VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGUYỄN THỊ TÂM THƯ NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG QUẦN XÃ VI KHUẨN KỴ KHÍ TRONG CÁC LÔ XỬ LÝ CHẤT DIỆT CỎ/DIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN HỦY SINH HỌC LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI, 2013 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Tâm Thư NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG QUẦN XÃ VI KHUẨN KỴ KHÍ TRONG CÁC LÔ XỬ LÝ CHẤT DIỆT DIỆT CỎ/DIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP PHÂN HỦY SINH HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật Mã số: 62 42 01 07 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: 1. PGS.TS. Đặng Thị Cẩm Hà Viện Công nghệ sinh học 2. TS. Đinh Thị Thu Hằng Viện Công nghệ sinh học Hà Nội, 2013 i LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS. TS. Ðặng Thị Cẩm Hà và TS. Đinh Thị Thu Hằng, Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những ngƣời thầy đã tận tình hƣớng dẫn, tạo mọi điều kiện về cơ sở vật chất giúp tôi thực hiện và hoàn thành đề tài luận án nhạy cảm và thuộc loại khó này. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học đã tạo mọi điều kiện cho tôi đƣợc học tập, nghiên cứu và hoàn thành luận án tại Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trƣờng, Phòng thí nghiệm trọng điểm, Phòng Kỹ thuật di truyền. Tôi xin đƣợc gửi lời cảm ơn chân thành nhất tới Đại tá Phan Nguyễn Khánh, Đại tá Tô Văn Thiệp – Thủ trƣởng Viện Công nghệ mới, Viện Khoa học và Công nghệ quân sự đã cho phép và tạo điều kiện cho tôi đƣợc thực hiện nguyện vọng của mình và hoàn thành luận án đúng thời hạn. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Đào Thị Ngọc Ánh, CN Lê Việt Hƣng, NCS. Phùng Khắc Huy Chú và các đồng nghiệp khác tại phòng Công nghệ Sinh học tái tạo môi trƣờng đã giúp đỡ và chia sẻ, bàn luận kết quả thu đƣợc với tôi trong suốt quá trình thực hiện luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn ThS. Bùi Thị Hải Hà - Chuyên viên phụ trách đào tạo, Viện Công nghệ sinh học, đã hƣớng dẫn tôi tận tình để hoàn thành mọi thủ tục trong quá trình làm nghiên cứu sinh. Tôi xin chân thành cảm ơn các đồng chí, cán bộ Phòng Công nghệ Sinh học, Phòng Công nghệ Hóa sinh và các cán bộ Viện Công nghệ mới đã luôn động viên, khích lệ, giúp đỡ tôi hoàn thành nhiệm vụ trong thời gian tôi không có mặt ở đơn vị. Tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc đến chồng tôi cùng hai bên gia đình đã động viên, chia sẻ trách nhiệm chăm lo gia đình, con cái để tôi có thêm thời gian thực hiện tốt nghiên cứu này. Hà Nội, ngày tháng năm 2013 Nguyễn Thị Tâm Thƣ ii LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan: Đây là công trình nghiên cứu của tôi và một số kết quả cùng cộng tác với các cộng sự khác. Các số liệu và kết quả trình bày trong luận án là trung thực, một phần đã đƣợc công bố trên các tạp chí khoa học chuyên ngành với sự cho phép và đồng ý của các đồng tác giả. Phần còn lại chƣa đƣợc ai công bố trong bất kỳ công trình nào khác. Hà Nội ngày tháng năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị Tâm Thư iii MỤC LỤC Trang Trang phụ bìa Lời cảm ơn i Lời cam đoan ii Mục lục iii Danh mục các thuật ngữ và ký hiệu viết tắt viii Danh mục các bảng x Danh mục các hình vẽ, đồ thị xi MỞ ĐẦU 1 CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 5 1.1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo 5 1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo 5 1.1.2. Ảnh hƣởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con ngƣời và môi trƣờng 7 1.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo 8 1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới 8 1.2.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam 9 1.3. 1.2.2.1. Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung 9 1.2.2.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa 10 1.2.2.3. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng 11 1.2.2.4. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát 11 Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo 12 1.3.1. Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo 12 1.3.2. Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin 17 1.3.2.1. Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy 17 1.3.2.2. Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin 18 1.3.3. Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin 20 1.3.3.1. Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy 20 1.3.3.2. Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin 21 iv Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo 21 1.4.1. Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo 21 1.4.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate 25 1.4.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides 28 1.4.4. Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas 30 1.4. 1.5. Đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo 32 1.6. Các phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật 36 1.6.1. Phƣơng pháp vi sinh vật 36 1.6.2. Phƣơng pháp hóa sinh 37 1.6.3. Phƣơng pháp sinh học phân tử 37 1.6.4. Phƣơng pháp Metagenomics 38 1.7. Các phƣơng pháp làm sạch nguồn ô nhiễm dioxin và các hợp chất tƣơng tự 42 bằng phân hủy sinh học 1.8. Nghiên cứu về phân hủy sinh học chất diệt cỏ chứa dioxin ở Việt Nam 45 1.8.1. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng 46 1.8.2. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Biên Hòa 48 1.8.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa và loại khử clo ở Việt Nam 49 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52 2.1. Vật liệu 52 2.1.1. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng 52 2.1.2. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Biên Hòa 52 2.1.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng 53 2.1.4. Các hóa chất và thiết bị máy móc 54 2.1.5. Thành phần các môi trƣờng nuôi cấy và dung dịch đã sử dụng 55 2.1.5.1. Thành phần môi trƣờng nuôi cấy 55 2.1.5.2. Các dung dịch đã sử dụng 56 2.2. Phƣơng pháp 56 2.2.1. Chiết các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin từ đất 56 2.2.2. Tách DNA tổng số 57 v 2.2.3. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý 57 2.2.3.1. Nested-PCR 57 2.2.3.2. DGGE 58 2.2.4. Xác định trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại 59 2.2.5. Đánh giá sự biến động các vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý chất diệt 59 cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa 2.2.6. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí 59 2.2.6.1. Làm giàu vi khuẩn khử sulfate 59 2.2.6.2. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo 60 2.2.7. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số yếu tố môi trƣờng lên sự sinh trƣởng 61 của quần xã vi khuẩn khử sulfate 2.2.8. Làm sạch vi khuẩn khử sulfate 61 2.2.9. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn 62 2.2.10. Tách dòng đoạn gene mã hóa 16S rRNA 62 2.2.11.Đánh giá khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo (đa) vòng thơm 62 2.2.11.1. Đánh giá khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ 62 2.2.11.2.Đánh giá khả năng phân hủy các đồng phân dioxin trong mẫu làm giàu 63 2.2.11.3. Xác định 2,4-DCP và 2,4,5-T 64 2.2.12.Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí và gene chức năng trong mẫu làm giàu 65 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 67 3.1. Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 68 3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý 68 3.1.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý 69 3.1.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides trong các lô xử lý 72 3.2. Sự đa dạng vi khuẩn và các gene chức năng trong mẫu làm giàu 3.2.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt 74 74 cỏ/dioxin 3.2.2. Sự đa dạng vi khuẩn trong mẫu làm giàu 3.3. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý tại Biên Hòa 75 80 vi 3.3.1. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý 80 3.3.2. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn kỵ khí sử dụng chất diệt cỏ/dioxin tại lô xử lý 81 3.4. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào 81 3.4.1. Sự có mặt của các gene reductive dehalogenase (rdhA) trong các lô xử lý 81 và trong mẫu làm giàu 3.4.2. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế 82 bào phát hiện bằng Metagenomics 3.4.3. So sánh trình tự một số gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia vào 84 quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm 3.5. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate 87 3.5.1. Làm giàu quần xã vi khuẩn khử sulfate 87 3.5.2. Ảnh hƣởng của các yếu tố môi trƣờng đến sinh trƣởng của quần xã vi 87 khuẩn khử sulfate 3.5.2.1. Ảnh hƣởng của nhiệt độ 88 3.5.2.2. Ảnh hƣởng của pH 88 3.5.2.3. Ảnh hƣởng của nồng độ NaCl 89 3.5.2.4. Ảnh hƣởng của nguồn carbon 90 3.5.2.5. Ảnh hƣởng của nồng độ dịch chiết đất 91 3.5.2.6. Ảnh hƣởng của một số hợp chất chứa clo hữu cơ 91 3.5.3. Phân lập, phân loại vi khuẩn khử sulfate 92 3.5.3.1. Quan sát hình thái tế bào 93 3.5.3.2. Trình tự đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu cho vi khuẩn khử sulfate 93 3.6. Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu 94 3.6.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí loại khử clo trên nguồn DCĐ, 2,4,5-T, 2,4-DCP 95 3.6.2. Hình thái một số tế bào vi khuẩn trong mẫu làm giàu trên các chất ô nhiễm 96 3.6.3. Nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của vi khuẩn Dehalococcoides 97 3.6.4. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu 97 3.7. Khả năng phân hủy hay chuyển hóa các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin 3.7.1. Khả năng phân hủy và chuyển hóa PCDD/Fs trong mẫu làm giàu 99 99 vii 3.7.2. Khả năng phân hủy và chuyển hóa 2,4-DCP, 2,4,5-T 102 3.7.2.1. Khả năng chuyển hóa 2,4,5-T 102 3.7.2.2. Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP 103 3.7.3. Khả năng phân hủy các hợp chất chứa clo của vi khuẩn khử sulfate 104 BDN10T đã đƣợc làm sạch CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN 106 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 127 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 129 TÀI LIỆU THAM KHẢO 131 SUMMARY 147 viii Danh mục các thuật ngữ và ký hiệu viết tắt 2,4,5-T 2,4-D 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid 2,4-dichlorophenoxyacetic acid Bộ TN-MT CDBF Bộ Tài nguyên và môi trƣờng Chlorodibenzo-p-furan CP Đ/C Chlorophenol Đối chứng DBF Dibenzo-p-furan DCB DCĐ Dichlorobenzene DCDD DCP DD DDD DDT DGGE EPA HCB HPLC MCDD MT PAH PCB PCDD PCDD/Fs PCDF PCE PeCDD RdhA rdhA TCB TCDD Dịch chiết đất Dichlorodibenzo-p-dioxin Dichlorophenol Dibenzo-p-dioxin 1-chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene 1,1,1-trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane Denaturing Gradient Gel Electrophoresis Environmental Protection Agency Hexachlorobenzene High Performance Liquid Chromatography Monochlorodibenzo-p-dioxin Môi trƣờng Polyaromatic hydrocarbon Polychlorobiphenyl Polychlorodibenzo-p-dioxin Polychlorodibenzo-p-dioxin/furan Polychlorodibenzo-p-furan Tetrachloroethene Pentachlorodibenzo-p-dioxin Reductive dehalogenase Reductive dehalogenase gene Tetrachlorobenzene Tetrachlorodibenzo-p-dioxin ix TCDF TCE Tetrachloro dibenzo-p-furan Trichloroethene TCP Trichlorophenol TeCB TEQ Tetrachlorobenzene Total toxic equivalent quantity TrCB Trichlorobenzene TrCDD Trichlorodibenzo-p-dioxin VK VK KK VK KSF Vi khuẩn Vi khuẩn kỵ khí Vi khuẩn khử sulfate VSV WHO Vi sinh vật World Health Organization x DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên Bảng Trang 2.1 Tổng hợp các nghiên cứu đã thực hiện trong luận án 53 2.2 Trình tự các đoạn mồi đã sử dụng trong nghiên cứu 53 2.3 Công thức pha gel DGGE ở các nồng độ biến tính khác nhau 58 2.4 Tổng hợp các phƣơng pháp đã sử dụng trong nghiên cứu 66 3.1 Sự có mặt của một số VK hô hấp loại khử clo trong các mẫu nghiên cứu 68 3.2 Mối quan hệ giữa một số dòng VK KSF tại các lô xử lý và một số VK 71 gần gũi 3.3 Sự tƣơng đồng của các dòng VK loại khử clo trong các lô xử lý với 6 73 chủng VK Dehalococcoides 3.4 Metagenome của VK đƣợc phân tích bởi máy Roche 454 GS Junior bằng 75 Newbler 3.5 Dữ liệu metagenome trong mẫu làm giàu đƣợc bằng phân tích MG-RAST 75 3.6 Tỷ lệ các VSV có mặt trong mẫu làm giàu 77 3.7 Các VK trong metagenome của mẫu làm giàu theo khả năng loại khử clo 78 3.8 Phân loại VK có mặt trong mẫu làm giàu theo khả năng hô hấp 79 3.9 Các enzyme đƣợc mã hóa bởi các gene tham gia vào các quá trình phân hủy 83 và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm 3.10 Sự biến đổi thành phần các chất ô nhiễm giữa mẫu đối chứng (Đ/C) và 100 mẫu làm giàu 3.11 Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP bởi tập đoàn VK KK trong các mẫu làm 104 giàu từ Đà Nẵng 3.12 Sự biến đổi thành phần hóa học trong mẫu nuôi cấy chủng BDN10T 105 so với mẫu không có VSV (ĐC) xi DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ, ĐỒ THỊ Hình Tên Hình Trang 1.1 Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình 6 1.2 Quá trình loại