiện t = 38oC pH = 5,4. Aiba va Muraka (1996) cho rằng (GlcNAc)n, n = 1 – 7, có thể sản xuất được bằng cách dùng enzyme, enzyme cellulose và hemicellulase thủy phân chitosan. Muzzarelli (1996) cho rằng enzymer cellulose và hemicellulase, papain lipase thủy phân chitosan ở những độ khác nhau hemicellulase thủy phân chitosan, sản (GlcNAc)n , n = 6, thu được 18%, Muzzare (1997) cũng cho rằng Strepmyces grigeus HUT 6037 tiết ra enzyme ngoại bào chitinase và chitosanase ứng dụng thủy phân một số loài giáp xác. Hằng năm chitin được sản xuất ra khoảng 5,11 triệu tấn trên toàn thế giới [14]. Theo đánh giá của FAO, nhu cầu dùng chitin trên thế giới còn tăng cao trong thế kỷ tới. Do những hạn chế về khả năng hòa tan của chitin nên người ta tiến hành nghiên cứu các chế phẩm từ chitin. Năm 1994 Shigermase và các cộng sự cho rằng Lysozyme có khả năng thủy phân chitin rất tốt trong điều kiện to = 37oC, pH = 5,4 với phương pháp: Phương pháp A (sử dụng một lượng nhỏ Lysozyme): Sự thủy phân chất keo chitin bởi Lysozyme. Cho một ít chất keo chitin (0.5% w/v, 10 ml) trong 0,2 M dung dịch đệm acetate (pH = 5,4) với 0,05% NaN3, được ủ với lysozyme (2 mg/ml, 1 ml), tại 370C trong 3 ngày và sau đó cho thêm dung dịch enzyme lysozyme vào (1ml). Sau 3 ngày, lấy đi ly tâm và những sản phẩm trên bề mặt dung dịch mang đi phân tích bởi HPLC. Phương pháp B (sử dụng một lượng lớn enzyme lysozyme): Chitosan đã được deacetyl 30 – 72%. Cho thêm vào 20mg enzyme lysozyme, tạo nên một hỗn hợp, đem đi ủ ở 37oC. Trong thời gian ủ, tách ra 0,5 ml đưa ra ngoài và phân tích bằng HPLC . 13 Năm 1997 Muzzarelli cho rằng Strepmyces griseus HUT 6037 tiết ra enzyme ngoại bào chitinase ứng dụng thủy phân chitin của loài giáp xác. Quy trình sản xuất chitin của Hackman Vỏ tôm được làm sạch bằng cách cạo và rửa dưới vòi nước chảy rồi sấy khô trong lò sấy ở nhiệt độ 100oC. Lượng dùng là 220 gam được ngâm trong 2 lít HCl 2N trong thời gian 5 giờ ở nhiệt độ phòng. Sau đó vớt ra rửa kỹ với nước và sấy ở 100oC. Sau đó nghiền thành bột, bột nhuyễn này được trích trong bình cầu và lắc mạnh trong 48 giờ với 0.5 lít HCl 2N, ly tâm bỏ phần lỏng, phần rắn được rửa kỹ, và tiếp tục được chiết bằng cách lắc mạnh trong 12 giờ với 0,5 lít NaOH 1N ở 100oC. Quy trình trích ly trong dung dịch kiềm được thực hiên 3 lần, sau đó phần rắn được thu hồi và rửa nhiều lần với nước cho đến khi trung tính. Cuối cùng rửa với ethanol và ether, rồi sấy khô, chitin thu được có màu vàng . Quy trình sản xuất chitin của Wistler và Beniller Lọc vỏ tôm được rửa sạch, sấy khô trong lò sấy chân không ở 50oC. Dùng 500 gam xây nguyễn rồi ngâm trong dung dịch NaOH 10% ở nhiệt độ phòng trong 3 ngày dung dịch kiềm được thay đổi hằng ngày. Những hạt đã được loại protein được rửa với nước rồi nghiền với ethanol 95% cho đến khi phần nước lọc gần như không màu (thao tác này dùng khoảng 6 lít ethanol 95%). Phần rắn lại tiếp tục đem nghiền với khoảng 1 lít acetone, 2,5 lít ethanol và 0,5 lít ether, sau đó lọc những hạt thu được gần như không màu, sấy khô ở áp suất kém và được ngâm trong dung dịch HCl 37%, ở 20oC trong 4 ngày. Những hạt trương phồng được ly tâm tách ra ở 0oC và rửa với nước ở 0oC cho đến khi hết acid. Hiệu suất là 20% (100g) hàm lượng nitơ là 7,1%. Quy trình sản xuất chitin của Roseman Vỏ tôm được khử Ca giống như phương pháp Hackman ở trên. Cân 100 gam được lắc rung cơ học trong 18 giờ với 100 ml dung dịch acid formic đặc (90%) ở nhiệt độ phòng. Lọc lấy phần bã, rửa kỹ với nước và được xử lý trong 2 giờ với dung dịch NaOH 10%. Đem lọc, phần bã thu được có màu trắng, rửa dưới vòi nước đến khi trung tính, sau đó rửa vài lần với ethanol và ether rồi sấy khô dưới áp suất 14 kém, hiệu suất khoảng 50 - 60%, hàm lượng nitơ là 8,5%, hàm lượng acetyl là 19,2%. 1.4. Khả năng ứng dụng của chitin và oligochitin 1.4.1. Ứng dụng của chitin. - Trong thực phẩm Chitin, chitosan là một polymer tự nhiên không độc và rất an toàn đối với thực phẩm, với tính năng kháng khuẩn, chống ẩm, tạo màng, có khả năng hấp phụ một số kim loại nặng, nên chitosan được nghiên cứu ứng dụng trong ngành công nghệ sản xuất thực phẩm và bảo quản. Ngoài ra, chitin có thể ứng dụng làm chất phụ gia trong thực phẩm, tạo độ bền dai cho thực phấm thay thế một số chất không cho phép (như hàn the…). - Trong công nghệ sinh học Trong lĩnh vực công nghệ sinh học chitin-chitosan là một chất mang phù hợp cho sự cố định enzyme tế bào. Enzyme cố định tế bào là một chất xúc tác sinh học hoạt động trong một không gian linh hoạt. Enzyme cố định cho phép mở ra việc sử dụng rộng rãi enzyme trong công nghiệp, y học, khoa học, khoa học phân tích,...enzyme cố định được sử dụng lâu dài, không cần thay đổi chất xúc tác như là trong công nghệ làm sạch nước, làm trong nước quả. Sử dụng enzyme cố định rất thuận lợi và đạt hiệu quả cao. - Trong công nghiệp giấy Chỉ cần bỏ ra 1% chitin tính theo trọng lượng vào bột giấy cũng đã đủ làm tăng sức dẻo dai của giấy. Nhờ đó, các nhà máy có thể dùng ít chất sợi hơn nhưng vẫn giữ được phần tốt cuả giấy. Theo ước tính các nhà sản xuất có thể tiết kiệm được 90% năng lượng tiêu thụ vì bây giờ họ không cần đánh bột giấy để rút nước ra. Loại giấy được chế tạo từ chitin dễ in hơn giấy bình thường và khó rách hơn khi giấy bị ướt. Với đặc tính này chitin được ứng dụng chế tạo tã lót cho trẻ em, khăn giấy và bao giấy gói hàng. 15 - Trong công nghiệp khác Chitin và các dẫn xuất của nó phổ biến là chitosan, đã được ứng dụng vào quá trình xử lí nước, là chất thêm vào trong dầu gội, làm da nhân tạo, chất chống nấm, các chất xơ... [10]. 1.4.2. Ứng dụng của oligochitin Trong công nghệ thực phẩm: Oligochitin được dùng để bảo quản cá, tôm,… - Trong nông nghiệp Oligochitin được dùng để tạo lớp phủ ngoài bảo quản hạt giống, điều hòa đất, làm tăng trưởng lá, tiêu diệt mầm bệnh, kháng nấm,… Oligochitin còn ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của cây. Chế phẩm oligosaccharide ảnh hưởng tích cực đến sinh trưởng và năng suất của ngô. Với nồng độ phun thích hợp là 40 ppm, số lần phun là 3 lần/vụ, liều lượng là 300 lít/ha, năng suất sau khi sử dụng tăng 20% so với đối chứng ( theo nghiên cứu cứu của Đại học Nông nghiệp I Hà Nội) [6]. Nguyễn Anh Dũng (2004) cũng đã nghiên cứu ảnh hưởng của chế phẩm oligosaccharide lên lá đậu phộng, đậu tương đến số nốt sàn ở rễ. Kết quả cho thấy nồng độ 40 ppm đã làm tăng 50% số lượng nốt sần so với mẫu đối chứng phun nước lã [2]. - Trong y học Oligochitin và các chế phẩm của nó có đặc tính miễn dịch do nó kích thích các tế bào giữ nhiệm vụ bảo vệ miễn dịch với các tế bào khối u và các tác nhân gây bệnh. Đồng thời oligochitin còn được sử dụng làm thuốc để hạ cholesterol trong máu [4]. Trường Đại học Pukyong National Hàn Quốc đã nghiên cứu thành công ứng dụng của oligochitin trong việc tăng sức đề kháng điều hòa lượng cholesterol, cải thiện máu và bệnh gan, điều hòa áo suất trong máu, làm tăng khả năng hấp thụ canxi, điều trị các bệnh: Viêm loét dạ dày, bệnh tiêu chảy,… Oligochitin có tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nên được sử dụng để làm chất bảo quản nguyên liệu thủy sản. 16 1.5. Tổng quan về phương pháp sản xuất oligochitin và đánh giá hoạt tính 1.5.1. Tổng quan về phương pháp hóa học Thủy phân chitin bằng phương pháp hóa học là sử dụng các chất acid để cắt mạch chitin ở nhệt độ cao. Quá trình thủy phân tạo thành các phân tử glucosamine có hoạt tính sinh học cao, quá trình này xảy ra ở các mối nối 1,4-glucozit, sau đó loại bỏ nhóm acetyl (-CO-CH3) tạo thành thành 88,5% D-Glucosamin và 12,5% acid acetic [6]. Phương trình thủy phân: (C32H54N4O21)x + 2(H2O)x = (C28H50N4O19)x + 2(CH3COOH)x ot Acid đậm đặc Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin bằng phương pháp hóa học: Hình 1.6. Cơ chế thủy phân chitin tạo oligochitin 17 Nghiên cứu sản xuất chitin và oligochitin bằng phương pháp hóa học Qui trình sản xuất oligosaccharides [12] Phế liệu tôm, cua... Khử protein bằng NaOH/ KOH Khử khoáng bằng HCl Khử màu Chitin Thủy phân một phần Oligochitin Glucosamine và N- acetyl glucosamine Hình 1.7. Sơ đồ sản xuất oligochitin Phương pháp thủy phân chitin tạo N-acetyl-chito-oligosaccharides (NACOSs): thủy phân chitin với HCl 12M ở nhiệt độ 40oC, thời gian 7h. Kết thúc quá trình thủy phân, thêm nước vào với tỉ lệ dung dịch: nước là 1:4. Trung hòa bằng NaOH 25%. Dùng thiết bị màng lọc UF (thiết bị siêu lọc) để tách ra 2 loại NA COSs có trọng lượng phân tử 1 – 3 kDa và dưới 1 kDa [7]. Hiện nay, phương pháp này ít được sử dụng do còn tồn tại nhiều hạn chế, sản phẩm tạo thành chủ yếu là D-glucosamine nên hướng quan tâm mới hiện nay là thủy phân chitin bằng phương pháp sinh học sử dụng enzyme. 