clo sản phẩm cắt vòng của lindane và pentachlorophenol ở 13 điều kiện hiếu khí 1.3 Con đƣờng phân hủy 2,4-DCP bởi nấm Phanerochaete chrysosporium 14 1.4 Các con đƣờng loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD ở 14 chủng D. mccartyi CBDB1 1.5 Sơ đồ khoáng hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm với hợp chất trung 15 gian là chlorocatechol 1.6 Con đƣờng phân hủy hoàn toàn PCDD/Fs bởi các quần xã VK trong quá 16 trình phân hủy sinh học 1.7 Cây phát sinh chủng loại của các vi khuẩn loại khử clo dựa trên trình tự 24 đoạn gene 16S rRNA 1.8 Quá trình chuyển hóa PCE tạo ra ethene ở một số VK khác nhau 29 1.9 Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự axit amin của các enzyme RdhA 34 2.1 Sơ đồ các nghiên cứu thực hiện trong luận án 54 3.1 Điện di đồ DGGE với cặp mồi DCC305f/DSV838r đặc hiệu cho VK KSF 70 từ các mẫu ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa 3.2 Cây phát sinh chủng loại của vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý 72 3.3 Điện di đồ DGGE phân tích sự đa dạng VK Dehalococcoides ở các lô xử lý 73 3.4 Cây phát sinh chủng loại của Dehalococcoides trong các lô xử lý 73 3.5 VK KK hô hấp loại khử clo từ đất ở 16 vị trí trong lô chôn lấp tích cực tại 75 Biên Hòa sau 36 tháng xử lý đƣợc làm giàu trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin rất nặng 3.6 Đa dạng VSV trong mẫu làm giàu VK KK trên đất ô nhiễm 76 3.7 Sự biến động số lƣợng VK KSF và VK KK nói chung sử dụng chất diệt 80 cỏ/dioxin từ lô xử lý tại Biên Hòa 3.8 Phân bố và tỷ lệ các gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào 82 3.9 Mối quan hệ của 2 gene haloacid dehalogenase với các gene của 85 xii Hình Tên Hình Trang Pseudomonas 3.10 Mối quan hệ giữa một số enzyme tham gia vào quá trình phân hủy hợp chất 86 vòng thơm do các gene chức năng có mặt trong mẫu làm giàu mã hóa 3.11 Sinh trƣởng của hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa ở các 88 nhiệt độ khác nhau 3.12 Sinh trƣởng của hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa ở các pH 89 khác nhau 3.13 Sinh trƣởng của quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa với các nồng 89 độ NaCl khác nhau 3.14 Sinh trƣởng của quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa trên các 90 nguồn carbon khác nhau 3.15 Ảnh hƣởng của nồng độ DCĐ đến sinh trƣởng của quần xã VK KSF ở Đà 91 Nẵng và Biên Hòa 3.16 Ảnh hƣởng của một số hợp chất hữu cơ chứa clo đến sinh trƣởng của 92 quần xã VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa 3.17 Hình thái tế bào chủng VK KSF BDN10T phân lập từ Đà Nẵng 93 3.18 Mối quan hệ gần gũi của các VK KSF với chủng BDN10T 94 3.19 VK KK hô hấp loại khử clo đƣợc làm giàu trên môi trƣờng chứa 2,4- 95 DCP, 2,4,5-T từ các mẫu đất ở Đà Nẵng và Biên Hòa 3.20 Các tế bào VK có mặt trong mẫu P1 làm giàu trên MT chứa 2,4-DCP và 96 P5 làm giàu trên MT chứa 2,4,5-T 3.21 Điện di đồ nhân đoạn gene 16S rRNA của VK Dehalococcoides từ mẫu 97 làm giàu VK hô hấp loại khử clo ở Đà Nẵng 3.22 Cây phát sinh chủng loại của hai dòng VK Dehalococcoides có mặt trong 98 mẫu làm giàu P5T 3.23 Hiệu suất phân hủy, chuyển hóa 2,3,7,8-TCDD, OCDD và 15 đồng phân 99 PCDD/Fs còn lại bởi tập đoàn VK KK ở Biên Hòa 3.24 Phổ sắc ký khả năng chuyển hóa 2,4,5-T ở các mẫu Đà Nẵng và Biên Hòa 103 1 MỞ ĐẦU Chất diệt cỏ chứa dioxin (chất diệt cỏ/dioxin) là một trong số các chất hữu cơ chứa clo độc hại không chỉ với môi trường, con người mà còn khó bị phân hủy bởi vi sinh vật (VSV). Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường. Các nghiên cứu về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4 con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV. Trong số đó có 3 con đường xảy ra với sự có mặt của oxy bao gồm oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo ở sản phẩm cắt vòng và phân hủy nhờ cơ chế xúc tác bởi enzyme ngoại bào hay các chất tương tự trao đổi chất hoạt động như enzyme. Quá trình thứ tư là loại khử clo xảy ra ở điều kiện không có oxy hay thiếu oxy được gọi chung là hô hấp loại khử clo. Công nghệ phân hủy sinh học đã được áp dụng thành công với quy mô 0,5 m3 đến 100 m3 tại Đà Nẵng và quy mô 3.384 m3 tại Biên Hòa. Hiệu quả xử lý tại Đà Nẵng đạt 50 – 70% sau gần 2 năm xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005) và tại Biên Hòa đạt hơn 99% sau 27 tháng xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả xử lý nêu trên có rất nhiều yếu tố liên quan trong đó có vai trò của VSV, các điều kiện mini sinh thái của mỗi lô xử lý, các nhóm VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy và khoáng hóa các hợp chất là thành phần chất diệt cỏ/dioxin. Đặc biệt, sự đa dạng và mức độ hoạt động của quần xã vi khuẩn kỵ khí (VK KK) hô hấp loại khử clo tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy sinh học các chất độc như thế nào vẫn đang là những câu hỏi cần được giải đáp bằng các nghiên cứu cơ bản với sự hỗ trợ của các kỹ thuật hiện hành. Hiện nay, các nghiên cứu về VK hô hấp loại khử clo trên thế giới đã công bố có 20 chi và thuộc về 3 ngành là Proteobacteria, Chloroflexi và Firmicute. Trong các lô xử lý ở Đà Nẵng, sự có mặt VK Dehalococcoides thuộc ngành Chloroflexi đã được xác định bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Một số VK KSF thuộc ngành Proteobacteria cũng đã được phát hiện tại khu vực này. Đặc biệt, 2 nhóm VK hô hấp loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất mà đại diện là Pseudomonas đã được phát hiện ở hầu hết các nghiên cứu ở Việt Nam (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Chúng không chỉ có mặt trong các mẫu nguyên thủy mà còn luôn được tìm thấy ở hầu hết các mẫu của quá trình xử lý ở các quy mô khác nhau trong điều kiện thiếu khí. Tuy nhiên, chưa có nghiên cứu sâu nào về nhóm VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo một cách có hệ thống. Đặc biệt, việc làm giàu các VK KK hô hấp loại khử clo bắt buộc bắt đầu được nghiên cứu nhưng chưa thành công. Để tìm hiểu sự có mặt và vai trò của nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề tài: “Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học”. Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây: Mục đích nghiên cứu  Đánh giá sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử.  Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa.  Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã VK KK hô hấp loại khử clo. Nội dung nghiên cứu  Xác định sự có mặt của một số nhóm VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý bằng phương pháp nested-PCR.  Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE.  Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử lý 3.384 m3 tại Biên Hòa. 3  Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại diện được làm giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam.  Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF.  Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu từ đất của 16 vị trí ở lô xử lý khử độc tại Biên Hòa sau 36 tháng. Phƣơng pháp nghiên cứu 1. Phương pháp sinh học phân tử: nested-PCR, DGGE, Metagenomics được sử dụng để đánh giá sự đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm giàu. 2. Phương pháp nuôi cấy truyền thống: nuôi cấy, làm giàu VK KK trong phòng thí nghiệm và đánh giá ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của các VK này. 3. Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa. NHỮNG ĐÓNG GÓP MỚI CỦA LUẬN ÁN 1. Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam làm giàu được quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ đất chôn lấp tích cực liên quan đến xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Các VK KK có mặt trong mẫu làm giàu bao gồm cả ba nhóm loại khử clo là hô hấp loại khử clo bắt buộc (Dehalococcoides, Dehalogenimonas); hô hấp loại khử clo không bắt buộc (Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfococcus, Anaeromyxobacter v.v.); hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất (Pseudomonas, Clostridium, Shewanella v.v.) trong đó Pseudomonas chiếm ưu thế hơn cả. 4 2. Đã đánh giá được khả năng phân hủy và chuyển hóa 55,7% tổng độ độc trên đất ô nhiễm nặng (41.265 ng TEQ/kg đất khô) bởi quần xã VK KK. Đánh giá được hiệu suất phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin (17 đồng phân PCDD/PCDF, 2,4,5-T) và sản phẩm phân hủy sinh học của 2,4,5-T, 2,4-D là 2,4,5-TCP, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK cũng như khả năng phân hủy 2,4,5TCP, 2,4-DCP bởi chủng VK KSF đã làm sạch. 3. Lần đầu tiên ở Việt Nam sử dụng công cụ Metagenomics để đánh giá sự đa dạng quần xã VK KK và các gene chức năng tham gia phân hủy, chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu một năm từ đất sau 36 tháng xử lý ở Biên Hòa trên đất ô nhiễm ở mục (2). 5 TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 1.1. Đặc điểm của các hợp chất hữu cơ chứa clo 1.1.1. Một số đặc điểm chung của các hợp chất hữu cơ chứa clo Các hợp chất hữu cơ chứa clo được sử dụng rộng rãi trong công nghiệp như quá trình sản xuất thuốc trừ sâu, trừ nấm, chất diệt cỏ, các quá trình tẩy rửa, luyện kim loại, sản xuất bột giấy, dùng làm dung môi v.v., trong nông nghiệp và cả trong chiến tranh xâm lược. Các hợp chất hữu cơ chứa clo cũng được sinh ra do sự đốt cháy không hoàn toàn (đốt cháy các chất thải rắn), các hoạt động tự nhiên (cháy rừng, hoạt động kiến tạo vỏ trái đất như động đất, núi lửa) (Schecter, 2006). Thời gian bán hủy của các chất hữu cơ chứa clo trong môi trường thường kéo dài hàng tuần đến hàng năm, thậm chí hàng chục năm như chất diệt cỏ chứa dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa. Đặc biệt, dioxin là một trong số các hợp chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo có thể tồn tại hàng trăm năm hay lâu hơn trong môi trường và không bị phân hủy dưới tác dụng của axit mạnh, kiềm mạnh, các chất có tính oxy hóa. Căn cứ vào đặc điểm cấu tạo của các hợp chất hữu cơ chứa clo, các nhà khoa học phân loại chúng thành 3 nhóm chính là chất hữu cơ chứa clo mạch thẳng, vòng thơm và đa vòng thơm (Hình 1.1) (Tas, 2009). (i) Các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường được sử dụng làm dung môi hữu cơ như tetrachloroethene (PCE), trichloroethene (TCE), chloroform và chúng được thải ra môi trường nhiều nhất (Hiraishi, 2003; Cheng, 2009). (ii) Các chất hữu cơ vòng thơm chứa clo như hexachlorobenzene, chlorobenzene, chlorophenol (CP) v.v. Nhóm chất này được sử dụng làm chất bảo quản gỗ, sản xuất thuốc nhuộm, chất diệt cỏ, diệt nấm (Tas, 2009). (iii) Các chất hữu cơ đa vòng thơm chứa clo bao gồm các hợp chất có cấu trúc 2-3 vòng thơm và chứa từ 2 đến 8 nguyên tử clo trong phân tử. Đây là các chất có độ độc cao tùy thuộc vào số lượng và vị trí các nguyên tử clo trong phân tử. Các chất này được gọi chung là dioxin. Căn cứ vào số nguyên tử clo và vị trí không gian 6 của những nguyên tử này, dioxin có 75 đồng phân polychlorodibenzo-p-dioxin (PCDD) và 135 đồng phân polychlorodibenzofuran (PCDF) với độc tính khác nhau. Thành phần của chất diệt cỏ mà quân đội Mỹ đã sử dụng trong chiến tranh ở Việt Nam chứa chủ yếu là các hợp chất 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D), 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T) (Hình 1.1) và nhiều hợp chất vòng thơm khác. cis-1,3dichloropropene Tetrachloroethene (PCE) 2,4,5-T 2,4-D PCDD Trichloroethene (TCE) 2,4-dichlorophenol (2,4-DCP) -hexachlorocyclohexane (HCH) 1,2,4,5tetrachlorobenzen PCDF 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-pdioxin (2,3,7,8-TCDD) Hình 1.1. Một số hợp chất hữu cơ chứa clo điển hình 2,4-D, 2,4,5-T thuộc họ chất diệt cỏ phenoxy có tác dụng làm rụng lá, tồn tại ở dạng axit, muối (chủ yếu là amin), ester. Ở nồng độ thấp, 2,4-D kích thích quá trình tổng hợp RNA, DNA và protein, trong khi đó ở nồng độ cao, 2,4-D có thể ức chế sự phân chia và sinh trưởng của tế bào thực vật. 2,4,5-T được tổng hợp từ 2,4,5trichlorophenol (2,4,5-TCP). 2,4,5-T được sử dụng làm tác nhân gây rụng lá trong nông nghiệp và lâm nghiệp. 2,3,7,8-tetrachlorodibenzo-p-dioxin (2,3,7,8-TCDD) là sản phẩm phụ của quá trình sản xuất chất diệt cỏ 2,4,5-T. Đây là chất có độ độc cao nhất với tổng độ độc tương đương là 1 (Schecter, 2006). Dioxin còn bao gồm nhóm các polychlorinated biphenyl (PCB) là các chất tương tự dioxin, bao gồm 419 đồng phân trong đó có 29 chất đặc biệt nguy hiểm (Schecter, 2006; Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). PCB được sản 7 xuất rất nhiều trong những năm 1930-1970 ở phía Bắc Bán cầu và được sử dụng trong máy biến áp, chất lỏng thủy lực, chất dẻo và trong một số ngành công nghiệp khác (Angelo, 2010). Nhìn chung, các hợp chất hữu cơ chứa clo thường kỵ nước (do hệ số octan – nước cao) nên chúng bị lắng đọng trong bùn và trầm tích. Đây là các hợp chất độc, tồn tại lâu dài trong môi trường, tích lũy trong các chuỗi thức ăn và gây bệnh cho người và động vật (Smidt, 2000; Schecter, 2006; Tas, 2009; Wagner, 2009). 1.1.2. Ảnh hưởng của các hợp chất hữu cơ chứa clo tới con người và môi trường Các hợp chất hữu cơ chứa clo đều là các chất có độ độc cao không những đối với người, động thực vật mà còn với cả VSV. Hầu hết các chất hữu cơ chứa clo có thể gây ung thư cho người. Tuy nhiên, các chất hữu cơ mạch thẳng chứa clo thường ít độc hơn và thời gian bán hủy ngắn hơn so với các hợp chất vòng thơm chứa clo. Các hợp chất PCDD, PCDF và PCB là những chất hữu cơ bền vững, độc hại và khó phân hủy (POP) trong môi trường tự nhiên. Hai đồng phân của dioxin có độ độc cao nhất là 2,3,7,8-TCDD và 1,2,3,7,8-pentachlorodibenzo-p-dioxin (PeCDD) với tổng độ độc tương đương là 1. Các chất có độ độc thấp hơn như hexachlorodibenzo-pdioxin (HxCDD), tetrachlorodibenzo-p-furan (TCDF), PCB. Các chất có độ độc thấp nhất là octachlorodibenzo-p-dioxin (OCDD), octachlorodibenzo-p-furan (OCDF), trichlorobenzene (TrCB) với tổng độ độc tương đương là 0,0001. Ở Việt Nam, độ tồn lưu của các chất là thành phần của chất diệt cỏ tại các căn cứ quân sự cũ của Mỹ vẫn ở mức cao. Trong đó, 2,3,7,8-TCDD có thể chiếm tới 99% tổng độ độc ở tại hai sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa (Hatfield, 2011). EPA đã công nhận dioxin là một chất gây ung thư nhóm 1 cho con người. Không có một liều lượng nào là an toàn hoặc ngưỡng dioxin mà dưới nó thì không gây ung thư (Van den Berg, 2006). Ở hàm lượng cao, dioxin có thể gây chết người. Khi ở nồng độ thấp, dioxin gây ra các đột biến và di truyền qua nhiều thế hệ khác nhau. Dioxin còn có thể liên quan đến một số bệnh nguy hiểm khác như bệnh rám da, bệnh đái tháo đường, bệnh ung thư trực tràng không Hodgkin, thiểu năng sinh dục cho cả nam và nữ, sinh con quái thai hoặc thiểu năng trí tuệ, đẻ trứng (ở nữ) 8 v.v. Theo WHO 2002, mức phơi nhiễm dioxin cho phép qua thức ăn của mỗi người là 1-10 pg đương lượng độc (TEQ/ngày) (Van den Berg, 2006). Theo Angelo và đtg, PCB có thể ảnh hưởng đến gan, đường ruột, máu, hệ nội tiết, miễn dịch, hệ thần kinh và hệ sinh sản (Angelo, 2010). Theo Bộ Tài nguyên và Môi trường (TN-MT), ngưỡng dioxin cho phép trong vùng đất và trầm tích bị ô nhiễm nặng dioxin tương ứng là 1.000 và 150 ng TEQ/kg đất. Cao hơn mức độ này, khu vực đó cần được khoanh vùng, xử lý và hạn chế hay ngừng hoàn toàn việc tiếp xúc của người, động vật cũng như các hoạt động canh tác nông nghiệp, thủy sản (QCVN2012/BTNMT). Tóm lại, các hợp chất hữu cơ chứa clo mà đặc biệt là các hợp chất đa vòng thơm có thể gây các bệnh về da, nội tiết, thần kinh, tim mạch, tiêu hóa cho con người. Chúng có thể di truyền cho nhiều thế hệ sau qua sinh sản, thậm chí gây tử vong và là nguyên nhân gây một số bệnh ung thư. Trong môi trường, chúng tồn tại bền vững qua nhiều năm, gây ô nhiễm đất, nước ngầm, trầm tích, được tích lũy qua các mắt xích của chuỗi thức ăn vào các động thực vật khác và cuối cùng là vào con người. 1.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo 1.2.1. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trên thế giới Trên thế giới đã có nhiều biện pháp để kiểm soát tốc độ thải ra môi trường của các chất hữu cơ chứa clo nhưng các chất độc này vẫn được thải ra môi trường rất nhiều, gây ô nhiễm đất và bùn trầm trọng (Fennell, 2004). Tính đến năm 2003, trong môi trường có khoảng 3.500 chất hữu cơ chứa clo có nguồn gốc tự nhiên và từ các hoạt động sống của con người (Smidt, 2004). Theo EPA, chỉ tính riêng năm 2001 đã có 150 kg dioxin và các hợp chất tương tự dioxin, 1,13 triệu kg PCB và 16.000 kg hexachlorobenzene (HCB) giải phóng vào môi trường do các hoạt động công nghiệp (EPA, 2006). Tổng số PCB thải vào môi trường trên toàn thế giới tính đến năm 2003 là 900-1800 triệu kg (Fennell, 2004). Theo Wagner và đtg (Wagner, 2009), tổng số PCDD/Fs trong khí quyển trên toàn thế giới hàng năm vào khoảng 13.000 kg/yard. Lượng các chất PCB và PCDD gây ô nhiễm các thủy vực ở Mỹ khoảng 1,2 tỷ m3 (Fennell, 2004). Theo Tas và đtg (Tas, 2009), các hợp chất hữu cơ 9 chứa clo là các chất gây ô nhiễm môi trường với phạm vi rộng nhất. Từ những năm 1980, hàng nghìn tấn HCB được sử dụng làm chất diệt cỏ, diệt nấm, chất bảo quản gỗ và sản xuất thuốc nhuộm. Do HCB có độ độc rất cao nên nó đã bị cấm sử dụng trên toàn thế giới. Tuy nhiên, HCB vẫn bị thải vào môi trường hàng năm do các quá trình hóa học xảy ra không kiểm soát được như quá trình đốt cháy không hoàn toàn. HCB gây ô nhiễm sông, hồ, biển gần các khu vực có công nghiệp phát triển. Nồng độ HCB trong đất cao nhất là ở Châu Âu (Tas, 2009). Hàng năm, có khoảng 3,9.105 tấn PCB bị thải ra môi trường trên toàn thế giới (Angelo, 2010). Ở nhiều khu vực biển và hệ thủy vực nước ngọt thuộc Bắc Mỹ, Châu Âu và Nhật Bản chứa PCDD với nồng độ từ 36 đến 8.560 g/kg (Ewald, 2007). Tại vịnh Thurston và vịnh Napoleon cũng phát hiện được 15 đồng phân PCDD/Fs và 11 chất PCB giống dioxin với tổng độ độc cao nhất từ 44 đến 136 pg TEQ/g đất khô (Ssebugere, 2013). Ngoài ra, tại các nhà máy sản xuất và sử dụng PCE, TCE cũng bị ô nhiễm các chất này ở phạm vi và nồng độ lớn. Hai hợp chất 2,4-D và 2,4,5-T là thành phần của chất diệt cỏ cũng đã được sử dụng ở rất nhiều nước trên thế giới, đặc biệt là sử dụng trong chiến tranh Việt Nam, gây ô nhiễm đất và trầm tích trầm trọng. Ở những năm 40 - 50 của thế kỷ trước, công nghệ sản xuất chất diệt cỏ còn lạc hậu nên sản phẩm phụ của quá trình sản xuất là dioxin có hàm lượng rất cao. Ngày nay, công nghệ và khoa học hiện đại đã làm giảm đi rất nhiều tạp chất của quá trình sản xuất này. Tuy hai chất diệt cỏ trên và nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo là thành phần của thuốc bảo vệ thực vật đã bị cấm sử dụng ở nhiều nước trong đó có Việt Nam nhưng một số nước vẫn còn sử dụng trong nông nghiệp (Bộ TN-MT, 2006, Nguyen, 2007). 1.2.2. Tình hình ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo ở Việt Nam 1.2.2.1. Ô nhiễm các hợp chất hữu cơ nói chung Ở Việt Nam, tại các nhà máy sản xuất thuốc trừ sâu, thuốc bảo vệ thực vật (Nhà máy Hóa chất Lâm Thao), sản xuất giấy (Nhà máy Giấy Bãi Bằng) cũng bị ô nhiễm trầm trọng các chất hữu cơ chứa clo này. Theo các số liệu đã công bố (Bộ TN-MT, 10 2006), Việt Nam còn khối lượng dầu có chứa PCB có thể lên tới 19.000 tấn, chủ yếu từ các máy biến thế điện kiểu cũ. Tổng lượng chất thải nguy hại ước tính năm 2003 là 160.000 tấn mỗi năm, trong đó 130.000 tấn từ các chất thải công nghiệp, 21.000 tấn từ các chất thải y tế của các bệnh viện, trạm xá, viện điều dưỡng và 8.600 tấn từ sản xuất nông nghiệp. Việt Nam đã và đang sử dụng khoảng 300 loại thuốc trừ sâu, 200 loại thuốc trừ bệnh, gần 150 loại thuốc trừ cỏ, 6 loại thuốc diệt chuột và 23 loại thuốc kích thích sinh trưởng cây trồng. Các hoá chất bảo vệ thực vật này nhiều về cả số lượng và chủng loại, trong đó có một số loại thuộc danh mục cấm sử dụng, hạn chế sử dụng và hết hạn sử dụng. Các chất hữu cơ ô nhiễm khó phân huỷ sử dụng trong nông nghiệp chủ yếu là DDT và HCB hiện còn ở các địa phương chờ được xử lý, còn trong công nghiệp phần lớn là PCB. Các hợp chất này đều có tính bền vững và nguy hại đối với môi trường và con người nên đã bị cấm sử dụng (Bộ TN-MT, 2006). Trong những năm 1961-1971, quân đội Mỹ đã rải xuống miền Trung và miền Nam Việt Nam hàng trăm triệu lít chất diệt cỏ có chứa dioxin. Mặc dù chất diệt cỏ được tồn chứa và phân phối cho các vụ phun rải đã trải qua hơn 40 năm nhưng hàm lượng của chúng ở ba sân bay quân sự cũ là Biên Hòa, Đà Nẵng và Phù Cát vẫn ở mức cao và rất cao. Mức độ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ được trình bày chi tiết dưới đây. 1.2.2.2. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Biên Hòa Sân bay Biên Hòa được chia làm 3 khu vực có mức độ ô nhiễm khác nhau. * Khu vực Nam sân bay: nhiều vị trí có nồng độ dioxin lớn hơn 1.000 ppt trong đó TCDD chiếm từ 75% đến 99% tổng độ độc (Hatfield, 2011). * Khu vực phía Tây Nam đường băng: ở các hồ, ao và rãnh thoát nước đều có nồng độ dioxin trong các mẫu trầm tích lớn hơn giá trị cho phép của Việt Nam và quốc tế (1000 ppt đối với đất phi nông nghiệp) và cao nhất là 5.970 ppt. Vị trí ô nhiễm cao nhất có nồng độ dioxin là 22.300 ppt trong đó TCDD chiếm hơn 90% tổng độ độc (Hatfield, 2011). * Khu vực Z1: Kết quả phân tích cho thấy nồng độ TCDD tăng dần theo độ sâu: ở độ sâu 0-30 cm nồng độ TCDD là 36.800 ppt, độ sâu 30 – 60 cm nồng độ là 11 144.000 ppt, độ sâu 60 – 90 cm nồng độ là 259.000 ppt, độ sâu 150 – 180 cm nồng độ là 184.000 ppt. Hàm lượng TCDD chiếm tới 99% tổng độ độc trong tất cả các mẫu lấy tại khu vực này (Hatfield, 2011). Đây là khu vực có các lô xử lý bằng biện pháp phân hủy sinh học của Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. Trong lô xử lý 3.384 m3, tổng độ độc trước khi xử lý dao động khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). 1.2.2.3. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Đà Nẵng * Trong Báo cáo tổng kết của Văn phòng 33 cho thấy khu vực ô nhiễm tại đầu Bắc sân bay (khu vực pha trộn và đóng nạp) có nồng độ TCDD cao nhất xác định được là 361.000 ppt ở độ sâu từ 0 – 10 cm và tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm tới trên 99%. Ở độ sâu từ 10 – 30 cm, nồng độ TCDD là 330.000 ppt và những mẫu khác ở khu vực này nằm trong khoảng 1.190 đến 36.800 ppt (Báo cáo tổng thể, 2011). Đây là khu vực mà Viện Công nghệ sinh học đã tiến hành xử lý thử nghiệm ở quy mô 10 m3 và 100 m3 bằng biện pháp chôn lấp tích cực. Tổng độ độc ban đầu trong đất dao động khoảng 899 – 365.000 ppt TEQ, trung bình khoảng 105.080 ppt TEQ. Tổng độ độc của mẫu trầm tích tại hồ A dao động khoảng 68,6 – 6.820 ppt TEQ (Báo cáo tổng thể, 2011). * Ở khu vực phía Nam sân bay, nồng độ TCDD cao nhất phân tích được là 20.600 ppt ở độ sâu 0-10 cm nhưng tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chỉ chiếm có 65%. Ở các độ sâu lớn hơn nồng độ TCDD vẫn cao, ở độ sâu 10-30 cm nồng độ TCDD dao động trong khoảng 3.500 đến 5.120 ppt và tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8TCDD chiếm 68,4%. Ở độ sâu 30-115 cm, nồng độ TCDD giảm dần theo độ sâu từ 123 đến 4,15 ppt. * Tại khu vực đóng thùng khi thu hồi, các mẫu phân tích trên bề mặt với độ sâu từ 0-10 cm nằm trong khoảng 5,2 ppt đến 99,7 ppt và tỷ lệ đồng phân độc 2,3,7,8TCDD chiếm trên 80%. Tại khu pha trộn và đóng nạp, nồng độ chất ô nhiễm vẫn ở mức độ cao và nằm trong khoảng 64 đến 11.700 ppt. Tất cả các mẫu tại khu vực này có tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm tỷ lệ cao 94,9 - 95,7 % (Hatfield, 2009). 1.2.2.4. Ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở sân bay Phù Cát 12 Khu vực nhiễm độc và hướng lan tỏa trong sân bay Phù Cát có nồng độ ô nhiễm giảm dần theo độ sâu và được chia thành các khu sau: * Khu nhiễm độc cao: khu chứa chất độc hóa học và nạp chất độc lên phương tiện phun rải. Khu vực này có độ ô nhiễm cao nhất với nồng độ khoảng 11.400 – 49.500 ppt. * Khu rửa phương tiện (sau khi phun rải chất phát quang): khu vực này có độ ô nhiễm thấp nhất, chỉ 18 - 270 ppt. * Khu vùng đệm: vùng đệm nằm trên vùng đất từ khu chứa, nạp rửa đến cửa cống qua đường liên khu chảy vào hồ A và có nồng độ ô nhiễm 210 – 2450 ppt. 1.3. Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo Nhiều nghiên cứu về quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo đã được công bố. Trong phần này sẽ đề cập chi tiết về cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo bởi VSV, các nghiên cứu về phân hủy chất diệt cỏ, dioxin bởi các VSV hiếu khí và kỵ khí. 1.3.1. Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo Có 4 con đường phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo bởi các VSV hiếu khí và kỵ khí (Reineke, 2001; Fennell, 2004; Yoshida, 2005) như sau: (i) Oxy hóa cắt vòng thơm bởi các enzyme hydrocarbon dioxygenase vòng thơm của các VSV hiếu khí. (ii) Loại clo của các sản phẩm cắt vòng bởi các VSV hiếu khí (Hình 1.2). (iii) Phân hủy nhờ xúc tác bởi các enzyme ngoại bào như laccase, mangan peroxidase (MnP), lignin peroxidase (LiP) chủ yếu do nấm và xạ khuẩn sinh ra (Hình 1.3). (iiii) Loại khử clo bởi các VK KK (Hình 1.4). Dưới đây là các cơ chế chuyển hóa bởi một số đại diện của một số nhóm VSV khác nhau đã được chứng minh. 13 Hình 1.2. Quá trình loại clo sản phẩm cắt vòng của lindane và pentachlorophenol ở điều kiện hiếu khí (Reineke, 2001) Quá trình loại clo ở VSV hiếu khí đối với các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa nhiều clo xảy ra theo hai cơ chế là cơ chế loại clo sớm và cơ chế loại clo muộn. Ở cơ chế loại clo sớm, các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa nhiều clo được tạo thành các hợp chất vòng thơm không chứa hoặc chứa rất ít clo, sau đó các hợp chất này bị phân hủy theo con đường ortho hay meta và cuối cùng đi vào chu trình Krebs. Cơ chế loại clo muộn sẽ tạo ra các hợp chất đã bị cắt vòng vẫn chứa clo như chlorocatechol, chloroprotocatechuate hay chlorohydroquinone. Sau đó, các hợp chất này bị phân hủy theo con đường ortho biến đổi (Reineke, 2001) (Hình1.5). Khác với vi khuẩn, nấm không sử dụng các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa clo làm nguồn carbon và năng lượng mà quá trình phân hủy các hợp chất này xảy ra nhờ một hệ thống enzyme ngoại bào được tiết ra môi trường bao gồm phenol oxidase, LiP, MnP và laccase ở các nấm phân hủy gỗ. Các enzyme này có phổ đặc hiệu cơ chất rộng, chúng có thể xúc tác quá trình phân hủy các hợp chất như chloroaniline, chlorobenzene, chlorophenol, chlorobiphenyl hay dibenzo-p-dioxin. Các chủng nấm có khả năng sinh enzyme ngoại bào phân hủy các hợp chất này bao gồm chi Phenarochaete, Pleurotus, Trametes, Sphingomonas, Cordyceps, Pennicilium. v.v. (Reineke, 2001, Cvančarová, 2013). 