18 Nhận xét: Ưu điểm: phương pháp hóa học đơn giản, thời gian thủy phân ngắn. Nhược điểm: chi phí cao, năng suất thấp, hoạt tính sinh học các sản phẩm thủy phân tạo thành không cao, khó tinh sạch, nguy cơ gây ô nhiễm môi trường do sử dụng một lượng lớn hóa chất trong quá trình sản xuất. 1.5.2. Tổng quan về phương pháp chiếu xạ Phương pháp chiếu xạ là phương pháp sử dụng nguồn bức xạ ion hóa năng lượng cao như bức xạ α, β, tia X, γ, notron, electron để tạo ra biến đổi ở mức nguyên tử, phân tử. Quá trình chiếu xạ sẽ làm biến đổi tính chất cơ lý, hóa lý của polymer, độ kết tinh, độ tan trong dung môi, tính dẫn điện, tính thấm khí. Cơ chế tác động: dưới tác động của các nguồn bức xạ thì vật liệu polymer sẽ xảy ra những biến đổi sau: Biến đổi hóa và hóa - lí [5] • Hiệu ứng khâu mạch (cross- linking) Người ta đưa ra ra rất nhiều cơ chế khâu mạch polymer, nhưng phổ biến nhất là tạo ra các gốc tự do. Khâu mạch là kết quả của quá trình nối mạch giữa 2 gốc tự do chẳng hạn như trường hợp của polystyrene: Hình 1.8. Cơ chế khâu mạch của polystyren 19 Trong quá trình ngắt mạch các phân tử lượng polymer giảm, quá trình này khác với quá trình này khác với quá trình trùng hợp, trong đó các monomer đươc tạo ra và phân tử lượng của polymer hầu như không thay đổi. Trong quá trình ngắt mạch, các gốc tự do được tạo ra không liên kết với nhau do những khó khăn về mặt không gian, ngoài ra do sự hiện diện của nguyên tử cacbon với 4 mối liên kết, cũng cản trở sự di chuyển hóa học dọc theo mạch polymer. • Hiệu ứng tách khí Khi chiếu xạ polymer, quá trính giải phóng sản phẩm ở thể khí thường xảy ra rất mạnh. Bản chất của các sản phẩm thể khí và hiệu suất hóa bức xạ của chúng thường phụ thuộc trước hết vào loại polymer và cấu trúc của nó. • Oxy hóa bức xạ và sau bức xạ của polymer Trong nhiều trường hợp oxy hóa có ảnh hưởng đáng kể tới qúa trình phân tích bức xạ của polymer. Quá trình oxy hóa này có thể do oxi hòa tan trong polymer, có thể do oxi khuếch tán vào polymer từ bên ngoài. Giai đoạn đầu là quá trình oxy hóa hòa tan, giai đoạn sau là oxy khuếch tán từ bên ngoài. Trong phản ứng oxy hóa, các gốc tự do lớn của peroxy có vai trò rất quan trọng. Các gốc tự do peroxy này xuất hiện khi oxy tác dụng với các gốc tự do lớn được tạo ra trong quá trình chiếu xạ. Cơ chế đơn giản nhất của quá trình oxy hóa polymer như sau: Trong đó R là gốc alkyl, R• là gốc tự do lớn, RH- polymer, RO2 là gốc tự do peroxy. Tốc độ oxy hoá phụ thuộc vào các yếu tố sau đây: + Nồng độ của oxy trong polyme: Nồng độ này được xác định bằng độ hoà tan của oxy, khả năng thẩm thấu của nó qua polyme cũng như tốc độ thâm nhập của oxy vào polyme. Ngoài ra hiệu ứng còn phụ thuộc vào liều, suất liều, áp suất của oxy, bề dày của mẫu, tốc độ khi chiếu v.v... 20 + Hiệu ứng suất liều: Sự khuếch tán của oxy vào polyme có liên quan tới suất liều. Rõ ràng suất liều càng nhỏ (tốc độ tiêu hao oxy nhỏ) thì xác suất thâm nhập của oxy từ ngoài vào polyme càng lớn và như vậy quá trình oxy hoá diễn ra càng mạnh. + Hiệu ứng nhiệt độ: Nhiệt độ ảnh hưởng đến quá trình oxy hoá bức xạ theo một số hướng: Khi nhiệt độ tăng, độ hoà tan của oxy trong polyme giảm, hiệu ứng oxy hoá giảm. Khi nhiệt độ tăng, tốc độ ở mọi giai đoạn của quá trình oxy hoá tăng, hiệu ứng oxy hoá tăng. Khi nhiệt độ tăng, xác suất phân rã của các gốc tự do tăng đồng thời độ bền vững của hyđro peroxy (H2O2) cũng giảm, hiệu ứng oxy hoá giảm. Do đó hiệu ứng nhiệt độ tổng phụ thuộc vào tỷ lệ đóng góp của các hiệu ứng thành phần. + Hiệu ứng áp suất: Khi áp suất của oxy tăng, nồng độ của oxy trong polyme tăng và độ thâm nhập của nó vào polyme cũng tăng do đó, tốc độ oxy hoá cũng tăng. Tuy nhiên, thông thường hiệu suất hoá bức xạ phụ thuộc vào áp suất tương đối yếu. Chẳng hạn khi chiếu màng polyetylen bằng gamma hiệu suất chỉ tăng từ 8,6 lên 10 phân tử/100 eV khi áp suất tăng 150 lần (suất liều 1,4 Gy/s). Sự thay đổi tính chất vật lý [5] Khi chiếu xạ polyme, cũng như khi chiếu xạ chất rắn khác, có thể xảy ra các biến đổi thuận nghịch và không thuận nghịch của nhiều tính chất vật lý như tính chất cơ điện, biến đổi về cấu trúc v.v... Nói chung các biến đổi thuận nghịch thường xảy ra ở các liều thấp còn biến đổi không thuận nghịch thì xảy ra ở các liều hấp thụ tương đối cao như khi polyme chịu những biến đổi hoá học rõ ràng như ngắt mạch, khâu mạch, oxy hoá v.v... Tương tác bức xạ ion hóa lên các hệ polymer có thể xảy ra phản ứng cắt mạch làm giảm cấp chiều dài hoặc khâu mạch tạo vật liệu trương nở cao, tăng độ bền cơ lý tùy thuộc vào bản chất và cấu trúc của polymer. Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng polymer có cấu tạo từ các vòng glucozit như chitin thường xảy ra phản ứng cắt mạch tạo oligomer khối lượng phân tử thấp khi được chiếu xạ, 21 trong khi đó các dẫn xuất của chúng thường xảy ra phản ứng khâu mạch tạo các sản phẩm có cấu trúc không gian ba chiều.  Một số nghiên cứu về phương pháp chiếu xạ Nghiên cứu chiếu xạ chitosan tạo thành chitosan oligomer [2] Phương pháp này sử dụng năng lượng cao của bức xạ gamma từ nguồn xạ Co-60 để phân huỷ bức xạ Chitosan thành các Chitosan oligomer. Phương pháp này lần đầu tiên được Kume (1997) sử dụng và ở Việt Nam, được nghiên cứu sử dụng là Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà lạt (Nguyễn Quốc Hiến, 1999). Nhược điểm của phương pháp này là đòi hỏi phải có nguồn chiếu xạ, vốn đầu tư lớn, đòi hỏi an toàn về phóng xạ cao. Tuy nhiên, nhược điểm lớn nhất là bức xạ gamma phân huỷ mạch Chitosan hoàn toàn ngẫu nhiên, hiệu suất tạo Chitosan oligomer có khối lượng phân tử thấp phải sử dụng liều chiếu xạ rất cao 100 – 150 kGy gây biến màu sản phẩm và làm thay đổi ít nhiều về mặt hoá học của Chitosan oligomer. Chitosan có thể được phân cắt dựa vào ảnh hưởng của tia . Chiếu xạ tia  là một phương pháp đơn giản và nhanh chóng, tác động lên cấu trúc polymer và làm giảm kích thước phân tử của polymer. Tùy vào từng liều xạ ta thu nhận được các oligomer có kích thước khác nhau. Khi chiếu dung dịch chitosan 10% có phân tử lượng trung bình 48 kDa bằng liều 100 kGy thì phân tử lượng trung bình giảm xuống còn 16 kDa, còn khi tăng lên liều xạ 200 kGy thì phân tử lượng trung bình là 9,1 kDa. Các đặc tính của chitosan sau chiếu xạ có thể được phân tích dựa vào phương pháp quang phổ hồng ngoại và phân tích nguyên tố. Nhóm amino acid trên các đơn phân khá ổn định trong khi nhóm C-O-C giảm khi tăng liều xạ. Khi nghiên cứu ứng dụng của chitosan chiếu xạ trên nuôi cấy thực vật in vitro, chitosan có phân tử lượng khoảng 16 kDa khi chiếu bằng liều xạ 100 kGy cho thấy khả năng kích thích tăng trưởng tốt nhất. Ngoài ra, nhóm nghiên cứu còn chứng minh được ứng dụng quan trọng của phương pháp chiếu xạ trong tăng cường hoạt tính các enzyme phân cắt chitosan. Các liều xạ ngoài tác dụng phân cắt sơ khởi phân tử chitosan thì có lẽ đã bẻ gãy cấu trúc xoắn cuộn, làm lộ ra nhiều hơn các vị trí nhận biết cho phân 22 cắt của enzyme và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân cắt của các enzyme, giúp tiết kiệm liều lượng sử dụng của enzyme. Công nghê bức xạ được ứng dụng trong nhiều lĩnh vực như [5]: Trong công nghiệp chế tạo: chế tạo kính tấm nhạy bức xạ, chế tạo màng lọc kĩ thuật bằng chiếu chùm ion gia tốc, công nghệ lưu hóa các chất đàn hồi (sản xuất các vật liệu cách nhiệt, bền nhiệt tự dính,...), công nghệ biến tính các vật liệu polymer (chế tạo vỏ cáp và dây điện bằng khâu mạch bức xạ, chế tạo ống và màng co nhiệt, chế tạo polyetylen bằng xốp bức xạ, công nghệ làm đông cứng chất phủ polymer, ...). Trong công nghệ xử lí bề mặt kim loại bằng phương pháp cấy ion, công nghệ lưu hóa các chất đàn hồi Trong y học: chế tạo băng vêt thương dưới dạng gel nước Sản xuất gỗ - chất dẻo và vật liệu bê tông – polimer. Nhận xét: Ưu điểm: nhanh chóng, hiệu suất cắt mạch khá tốt. Nhược điểm: đòi hỏi phải có nguồn chiếu xạ, vốn đầu tư lớn, đòi hỏi an toàn về phóng xạ cao. Liều chiếu xạ cao ảnh hưởng tới tính chất của sản phẩm tạo thành. 