14 Hình 1.3. Con đường phân hủy 2,4-DCP bởi nấm Phanerochaete chrysosporium (Reineke, 2001). LiP/MnP: sự tham gia của 1 hay cả 2 enzyme LiP và MnP Hình 1.4. Các con đường loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD (A) và 1,2,3,7,8-PeCDD (B) ở chủng D.mccartyi CBDB1 (Hiraishi, 2003) Ở điều kiện kỵ khí, quá trình loại khử clo là quá trình phân hủy hay chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo xảy ra nhờ các enzyme nội bào trong điều kiện thiếu oxy và hoàn toàn không có oxy. Quá trình này xảy ra với các chất chứa nhiều 15 clo nhanh hơn các hợp chất chứa ít clo và có tính chọn lọc với các hợp chất, chi và loài vi khuẩn. Vị trí các nguyên tử clo trong phân tử cũng ảnh hưởng đến quá trình loại khử clo. Ví dụ, quá trình loại khử clo của monochlorobenzoate sẽ ưu tiên ở vị trí meta-, rồi đến vị trí para- và cuối cùng là vị trí ortho- nhưng quá trình loại khử clo của các hợp chất chứa nhiều clo lại ưu tiên ở vị trí para- hay nguyên tử clo nằm giữa hai nguyên tử clo khác trong phân tử (Reineke, 2001). Các VK KK tham gia vào quá trình loại khử clo cũng khá đa dạng, bao gồm nhóm VK KSF (Desulfovibrio, Desulfitobacterium, Desulfomonile) và một số VK khác (Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalogenimonas). Quá trình loại khử clo của một số hợp chất đa vòng thơm ở D. mccartyi CBDB1 được trình bày ở Hình 1.4. Hình 1.5. Sơ đồ khoáng hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm với hợp chất trung gian là chlorocatechol (Reineke, 2001) 16 Các cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo đã trình bày (Hình 1.2 – 1.5) cho ta thấy tiềm năng và sự loại bỏ clo ở những hợp chất này bởi những VSV khác nhau trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí. Ở mỗi con đường đều có sự tham gia của các đại diện thuộc rất nhiều chi VSV khác nhau. Cho đến nay, các nhà khoa học cần rất nhiều nghiên cứu sâu sắc bằng các công nghệ cao, hiện đại mới có thể làm rõ hiệu quả phân hủy và cơ chế phân hủy các hợp chất clo. Quá trình phân hủy sinh học có thể triệt để chỉ khi trong công nghệ xử lý có sự kết hợp nhiều cơ chế khác nhau. Quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo thường tạo ra hợp chất trung gian là chlorocatechol như ở Hình 1.5. Quá trình chuyển hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo có thể được tóm tắt trên Hình 1.6. Qua một số cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo ở trên, một lần nữa khẳng định vai trò của việc kết hợp nhiều nhóm VSV hiếu khí và kỵ khí trong quá trình chuyển hóa hay khoáng hóa hoàn toàn các hợp chất hữu cơ chứa clo, trong đó không thể không có sự tham gia của các VK KK hô hấp loại khử clo. Hình 1.6. Con đường phân hủy hoàn toàn PCDD/Fs bởi các quần xã VK trong quá trình phân hủy sinh học (Hiraishi, 2003) Trong quá trình phân hủy sinh học các chất hữu cơ chứa clo, quá trình loại khử clo là bước mở đầu, bước khử độc ở điều kiện kỵ khí tạo điều kiện cho sự khoáng hóa hoàn toàn các hợp chất này ở điều kiện hiếu khí. Tuy nhiên, một số VSV vẫn có khả 17 năng chuyển hóa hay phân hủy các hợp chất như 2,4-D, 2,4,5-T trong điều kiện hiếu khí. Để có bức tranh tổng thể về quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo nói chung và các hợp chất dioxin nói riêng, sự đa dạng các VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy chất diệt cỏ/dioxin ở điều kiện hiếu khí và vai trò của các VK KK trong quá trình loại khử clo sẽ được đề cập. 1.3.2. Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin 1.3.2.1. Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy Hiện nay, trên thế giới đã có nhiều nghiên cứu về phân hủy hiếu khí các hợp chất chứa clo nói chung, các chất là thành phần chính của chất diệt cỏ như 2,4-D, 2,4,5-T nói riêng. Các nhân tố ảnh hưởng đến phân hủy sinh học 2,4-D, 2,4,5-T bao gồm nồng độ, cấu trúc hóa học, mức độ đa dạng VSV, độ ẩm, nhiệt độ, pH, nồng độ oxy và các điều kiện địa hóa thổ nhưỡng khác (Picton, 2004). Chuyển hóa 2,4-D bởi dioxygenase phụ thuộc -ketoglutarate do gene tfdA mã hóa đã được nghiên cứu ở chủng Cupriavidus necator JMP134 (Fukumori, 1993). Các VSV phân hủy 2,4-D đã được tìm thấy trong một số loại đất, bùn, vùng nước hiếu khí gần bề mặt, phân ủ, bùn hoạt tính, hồ và sông. 2,4-D được chuyển hóa thành 2,4-DCP và sau đó được oxy hóa đến 3,5-dichlorocatechol. Quá trình phân hủy 2,4-D được thực hiện bởi các VK Arthrobacter, Pseudomonas, Cupriavidus (tên cũ Alcaligenes hoặc Ralstonia), Flavobacterium, Burkholderia (tên cũ Pseudomonas), Halomonas và Variovorax thuộc lớpß và γ-Proteobacteria (Itoh, 2004). Một số nghiên cứu về phân hủy 2,4-D và 2,4-DCP bởi nấm sợi đã được ghi nhận. Ryan và Rumbus (1989) nghiên cứu về quá trình khoáng hóa 2,4,5-T bởi nấm đảm P. chrysosporium BKM-F-1767 trong điều kiện nuôi cấy lỏng và trong đất. Vroumsia và đtg (2005) đã nghiên cứu chi tiết về khả năng phân hủy 2,4-D và 2,4DCP bởi các loài nấm Aspergillus penicilloides, Mortierella isabellina, Chrysosporium pannorum và Mucor geneevensis. 2,4,5-T khó bị phân hủy hơn và các nghiên cứu về phân hủy sinh học hợp chất này ít hơn so với 2,4-D. Chủng VK sử dụng 2,4,5-T được nghiên cứu đầy đủ nhất là Burkholderia phenoliruptrix AC1100 (tên cũ Pseudomonas cepacia AC1100) (Kitagawa, 18 2002). Một số chủng VK khác sử dụng 2,4,5-T như Nocardioides simplex 3E, Stenotrophomonas maltophilia (Mai, 2001), Burkholderia sp. JR7B3 (Rice, 2005), Raoultella planticola (Zharikova, 2006). Tại Việt Nam, một số nhà khoa học đã quan tâm nghiên cứu các chủng hay quần xã VSV có khả năng sinh trưởng và sử dụng 2,4-D, 2,4,5-T là nguồn carbon theo cơ chế đồng trao đổi chất (Kiều Hữu Ảnh, 2003; Hoàng Thị Mỹ Hạnh, 2004; Đặng Thị Cẩm Hà, 2005; La Thanh Phương, 2005; Lê Văn Nhương, 2005). Các kết quả nghiên cứu sẽ được trình bày chi tiết ở phần cuối của chương này nhằm làm sáng tỏ mục tiêu và các đóng góp của luận án. 1.3.2.2. Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin Theo Field (2008), trong số các nghiên cứu về VK phân hủy các hợp chất PCDD và PCDF có tới 84% kết quả nghiên cứu công bố về phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin chứa 1 hoặc 2 clo. Hiện nay, phân hủy sinh học các dioxin chứa ba hay bốn clo đang được quan tâm nghiên cứu. Nhìn chung, quá trình phân hủy sinh học của các hợp chất dioxin chứa clo tăng lên khi số nguyên tử clo trong phân tử giảm. Các hợp chất PCDD/F chứa 5 nguyên tử clo hoặc nhiều hơn khó bị phân hủy sinh học hiếu khí do độ độc của các hợp chất tăng cùng với số nguyên tử clo trong phân tử. Nghiên cứu của Cermiglia (1979), Klecka (1980) cho thấy, dibenzo-dioxin (DD), dibenzo-furan (DBF) và các chất tương tự chứa clo được chuyển hóa đầu tiên đến các hợp chất dạng cis-dihydroxylate bởi các VK Pseudomonas và Beijerinckia spp. Phân hủy naphthalene và biphenyl bởi VK không triệt để và tạo ra các sản phẩm “ngõ cụt”. Phản ứng oxy hóa kép vị trí bên tạo ra DBF đã được hydroxylate hóa và sản phẩm này được chuyển hóa tiếp thông qua quá trình cắt vòng ở vị trí meta để tạo ra chất chuyển hóa phân cực màu vàng và hấp thụ cực đại ở bước sóng khoảng 460 nm. Một số VK oxy hóa kép vị trí bên của dioxin và các hợp chất tương tự bao gồm Novosphingobium aromaticivorans IFO15084, N. stygium IFO 16085, N. sunterraneum IFO 16086, Porphyribacter sanguineus IAM 12620T, Sphingobacterium yanoikuyae B1, B. cepacia F297, B. cepacia ET4, Ralstonia sp. SBUG290, Pseudomonas sp. HL7b v.v. Kubota và đtg (2005) đã phân lập 7 chủng 19 VK Nocardioides aromaticivorans sử dụng DBF. Các chủng VK này tạo ra các chất chuyển hóa màu vàng không hòa tan, hấp thụ cực đại ở bước sóng từ 400 đến 507 nm và phụ thuộc pH. Chủng Sphingomonas wittichii RW1 có khả năng chuyển hóa một số đồng phân của dibenzo-p-dioxin và dibenzo-p-furans thành các hợp chất không độc. Chủng này cũng có thể bẻ gãy khung carbon của dioxin và sử dụng chúng như nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Chủng này cũng đã được chứng minh là mang enzyme dioxin dioxygenase (Hartmann, 2013, Sowers, 2013). Chủng nấm Cerrena sp. F0607 có khả năng phân hủy 2,4,8-trichlorodibenzo-pfuran ở nồng độ 10 mg/l trong đó phát hiện được cả 3 loại enzyme ngoại bào phân hủy lignin (Hidayat, 2013). Nấm Pleurotus ostreatus có khả năng phân hủy penta-, hexa-chlorobiphenyl. Trong môi trường nuôi cấy phát hiện được phức hệ enzyme tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm như enzyme ngoại bào (ligninolytic enzyme) và enzyme nội bào (cytochrome P450 monooxygenase, arylalcohol dehydrogenase, arylaldehyde dehydrogenase) (Cvančarová, 2013). Một số VK khác có cả hai quá trình oxy hóa kép ở vị trí bên và vị trí góc của các dioxin như VK biển Cycloclasticus pugetti, Comamonas sp. KD7, Rhodococcus sp. NCIMB 12038, Rhodococcus opacus SAO 101 (Chang, 2008) và Rhodococcus sp. HA01 (Aly, 2008). Theo Habe, chủng Rhodococcus opacus SAO101 có khả năng sử dụng 1MCDD, 2,3-DCDD, 2,7-DCDD; chủng Terrabacter sp. DBF63 có khả năng sử dụng 2-MCDD, 2,3-DCDD (Habe, 2001). Theo Aly, chủng Rhodococcus sp. HA01 có thể sử dụng DD là nguồn carbon duy nhất nhưng các tế bào sinh trưởng trên DBF có thể chuyển hóa DD, 2-CDBF và 3-CDBF (Aly, 2008). Chủng P. veronii PH03 phân hủy được 90,7% DD, 79,7% DBF, 88,3% 1-MCDD và 78,6% 2-MCDD sau 60 giờ nuôi cấy với nồng độ ban đầu của các chất là 1 mM (Hong, 2004). Ở Việt Nam, một số chủng VSV phân lập từ đất hoặc bùn ô nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin có khả năng sử dụng DBF và sinh trưởng trên môi trường chứa DD, 2- 20 MCDD như nguồn carbon đồng trao đổi chất. Tuy nhiên, các kết quả chi tiết sẽ được trình bày ở phần cuối của chương này. 1.3.3. Phân hủy kỵ khí chất diệt cỏ/dioxin Trong nhiều thập niên qua, quá trình phân hủy kỵ khí các hợp chất hữu cơ chứa clo đã và đang được quan tâm nghiên cứu. Nhiều VK KK sử dụng các chất ô nhiễm chứa clo là các chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp và được gọi là VK KK hô hấp loại clo hoặc hô hấp clo (Hiraishi, 2008). Tuy nhiên, số lượng các nghiên cứu loại khử clo vẫn ít hơn nhiều so với nghiên cứu phân hủy sinh học dioxin, các chất tương tự dioxin và các sản phẩm trung gian của quá trình phân hủy theo cơ chế oxy hóa. 1.3.3.1. Phân hủy sinh học kỵ khí các chất diệt cỏ chlorophenoxy Các VSV tham gia vào quá trình loại khử clo rất đa dạng, chủ yếu thuộc ba ngành chính là Chloroflexi, Firmicute và Proteobacteria (Hiraishi, 2008; Maphosa, 2010). Nghiên cứu đầu tiên về loại khử clo là quá trình chuyển hóa 2,4,5-T thành 2,5-D bởi quần xã VSV chuyển hóa 3-chlorobenzoate (Suflita, 1984). Theo Bryant (Bryant, 1992), phân hủy 2,4,5-T được bắt đầu bởi sự loại một nguyên tử clo thành 2,5-D trong mẫu bùn và trầm tích. Tuy nhiên, trong các quần xã VSV, quá trình loại khử clo thường xảy ra ở các vị trí bên và 2,4,5-TCP được phát hiện là sản phẩm đầu tiên của quá trình chuyển hóa kỵ khí 2,4,5-T (Mitsevich, 2000, Nguyen, 2007). Phân hủy 2,4-D chủ yếu bắt đầu bởi sự loại bỏ nguyên tử clo ở vị trí bên (Boyle, 1999a). Quá trình chuyển hóa 2,4-D đến 4-chlorophenoxyacetate cũng đã được phát hiện (Warner, 2002). Quá trình phân hủy 2,4-DCP ở điều kiện kỵ khí trong các mẫu trầm tích nước ngọt cũng đã được công bố (Zhang,1990). Trong các quần xã VK, loại khử clo của các chlorophenol tạo thành từ các chlorophenoxyacetate thường được bắt đầu bởi phản ứng loại một clo ở vị trí ortho, kết quả là làm tăng lượng 3,4-dichlorophenol từ 2,4,5-T (Mikesell, 1985; Gibson, 1990), 3chlorophenol từ 2,5-D (Bryant, 1992; Nguyen, 2007) hoặc 4-chlorophenol từ 2,4-D (Warner, 2002). 21 1.3.3.2. Phân hủy kỵ khí các hợp chất dioxin Townsend (Townsend, 1983) đã có nghiên cứu đầu tiên về sự thay đổi các dạng dioxin và sự tích lũy các dạng ít clo trong các mẫu trầm tích. Loại khử clo của các hợp chất dioxin bởi VSV đã được phát hiện trong trầm tích, bùn và đất nhiễm những hợp chất này (Vargas, 2001; Yoshida, 2005; Hiraishi, 2008). Kết quả nghiên cứu của Bunge và đtg cho thấy chủng Dehalococcoides mccartyi CBDB1 có khả năng loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD (Bunge, 2003). Chủng thuần D. mccartyi 195 hay quần xã VK có mặt chủng này có khả năng loại khử clo của 1,2,3,4-TCDD tạo ra 1,2,4-TrCDD, 1,3-DiCDD, loại clo của HCB tạo ra 1,2,3,5-TCB, loại clo của 2,3,4,5,6-pentachlorobiphenyl thành 2,3,4,6-TCB, 1,3,5-TrCB, loại clo của 1,2,3,4-tetrachloronaphthalene tạo ra các đồng phân dichloronaphthalene chưa xác định (Fennell, 2004). Việc bổ sung 1,2,3,4-TCB và 2,3,4,5-tetrachloroanisole đã tăng cường quá trình loại clo của 1,2,3,4-TCDD và TCDF của VSV trong các trầm tích (Hiraishi, 2008). Theo Bunge, các mẫu làm giàu VK KK từ bùn có khả năng loại clo 1,2,4-TrCDD và 1,2,3-TrCB tới 1,3-DCB. Ngoài ra, trong quá trình loại khử clo, số VK loại khử clo đã tăng 4 lần so với ban đầu và đạt 11% số lượng VK tổng số có mặt trong mẫu làm giàu ở cuối chu kỳ nuôi cấy (Bunge, 2008). Các VK Dehalococcoides có khả năng loại khử clo của các hợp chất hữu cơ chứa nhiều clo thành các hợp chất chứa ít clo như các đồng phân chứa 1-2 nguyên tử clo. Các hợp chất này sẽ bị các VSV hiếu khí phân hủy tiếp bằng cách cắt khung carbon (Bunge, 2009). 