1.5.3. Tổng quan về phương pháp sinh học Phương pháp sinh học là phương pháp sử dụng các chế phẩm sinh học để thủy phân chitin trong đó được sử dụng nhiều nhất là các enzyme do chúng có hiệu quả xúc tác cao gấp nhiều lần so với các chất xúc tác vô cơ thông thường. Cơ chế xúc tác của enzyme [6] Enzyme là chất xúc tác sinh học, do đó trước tiên chúng mang đầy đủ các đặc điểm của chất xúc tác nói chung. Phương trình phản ứng enzyme như sau: ES + S ES P+E Trong đó: E: enzyme; S: cơ chất; ES: phức hợp enzyme có chất; P: sản phẩm. Enzyme có tác dụng và chuyển hóa cơ chất trải qua 3 giai đoạn: 23 Giai đoạn 1: enzyme cơ chất kết hợp với nhau tạo thành phức hợp enzyme cơ chất (ES) không bền, phản ứng xảy ra nhanh và đòi hỏi năng lượng thấp. Giai đoạn 2: là giai đoạn tạo thành phức chất hoạt hóa, đây là giai đoạn xảy ra sự biến đổi cơ chất dưới tác dụng của một số nhóm chức trong trung tâm hoạt động của enzyme và làm cho cơ chất từ chỗ không hoạt động trở thành hoạt động, một số liên kết trong cơ chất bị kéo căng ra và mật độ electron trong cơ chất bị thay đổi. Giai đoạn 3: là giai đoạn giải phóng enzyme, đây là giai đoạn cuối của quá trình phản ứng. Từ cơ chất sẽ thành sản phẩm và enzyme sẽ được giải phóng dưới dạng tự do ban đầu. Tác động của enzyme lên quá trình thủy phân chitin: Quá trình cắt mạch chitin của enzyme xảy ra tại vị trí liên kết 1,4-glucozit tạo thành các đoạn mạch ngắn hơn. Một số nghiên cứu thủy phân chitin bằng phương pháp sinh học Wang và Chio (1998) cùng với cộng sự (2006) đã nghiên cứu về việc sử dụng enzyme Alcalase, chymotrypsin, và papain để khử protein (COS) trong phế liệu vỏ giáp xác. Năm 2008, Wang đã nghiên cứu và dùng enzyme bromelin và papain để thủy phân chitin tạo chitosan oligomer tốt hơn papain với nồng độ enzyme tối thích là 0,1% [13]. Qui trình nghiên cứu sử dung enzyme thủy phân chitin sản xuất oligosaccharides [13]. 24 Phế liệu vỏ tôm cua Xử lí sơ bộ Khử khoáng Khử khoáng Khử protein bằng enzyme thương mại Khử protein bằng vi khuẩn phân giải protein Bất hoạt enzyme Rửa và làm khô Chitin Deacetyl bằng chitin deacetylase hoặc vi khuẩn axit lactic Thủy phân chitin bằng enzyme chitinolitics Oligochitin Rửa và làm khô Chitosan Thủy phân chitosan + enzyme chitinolitics Rửa và làm khô Oligochitosan Hình 1.9. Qui trình xử lí chitin tạo các dẫn xuất của chitin 25 Nhận xét: Ưu điểm: thủy phân có tính chọn lọc cao, an toàn, sản phẩm tạo thành có chất lượng tốt. Nhược điểm: chi phí cao, thời gian thủy phân dài.  Phương pháp đánh hoạt tính sinh học oligochitin - Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy hóa [9] Ngày nay, có nhiều phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxi hóa trong đó, phương pháp sàng lọạt tính bẫy gốc tự do DPPH thường được sử dụng để khảo sát khả năng ức chế gốc tự do các chất kháng oxi hóa. Phương pháp này rất hữu hiệu được dùng phổ biến vì đơn giản, nhanh chóng và dễ ổn định. Năm 1992 Govldschmidt và Renn, đã phát hiện ra 1 gốc tự do bền có màu tím đậm, hầu như không bị phân hủy, không nhị trùng hóa và cũng không phản ứng với oxi đó chính là gốc tự do DPPH ( 2,2-diphenol-1-picrylhyrdarzyl). DPPH• là một gốc tự do màu tím giống màu của dung dịch KMnO4, không tan trong nước, tan trong dung môi hữu cơ. Gốc tự do DPPH• do sự bất định xứ của đơn điện tử chưa liên kết (điện tử này nằm trong hệ thống liên hợp rộng khắp gốc tự do DPPH•. Dung dịch DPPH trong ethanol có cực đại hấp phụ tai bước sóng 517nm và sản phẩm khử của nó là 2,2-diphenyl-1-picrylhyrazine (DPPH-H) thì có màu vàng cam. Nguyên lý Các gốc tự do sẽ có khả năng trung hòa các gốc tự do bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp phụ tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ giảm dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. Phản ứng trung hòa của các gốc tự do DPPH được minh họa bằng hình bên dưới. 26 Hình 1.10 Phản ứng trung hòa các gốc tự do DPPH• Tiến hành Cho chất kháng oxi hóa cần khảo sát tác dụng với gốc tự do DPPH• ở các nồng độ khác nhau. Sau đó theo dõi sự thay đổi nồng độ hấp thu ở bước sóng 517nm hoặc tốc độ mất màu của hỗn hợp qua đó, đánh giá hoạt tính của chất chống oxi hóa đó. Tốc độ mất màu của dung dịch tỉ lệ thuận với khả năng chống oxi hóa của chất đó. - Phương pháp đánh giá khả năng kháng khuẩn của oligochitin [11] Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch. Nguyên lí Các chủng vi khuẩn được cấy trong môi trường thích hợp được đục lỗ đem ủ qua đêm ở các điều kiện tối ưu cho từng chủng vi khuẩn, sau đó đo vùng ức chế (vùng các lớn khả năng kháng khuẩn càng mạnh) Tiến hành Lựa chọn chủng vi khuẩn phổ biến liên quan đến vệ sinh an toàn thực phẩm, chia ra hai nhóm gram dương và gram âm để xác định tình kháng khuẩn. Việc chọn nhóm gram dương hay gram âm phụ thuộc vào mức độ chủng vi khuẩn thuộc nhóm gram gây ảnh hưởng nhiều đến sức khỏe con người khi có mặt trong thực phẩm. Đĩa thạch chứa môi trường MRS được khoan một lỗ ở giữa, rồi được lấp đầy bằng 2 ml dịch oligochitin (1mg/1ml). Sau đó 1 giờ toàn bộ đĩa thạch được phủ đều với 3 ml thạch mềm (0,7%, w/v) của môi trường LB có chứa một trong các vi khuẩn 27 đích (E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+)). Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở điều kiện tối ưu cho từng loại vi khuẩn đích, sau đó đo kích thước vùng ức chế xuất hiện. Quan sát vùng ức chế càng lớn khả năng kháng khuẩn càng mạnh. 28 CHƯƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu và địa điểm nghiên cứu 2.1.1. Vật liệu chính Chitin chiếu xạ ở các liều xạ: 200 kGy, 350 kGy, 400 kGy tại Viện Nghiên cứu Hạt nhân Đà Lạt. 2.1.2. Vật liệu phụ - Axit HCl loại sử dụng cho thí nghiệm, xuất xứ Tây Ban Nha, Trung Quốc. - 1,1 diphenyl-2-picryllhydrazyl (DPPH) sử dụng cho thí nghiệm. - Enzyme hemicellulase: loại tinh khiết sử dụng thí nghiệm có nguồn gốc từ vi sinh vật Aspergillus niger, sản phẩm của hãng Sigm – Aldrich. Hình 2.1 Enzyme Hemicellulase - Cồn loại sử dụng trong thí nghiệm - Acetol loại sử dụng cho thí nghiệm, xuất xứ Trung Quốc 2.1.3. Địa điểm nghiên cứu Phòng thí nghiệm Trung tâm Thí nghiệm và Thực hành trường Đại học Nha Trang. 2.2. Thiết bị, dụng cụ sử dụng trong nghiên cứu - Thiết bị nghiên cứu gồm: tủ ấm, máy cô quay chân không, máy li tâm ống lớn, bể ổn nhiệt, tủ sấy, tủ nung, tủ lạnh, tủ đông, máy so màu UV – Vis, máy sấy chân không. 29 - Dụng cụ nghiên cứu là các dụng cụ thí nghiệm thông thường của phòng thí nghiệm. 2.3. Phương pháp nghiên cứu 2.3.1. Phương pháp sử dụng trong phân tích 2.3.1.1. Phân tích/đánh giá hiệu suất thu hồi oligochitin Xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp sấy. 2.3.1.2. Phương pháp đánh giá khả năng chống oxi hóa phân đoạn oligochitin Xác định khả năng chống oxi hóa bằng phương pháp quét gốc tự do DPPH. - Xác định khả năng kháng khuẩn bằng phương pháp đục lỗ thạch. 30 2.3.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.3.2.1. Sơ đồ quy trình tổng quát (dự kiến) Chitin Xử lý bằng phương pháp Chiếu xạ + Enzyme Chiếu xạ Xử lý tạo huyền phù Tách chiết phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) khác nhau Sấy lạnh Thu được ba phân đoạn oligochitin A, B, C Đánh giá hiệu suất thu hồi Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa Đánh giá khả năng kháng khuẩn Đề xuất phương án sử dụng các phân đoạn oligochitin 31 Thuyết minh quy trình: Nguyên liệu: Nguyên liệu chitin sử dụng cho các thí nghiệm là chitin khô dạng bột xay nhỏ đã được chiếu xạ ở các liều xạ 200, 350, 400 kGy. Xử lí: + Phương pháp chiếu xạ: Bột chitin đã chiếu xạ (200, 350, 400 kGy) đem ngâm nước cất để làm mềm, sau đó xử lý bằng HCl 37% khuấy đều và ủ trong bể ổn nhiệt 30 phút. Lấy dịch đã xử lý hòa với nước cất ta được dạng huyền phù của chitin. + Phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme: Bột chitin đã chiếu xạ ở liều chiếu 200 kGy ngâm nước cất để làm mềm, sau đó xử lý bằng HCl 37% rồi ủ trong bể ổn nhiệt 30 phút, vừa ủ vừa khuấy đều. Khi đã đủ thời gian ủ, lấy dịch hòa với nước cất lạnh (2 – 4oC) đến khi đạt 500 ml khuấy đều, dịch đó đem li tâm khoảng 4 – 5 lần để thu được dịch có pH = 4 – 4,5. Cuối cùng hòa tan trong nước cất đến khi đạt 500 ml, đó là dịch huyền phù để tách phân đoạn. Tách chiết các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp oligochitin: Dung môi dùng tách chiết gồm ethanol và acetol. Tùy thuộc vào chiều dài mạch của từng phân đoạn để pha tỷ lệ dung môi chiết phù hợp. Sau quá trình tách chiết, hiệu suất ba phân đoạn thu được thấp hơn khối lượng nguyên liệu ban đầu do có phần hao hụt của tủa với chiều dài mạch lớn hơn phân đoạn A và phần hao hụt có chiều dài mạch nhỏ hơn phân đoạn C. Phương pháp tách chiết ba phân đoạn như sau [8]: + Thu phân đoạn A (trên 16 monomer): Dung dịch thủy phân/chiếu xạ được trộn với ethanol theo tỷ lệ 1/1 (v/v). Tủa thu được bằng cách lọc và rửa bằng ethanol 50%. Cuối cùng làm khô tủa bằng máy hút chân không. Tủa nhận được gọi là phân đoạn A chứa gốc oligochitn có độ dài lớn hơn 16 monomer. Dịch lọc gọi là dịch A. + Thu phân đoạn B (9 - 16 monomer): Dịch A được cô đặc bằng máy hút chân không cho đến thể tích cuối cùng bằng khoảng 10% thể tích ban đầu. Sau đó, bổ sung 9 lần thể tích ethanol vào dịch A và khuấy liên tục. Sau khi khuấy, thu được 32 tủa. Lọc và rửa tủa bằng ethanol 90%. Làm khô tủa bằng máy hút chân không và thu được phân đoạn B chứa oligochitin có độ dài 9 - 16 monomer. Dịch lọc gọi là dịch B. + Thu phân đoạn C (5 - 8 monomer): Dịch B được cô lại đến 10% thể tích ban đầu, bổ sung 9 thể tích acetol vào dịch B, khuấy liên tục. Sau khi khuấy, thu được tủa. Lọc và làm khô tủa bằng máy hút chân không, thu được phân đoạn C. Sấy lạnh: Các phân đoạn thu được chia làm 2 phần: Một phần sấy nóng để xác định hiệu suất thu hồi, phần còn lại sấy lạnh bằng máy sấy chân không ở nhiệt độ 30oC.Phân đoạn sau sấy lạnh được nghiền mịn thành bột để: + Xác định hoạt tính chống oxi hóa của 3 phân đoạn oligochitin A, B, C theo phương pháp DPPH. + Xác định khả năng kháng khuẩn của phân đoạn oligochitin thu được. Đề xuất phương án sử dụng các phân đoạn oligochitin + Dựa trên kết quả xác định hiệu suất thu hồi oligochitin theo từng phương pháp chọn phương pháp có hiệu suất thu hồi oligochitin cao nhất. + Dựa vào hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn oligochitin cao nhất. + Dựa vào khả năng kháng khuẩn của phân đoạn oligochitin cao nhất. 33 2.3.2.1. Sơ đồ qui trình xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin bằng phương pháp chiếu xạ Chitin đã chiếu xạ ở các liều 200, 350, 400 kGy Xử lý tạo huyền phù Tách phân đoạn Thu được 3 phân đoạn A, B, C Sấy lạnh và xác định hiệu suất thu hồi So sánh hiệu suất thu hồi giữa các phân đoạn Dịch 34 2.3.2.2. Sơ đồ qui trình xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme Chitin đã chiếu xạ ở liều xạ 200 kGy Xử lí tạo huyền phù Thủy phân bằng Enzyme Hemicellulase (thời gian 72h, to = 37oC, nồng độ enzyme = 0.02% pH = 4.5) Tách phân đoạn Thu được 3 phân đoạn A, B, C Sấy lạnh và xác định hiệu suất thu hồi So sánh hiệu xuất thu hồi giữa các phân đoạn Dịch 35 2.3.2.3. Sơ đồ đánh giá hoạt tính sinh học của oligochitin thu được  Sơ đồ đánh giá hoạt tính chống oxi hóa Oligochitin Phân đoạn A Phân đoạn B Phân đoạn C Xác định khả năng chống oxi hóa So sánh khả năng chống oxi hóa giữa các phân đoạn  Sơ đồ đánh giá khả năng kháng khuẩn Oligochitin Phân đoạn A Phân đoạn B Xác định khả năng kháng khuẩn So sánh khả năng kháng khuẩn giữa các phân đoạn Phân đoạn C 36 2.3.3. Phương pháp xử lí số liệu Các thí nghiệm đều tiến hành 3 lần, kết quả là trung bình giữa các lần thí nghiệm. Sử dụng phần mềm Microsoft Excel 2013 để xử lý số liệu và vẽ đồ thị. 37 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THÁO LUẬN 3.1. Kết quả nghiên cứu xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ được thể hiên đồ thị hình 3.1 và bảng 3.1, 3.2, 3.3 (phụ lục II) như sau: Hình 3.1 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ ở các liều chiếu xạ khác nhau Kết quả nghiên cứu thể hiện trên đồ thị hình 3.1 cho thấy hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) theo phương pháp chiếu xạ ở mức khá đối với phân đoạn A, còn phân đoạn B và C thấp, hiệu suất thu hồi tăng khi liều xạ tăng. Cụ thể, hiệu suất thu hồi mẫu chitin chiếu xạ 200 kGy của 3 phân đoạn A, B, C lần lượt là 51,38; 4,78; 0,3%; mẫu 350 kGy là 58,85; 6,31; 0,38%; mẫu 400 kGy là 60,84; 7,31; 0,41%. Liều lượng chiếu xạ càng cao chitin bị cắt mạch càng nhiều hiệu suất thu hồi càng tăng nhưng khi liều xạ tăng đến 400 kGy thì hiệu suất thu hồi cũng không tăng nhiều. 38 Sở dĩ có hiện tượng trên là do khi cắt mạch bằng tia bức xạ thì chitin bị cắt mạch một cách ngẫu nhiên tạo thành những đoạn phân tử ngắn mạch khác nhau tùy vào từng liều xạ dẫn tới độ hòa tan khác nhau. Liều xạ càng cao hiệu suất cắt mạch chitin càng cao, chitin bị cắt mạch càng mạnh mẽ, tạo những đoạn phân tử ngắn mạch hơn (phân tử lượng thấp hơn) hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin tăng. Tuy nhiên, nếu liều xạ cao quá sẽ làm cháy chitin, chính vì vậy, hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin càng giảm khi liều chiếu xạ tăng. Trong quá trình cắt mạch, các gốc tự do được tạo ra không liên kết với nhau do những khó khăn về mặt không gian, ngoài ra do sự hiện diện của nguyên tử cacbon với 4 mối liên kết, cũng cản trở sự di chuyển hóa học dọc theo mạch polymer. Kết luận: Hiệu suất thu hồi lần lượt 3 phân đoạn oligochitin cao nhất theo phương pháp chiếu xạ là 60,84; 7,31; 0,41% (mẫu chiếu xạ 400 kGy). 3.2. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme được thể hiên đồ thị hình 3.2 và bảng 3.4, 3.5, 3.6 (phụ lục II) như sau: 39 Hình 3.2. Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lương thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp với enzyme Kết quả nghiên cứu thể hiện trên đồ thị hình 3.2 cho thấy hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin ở mức khá cao, hiệu suất thu hồi ở phân đoạn A cao nhất là 75,1%; phân đoạn B và C giảm dần lần lượt là 25,86; 18,81%. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn cao hơn phương pháp chiếu xạ là vì quá trình chiếu xạ tăng cường hoạt tính các enzyme phân cắt chitin. Các liều xạ ngoài tác dụng phân cắt sơ lược phân tử chitin thì có lẽ đã bẻ gãy cấu trúc xoắn cuộn, làm lộ ra nhiều hơn các vị trí nhận biết (liên kết 1,4-glucozit) và tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình phân cắt của các enzyme nên hiệu suất thu hồi oligochitin khá cao. Qua quá trình tách chiết từng phân đoạn hiệu suất thu hồi càng thấp do các phân đoạn càng được cắt mạch càng ngắn nên khả năng hòa tan vào dung môi tách càng cao, vì vậy hiệu suất kết tủa thu được càng thấp. Kết luận: Hiệu suất thu hồi ở phân đoạn A cao nhất là 75,1; phân đoạn B và C giảm dần lần lượt là 25,86; 18,81%. 40 3.3. So sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) sản xuất giữa 2 phương pháp và lựa chọn phương pháp sản xuất Kết quả so sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) sản xuất bằng 2 phương pháp được thể hiện ở hình 3.3 và bảng 3.7 (phụ lục II) như sau : Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất thu hồi các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng hai phương pháp Kết quả nghiên cứu thể hiện trên đồ thị hình 3.3 cho thấy hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ thấp hơn phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme. Đặc biệt ở 2 phân đoạn B và C của phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme cao nhiều và thể hiện rõ ràng hơn phương pháp chiếu xạ. Kết quả nghiên cứu cũng tương tự với nghiên cứu của Nguyễn Anh Dũng (2009) khi nghiên cứu sản xuất chitosan kết hợp giữa chiếu xạ và enzyme cellulase [2]. 