1.4. Đa dạng các vi khuẩn tham gia hô hấp loại khử clo Các VK KK hô hấp loại khử clo rất đa dạng và được chia thành 3 nhóm. Trong phần này sẽ trình bày chi tiết về đặc điểm của các VK hô hấp loại khử clo nói chung và đặc điểm, đại diện của từng nhóm nói riêng. 1.4.1. Đặc điểm chung của các vi khuẩn hô hấp loại khử clo Đã có nhiều bằng chứng về VK KK tham gia hô hấp loại clo đóng vai trò quan trọng trong quá trình chuyển hóa và loại độc tố của các hợp chất hữu cơ chứa clo như chloroethene, chlorobenzene, chlorophenol, PCB, PCDD/Fs. Theo công bố của một số tác giả thì các VK tham gia loại khử clo thuộc 3 ngành chính là Firmicutes (VK Gram 22 dương có tỷ lệ G + C thấp), Proteobacteria (bao gồm  - và δ- Proteobacteria) và Chloroflexi (Hình 1.7) (Smidt, 2000, 2004; Hiraishi, 2008; Richardson, 2013). (i) Các đại diện của ngành Firmicutes bao gồm các chi Desulfitobacterium, Dehalobacter, Clostridium, Acetobacterium có khả năng loại khử clo của các hợp chất hữu cơ mạch thẳng, vòng thơm hay cả hai. (ii) Các đại diện của ngành Proteobacteria bao gồm các chi Desulfuromonas, Desulfomonile, Desulfovibrio, Dehalospirillum và một số chi khác như Sulfurospirillum, Anaeromyxobacter, Geobacter, Pseudomonas, Shewanella v.v. (Suyama, 2001; Rowe, 2008; Richardson, 2013; Kranzioch, 2013). (iii) Các đại diện của ngành Chloroflexi bao gồm các chi Dehalococcoides, Dehalobium và Dehalogenimonas. Đây là các chi VK có khả năng loại clo của rất nhiều hợp chất chứa clo vòng thơm, đa vòng thơm và mạch thẳng (Hiraishi, 2008; Richardson, 2013; Kranzioch, 2013). Ngoài ra, rất nhiều VK thuộc ngành Chloroflexi không nuôi cấy được cũng có mặt trong các khu vực ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo (Nguyễn Bá Hữu, 2009; Đào Thị Ngọc Ánh, 2013). Dựa vào đặc tính sinh lý về khả năng loại khử clo, các VK có khả năng hô hấp loại khử clo được chia thành ba nhóm là nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc, nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc và nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất (Hiraishi, 2008). (a) VK hô hấp loại khử clo không bắt buộc là nhóm có khả năng loại khử clo của các hợp chất chứa clo để sinh năng lượng trong quá trình hô hấp (Hiraishi, 2008). Tuy nhiên, các VK nhóm này vẫn có thể tổng hợp năng lượng khi được nuôi cấy trên các cơ chất hữu cơ không chứa clo khác như hydrocarbon, 2,4,6trinitrotoluene, 2,4-dinitro-toluene, hexahydro-1,2,3-trinitro-1,3,5-triazine và có thể là một số hợp chất vô cơ như muối sulfate, thiosulfate, nitrate, nitrite, Mn2+, Fe2+ (Barton, 2007). Nhóm này thường có kiểu trao đổi chất đa dạng, dễ nuôi cấy và phân lập. Hầu hết các VK KSF thuộc nhóm này. Theo một số tác giả (Hiraishi, 2008; Maphosa, 2010; Richardson, 2013), nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc bao gồm các loài thuộc chi Anaeromyxobacter, Desulfomonile, Desulfovibrio, Desulfomonas, Geobacter, Sulfurospirillium, Desulfitobacterium. 23 (b) VK hô hấp loại clo bắt buộc là nhóm VK có kiểu sống bị giới hạn, tổng hợp năng lượng cho sinh trưởng từ quá trình loại khử clo của các hợp chất vòng thơm hay mạch thẳng chứa clo với H2 là chất cho điện tử. Tất cả các chủng đã phân lập được đều là VK sinh trưởng trong khoảng nhiệt độ và pH trung tính, sống trong môi trường đất, nước ngọt và nước biển (Hiraishi, 2008). VK hô hấp loại clo bắt buộc gồm các loài thuộc chi Dehalobacter, Dehalococcoides, Dehalobium, Dehalogenimonas và một số đại diện thuộc ngành Chloroflexi không nuôi cấy. Nhóm VK này thường là kỵ khí bắt buộc và chỉ sử dụng năng lượng sinh ra từ quá trình loại khử clo cho hô hấp và sinh trưởng. Nhóm này rất khó phân lập và nuôi cấy ở dạng chủng thuần. Tuy nhiên, nhóm VK này có tiềm năng để xử lý các chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo do chúng chứa rất nhiều bản sao gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo (Krajmalnik-Brown, 2005; Lee, 2006; Richardson, 2013). (c) Nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất là nhóm VK KK bắt buộc hay không bắt buộc, chúng loại khử clo cùng với quá trình trao đổi chất và sinh năng lượng. Đại diện của nhóm này bao gồm Propionigenium, Pseudomonas, Shewanella, Desulfobacterium, Acetobacterium, Clostridium (Hiraishi, 2008). Đây là các VK kỵ khí bắt buộc hay không bắt buộc nhưng chúng có thể sống trong điều kiện hoàn toàn không có oxy. Đặc biệt là VK Pseudomonas là VK hiếu khí nhưng cũng sống được trong điều kiện có rất ít hay hoàn toàn không có oxy. 24 Hình 1.7.Cây phát sinh chủng loại của các VK loại khử clo dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA. Con số trong ngoặc đơn là mã số trên GenBank (Hiraishi, 2008) O: Các VK loại khử clo bắt buộc F: các VK loại khử clo không bắt buộc +: Các VK có khả năng loại khử clo đồng trao đổi chất Khi nghiên cứu quần xã VK KK loại clo từ vị trí ô nhiễm các dung môi hữu cơ ở West Louisiana Hoa Kỳ cho thấy có 42 dòng VK trong đó Dehalobacter chiếm 25 dòng, Clostridium chiếm 5 dòng, Dehalococcoides chiếm 4 dòng, các chi khác chiếm ít hơn 3 dòng (Grostern, 2006). Ngoài ra, một số VK sinh metan như Methanosarcina và acetogene như Acetobacterium, Spomusaovate có thể loại clo theo cơ chế đồng trao đổi chất (EPA, 2006; Hiraishi, 2008). Trong các mẫu làm giàu từ sông Dương Tử (Trung Quốc) trên PCE, các VK Dehalobacter, Dehalococcoides, Desulfomonile và Desulfitobacterium có mặt và quá trình loại clo 25 của PCE xảy ra hoàn toàn tới ethene. Tuy nhiên, nếu không có mặt Dehalococcoides thì quá trình loại khử clo chỉ dừng lại ở 1,2-cis-DCE (Kranzioch, 2013). Ngoài ra, có nhiều VSV hiếu khí khác cũng tham gia loại khử clo của DDT thành DDD như Proteus vulgaris, E.coli, Enterobacter, Bacillus, Flavobacterium, Cyanobacteria. Một số VK hiếu khí khác lại phân hủy DDT theo con đường kỵ khí như Hydrogenomonas, Enterobacter aerogenes, Bacillus, E.coli (Gohil, 2011). Trong số các VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo, VK KSF, Dehalococcoides và Pseudomonas được nghiên cứu nhiều do đặc tính riêng của chúng. Cho đến nay, Dehalococcoides được xem là các “thợ khử” clo, thuộc nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc còn VK KSF thuộc nhóm loại khử clo không bắt buộc, dễ nuôi cấy. VK Pseudomonas có thể sống trong cả điều kiện hiếu khí hay kỵ khí không bắt buộc và có khả năng loại khử clo (trong điều kiện kỵ khí) hay chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo (trong điều kiện hiếu khí). Do đó, sự đa dạng các nhóm này sẽ được trình bày ở các tiểu mục sau. 1.4.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate VK KSF có mặt ở hầu hết các môi trường sinh thái như trong nước biển, nước ngọt và cả trầm tích, đất, đặc biệt là những nơi có nồng độ sulfate cao. Các VK KSF là nhóm VK KK sử dụng sulfate làm chất nhận điện tử trong quá trình trao đổi năng lượng (Barton, 2007). Về đặc điểm sinh lý và trao đổi chất, các VK KSF thuộc nhóm loại clo không bắt buộc, có thể sử dụng các hợp chất hữu cơ chứa clo làm chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp. Tuy nhiên, tại các nơi không có các hợp chất chứa clo, các VK này vẫn tồn tại và có thể sử dụng các hợp chất vô cơ như các muối sulfate, muối thiosulfate hay các hợp chất hữu cơ không chứa clo như 2,4dinitrotoluene, 2,4,5-trinitrotoluene, hydrocarbon v.v. làm chất nhận điện tử cuối cùng trong chuỗi hô hấp của chúng. Do đó, vai trò của nhóm VK này rất quan trọng trong quá trình phân hủy sinh học các chất ô nhiễm hữu cơ chứa clo hay không chứa clo (Barton, 2007). Trong một quần xã VK KSF thường tồn tại nhiều nhóm VK KSF khác nhau, chúng hỗ trợ nhau trong quá trình sinh trưởng. Một số chủng sẽ phân hủy các 26 chất hữu cơ mạch dài thành acetate, chất này sẽ là nguồn carbon và chất cho điện tử để các chủng khác sinh trưởng (Muyzer, 2008). Các VK KSF thuộc các chi Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfomonile, Desulfuromonas, Desulfobacterium có khả năng loại khử clo của cả các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa clo (chlorobenzene, chlorophenol) và mạch thẳng (PCE, TCE) (Hiraishi, 2008; Kranzioch, 2013). Trong số các VK KSF có khả năng hô hấp loại clo, Desulfovibrio là VK KK không bắt buộc, chúng có khả năng sống ở môi trường kỵ khí hay vi hiếu khí. Desulfovibrio là VK hô hấp loại halogen, có khả năng loại clo, brom của một số hợp chất halogen hữu cơ (Boyle, 1999b; Sun, 2000; Häggblom, 2006). Đây là chi dễ nuôi cấy và phân lập được trong phòng thí nghiệm và đã được xác định là có mặt trong lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Đà Nẵng (Nguyễn Thị Sánh, 2005). Trên thế giới, chi Desulfovibrio được nghiên cứu khá nhiều về khả năng loại khử clo, brom. Chủng Desulfovibrio dechloracetivorans SF3 phân lập từ biển có khả năng loại clo ở vị trí ortho của 2chlorophenol và 2,6-dichlorophenol tạo ra phenol (Sun, 2000). Desulfovibrio phân lập từ vùng bùn cửa sông có thể sinh trưởng trên lactate kết hợp với loại khử halogen của 2,4,6-tribromphenol (Boyle, 1999b). Chủng Desulfovibrio sp. 2BP-48 có khả năng khoáng hóa 2-bromophenol kết hợp với quá trình khử sulfate. Chủng 2BP-48 này khi đồng nuôi cấy với một chủng Desulfovibrio khác có thể loại khử halogen của các chất 2-bromophenol, 2,6-dibromo-phenol, 2-iodophenol tạo ra phenol (Häggblom, 2006). Theo Drzyzga, chủng Desulfovibrio sp. TBP1 có khả năng loại khử brom của các hợp chất chứa brom trong trầm tích biển như 2-bromo-, 4-bromo-, 2,4-dibromo-, 2,6-dibromo- 2,4,6-tribromo-phenol (Drzyzga, 2001). Chi Desulfovibrio và chi Desulfitobacterium cùng tồn tại trong mẫu làm giàu từ đất ô nhiễm PCE và loại clo của hợp chất này đến 1,2-DCE. Chi Desulfovibrio chiếm ưu thế trong môi trường có tỷ lệ SO42-/PCE cao (Drzyzga, 2001). Theo Boyle và đtg, các loài Desulfovibrio gigas, D.africanus, Desulfococcus multivorans có khả năng loại clo của lindane tới benzene và chlorobenzene trong vòng 48 giờ (Boyle, 1995). Desulfitobacterium là chi tiềm năng trong quá trình xử lý các chất ô nhiễm chứa clo bằng phân hủy sinh học. Đây là VK KK bắt buộc, khó nuôi cấy trong 27 phòng thí nghiệm nhưng lại có khả năng loại khử clo của cả hợp chất chứa clo mạch thẳng và vòng thơm. Chẳng hạn, các chủng Desulfitobacterium sp. YT1, Desulfitobacterium sp. PCE1, Desulfitobacterium sp. DCE-S, D. frappieri TCE1, D. hafniense TCE1 cũng có khả năng loại clo của PCE và TCE (Duret, 2012). D. dehalogenans loại clo của 2,4-dichlorophenol, PCB, các chloroalkane. D. chlororespirans Co23 loại clo của 3-chloro-4-hydroxybenzoate, D. hafniense DCB2 loại clo của pentachlorophenol, 3-chloro-4-hydroxyphenylacetate, 2,4,6-trichlorophenol, D. metallireducens loại clo của PCE, TCE, dichloroethane và chlorophenol. Ngoài ra, chủng D. hafniense PCP-1 có thể loại khử clo của pentachlorophnol (PCP) tới 3-chlorophenol và các hợp chất vòng thơm chứa clo ở vị trí ortho-, meta-, para- theo thứ tự như sau: PCP loại khử clo tạo ra 2,3,5,6-tetrachlorophenol (2,3,5,6-TeCP), sau đó tạo ra 3,4,5-trichlorophenol (3,4,5-TCP), tiếp tục loại khử clo tạo ra 3,5-dichlorophenol (3,5-DCP) và cuối cùng tạo ra 3-CP (Bisaillon, 2010). Chủng D. dichloroeliminans DCA1 loại clo của 1,2-dichloroethane (Marzorati, 2007). Chủng Desulfitobacterium sp. Viet1 có khả năng loại clo của chlorophenol và dichoroethane (Ritalahti, 2004). Ngoài ra, một số VK KSF thuộc các chi khác cũng có khả năng hô hấp loại clo như chủng Desulfomonile tiedjei DCB-1 và loài D. liminaris loại khử clo của 3chlorobenzoate tạo thành benzoate (Muyzer, 2008). Các VK có khả năng loại khử PCB được phát hiện ở sông Ohio bị nhiễm PCB với mức độ 0,01-8,5 mg/kg bùn bao gồm Geobacter, Desulfitobacterium, Desulforomonas, Desulfomonile (Angelo, 2010). Trong mẫu nuôi cấy các VK phân hủy PCE đến ethene cũng có mặt các VK KSF như Desulfomonile, Desulfitobacterium (Kranzioch, 2013). Trong quá trình loại khử clo, VK KSF sử dụng các chất như hydro phân tử, formate, acetate làm chất cho điện tử và các chất chứa clo làm chất nhận điện tử cuối cùng để tích lũy năng lượng. Các VK KSF có thể khoáng hóa hoàn toàn các chất hữu cơ này khi chúng được nuôi riêng rẽ hay kết hợp với các VSV khác (Barton, 2007). Theo Dar và đtg, quá trình khử sulfate chiếm tới 50% các quá trình 28 phân hủy chất hữu cơ trong môi trường biển, bùn hồ, khu xử lý nước thải và khu sản xuất dầu (Dar, 2005). Về đặc điểm di truyền, dựa vào các cặp mồi đặc hiệu cho đoạn gene 16S rRNA, các VK KSF được chia thành 6 nhóm, bao gồm nhóm 1 (Desulfuromaculum), nhóm 2 (Desulfobulbus), nhóm 3 (Desulfobacterium), nhóm 4 (Desulfobacter), nhóm 5 (Desulfococcus, Desulfovibrio, Desulfosarcina, Desulfonema), nhóm 6 (Desulfovibrio, Desulfomicrobium). Cả 6 nhóm đều có đại diện của các chi có khả năng hô hấp loại clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo (Boyle, 1995; Reineke, 2001; Muyzer, 2008; Angelo, 2010). Ngoài 6 nhóm này, nhiều VK KSF khác cũng tham gia loại clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo như các đại diện thuộc chi Desulfitobacterium, Desulfomonas, Desulfomonile (Reineke, 2001; Kranzioch, 2013). 1.4.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides Dehalococcoides thuộc nhóm VK hô hấp loại clo bắt buộc, chúng sử dụng khí H2 làm chất cho điện tử và các chất hữu cơ chứa clo làm chất nhận điện tử để tổng hợp năng lượng cho quá trình sinh trưởng. Dehalococcoides là nhóm VK loại khử clo kỵ khí bắt buộc, có thể sinh trưởng trên một số cơ chất là các axit hữu cơ như pyruvate, lactate, furmarate, formate v.v. Do Dehalococcoides chỉ sinh trưởng trên nguồn chất cho điện tử là H2 nên chúng thường sống trong quần xã, rất khó nuôi cấy và phân lập ở dạng thuần khiết. Khi ở trong quần xã, các VK khác có thể lên men các axit hữu cơ tạo ra H2 là nguồn chất cho điện tử để VK Dehalococcoides sinh trưởng (Hug, 2012; Löffler, 2013). Dehalococcoides có thể sinh trưởng ở dải nhiệt độ từ 25-40oC, pH trong khoảng trung tính (Kube, 2005; Seshadri, 2005). Các điều kiện môi trường tối ưu cho nhóm VK này sinh trưởng là pH 7,2, nhiệt độ 30 + 2oC. Dehalococcoides cũng có khả năng kháng kháng sinh, chúng có thể sinh trưởng trên môi trường chứa ampicillin, vancomycin với nồng độ 5 mg/l (Bunge, 2008; Cheng, 2009). Quá trình loại clo của Dehalococcoides xảy ra tốt nhất ở pH 6,5-8, nhiệt độ từ 15-35oC nhưng nhiệt độ tối ưu là 25-30oC. Các VK này đều cần vitamin B12 cho quá trình sinh trưởng và loại khử clo (Löffler, 2013). 29 Dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA, lượng nucleotide trung bình trong genome và đặc trưng kiểu hình, 6 chủng đã được xác định đặc điểm (gồm các chủng 195, CBDB1, BAV1, VS, FL2 và GT) được xếp vào cùng 1 loài với tên gọi Dehalococcoides mccartyi, trong đó chủng D. mccartyi 195 là chủng chuẩn của loài (Löffler, 2013). Tuy nhiên, sơ đồ chuyển hóa PCE trên Hình 1.8 cho thấy các chủng Dehalococcoides khác nhau ở khả năng loại khử clo của các hợp chất khác nhau. Hình 1.8. Quá trình chuyển hóa PCE tạo ra ethen ở một số VK khác nhau. Nét đứt thể hiện quá trình đồng trao đổi chất, nét liền thể hiện quá trình loại khử clo (Futagami, 2008) Dựa vào sự khác nhau về trình tự nucleotide ở vùng dễ biến đổi (V2 và V6) trong trình tự đoạn gene 16S rRNA của VK Dehalococcoides, người ta chia các VK Dehalococcoides thành 3 nhóm là Cornell, Victoria và Pinellas (Henrickson, 2002). Đây cũng là một trong các đặc điểm tạo ra sự đa dạng cho nhóm VK Dehalococcoides. Dehalococcoides có thể loại khử clo của cả các hợp chất mạch thẳng, vòng thơm, đa vòng thơm (Hendrickson, 2002; Adrian,2007; Bunge, 2008; Cheng, 2009). Mặt khác, trong số rất nhiều VK có khả năng loại khử clo của PCE và TCE nhưng chỉ có Dehalococcoides là nhóm VK có khả năng loại khử clo của PCE, TCE tới hợp chất ethene hoàn toàn không độc (Hình 1.8) (Futagami, 2008). Trong quần xã VK hô 30 hấp loại khử clo, khi không có mặt Dehalococcoides thì sản phẩm cuối cùng của quá trình loại khử clo của PCE, TCE là 1,2-cis-DCE (không loại khử hoàn toàn tới ethene) (Kranzioch, 2013). Chủng D. mccartyi CBDB1 chứa gene mã hóa cho enzyme CbrA xúc tác cho quá trình loại clo của 1,2,3,4-TCB và 1,2,3-TeCB, gene này không có trình tự tương đồng trên genome của chủng D. mccartyi 195 (Krajmalnik-Brown, 2005; Wagner, 2009). Chủng D. mccartyi CBDB1 chứa nhiều gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia xúc tác các quá trình loại khử clo nhất nên đây là chủng có khả năng loại khử clo của nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo khác nhau. Chủng này có khả năng loại khử 1-2 nguyên tử clo dẫn tới con đường loại clo phân nhánh của các hợp chất HCB, pentachlorobenzene, cả 3 đồng phân của TCB, 2 đồng phân của TrCB, DD, pentachlorophenol, 3 đồng phân tetrachlorophenol, 6 đồng phân TCP, 3 đồng phân DCP (Wagner, 2009). Ngoài ra, các chủng Dehalococcoides khác nhau còn có số lượng bản sao gene rdhA trong genome không giống nhau. Có chủng chỉ có 2 bản sao như chủng FL2 nhưng có chủng lại có tới 32 bản sao như chủng CBDB1. Chính sự khác nhau về số lượng bản sao gene rdhA này mà mỗi chủng có khả năng loại khử clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo khác nhau, có chủng chỉ loại khử clo của hợp chất mạch thẳng nhưng có chủng lại loại khử clo của cả các hợp chất vòng thơm, đa vòng thơm. 1.4.4. Đa dạng vi khuẩn Pseudomonas Chi Pseudomonas được biết đến với khả năng tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa chất ô nhiễm hay sinh tổng hợp các chất thứ cấp. Chúng là nhóm “phàm ăn” nhất trong giới VK. Chúng có thể sinh trưởng và hoạt động ở khoảng hiệu điện thế oxy hóa khử rất rộng, trong môi trường với biến động rất lớn, từ cực dương cho đến cận cực âm. Chính vì thế Pseudomonas đóng vai trò rất quan trọng trong quá trình phân hủy dioxin và các chất tương tự. Sau đây là các thông tin liên quan trực tiếp đến khả năng chuyển hóa, phân hủy các hợp chất đa vòng thơm và các hợp chất halogen. Pseudomonas sp. PS14 có thể phân hủy 1,2,3,5-TCB với sự tham gia của các enzyme benzene dioxygenase, chloromuconate cycloisomerase, maleylacetate reductase (Reineke, 2001). Chủng Pseudomonas sp. B13 có khả năng phân hủy 3- 31 chlorobenzoate, 4-chlorophenol như nguồn carbon duy nhất và sử dụng 2-, 3chloro-phenol như nguồn carbon đồng trao đổi chất. P. putida GJ31 phân hủy chlorobenzene tới 3-chlorocatechol. P.pickettii loại clo của 2,4,6-TCP thành 2,6dichlorohydro-quinone (Reineke, 2001). Chủng Pseudomonas sp. WR912 có khả năng sinh trưởng trên 3-chloro-, 4-chloro-, 3,5-dichlorobenzoate. Chủng P. aeruginosa JB2 có khả năng sinh trưởng kỵ khí trên 2,5-dichlorobenzoate. Chủng P. veronii PH-03 có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa dioxin là nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Chủng này phân hủy được 90,7% DD, 79,7% DBF, 88,3% 1-MCDD, 78,6% 2-CDD sau 60 giờ nuôi cấy với nồng độ các chất ban đầu là 1 mM (Hong, 2004). P. aeruginosa phân lập từ bùn hoạt tính hay từ đất tham gia loại khử clo của 1,1,1-trichloro-2,2-di(4-chlorophenyl)ethane (DDT) thành 1chloro-4-[2,2-dichloro-1-(4-chlorophenyl)ethyl]benzene (DDD) ở điều kiện kỵ khí, sau đó chúng chuyển hóa tiếp bằng cách cắt vòng thơm ở điều kiện hiếu khí. Dịch chiết tế bào của Pseudomonas có thể phân hủy các sản phẩm DDT, DDD, 1,1'-(2chloroethane-1,1-diyl)bis(4-chlorobenzene)(DDMS), 1-chloro-4-[1-(4-chloro- phenyl) ethenyl]benzene (DDNU) theo con đường chuyển hóa kỵ khí (Gohil, 2011). Tại Việt Nam, các nghiên cứu về sự đa dạng VSV trong các lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng bằng phương pháp DGGE (Denaturing Gradient Gel Electrophoresis) hay SSCP (Single-strand chain polymorphism) đều cho thấy có mặt các VK thuộc ngành Proteobacteria với các lớp -Proteobacteia trong đó lớp Proteobacteia chiếm ưu thế. Trong số đó, VK thuộc chi Pseudomonas có mặt và chiếm đa số trong các lô xử lý (Nguyễn Bá Hữu, 2007c, 2008). Chẳng hạn, khi phân tích cấu trúc quần xã VK có mặt ở lô xử lý 0,5 m3 bằng phương pháp SSCP cho thấy xuất hiện 8 dòng VK Pseudomonas (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Ở công thức xử lý 1,5 m3 có xuất hiện 4 dòng VK Pseudomonas (Nguyễn Bá Hữu, 2008). Ở lô xử lý 10 và 100 m3 xuất hiện 12 dòng Pseudomonas (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Ngoài ra, có nhiều nghiên cứu về chủng thuần hay hỗn hợp chủng Pseudomonas có khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng cũng đã được công bố. Chủng VK KK không bắt buộc Pseudomonas sp. SETDN1 phân lập từ lô xử lý 10 DNT có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa dịch chiết đất bao gồm 32 2,4-D, 2,4,5-T, TCDD, PCDD, PCDF (Nguyễn Thị Sánh, 2005). Chủng Pseudomonas sp. BDN15 có khả năng sinh trưởng trên môi trường muối khoáng chứa 2,4,5-T ở nồng độ 1000 ppm như nguồn carbon và năng lượng duy nhất. Chủng này phân hủy tới 39,37% 2,4,5-T ở nồng độ 1000 ppm sau 5 ngày nuôi cấy (La Thanh Phương, 2005). Hỗn hợp chủng SETDN20 nuôi kỵ khí không bắt buộc trong phòng thí nghiệm có khả năng phân hủy 17,9% tổng độ độc sau 60 ngày ở nồng độ 4.299,243 pg TEQ/ml. Bằng phương pháp DGGE đã xác định hỗn hợp này có ít nhất 3 chủng vi khuẩn (Nguyễn Thị Sánh, 2007). Chủng Pseudomonas sp. HR5.1 phân lập từ bioreactor xử lý chất độc hóa học có mặt 2,4,5-T ở nồng độ 200 ppm (Phạm Ngọc Long, 2009). Chủng Pseudomonas sp. BQNR có khả năng phân hủy TNT tới nồng độ 600 ppm và có thể loại bỏ 99,35% TNT ở nồng độ 100 ppm (Đặng Thị Cẩm Hà, 2009). Ngoài ra, một số gene mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy 2,4-D, 2,4,5-T của Pseudomonas cũng đã được công bố. Gene tfdA mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy 2,4-D được phát hiện ở chủng Pseudomonas sp. BHNA1 phân lập từ khu vực ô nhiễm tại sân bay Biên Hòa (Phùng Khắc Huy Chú, 2012). Ở hỗn hợp chủng VK KK không bắt buộc SETDN20 có chứa gene mã hóa cho dioxygenase có độ tương đồng cao tới 99% so với trình tự phenylpropionate dioxygenase. Kết quả này chứng tỏ ở điều kiện kỵ khí, gene mã hóa cho dioxygenase tham gia vào quá trình cắt vòng thơm vẫn có mặt (Nguyễn Thị Sánh, 2007). Chủng Pseudomonas sp. BDNR1 có khả năng sinh trưởng trên DCĐ chứa dioxin, 2,4,5-T, 2,4-D, DBF, pyrene (300 ppm). Chủng này cũng có khả năng sinh laccase (Nguyễn Ngọc Bảo, 2010). Các kết quả đã nghiên cứu chứng tỏ trong các lô xử lý và trong đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin của Việt Nam nhiều đại diện của chi Pseudomonas đã có mặt. Vai trò của Pseudomonas và các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất chứa clo vòng thơm sẽ được làm sáng tỏ ở các nghiên cứu tiếp theo. 1.5. Đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình loại khử clo Như đã trình bày ở phần trên, các VK KK hô hấp loại khử clo rất đa dạng và được chia thành 3 nhóm khác nhau nên các gene chức năng tham gia vào quá trình 33 này cũng khác nhau. Thông thường, các phản ứng loại khử clo được xúc tác bởi các enzyme RdhA (reductive dehalogenase). Các gene mã hóa cho enzyme RdhA có mặt ở cả nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc, không bắt buộc và loại clo đồng trao đổi chất. Tuy nhiên, chúng có mặt ở 2 nhóm loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc nhiều hơn, ít có mặt ở nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất. Khả năng loại khử clo của các VK khác nhau cũng rất khác nhau phụ thuộc vào enzyme có mặt trong tế bào, số lượng, loại gene chức năng mã hóa cho enzyme RdhAcó mặt trong genome của mỗi chủng (Waller, 2005). Theo Wagner và đtg, các gene rdhA của chủng D. mccartyi CBDB1-chủng chứa nhiều gene chức năng rdhA nhất được phân thành 4 nhóm chính và được chia thành 13 phân nhóm. Mỗi phân nhóm có từ 1-5 gene rdhA. Mỗi cặp primer được thiết kế cho một phân nhóm (Wagner, 2009). Các VK KK sử dụng enzyme RdhA xúc tác cho quá trình thay thế các nguyên tử clo bởi hai điện tử từ H2 và một proton (Hiraishi, 2008; Angelo, 2010). RdhA là enzyme chìa khóa tham gia vào chuỗi hô hấp loại khử clo ở các VK KK. Đây là nhóm enzyme có tính đặc hiệu cơ chất rộng, một enzyme có thể xúc tác cho quá trình loại clo của nhiều hợp chất hữu cơ chứa clo khác nhau (Krajmalnik-Brown, 2005). Chẳng hạn, enzyme TceA xúc tác quá trình loại clo của TCE, một số haloalkane và haloalkene (Wagner, 2009). Tuy các VK có khả năng hô hấp loại khử clo có quan hệ phát sinh chủng loại khác xa nhau và thuộc về nhiều chi khác nhau nhưng các gene mã hóa cho enzyme RdhA lại có độ tương đồng rất cao về cấu trúc và chức năng. Các enzyme RdhA của các VK KK đều bao gồm các lớp protein Fe/S có chứa corrinoid (Smidt, 2000). Chức năng của một số protein được mã hóa từ các gene chức năng của nhóm VK Dehalococcoides đã được chứng minh (Krajmalnik-Brown, 2005). Ví dụ như gene mã hóa cho enzyme PceA xúc tác cho quá trình loại clo từ PCE đến ethene. 34 Hình 1.9. Cây phát sinh chủng loại dựa trên trình tự axit amin của các enzyme RdhA (các gene tương ứng có độ tương đồng trên 95%) (Futagami, 2008). Các chủng Dehalococcoides sp. CBDB1, BAV1, VS, 195 nay là D. mccartyi CBDB1, BAV1, VS, 195(Löffler, 2013) Mối quan hệ giữa các RdhA ở các VK khác nhau dựa trên trình tự các đoạn axit amin do gene rdhA tương ứng mã hóa (Hình 1.9). Từ mối quan hệ này cho thấy các VK khác nhau có thể mang cùng gene rdhA (gene pceA, cprA) và cấu trúc của các enzyme do chúng mã hóa khá tương đồng với nhau như enzyme PceA của các chủng Dehalobacter restrictus, Desulfitobacterium hafniense Y51và D. hafniense TCE1. Khi phân tích genome của các chủng VK Dehalococcoides khác, Kube và đtg đã phát hiện mỗi chủng còn chứa một lượng lớn các gene rdhA khác cũng tham gia vào quá trình loại khử clo (Kube, 2005). Chủng D. mccartyi 195 chứa 17 bản sao, chủng D. mccartyi BAV1 chứa 7 bản sao, chủng D. mccartyi FL2 chứa 14 bản sao, D. mccartyi CBDB1 chứa tới 32 bản sao gene rdhA (Waller, 2005). 