41 Thông thường đối với phương pháp chiếu xạ, khi sử dụng liều chiếu càng cao thì khả năng cắt mạch diễn ra càng tăng, tạo ra những đoạn phân tử ngắn mạch hơn nên hiệu suất cũng tăng. Nếu kết hợp bằng cả hai phương pháp nghĩa là quá trình cắt mạch càng diễn ra mạnh mẽ hơn để tạo nhiều hơn các đoạn oligochitin. Vì vậy, vừa chiếu xạ vừa thủy phân bằng enzyme sẽ làm giảm một lượng lớn năng lượng để hoạt hóa enzyme, khả năng tiếp xúc enzyme và nhận diện vị trí cắt mạch mới làm cho hiệu suất cắt mạch càng cao. Ở đây chỉ mới sửa dụng phương pháp chiếu xạ liều thấp 200 kGy, nhưng nếu sử dụng liều chiếu càng cao thì sẽ càng làm cháy chitin dẫn đến hiệu suất thu hồi oligochitin càng giảm khi liều chiếu xạ tăng. Do đó, cần sử dụng liều chiếu với nồng độ enzyme thích hợp để thu được hiệu suất cao nhất. Kết luận: Phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme cho hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin lần lượt của 3 phân đoạn cao (75,1; 25,86; 18,81% với liều chiếu là 200 kGy nồng độ enzyme 0,02%) hơn so với các phương pháp chiếu xạ. 3.4. Lựa chọn phương pháp sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) Từ kết quả nghiên cứu sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng hai phương pháp khác nhau (thông qua đánh giá hiệu suất thu hồi) cũng như phần so sánh hiệu suất thu hồi giữa hai phương pháp sử dụng trên thì phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme có nhiều ưu điểm như hiệu suất cắt mạch cao. Do đó nên chọn phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme để sản xuất các phân đoạn oligochitin. 42 3.5. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 3.5.1. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ Nồng độ đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của oligochitin được thể hiện ở bảng 3.8, 3.9, 3.10, 3.11 (phụ lục II) và đồ thị hình 3.4 như sau: Hình 3.4 Đồ thị biểu diễn kết quả đo bước sóng 517 nm qua các nồng độ của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ Như thể hiện trên hình 3.4, nồng độ chất chống oxi hóa càng cao thì khả năng chống oxi hóa càng tăng nhưng chỉ tăng nhẹ không đáng kể. Kết quả phần trăm đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của oligochitin được thể hiện ở bảng 3.12 (phụ lục II) và đồ thị hình 3.5 như sau: 43 Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ Kết quả nghiên cứu thể hiện trên đồ thị hình 3.5 cho thấy khả năng quét gốc tự do của oligochitin còn rất thấp so với vitamin C và khả năng quét gốc tự do của phân đoạn B là cao hơn trong 3 phân đoạn nhưng không đáng kể. Cụ thể, ở cùng nồng độ 500 µg/ml thì khả năng quét gốc tự do của oligochitin phân đoạn A, B, C lần lượt là 8,96; 9,76; 6,65%, trong khi đó vitamin C là 67,9%. Nồng độ càng cao thì khả năng chống oxi hóa của phân đoạn oligochitin càng cao, còn đối với vitamin C khi tăng nồng độ thì khả năng chống oxi hóa cũng tăng nhưng không đáng kể. Hiện tượng này có thể do cấu tạo mạch có nối đôi C=C rất linh động nên vitamin C dễ dàng nhường hydro cho gốc tự do DPHH nên khả năng chống oxi hóa của chúng cao chỉ với nồng độ thấp (100 µg/ml) còn oligochitin có cấu trúc mạch ít linh động hơn, khó nhường hydro hơn nên khả năng chống oxi hóa thấp hơn. Khả năng quét gốc tự do của phân đoạn B cao hơn hai phân đoạn còn lại có thể do được tinh chế sạch ít lẫn tạp chất và ít bị ảnh hưởng của nhiệt độ cô quay. 44 Trong khi đó phân đoạn A được tách đầu tiên nên sẽ lẫn tạp chất và phần chitin không tan, phân đoạn C được tách cuối cùng nên thời gian và nhiệt độ cô quay lâu sẽ làm biến đổi hoạt tính chống oxi hóa của nó. Kết luận: Oligochitin phân đoạn B có khả năng chống oxi hóa (với nồng độ 500 µg/ml khả năng kháng gốc hydroxyl cao nhất là 9,76%). Nồng độ càng cao thì khả năng chống oxi hóa càng tăng nhưng không đáng kể (của oligochitin phân đoạn B tại nồng độ 100 µg/ml là 2,37%, khi tăng nồng độ lên 200 µg/ml thì khả năng khả năng kháng gốc hydroxyl tăng lên 3,16%). 3.5.2. Kết quả đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme Nồng độ đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của oligochitin được thể hiện ở bảng 3.11, 3.13, 3.14, 3.15 (phụ lục II) và đồ thị hình 3.6 như sau: Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn kết quả đo bước sóng 517 nm qua các nồng độ của phân đoạn oligochitin theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 45 Như thể hiện trên hình 3.6, nồng độ chất chống oxi hóa càng cao thì khả năng chống oxi hóa càng tăng nhưng chỉ tăng nhẹ không đáng kể. Kết quả phần trăm đánh giá hoạt tính chống oxi hóa của oligochitin được thể hiện ở bảng 3.16 (phụ lục II) và đồ thị hình 3.7 như sau: Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc hydroxyl tự do của phân đoạn oligochitin và vitamin C theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme Kết quả nghiên cứu thể hiện trên đồ thị hình 3.7 cho thấy khả năng quét gốc tự do của oligochitin còn rất thấp so với vitamin C và khả năng quét gốc tự do của phân đoạn B là cao hơn trong 3 phân đoạn nhưng không đáng kể. Cụ thể, ở cùng nồng độ 500 µg/ml thì khả năng quét gốc tự do của oligochitin phân đoạn A, B, C lần lượt là 8,76; 9,76; 6,73%; trong khi đó vitamin C là 67,9%. Nồng độ càng cao thì khả năng chống oxi hóa của phân đoạn oligochitin càng cao, còn đối với vitamin C khi tăng nồng độ thì khả năng chống oxi hóa cũng tăng nhưng không đáng kể. 46 Kết luận: Oligochitin phân đoạn B có khả năng chống oxi hóa (với nồng độ 500 µg/ml khả năng kháng gốc hydroxyl cao nhất là 9,76%). Nồng độ càng cao thì khả năng chống oxi hóa càng tăng nhưng không đáng kể (của oligochitin phân đoạn B tại nồng độ 100 µg/ml là 2,42%, khi tăng nồng độ lên 200 µg/ml thì khả năng khả năng kháng gốc hydroxyl tăng lên 3,2%). 3.5.3. So sánh khả năng chống oxi hóa của các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) giữa hai phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme Kết quả so sánh hoạt tính chống oxi hóa của 3 phân đoạn phân tử lượng thấp (oligochitin) giữa hai phương pháp được thể hiện lần lượt ở bảng 3.12, 3.16 (phụ lục II) và đồ thị hình 3.8, 3.9, 3.10 như sau: Hình 3.8 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn A giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 47 Hình 3.9 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn B giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme 48 Hình 3.10 Đồ thị biểu diễn khả năng quét gốc tự do oiligochitin của phân đoạn C giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme Kết quả nghiên cứu thể hiện trên đồ thị hình 3.8, 3.9, 3.10 cho thấy khả năng quét gốc tự do của các phân đoạn oilgochitin qua các nồng độ giữa 2 phương pháp gần giống nhau. Cụ thể, cùng nồng độ 500 µg/ml khả năng quét gốc tự do lần lượt 3 phân đoạn của phương pháp chiếu xạ là 8,96; 9,76; 6,65%; phương pháp chiếu xạ kết hợp với enzyme là 8,76; 9,76; 6,73%. Sở dĩ có hiện tượng trên là do khi tách chiết các phân đoạn đều có cùng một đặc tính với chiều dài mạch giống nhau nên khả năng quét gốc tự do là gần như nhau. Kết luận: Khi so sánh khả năng quét gốc tự do các phân đoạn khác nhau giữa phương pháp chiếu xạ và phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme gần như là giống nhau. Do đó, nếu lựa chọn phương pháp thu hồi phân đoạn oligochitin nên chọn phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme để đạt hiệu suất thu hồi cao nhất và lựa 49 chọn phân đoạn B đánh giá khả năng chống oxi hóa thì cho ra kết quả tối ưu hơn phân đoạn còn lại. 3.6. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn oiligochitin Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn oligochitin được thể hiện ở bảng 3.17 và hình 1, 2, 3 (phụ lục II) dưới đây: Bảng 3.17. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn oligochitin CHỈ TIÊU Stt Tên mẫu Mã E.coli Salmonella hóa (Gr-) mẫu (D-d) 2 3 Oligochitin phân đoạn A Oligochitin phân đoạn B Oligochitin phân đoạn C 13St 12St 12Sa B. S. pneumoniae cereus aureus (Gr-) (Gr+) (Gr+) (D-d) (D-d) mm mm (D-d) mm (D-d) mm 2,1 2,2 2,0 2,0 2,0 2,7 2,7 2,6 2,6 2,6 2,5 2,5 2,4 2,4 2,4 mm 1 (Gr-) Klebsiella Kết quả nghiên cứu thể hiện trên bảng 3.17 cho thấy khả năng kháng khuẩn oligochitin phân đoạn B là cao nhất, phân đoạn A thấp nhất. Cụ thể, phân đoạn A có vùng ức chế E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+) lần lượt là 2,1; 2,2; 2,0; 2,0; 2,0 mm; phân đoạn B có vùng ức chế E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+) lần lượt là 2,7; 2,7; 2,6; 2,6; 2,6 mm. Vi khuẩn là nhóm hiện diện đông đảo nhất trong sinh giới gồm loại gây độc và loại có lợi. Do chúng có mặt khắp nơi nên việc xâm nhập vào các dạng thực 50 phẩm để gây ngộ độc thực phẩm là tất nhiên, ngộ độc thực phẩm xảy ra khi chúng ta ăn uống nước nhiễm bẩn, không được bảo quản đúng cách,…Trên thực tế các loại vi khuẩn thường gây độc là: + Escherichia coli: Hiện diện một cách tự nhiên trong ruột của người và động vật, khi nhiễm độc sẽ gây rối loạn tiêu hóa, đau bụng, tiêu chảy, nôn, thân nhiệt có thể tăng. + Staphylococcus aureus: Thường thấy trên da, từ các nốt ghẻ lở có mủ, trong mũi và họng của người. Khi nhiễm gây đau bụng tiêu chảy và nôn mửa dữ dội. + Samonella: Gây bệnh thương hàn, viêm dạ dày ruột. + Klebsiella pneumonia: Gây bệnh viêm phổi, viêm màng não… + Bacillus cereus: Gây tiêu chảy… Bởi vì thực tế có các loại vi khuẩn trên gây bệnh nên việc nghiên cứu khả năng kháng khuẩn cũng cần dựa vào loại vi khuẩn đặc trưng đó thì kết quả mới có ý nghĩa hơn. Trong bài, chọn ra 5 vi khuẩn mang đặc tính khác nhau chia thành 2 nhóm gram dương và gram âm: vi khuẩn gram dương có thành tế bào dày và vách peptidoglycan ngược lại vi khuẩn gram âm có thành tế bào mỏng, có màng. Mục đích phân loại vi khuẩn gram dương và gram âm là để phân loại vi khuẩn, từ đó tìm ra các biện pháp chữa trị bệnh do chúng gây ra, vi khuẩn gram âm gây bệnh nguy hiểm hơn. Kết quả ở bảng 3.17 cho thấy oligochitin có khả năng kháng khuẩn tương đối tốt, đặc biệt là kháng mạnh đối với nhóm vi khuẩn gram âm. Trong phân tử chitin/chitosan có chứa các nhóm chức -OH, -NHCOCH3 trong các mắt xích Naxetyl-D-glucozamin và nhóm –OH, nhóm -NH2 trong các mắt xích D-glucozamin có nghĩa chúng vừa là ancol vừa là amin, vừa là amit. Phản ứng hoá học có thể xảy ra ở vị trí nhóm chức tạo ra dẫn xuất thế O-, dẫn xuất thế N-, hoặc dẫn xuất thế O-, N. Tại vị trí N xảy ra phản ứng N-axetyl hoá chitosan, chính điều này có tác dụng mạnh mẽ lên thành tế bào vi khuẩn. Khả năng ức chế nhóm vi khuẩn gram âm mạnh hơn nhóm gram dương vì lớp peptidoglucan nhóm gram âm mỏng hơn nên sự tác 51 động của N-axetyl mạnh mẽ hơn. Phân đoạn B có khả năng kháng khuẩn cao nhất vì được qua quá trình tách chiết hoạt tính của nó vẫn được giữ, còn phân đoạn A có lẫn phần hợp chất không tan của mạch chitin dài hơn phân đoạn A, phân đoạn C được cô quay trong thời gian lâu hơn nên sẽ bị cháy dẫn đến hoạt tính của nó giảm hơn so với đoạn B. Kết luận: Các phân đoạn oligochitin có khả năng kháng khuẩn, trong đó phân đoạn B có khả năng kháng khuẩn cao nhất đối với vi khuẩn E. coli (Gr-) có vùng ức chế là 2,7 mm. 3.7. Lựa chọn phương pháp sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) dựa vào kết quả đánh giá hoạt tính sinh học của oligochitin Dựa trên kết quả đồ thị hình 3.3, 3.8, 3.9, 3.10 và bảng 3.17 rút ra kết luận: Quy trình lựa chọn phương pháp sản xuất các phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu được hiệu suất cao nhất là quy trình sản bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme. Ở quy trình này nên lựa chọn sản xuất phân đoạn oligochitin B để đánh giá khả năng chống oxi hóa và khả năng kháng khuẩn là cao hơn trong 3 phân đoạn A, B, C. 52 CHƯƠNG 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT Ý KIẾN 4.1. Kết luận - Lựa chọn được phương pháp sản xuất oligochitin có hiệu suất thu hồi cao nhất là phương phương pháp chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme. - Quy trình tách chiết của từng phân đoạn sẽ khác nhau về nồng độ và dung môi tách chiết, cụ thể: Phân đoạn A (trên 16 monomer) tách bằng ethanol 50%, phân đoạn B (9 – 16 monomer) tách bằng ethanol 90%, phân đoạn C (5 – 8 monomer) tách bằng acetol 90%. - Oligochitin thu được có khả năng chống oxi hóa, trong đó phân đoạn B > phân đoạn C > phân đoạn A. Phân đoạn B có khả năng chống oxi hóa cao nhất tại nồng độ 500µg/ml khả năng quét gốc tự do DPPH là 9,76% khá thấp so với vitamin C là 67,9%. Dù sản xuất oilgochitin theo phương pháp nào thì khả năng chống oxi hóa là như nhau. - Khả năng kháng khuẩn oligochitin của phân đoạn B > phân đoạn C > phân đoạn A, cụ thể vùng ức chế vi khuẩn E. coli (Gr-) là 2,7 mm. 4.2. Đề xuất ý kiến - Tiếp tục nghiên cứu phương pháp xác định cấu trúc phân tử của sản phẩm sau khi thủy phân. - Sử dụng các dung môi tách chiết tinh khiết hơn đước sản xuất từ Mỹ để có được hiệu suất cao. - Vì oligochitin có khả năng kháng khuẩn nên có thể ứng dụng trong bảo quản thực phẩm bằng phương pháp tạo màng. Đặc biệt trong bảo quản cá ngừ, khi ca ươn histidin thủy phân tạo histamine gây độc. Ngoài ra, tiếp tục nghiên cứu khả năng kháng khuẩn đối với chủng Enterobacteriaceae, Vibro sp, Lactobacillus sp, Morganella morganii… để ức chế khả năng tạo histamine mà nó có mặt khi cá chết. 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng việt: 1. Nguyễn Anh Dũng (2001).” Nghiên cứu chế tạo vật liệu cố định enzyme từ các polyme sinh học bằng kĩ thuật bức xạ kết hợp với kĩ thuật sinh hóa học”. Luận án Tiến sĩ sinh học. 2. Nguyễn Anh Dũng, (2009). “Polysaccharide hoạt tính sinh học và ứng dụng”. NXB Giáo dục Việt Nam. 3. Trần Thị Luyến (số 1-2003). “Nghiên cứu sản xuất chitosan bằng enzyme papain”. Tạp chí Khoa học công nghệ Thủy sản, Trường Đại học Thủy sản. 4. Trần Thị Luyến, Đỗ Minh Phụng, Nguyễn Anh Tuấn. “Sản xuất các chế phẩm kỹ thuật và y dược từ phế liệu thủy sản”. Nhà xuất bản Nông nghiệp. 5. Trần Đại Nghiệp (2006), “Giáo trình xử lí bức xạ cơ sở của công nghệ bức xạ”, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội 6. Lê Thị Tưởng (2007). “Nghiên cứu thủy phân chitin, chitosan bằng enzyme hemicellulase và ứng dụng sản phẩm thủy phân vào bảo quản sữa tươi nguyên liệu”. Luận văn thạc sỹ ngành “Thí nghiệm hóa sinh học” (tập 1). Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Thanh phố Hồ Chí Minh.công nghệ sau thu hoạch. Tài liệu tiếng nước ngoài: 7. Dai-Nghiep Ngo, Sang-Hoon Lee, Moon-Moo Kim, Se-Won Kim “ Production of chitin oligosaccharides with different molecular weight and antioxidan effect and raw 264.7 cell”.Joural of funtion food I (2009). 8. E. Muraki, F. Yaku & H. Kojima. Carbohydrate Reasearch, 1993, 239: 227-237. 9. John P. Hart (2012)“Chemical Composition and Antioxidant Activities of Broussonetiapapyrifera Fruits”. PLoS ONE 10. Musashino-shi, (1997). ” Chemistry and application of chitin and chitosan” Tokyo 180, Japan, Department of Industrial Chemistry, Faculty of Engineering, Seikei University 54 11. M.S Benhabiles, R Salah, H Lounici, N Drouiche, M.F.A Goosen, N.Mameri (2012) ”Antibacterial activity of chitin, chitosan and its oligomers prepareed from shrim shell waste”. Food Hydrocolloids 12. Muzzarelli, R.A., (1997). “Depolymerisation of chitins and chitosan with hemicellulase, lysosyme, papain and lipase”. In chitin Hankbook, ed Muzzarelli, R.A. and Peters, M.G, European Chitin Society, p153. 