35 Việc biểu hiện các gene mã hóa cho các enzyme RdhA tham gia loại khử clo phụ thuộc vào cơ chất chứa clo có mặt trong mẫu nuôi cấy. Điều này cho thấy chính các chất hữu cơ chứa clo là chất cảm ứng của quá trình phiên mã các gene rdhA. Theo Wagner và đtg, 29 trong số 32 gene rdhA của chủng D. mccartyi CBDB1 được sao mã khi chủng này được nuôi cấy trên môi trường chứa 1,2,3-TrCB và 1,2,4TrCB. Mức độ phiên mã cao nhất là của gene cbrA - gene mã hóa cho quá trình loại khử clo của chlorobenzene ở chủng CBDB1. Gene này xúc tác quá trình loại khử clo của 1,2,3-TrCB tới 1,3-DCB và từ 1,2,3,4-TCB tới 1,2,4-TrCB. Cũng trong nghiên cứu này, số bản sao của gene cbrA tăng hơn 10 lần so với ban đầu khi nuôi cấy trên hai cơ chất 1,2,3-TrCB và 1,2,4-TrCB. Gene cbdbA80 cũng được phát hiện khi chủng D. mccartyi CBDB1 nuôi cấy trên 2,3-dichlorophenol (Wagner, 2009). Đối với nhóm VK hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất, ngoài một số ít các VK mang gene rdhA thì còn có rất nhiều gene chức năng khác tham gia vào quá trình hô hấp loại clo. Các gene này có thể là các gene tham gia vào quá trình cắt vòng thơm như benzoyl-CoA, chlorocatechol dioxygenase, 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase (Gohil, 2011). Ngoài ra, gene mã hóa cho enzyme 2,4-dichlorophenoxyacetate/α -ketoglutarate dioxygenase (TfdA) tham gia vào quá trình phân hủy 2,4-D cũng được phát hiện ở một số chủng thuộc chi Pseudomonas (Phùng Khắc Huy Chú, 2012). Các gene mã hóa cho enzyme benzene dioxygenase, chloromuconate cycloisomerase, maleylacetate reductase tham gia vào quá trình phân hủy 1,2,3,5TCB ở chủng Pseudomonas sp. PS14 (Reineke, 2001). Quá trình phân hủy các hợp chất chứa clo đồng trao đổi chất ở các VK hiếu khí còn xuất hiện các gene chức năng như toluene monooxygenase, toluene dioxygenase, phenol monooxygenase and methane monooxygenase. VK Pseudomonas sp. B13 mang các enzyme tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa benzoate, chlorobenzoate như 3-oxoadipate enollactone hydrolase, 3-oxoadipate:succinyl-CoA transferase, 3-oxoadipyl-CoA thiolase (Kaschabek, 2002). Chủng P. putida KT2440 mang các gene mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình phân hủy phenylacetate acid như pentylacetyl-CoA ligase, ringhydroxylating complex, ring-opening enzyme, enoyl-CoA hydratase, acyl-CoA dehydrogenase, putative thioesterase, ketothiolase (Kim, 2009). 36 Tóm lại, các VK hô hấp loại khử clo cũng như các gene mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình này ở VK KK rất đa dạng. Các VK này bao gồm nhiều chi thuộc 3 ngành khác nhau là Chloroflexi, Firmicute, Proteobacteria. Các VK hô hấp loại khử clo này có thể nuôi cấy được và không nuôi cấy được phụ thuộc vào các điều kiện trang bị trong phòng thí nghiệm. Cho đến nay còn có rất nhiều hạn chế khách quan và chủ quan trong nuôi cấy VSV nói chung và VSV phân hủy dioxin, các hợp chất hữu cơ chứa halogen nói riêng. Do đó, cần sử dụng nhiều phương pháp tiên tiến khác nhau để có thể đánh giá sự đa dạng các VSV trong đất và trầm tích ô nhiễm. Các phương pháp đó sẽ trình bày dưới đây. 1.6. Các phƣơng pháp nghiên cứu đa dạng vi sinh vật Theo tổ chức Lương nông Liên hiệp quốc: “Đa dạng sinh học là tính đa dạng của sự sống dưới mọi hình thức, mức độ và mọi tổ hợp, bao gồm đa dạng gene, đa dạng loài và đa dạng hệ sinh thái”. Đa dạng VSV bao gồm đa dạng về loài VSV và đa dạng khả năng trao đổi chất của VSV. Đa dạng loài bao gồm độ phong phú loài, tổng số loài có mặt, độ đồng dạng loài và sự phân bố của loài (Kirk, 2004, Ovreas, 2000). Để đánh giá hết được số lượng VSV trong các mẫu, cần có các phương pháp phân tích nhanh, đồng thời và lặp lại với nhiều mẫu. Ước tính, khoảng 5.000 loài VK khác nhau đã được mô tả và trong tự nhiên có khoảng từ 107 đến 109 loài VK. Xấp xỉ 1% VK có thể nuôi cấy được bằng các phương pháp thực nghiệm chuẩn ở điều kiện phòng thí nghiệm và số liệu 1% này không thể đại diện đầy đủ cho các VK (Smalla, 2007; Maira 2010). Có ít nhất 99% các VK được quan sát dưới kính hiển vi không nuôi cấy được bằng các kỹ thuật phòng thí nghiệm thông thường (Kirk, 2004). Tuy nhiên, trong số 1% VK có thể nuôi cấy được cũng rất khác nhau về kiểu hình, di truyền và chỉ phần nhỏ của quần thể được xác định. Các phương pháp xác định tính đa dạng VSV trong đất có thể được chia thành 3 nhóm: các kỹ thuật hóa sinh, VSV và sinh học phân tử. 1.6.1. Phương pháp vi sinh vật Phương pháp thường được sử dụng nhất là đếm số lượng trên thạch đĩa Petri hay đếm số ống có thể nhất (MPN). Đây là phương pháp truyền thống, có ưu điểm 37 là nhanh, rẻ và có thể cung cấp thông tin về thành phần các VSV trong quần xã. Tuy nhiên, phương pháp này được sử dụng với từng nhóm VSV nhất định trên môi trường đặc hiệu nhất cho nhóm đó và kết quả phụ thuộc vào các điều kiện nuôi cấy như nhiệt độ, pH, ánh sáng… Phương pháp này chỉ áp dụng cho các VSV có thể nuôi cấy được và do đó không thể phản ánh hết số lượng VSV trong đất. Do đó, kết quả của phương pháp này cũng có thể ảnh hưởng đến sự đánh giá chính xác tính đa dạng của quần xã VSV. 1.6.2. Phương pháp hóa sinh Phương pháp hóa sinh để nghiên cứu sự đa dạng của VSV liên quan đến các chất hữu cơ đa vòng thơm bao gồm đánh giá tính đa dạng VSV dựa trên khả năng sử dụng nguồn carbon duy nhất hay sử dụng đồng thời một vài nguồn carbon (đồng trao đổi chất) của các quần xã VSV và phân tích axít béo phospholipid. Tuy nhiên, việc sử dụng nguồn carbon có thể không đại diện cho tất cả các nguồn carbon trong đất và dẫn đến không đầy đủ về thông tin quần xã VSV. Phân tích axít béo phospholipid có thể bị ảnh hưởng bởi nhiệt độ và dinh dưỡng và các acid béo có thể không đại diện cho loài đặc hiệu (một VSV có thể có nhiều acid béo và cũng acid béo có thể có trong nhiều loài). Do vậy, phương pháp hóa sinh thường được sử dụng kết hợp với phương pháp sinh học phân tử khác để đánh giá đa dạng VSV trong đất và nước ô nhiễm. 1.6.3. Phương pháp sinh học phân tử Phương pháp sinh học phân tử là công cụ hiện đại để đánh giá sự đa dạng của các VSV trong đất. Phương pháp này dựa vào cấu trúc ở mức độ DNA, RNA hay gene của các VSV để đánh giá sự đa dạng đến loài. Các kỹ thuật hiện nay được sử dụng bao gồm: (1) tỷ lệ phần trăm G+C; (2) tái liên kết và lai acid nucleic; (3) DNA microarray (array gene chức năng, array genome cộng đồng, array oligonucleotide phát sinh loài, mẫu dò hệ gene đảo chiều); (4) PCR (nhân đoạn gene 16S rRNA, 18S rRNA, 23S rRNA, PCR đơn giản và PCR đa thành phần, real-time PCR); (5) điện di trên gel với dải nồng độ biến tính (DGGE) hoặc nhiệt độ biến tính (TGGE); (6) đa hình chiều dài đọa cắt bởi enzyme giới hạn (RFLP) hay phân tích cắt enzyme giới 38 hạn rDNA đã được khuếch đại (ARDRA); (7) đa hình chiều dài đoạn cắt giới hạn cuối (T-RFLP); (8) phân tích khoảng đệm gene ribosome (RISA), phân tích khoảng đệmliên gene ribosome (ARISA); (9) xác định trình tự lặp lại cao hoặc các vùng vệ tinh; (10) đa hình cấu trúc sợi đơn (SSCP) (Nguyễn Bá Hữu, 2009; Maphosa, 2012). Tuy nhiên, mỗi phương pháp đều có những ưu điểm và nhược điểm riêng. Do đó, để có kết quả phân tích chính xác sự đa dạng VSV trong đất cần kết hợp nhiều phương pháp nghiên cứu khác nhau. Trong nghiên cứu này, các phương pháp nghiên cứu đa dạng VSV bao gồm nuôi cấy truyền thống (làm giàu, phân lập VK KK) và phương pháp sinh học phân tử hiện đại như nested-PCR, DGGE đã được sử dụng đánh giá sự đa dạng các VK KK nuôi cấy được và không nuôi cấy được. Ngoài ra, nghiên cứu này cũng đã được tiếp cận với công cụ Metagenomics là công cụ đánh giá sự đa dạng VSV đầy đủ nhất cho đến thời điểm hiện nay. 1.6.4. Phương pháp Metagenomics Trong những năm trở lại đây, Metagenomics đã tạo nên những tiến bộ vượt bậc trong sinh thái học, tiến hóa và đa dạng VSV. Đây là định hướng mới, quan trọng và trở thành chiến lược trong phát triển kinh tế bền vững, an ninh quốc phòng, bảo vệ sức khỏe và môi trường trên thế giới hiện nay (Riesenfeld, 2004). Metagenomics là công cụ mới, tổ hợp của rất nhiều kỹ thuật sinh học kết hợp tin sinh học để phân tích, sàng lọc, xây dựng thư viện metabase, quản lý và khai thác cho các mục tiêu phát triển kinh tế, bảo vệ môi trường từ nguồn DNA, RNA được tách chiết thẳng từ môi trường tự nhiên, cơ thể người, động thực vật không thông qua nuôi cấy (Meyer, 2008). Metagenomics đã được nghiên cứu trong 5-10 năm qua nhằm nghiên cứu hệ sinh thái VSV, sự tiến hóa và sự đa dạng VSV bao gồm cả đa dạng chủng loài, gene chức năng. Metagenomics cũng có thể sử dụng hiệu quả trong việc giám định pháp y, bảo vệ sinh học (biodefense), phát triển nông nghiệp bền vững (Handelsman, 2004). Để nghiên cứu quần xã không thông qua nuôi cấy, một loạt các phương pháp và kỹ thuật đã được sử dụng như kỹ thuật PCR định lượng (qPCR), lai in situ đánh dấu huỳnh quang, xác định hoạt tính enzyme, phân tích phóng xạ đặc hiệu cơ chất, 39 nghiên cứu hệ phiên mã (transcriptomics), hệ protein (proteomics) và xác định trình tự DNA (meta)genome hoặc DNA được khuếch đại bởi phản ứng PCR từ mẫu môi trường bằng máy giải trình tự công năng cao thế hệ mới. Các công cụ này được sử dụng kết hợp với nhau để cung cấp những hiểu biết sâu sắc toàn diện hơn về các quá trình vi sinh vật liên quan đến phân hủy loại khử clo (Maphosa, 2012). Metagenomics đã được sử dụng để nghiên cứu quần xã sinh vật trong nhiều loại môi trường khác nhau như ruột mối, đường ruột ở người, hệ thống xử lý nước thải và hệ thống thoát nước mỏ acid v.v. (Beloqui, 2006; Fang, 2011; Hug, 2013). Một cấu trúc quần xã phù hợp giữ vai trò thiết yếu trong quá trình loại khử clo hoàn toàn ở một hệ thống phân hủy sinh học. Cho đến nay, nhiều nghiên cứu liên quan đến sự đa dạng của VK hô hấp loại khử clo và quá trình trao đổi chất của chúng (bao gồm cả dòng năng lượng bên trong quần xã VK KK) đã được thực hiện. Các quần xã VK cần cho mục đích phân hủy sinh học thường dựa trên sự tương tác đa loài trong theo mạng lưới. Các VK hô hấp loại clo thường sống trong quần xã nhưng chúng khó phân lập ở dạng chủng sạch nên cần thiết phải xác định đặc diểm của quần xã dựa vào công cụ Metagenomics. Các ứng dụng của công cụ Metagenomics đã đưa một cái nhìn tổng thể về thành phần di truyền của quần xã vi sinh vật bao gồm các thông tin về định loại và khả năng trao đổi chất tiềm năng (như hoạt động loại khử clo) của các thành viên trong quần xã. Hiện nay, hiểu biết về cấu trúc quần xã một cách phù hợp giữ vai trò thiết yếu trong quá trình xử lý bằng loại clo hoàn toàn xảy ra ở các hệ thống phân hủy sinh học. Đặc biệt, đối với các VSV tham gia vào quá trình loại khử clo các hợp chất ô nhiễm chứa clo, các VK KK hô hấp loại khử clo rất khó nuôi cấy và phân lập ở dạng chủng sạch nên khó xác định các đặc điểm sinh học và vai trò của mỗi cá thể trong quần xã. Hiện nay, công cụ Metagenomics đã được một số nhà khoa học trên thế giới sử dụng để đánh giá sự đa dạng quần xã vi khuẩn (KB-1, ANAS, Donnall) tham gia vào quá trình loại khử clo và mối quan hệ về trao đổi chất giữa các VK này trong quần xã (Maphosa, 2012; Hug, 2012, 2013). Chẳng hạn, đối với quần xã VK loại khử clo của TCE, ban đầu Dehalococcoides xuất hiện và chiếm ưu thế để tham gia quá trình loại 40 khử clo trong quần xã ANAS. Các gene rdhA được phát hiện trong quần xã có cấu trúc gần với các gene đã được công bố trong genome của các chủng D. mccartyi khác nhau. Tiếp theo, các gene hydrogenase chiếm ưu thế vì nó tham gia vào quá trình trao đổi chất hydro trong quần xã. Phân tích cấu trúc quần xã ANAS giả thiết rằng có sự sinh trưởng mạnh của các VK dị dưỡng sinh hydro khác nhau (các VK lên men, nhóm VK tự dưỡng sinh acetate) và các nhóm tiêu thụ (nhóm loại khử clo và sinh metan). Hydro cần thiết cho các VK loại khử clo và sinh metan, duy trì ổn định hoạt tính loại clo. Tiếp theo là quá trình tổng hợp cobalamin, một cofactor quan trọng của quá trình loại khử clo. Gene này có mặt ở một số VK trong đó có Dehalococcoides. Các VK khác trong quần xã cũng có vai trò quan trọng trong quá trình tổng hợp cobalamin. Metagenomics cũng được sử dụng để xác định metagenome của hỗn hợp gồm hai chủng Dehalobacter sp. E1 và Sedimentibacter sp. B4 có khả năng loại khử clo của beta-hexa-chlorocyclohexane (Maphosa, 2012). Dehalobacter sp. không thể được nuôi cấy ở dạng chủng sạch và cần có VK Sedimentibacter để duy trì khả năng loại khử clo (Van Doesburg, 2005). Phân tích metagenome cho thấy Dehalobacter có số lượng gene rdhA tăng lên trong quá trình loại khử clo của các hợp chất như chloroform, chloroethane, methane. Sự có mặt của nhiều nhóm gene rdhA giả thiết Dehalobacter có khả năng loại khử clo của nhiều hợp chất hơn so với chúng ta đã biết trước đây. Sedimentibacter giữ vai trò là chủng hỗ trợ (như tạo ra cofactor) cho Dehalobacter sinh trưởng và duy trì hoạt tính loại clo. Metagenome của hỗn hợp KB-1 có khả năng loại khử clo của TCE chứa các chi Dehalococcoides, Geobacter, Methanosarcina, Spirochaeeta và Sporomusa. Quần xã ANAS loại clo của PCE có Dehalococcoides và một số VK lên men, VK sinh metan và nhiều VK khác (Hug, 2012, 2013). Phân tích metagenome của các quần xã VK có khả năng chuyển hóa các hợp chất chứa clo cho thấy các VK KK hô hấp loại khử clo chỉ chiếm một phần rất nhỏ trong tổng số quần xã VSV. Hiểu được cấu trúc của quần xã và chức năng của mỗi cá thể trong quần xã giúp cho việc tăng cường hiệu quả phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo. Khi sử dụng các kỹ thuật nhận diện (fingerprinting) phân tử như DGGE, TRFLP từ các đoạn gene 16S rRNA để nghiên 41 cứu các quần xã VK KK loại