13. Wolfram M. Brück, John W. Slater, and Brian F. Carney (2010) Chitin and Chitosan from Marine Organisms “Chitin, Chitosan, Oligosaccharides and Their Derivatives”. Copyright Clearance Center, Inc. (CCC). Tài liệu điện tử: 14. http://www.thuviensinhhoc.com/chuyen-de-sinh-hoc/sinh-hoc-te-bao/1716-tengi-va-phan-loi-enzym.html 55 PHỤ LỤC I (CÁC PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU) 1. Xác định hiệu suất thu hồi bằng phương pháp sấy * Nguyên lý: Dùng sức nóng 105C ± 2oC sấy mẫu và cốc đến khối lượng không đổi. Phần còn lại đem cân và tính ra % hàm lượng mẫu có trong nguyên liêụ. * Tiến hành xác định: Sấy cốc sứ đã rửa sạch ở tủ sấy tới 105C đến trọng lượng không đổi. Để nguội trong bình hút ẩm và cân trọng lượng cốc trên cân phân tích với độ chính xác 10-4, cho vào chén m (g) mẫu. Cân tất cả trên cân phân tích với độ chính xác như trên. Cho tất cả vào tủ sấy ở nhiệt độ 105C, sấy đến khối lượng không đổi. Sau đó lấy ra để nguội trong bình hút ẩm, rồi đem cân trên cân phân tích. * Tính kết quả: X= (G 2  G )100 (%) (G1  G ) Trong đó: G: Trọng lượng cốc (g). G1: Trọng lượng cốc + mẫu trước khi sấy (g). G2: Trọng lượng cốc + mẫu sau sấy (g) 2. Phương pháp và các bước tiến hành cắt mạch chitin • Phương pháp chiếu xạ [1] Sử dụng các mẫu chitin đã được chiếu xạ ở các liều xạ khác nhằm đánh giá ảnh hưởng của các liều xạ tới hiệu suất thu hồi oligochitin. Xử lý tạo chitin huyền phù: + Bước 1: Lấy 25 gam chitin khô cho vào cố thủy tinh 500 ml. + Bước 2: Thấm ướt chitin: Lấy 75 ml nước cất cho vào cốc đựng mẫu chitin đã cân, sau đó dùng đũa thủy tinh khuấy đều và cứ 5 phút lại khuấy 1 lần trong thời gian 5 giờ. + Bước 3: Lấy 100ml dung dịch HCl 37% cho vào cốc đựng chitin đã thấm ướt. Khuấy liên tục trong 30 phút ở nhiệt độ 40oC. 56 + Bước 4: Thêm từ từ nước cất đến 500ml. • Phương pháp xử lý chitin chiếu xạ kết hợp với phương pháp enzyme Hemicellulase Chitin làm mềm với nước nhằm làm tăng độ trương nở tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình xử lý tạo huyền phù chitin. Tạo huyền phù chitin: Để quá trình thủy phân dễ dàng, enzyme tiếp xúc với cơ chất nhiều hơn. + Bước 1: Lấy 25 gam chitin khô cho vào cố thủy tinh 500 ml. + Bước 2: Thấm ướt chitin: Lấy 75 ml nước cất cho vào cốc đựng mẫu chitin đã cân, sau đó dùng đũa thủy tinh khuấy đều và cứ 5 phút lại khuấy 1 lần trong thời gian 5 giờ. + Bước 3: Lấy 100ml dung dịch HCl đậm đặc cho vào cốc đựng chitin đã thấm ướt. Khuấy liên tục trong 30 phút ở nhiệt độ 40oC. + Bước 4: Thêm từ từ nước lạnh (2 - 40C: Lấy đá cho vào cốc nước để làm lạnh tới nhiệt độ mong muốn) đến 500 ml. Dịch huyền phù được thu lại bằng cách ly tâm ở tốc độ 3500 vòng /phút trong thời gian 20 phút. Lặp lại bước này khoảng 4 - 5 lần (thu được huyền phù có pH = 4 - 4.5). +Bước 5: Hòa tan trong nước cất ấm (40 - 450C) đến khi đạt 500 ml. + Bước 6: Thủy phân: Công đoạn thủy phân có tác dụng làm yếu và cắt các liên kết glucozit trong mạch chitin. Nó quyết định đến hiệu suất sản phẩm. Tiến hành thủy phân bằng enzyme với các chế độ thủy phân: nồng độ enzyme là 0.02%, nhiệt độ thủy phân 40oC, thời gian 72h. Trong quá trình thủy phân cần khuấy hoặc lắc 2 – 3 giờ/lần để tăng cường khả năng tiếp xúc giữa enzyme và cơ chất. Đồng thời theo dõi nhiệt độ và pH để đảm bảo nhiệt độ và pH luôn ổn định trong quá trình thủy phân. 57 3. Phương pháp đánh giá hoạt tính sinh học của oligochitin 3.1. Xác định khả năng quét gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2picrylhydrazyl) 3.1.1. Nguyên lý. DPPH là một gốc tự do bền, dung dịch có màu tím, bước sóng cực đại hấp thụ tại 517 nm. Các chất có hoạt tính chống oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần, chuyển từ tím sang vàng nhạt. 3.1.2. Tiến hành. Hóa chất. - 1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl (chuẩn). - Nước cất/Ethanol. Thiết bị, dụng cụ. - Máy so màu UV-Vis. - Cân phân tích. - Ống nghiệm (10ml). - Máy ly tâm. - Thiết bị cô quay. - Thiết bị ổn nhiệt. - Một số dụng cụ thủy tinh thông thường dùng trong phòng thí nghiệm. Xác định khả năng khử gốc tự do DPPH. - Bước 1: Hòa tan mẫu thử ở các nồng độ khác nhau (4): 100, 50, 25, 10 µM. - Bước 2: Lấy 3 ml mẫu thử ở các nồng độ khác nhau (4) cho vào ống nghiệm (10 ml). Đồng thời chuẩn bị thêm 1 ống nghiệm có chứa 3 ml nước cất (mẫu trắng). - Bước 3: Bổ sung thêm 1 ml dung dịch DPPH 0,1 mM vào các ống nghiệm (5). Lắc đều và để yên trong bóng tối 30 phút. - Bước 4: So màu trên máy UV-Vis ở bước sóng 517 nm. 58 - Bước 5: Tính toán khả năng khử gốc tự do DPPH bằng công thức. I = 100 × (ACT - ASP)/ACT (%). Từ đó tìm ra được thông số IC50 của mẫu thử.. Trong đó: + ACT: Độ hấp thu quang học của mẫu trắng không chứa dịch chiết. + ASP: Độ hấp thu quang học của mẫu thử. * Chú ý: + Mỗi nồng độ (của mẫu thử) được thực hiện 3 lần, lấy giá trị trung bình. + Trong trường hợp mẫu thử có hoạt tính khử mạnh sẽ được thử tiếp ở nồng độ 10, 5, 2, 1 µM để tìm ra giá trị IC50 của mẫu thử. + IC50 (Inhibition Concentration): Là nồng độ của mẫu mà tại đó nó có khả năng ức chế 50% gốc tự do. Mẫu có hoạt tính càng cao thì giá trị IC50 càng thấp. 3.2. Thí nghiệm đánh giá khả năng kháng khuẩn [10] Xác định hoạt tính kháng các chủng vi khuẩn thử nghiệm bằng phương pháp đục lỗ thạch. Đĩa thạch chứa môi trường MRS được khoan một lỗ ở giữa, rồi được lấp đầy bằng 2 ml dịch oligochitin (1mg/1ml). Sau đó 1 giờ toàn bộ đĩa thạch được phủ đều với 3 ml thạch mềm (0,7%, w/v) của môi trường LB có chứa một trong các vi khuẩn đích (E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+) lần lượt là 2.1, 2.2, 2.0, 2.0, 2.0 mm; phân đoạn C có vùng ức chế E. coli (Gr-), Salmonella (Gr-), Klebsiella pneumonia (Gr-), B. cereus (Gr+), S. aureus (Gr+)). Các đĩa thạch được ủ qua đêm ở điều kiện tối ưu cho từng loại vi khuẩn đích, sau đó đo kích thước vùng ức chế xuất hiện. Vùng ức chế càng lớn khả năng kháng khuẩn càng mạnh. Các vi khuẩn đích được lấy từ bộ sưu tập các mẫu chuẩn hiện có ở phòng thí nghiệm Khoa Công nghệ Sinh học – Đại học Nông nghiệp Hà Nội. 59 PHỤ LỤC II (CÁC KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU) 1. Kết quả xác định hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng các phương pháp Bảng 3.1. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn A Mẫu Lần thí nghiệm và kết quả (%) (kGy) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 200 51,35 51,38 51,41 51,41±0,07 350 58,83 58,84 58,88 58,88±0,07 400 60,81 60,84 60,87 60,87±0,07 Bảng 3.2. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn B Mẫu Lần thí nghiệm và kết quả (%) (kGy) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 200 4,64 4,77 4,92 4,78±0,35 350 6,28 6,31 6,34 6,31±0,07 400 7,29 7,33 7,31 7,31±0,05 Bảng 3.3. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ của phân đoạn C Mẫu Lần thí nghiệm và kết quả (%) (kGy) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 200 0,35 0,25 0,3 0,3±0,12 350 0,37 0,37 0,4 0,38±0,04 400 0,39 0,42 0,42 0,41±0,04 60 Bảng 3.4. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn A Mẫu Lần thí nghiệm và kết quả (%) Chiếu xạ 200 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 75,08 75,1 75,13 75,1±0,06 + Enzyme (0,02%) Bảng 3.5. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn B Mẫu Lần thí nghiệm và kết quả (%) Chiếu xạ 200 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 25,83 25,86 25,89 25,86±0,07 + Enzyme (0,02%) Bảng 3.6. Hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin bằng phương pháp chiếu xạ kết hợp phương pháp enzyme của phân đoạn C Mẫu Lần thí nghiệm và kết quả (%) Chiếu xạ 200 Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 18,78 18,82 18,83 18,81±0,07 + Enzyme (0,02%) Bảng 3.7. So sánh hiệu suất thu hồi các phân đoạn oligochitin theo hai phương pháp Phương pháp Hiệu suất thu hồi oligochitin (%) Phân đoạn A Phân đoạn B Phân đoạn C Chiếu xạ 60,84 7,31 0,41 Chiếu xạ kết hợp enzyme 75,1 25,86 18,81 61 2. Kết quả xác định hoạt tính chống oxy hóa của phân đoạn oilgochitin Bảng 3.8. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn A Nồng độ (µg/ml) Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 500 0,2556 0,2577 0,255 0,2561±0,0035 400 0,2612 0,2618 0,2632 0,2621±0,0025 300 0,2689 0,2678 0,2654 0,2674±0,0044 200 0,2732 0,273 0,2735 0,2732±0,0006 100 0,2777 0,2768 0,2789 0,2778±0,0026 Bảng 3.9. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn B Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (µg/ml) 500 0,2544 0,2519 0,2552 0,2538±0,0043 400 0,2634 0,2661 0,2628 0,2641±0,0044 300 0,2689 0,269 0,2673 0,2684±0,0024 200 0,2714 0,2726 0,2732 0,2724±0,0023 100 0,2741 0,2745 0,2753 0,2746±0,0015 Bảng 3.10. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ phân đoạn C Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (µg/ml) 500 0,2631 0,2621 0,2626 0,2626±0,0012 400 0,2678 0,2688 0,2679 0,2682±0,0014 300 0,277 0,2756 0,2762 0,2763±0,0017 200 0,2791 0,2789 0,2767 0,2782±0,0033 100 0,2813 0,2802 0,2808 0,2808±0,0014 62 Bảng 3.11. Kết quả đo bước sóng 517 nm của vitamin C Nồng độ (µg/ml) Kết quả đo bước sóng 517 nm Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 500 0,09 0,09 0,091 0,09±0,0001 400 0,0917 0,0913 0,0916 0,0915±0,0005 300 0,0939 0,0963 0,0941 0,0948±0,0033 200 0,1005 0,1012 0,1022 0,1013±0,0021 100 0,1155 0,1121 0,1108 0,1128±0,006 Bảng 3.12. Xác định khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo phương pháp chiếu xạ Nồng độ Khả năng quét % Phân đoạn A Phân đoạn B Phân đoạn C Vitamin C 500 8,96±1,25 9,76±1,52 6,65±0,44 67,9±0,05 400 6,84±0,91 6,11±1,55 4,67±0,49 67,37±0,18 300 4,95±1,58 4,59±0,84 1,79±0,62 66,22±1,18 200 2,87±0,22 3,16±0,81 1,09±1,18 63,89±0,76 100 1,24±0,93 2,37±0,54 0,19±0,49 59,79±2,15 (µg/ml) Bảng 3.13. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme phân đoạn A Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 500 0,2567 0,2549 0,2562 0,2559±0,0023 400 0,2601 0,2618 0,2604 0,2608±0,0023 300 0,2679 0,2689 0,2678 0,2682±0,0015 200 0,2726 0,2731 0,273 0,2729±0,0007 100 0,2775 0,2767 0,277 0,2771±0,001 (µg/ml) 63 Bảng 3.14. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme phân đoạn B Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (µg/ml) 500 0,254 0,2542 0,2512 0,2531±0,0042 400 0,2623 0,2655 0,2634 0,2637±0,004 300 0,2644 0,2631 0,2666 0,2647±0,0044 200 0,2704 0,2716 0,2726 0,2715±0,0027 100 0,2732 0,274 0,2739 0,2737±0,0011 Bảng 3.15. Kết quả đo bước sóng 517 nm theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme phân đoạn C Nồng độ Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình (µg/ml) 500 0,2623 0,2612 0,2614 0,2616±0,0015 400 0,2678 0,2671 0,2667 0,2672±0,0015 300 0,2732 0,277 0,2754 0,2752±0,0047 200 0,2791 0,2754 0,2761 0,2769±0,0049 100 0,28 0,2803 0,2805 0,280±0,0006 Bảng 3.16. Xác định khả năng kháng gốc hydroxyl tự do theo phương pháp chiếu xạ kết hợp enzyme Nồng độ Khả năng quét % (µg/ml) Phân đoạn A Phân đoạn B Phân đoạn C Vitamin C 500 8,76±0,82 9,76±1,49 6,73±0,52 67,9±0,05 400 7,04±0,8 5,98±1,44 4,74±0,49 67,37±0,18 300 4,39±0,54 5,63±1,57 1,89±1,69 66,22±1,18 200 2,71±0,23 3,2±0,98 1,3±1,74 63,89±0,76 100 1,22±0,36 2,42±0,39 0,08±0,22 59,79±2,15 64 Bảng 3.17. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn các phân đoạn oligochitin CHỈ TIÊU Stt Tên mẫu Mã E.coli Salmonella hóa (Gr-) mẫu (D-d) 2 3 Oligochitin phân đoạn A Oligochitin phân đoạn B Oligochitin phân đoạn C 13St 12St 12Sa B. S. pneumoniae cereus aureus (Gr-) (Gr+) (Gr+) (D-d) (D-d) mm mm (D-d) mm (D-d) mm 2,1 2,2 2,0 2,0 2,0 2,7 2,7 2,6 2,6 2,6 2,5 2,5 2,4 2,4 2,4 mm 1 (Gr-) Klebsiella 65 3. Kết quả đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của phân đoạn oligochitin thu được Hình 1. Phân đoạn A Hình 2. Phân đoạn B Hình 3. Phân đoạn C 66 PHỤ LỤC III MỘT SỐ DỤNG CỤ, THIẾT BỊ SỬ DỤNG TRONG ĐỒ ÁN Hình 1: Cân phân tích Hình 2: Máy li tâm cỡ lớn Hình 3: Tủ ấm Hình 4: Tủ lạnh Hình 5: Bể ổn nhiệt Hình 6: Máy cô quay chân không [...]... 4 Đánh giá hoạt tính kháng khuẩn của các phân đoạn oligochitin thu được Mục tiêu của đề tài: Nghiên cứu khả năng chống oxi hóa 3 phân đoạn oligochitin sản xuất bằng phương pháp chiếu xạ và enzyme để tìm ra phân đoạn có khả năng chống oxi hóa cao nhất Ý nghĩa khoa học của đề tài: nghiên cứu khả năng chống oxi hóa của một số phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) bằng phương pháp chiếu xạ và. .. N-acetyl-β-D-glucosamine liên kết với nhau bằng liên kết 1,4-glucozit Oligochitin được tạo thành qua quá trình thủy phân/ cắt mạch bằng phương pháp hóa học, phương pháp sinh học, phương pháp chiếu xạ bằng bức xạ năng lượng cao như γ hoặc chùm điện tử gia tốc Oligochitin là một saccharide, được kết hợp bởi các monosaccharide từ 2 – 10 trong cấu trúc của chitin Oligochitin có khối lượng phân tử thấp, nó có khả năng... phân dạng chitin do nó tồn tại nhiều và phổ biến 7 1.1.2 Độ kết tinh của chitin Chitin có cấu trúc tinh thể rắn chắc so với polymer sinh học khác, chitin có độ kết tinh cao và biến đổi theo từng loại chitin được chiết rút từ nguồn nguyên liệu khác nhau Phổ nhiễu xạ tia X của α -chitin từ vỏ tôm và β -chitin từ xương mực cho thấy mẫu α -chitin có vòng nhiễu xạ mạnh, ở vòng trong thì không có tính hydrat... giảm kích thước phân tử của polymer Tùy vào từng liều xạ ta thu nhận được các oligomer có kích thước khác nhau Khi chiếu dung dịch chitosan 10% có phân tử lượng trung bình 48 kDa bằng liều 100 kGy thì phân tử lượng trung bình giảm xuống còn 16 kDa, còn khi tăng lên liều xạ 200 kGy thì phân tử lượng trung bình là 9,1 kDa Các đặc tính của chitosan sau chiếu xạ có thể được phân tích dựa vào phương pháp... chảy,… Oligochitin có tính kháng khuẩn, kháng nấm cao nên được sử dụng để làm chất bảo quản nguyên liệu thủy sản 16 1.5 Tổng quan về phương pháp sản xuất oligochitin và đánh giá hoạt tính 1.5.1 Tổng quan về phương pháp hóa học Thủy phân chitin bằng phương pháp hóa học là sử dụng các chất acid để cắt mạch chitin ở nhệt độ cao Quá trình thủy phân tạo thành các phân tử glucosamine có hoạt tính sinh học. .. mạch chitin của enzyme xảy ra tại vị trí liên kết 1,4-glucozit tạo thành các đoạn mạch ngắn hơn Một số nghiên cứu thủy phân chitin bằng phương pháp sinh học Wang và Chio (1998) cùng với cộng sự (2006) đã nghiên cứu về việc sử dụng enzyme Alcalase, chymotrypsin, và papain để khử protein (COS) trong phế liệu vỏ giáp xác Năm 2008, Wang đã nghiên cứu và dùng enzyme bromelin và papain để thủy phân chitin. .. Oligochitin Rửa và làm khô Chitosan Thủy phân chitosan + enzyme chitinolitics Rửa và làm khô Oligochitosan Hình 1.9 Qui trình xử lí chitin tạo các dẫn xuất của chitin 25 Nhận xét: Ưu điểm: thủy phân có tính chọn lọc cao, an toàn, sản phẩm tạo thành có chất lượng tốt Nhược điểm: chi phí cao, thời gian thủy phân dài  Phương pháp đánh hoạt tính sinh học oligochitin - Phương pháp đánh giá hoạt tính chống oxy... oligochitin và ứng dụng của chúng rất phổ biến và được quan tâm Tuy nhiên việc nghiên cứu sản xuất oligochitin còn là một vấn đề khá mới mẻ, mới bắt đầu được quan tâm và đi vào nghiên cứu Ở nước ta, trường Đại học Nha Trang bắt đầu nghiên cứu tách chiết chitin từ năm 1978 với quy trình của cô Đỗ Minh Phụng nhưng chưa có ứng dụng trong sản xuất cụ thể Gần đây với yêu cầu bức bách trong xử lí phế phẩm từ. .. Trang là nơi sản xuất chitin có chất lượng cao Ở miền Bắc, Viện Khoa học Việt Nam đã kết hợp với xí nghiệp Thủy sản Hà Nội sản xuất chitin và ứng dụng của nó Ở miền Nam, trung tâm Công nghệ Sinh học và Sinh học Thủy sản phối hợp với một số cơ quan khác như: Đại học Y dược Hồ Chí Minh, Phân viện Khoa học Việt Nam, viện Khoa học Nông nghiệp Việt Nam… đang nghiên cứu sản xuất và ứng dụng chitin trong các lĩnh... polymer Nhiều công trình nghiên cứu đã chứng minh rằng polymer có cấu tạo từ các vòng glucozit như chitin thường xảy ra phản ứng cắt mạch tạo oligomer khối lượng phân tử thấp khi được chiếu xạ, 21 trong khi đó các dẫn xuất của chúng thường xảy ra phản ứng khâu mạch tạo các sản phẩm có cấu trúc không gian ba chiều  Một số nghiên cứu về phương pháp chiếu xạ Nghiên cứu chiếu xạ chitosan tạo thành chitosan ... phân tử lượng thấp (oligochitin) từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme đánh giá hoạt tính sinh học phân đoạn oligochitin thu được Nội dung đề tài: Xây dựng quy trình tách chiết phân đoạn oligochitin. .. oligochitin từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme Xác định hiệu suất thu hồi phân đoạn oligochitin từ chitin chiếu xạ, chiếu xạ kết hợp enzyme Đánh giá hoạt tính chống oxy hóa phân đoạn oligochitin. .. xuất phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) 41 3.5 Kết đánh giá hoạt tính chống oxi hóa phân đoạn chitin phân tử lượng thấp (oligochitin) thu theo phương pháp chiếu xạ phương