clo cho thấy quá trình loại clo hoàn toàn từ PCE đến ethene xảy ra ở các hệ VSV khác nhau, quần thể loại clo là giống nhau nhưng không xác định được các con đường lên men giống và khác nhau khi có mặt hay không có mặt nhóm VK sinh methane. Việc hiểu được tổng thể quần xã VK KK và sự tương tác của chúng có thể trả lời các câu hỏi như tại sao quá trình tạo ra ethen bị chậm lại mặc dù Dehalococcoides vẫn có mặt (Daprato, 2007). Phương pháp Metagenomics kết hợp với (meta)transcriptomics và proteomic cho phép chúng ta biết được hoạt động thực tế của VSV. Công cụ Metagenomics đã được sử dụng để xác định cấu trúc của quần xã VK KK được làm giàu từ bùn ô nhiễm ở Alameda Naval Air Station (ANAS), California đã loại clo của TCE đến ethene (Richarson, 2002; Freeborn, 2005; Holmes, 2006). Kết quả phân tích bằng Metagenomics đã chứng minh thành phần của quần xã VK KK được nghiên cứu bằng thư viện dòng gene 16S rRNA và microarray trước đây. Dựa trên hai quần thể chứa Dehalococcoides, các tác giả đã xác định các VK trong quần xã thuộc nhóm Gram dương có tỷ lệ G+C thấp (chủ yếu là Clostridium và Eubacterium sp.), Bacteroides sp., Citrobacter sp., Proteobacteria (chủ yếu là Desulfovibrio sp.). Xác định trình tự metagenome chỉ ra chỉ ra sự thay đổi về các loài chiếm ưu thế và có mặt cả nhóm VK sinh metan là khác biệt so với việc sử dụng các công cụ sinh học phân tử khác. Phân tích metagenome không chỉ đưa ra thông tin về quần xã VK KK loại khử clo hoạt động như thế nào mà nó có thể xác định khả năng ô nhiễm các hợp chất trung gian khác do các VSV này sinh ra. Ngoài ra, thông tin của metagenome cũng cho phép các nhà nghiên cứu phân tích so sánh giữa các VK KK hô hấp loại khử clo như Dehalococcoides, Dehalobacter, Desulfitobacterium và các quần xã VK loại khử clo khác, quá trình trao đổi chất của chúng và mối quan hệ giữa các loài trong quần xã. Metagenomics cho phép chúng ta nghiên cứu động học và mối tương tác bên trong phạm vi quần xã VSV bao gồm sự trao đổi và cung cấp chất dinh dưỡng giữa các loài cùng với vai trò của các vi khuẩn hô hấp loại clo đặc hiệu liên quan đến quá trình phân hủy các chất ô nhiễm chứa clo. Ngoài ra, một số VK 42 khác trong quần xã liên quan tới quá trình loại khử clo như các chủng sinh hydro và methane cũng được xác định trình tự và chúng có thể hữu ích cho các mục đích khác như tạo ra năng lượng sinh học. Hơn nữa, về phương diện an toàn thì sự tạo thành methane trong các thủy vực là điều không mong muốn. Do đó, việc làm thiết yếu là hiểu rõ hoạt động của VK sinh metan khi một chất cho điện tử được bổ sung vào để kích thích quá trình loại khử clo. Vì vậy, cần hiểu rõ vai trò của các VSV trong quần xã trong đó có VK sinh methane có thể giúp chúng ta tiết kiệm nhu cầu năng lượng trong quá trình thiết lập lô xử lý bằng phân hủy sinh học. Để hiểu được chi tiết các mối quan hệ giữa các VSV trong quần xã, việc sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu là cần thiết. Vai trò của nghiên cứu cơ bản khi sử dụng các phương pháp nêu trên phục vụ trực tiếp hay gián tiếp cho nghiên cứu phân hủy, chuyển hóa hay khoáng hóa nhằm khử độc làm sạch dioxin và các chất tương tự hiện có trên thế giới và ở Việt Nam sẽ được trình bày dưới đây. 1.7. Các phƣơng pháp làm sạch các nguồn ô nhiễm dioxin và các hợp chất tƣơng tự bằng phân hủy sinh học Hiện nay, trên thế giới có khoảng 50 công nghệ sử dụng các phương pháp vật lý, hóa học và sinh học đã, đang được nghiên cứu và ứng dụng trong xử lý tẩy độc các hợp chất POP trong đó có chất diệt cỏ/dioxin. Các công nghệ này được xếp thành 4 nhóm là các công nghệ đã được thương mại hóa với nhiều kinh nghiệm (khử bằng hóa chất ở pha khí, khử natri, xúc tác…), các công nghệ tiến gần hoặc ở giai đoạn bắt đầu thương mại hóa (oxi hóa muối nóng chảy, điện sônvat), các công nghệ nhiều triển vọng (nghiền bi phân tử, oxi hóa điện hóa trung gian, kim loại nóng chảy…) và công nghệ gần như có thể ứng dụng để phân hủy các kho chứa POPs (phản ứng Fenton, phân hủy nhờ nấm mục trắng, do enzyme, phân hủy nhờ thực vật…) (UNEP, 2005). Tại Việt Nam, các công nghệ đã, đang được thực hiện và thử nghiệm ở quy mô pilot bao gồm công nghệ hóa cơ (mechano-chemical destruction -MCD) của EDL (Newzealand) (phương pháp vật lý), công nghệ giải hấp thụ nhiệt của Mỹ (phương pháp hóa học) và công nghệ chôn lấp tích cực của 43 Viện Công nghệ sinh học (phương pháp phân hủy sinh học). Công nghệ chôn lấp tích cực đã xử lý thành công ở quy mô 3.384 m3 với giá thành 150 USD/m3. Công nghệ giải hấp thu nhiệt đẵ bắt đầu khởi động và cuối năm 2012 với quy mô 12.400 m3 và giá thành 600-800 USD/m3. Công nghệ MCD mới trình diễn ở pilot hiện trường năm 2012 và sẽ thử nghiệm ở quy mô 100 m3. So với các phương pháp vật lý và hóa học thì phương pháp phân hủy sinh học cũng có hạn chế là tốc độ phân hủy chậm hơn, khó kết hợp được hoạt động của các vi khuẩn hiếu khí và kỵ khí tại cùng một thời điểm và địa điểm. Tuy nhiên, làm sạch ô nhiễm bằng phân hủy sinh học có ưu điểm hơn hẳn so với các phương pháp vật lý và hóa học bởi tính kinh tế, an toàn và thân thiện với môi trường. Xử lý ô nhiễm các hợp chất hữu cơ chứa clo trong đó có dioxin và các hợp chất tương tự có thể có nhiều cách: sử dụng các tế bào VSV, kích thích sinh học, tăng cường sinh học, hấp phụ sinh học và làm sạch bằng thực vật (Nam, 2005, Yoshida, 2005, Sonoki, 2006). - Sử dụng các tế bào VSV: các hợp chất PCDD bị khử 75% và 20% trong các mẫu tro nhà máy đốt chất thải rắn có bổ sung tương ứng các tế bào VSV sống và chết trong 15 ngày xử lý (Nam, 2005). Khi bổ sung thêm chủng VK RW1 đã tăng cường loại bỏ đến 10,3% các PCDD/F. Biphenyl dioxygenase cải biến từ chủng VK B. xenovorans LB400 phân hủy được các dioxin chứa clo (Mohammadi, 2005). - Kích thích sinh học: là quá trình kích thích làm tăng số lượng các VSV bản địa tham gia phân hủy chất ô nhiễm bằng cách thay đổi các yếu tố môi trường như oxy, nguồn dinh dưỡng, các chất cho điện tử, các chất làm cho chất ô nhiễm có tính sẵn sàng sinh học cao hơn v.v. để thúc đẩy quá trình chuyển hóa, phân hủy và khoáng hóa dioxin, chất diệt cỏ, các chất trao đổi vẫn còn độc nhanh hơn. Tóm lại, kích thích sinh học là tạo điều kiện môi trường thuận lợi để quá trình phân hủy sinh học hỗn hợp các chất ô nhiễm xảy ra nhanh nhất (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Tại các lô xử lý của sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa, phương pháp kích thích sinh học đã được áp dụng và đã có những kết quả rõ rệt (sẽ được trình bày ở cuối chương). Hiraishi và đtg (2001) đã bổ sung compost khử trùng vào các chai chứa PCDD/F và 22% PCDD/F đã bị loại bỏ trong 3 tháng nuôi cấy với nồng độ ban đầu khoảng 4.000 pg TEQ/g đất khô. 44 - Tăng cường sinh học: là quá trình bổ sung các VSV có khả năng phân hủy các chất ô nhiễm cao vào các vị trí ô nhiễm chưa có hoặc đã có mặt các VSV này nhưng với nồng độ thấp (Krajmalnik-Brown, 2005). Ưu điểm của phương pháp này là chọn lọc được những chủng có hoạt tính cao có khả năng phân hủy các chất chúng ta mong muốn. Nhược điểm của phương pháp này là phải chọn lựa các chủng không có độc tố, không gây bệnh đối với con người và động thực vật. Hơn thế nữa phương pháp này chỉ có thể có hiệu quả khi tất cả các yếu tố môi trường có thể kiểm soát được. Thông thường chúng ta kết hợp cả biện pháp kích thích và tăng cường sinh học thì công nghệ sẽ mang lại hiệu quả cao hơn với quy mô nhỏ và vừa. Đối với khu vực ô nhiễm lớn, rất độc thì tăng cường sinh học sẽ không mang lại hiệu quả cả về hiệu quả và kinh tế. - Làm sạch ô nhiễm trong đất, nước và trầm tích bằng thực vật cũng là một kỹ thuật hiệu quả. Sonoki và đtg (2006) đã tách dòng gene mã hóa laccase, LiP và MnP từ các nấm đảm trắng P. chrysosporium,Trametes versicol và biểu hiện các sản phẩm gene tái tổ hợp trong cây Arabidopsis thaliana. Sau đó, A. thaliana tái tổ hợp được sử dụng để loại bỏ dioxin ở trong phòng thí nghiệm và có kết quả dương tính. Dioxin cũng có thể được hấp thụ bởi Boussonetia papyrifera ở đất nhiễm nặng và bởi Physalis angulatal ở đất nhiễm nhẹ. Sự hấp thụ dioxin ở mức thấp cũng được phát hiện trong zucchini (Jonhson, 2008). Tuy nhiên sau khi hấp thụ vào cây thì thực vật này sẽ phải mang đốt ở trên 12000C để dioxin bị loại bỏ hoàn toàn. Đây là yếu điểm làm cho phương pháp này khó có thể áp dụng trên quy mô thực tế. - Hấp phụ sinh học: là sự hấp phụ hoặc tích lũy các chất hóa học bởi sinh khối VSV. Các nhà khoa học Hàn Quốc đã chứng minh sự loại bỏ PCDD/F và các hợp chất hữu cơ chứa clo bằng sự hấp phụ sinh học (Nam, 2006). Sinh khối tế bào chết của chủng Bacilluspumilus PH-01 đã hấp phụ PCDD/F tốt hơn so với các sinh khối của các tế bào sống tương tự. Tế bào từ B.pumilus có thể hấp phụ các hợp chất PCDD/F, PCB, chlorobenzene và chlorinate naphtalene (Hong, 2000). Ở Việt Nam, các nghiên cứu về phân hủy sinh học các hợp chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin cũng đã và đang được tiến hành trong hơn 1 thập kỷ qua. Quá trình được thực hiện từ các nghiên cứu cơ bản đến quy mô phòng thí nghiệm, 45 sau đó là áp dụng ngoài hiện trường và thực hiện khử độc với các quy mô khác nhau từ 0,5 đến 3384 m3. Hiệu quả khử độc thu được từ các quy mô xử lý cũng khác nhau và khá lý thú (từ 30% đến 99,8%). Trong các lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa cũng như tại các điểm ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học đã nghiên cứu đa dạng cấu trúc quần xã VSV và đặc điểm sinh học của các chủng thuần khiết sau khi phân lập từ các vùng nhiễn độc và các lô xử lý khử độc. Để làm rõ mục tiêu nghiên cứu cũng như các đóng góp mới của luận án, các nghiên cứu về quá trình tẩy độc, VK chuyển hóa và loại khử clo ở Việt Nam đã thực hiện như thế nào sẽ được trình bày ở các mục tiếp theo. 1.8. Nghiên cứu về phân hủy sinh học chất diệt cỏ chứa dioxin ở Việt Nam Các nghiên cứu trên thế giới đã cung cấp các bằng chứng về khả năng VSV loại bỏ các hợp chất PCDD/F trong đất thông qua nhiều công trình từ đầu những năm 90 của thế kỷ trước. Các nghiên cứu xây dựng công nghệ khử độc các vùng ô nhiễm các hợp chất PCDD/F ở quy mô từ phòng thí nghiệm đến thử nghiệm hiện trường nhằm xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ và đồng phân dioxin 2,3,7,8-TCDD ở các “điểm nóng” tại Việt Nam đã được thực hiện. Trong hơn mười năm qua bắt đầu từ 1999, nhiều đề tài khoa học và dự án thử nghiệm đã được tiến hành để tạo ra công nghệ khử độc đất bị ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Đà Nẵng và Biên Hòa với mức độ ô nhiễm khác nhau (từ 10.000 đến 43.000 pg TEQ/g đất khô) bằng công nghệ phân hủy sinh học. Sử dụng công nghệ phân hủy sinh học ở các điều kiện, quy mô khác nhau, từ phòng thí nghiệm đến pilot hiện trường đã được thực hiện từ năm 2000 đến 2009 và quá trình đánh giá sự phân hủy sinh học kéo dài cho đến nay. Ngay từ những giai đoạn đầu tiên, dựa trên kết quả xử lý ở quy mô phòng thí nghiệm dạng pilot với 15 kg, 50 kg đất ô nhiễm, các công thức xử lý bằng chôn lấp tích cực đơn giản quy mô 10 và 100 m3 đã tiến hành. Ở quy mô 0,5 và 1,5 m3, với 10 công thức xử lý khác nhau nhằm kích thích quần xã VSV hiếu khí và vi hiếu khí đã được thử nghiệm tại Đã Nẵng. Mục đích của các công thức khác nhau là tìm được tổ hợp “chất nuôi” phù hợp nhất để VSV hiếu khí khử độc có hiệu quả cao nhất. Trong các nghiên cứu này cũng đã khẳng định với tổng độ độc lên tới 268.000 46 ng TEQ/kg VSV vẫn loại bỏ được 51% tổng độ độc sau 2 năm xử lý. Kết quả thu được đã góp phần vào việc xác định ngưỡng độc của đất cao đến vài trăm nghìn ng TEQ/kg đất mà VSV vẫn sinh trưởng và phân hủy được chất diệt cỏ/dioxin. Công nghệ xử lý khử độc bằng phân hủy sinh học trong các hố chôn lấp (gọi là chôn lấp tích cực) đã được tiến hành quy mô 3.384 m3 thành công. Sau 27 tháng và 40 tháng xử lý, 99,48 % đến 99,8 % tổng độ độc của lô xử lý đã được loại bỏ khi kết quả phân tích được đánh giá bởi các phòng thí nghiệm khác nhau trong nước và quốc tế. Năm 2009, sau khi thực hiện khử độc 3.384 m3 tại sân bay Biên Hòa, để so sánh hiệu quả tốc độ khử độc bởi công nghệ của Việt Nam và Hoa Kỳ, các lô xử lý ở quy mô nhỏ hơn 2 m3 với 11 công thức xử lý khác nhau đã được thực hiện ở Đà Nẵng. Trong số 11 công thức xử lý có 5 công thức xử lý kỵ khí đã được thiết kế và thực hiện bởi Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam (VAST) và EPA. Quá trình phân hủy sinh học thành công khi kích thích và điều khiển được cả 4 quá trình phân hủy sinh học xảy ra trong các hố chôn lấp. Đó là oxy hóa cắt vòng thơm, loại clo các sản phẩm cắt vòng, xúc tác bởi enzyme ngoại bào và loại khử clo. Quá trình loại khử clo xảy ra trong điều kiện kỵ khí và kỵ khí bắt buộc còn ba con đường còn lại xảy ra ở điều kiện hiếu khí. Đây là bài toán rất khó và chỉ có thể điều khiển các quá trình phân hủy sinh học thông qua “thức ăn” cho tất cả quần xã VSV và điều kiện môi trường để “thức ăn” đó tác động làm cho chúng hoạt động trong các hệ mini sinh thái và ở các tầng đất khác nhau của hố chôn. Thông tin về sự đa dạng VK KK bắt buộc và không bắt buộc, hiệu quả xử lý ở hai sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa trong quá trình nghiên cứa xử lý sẽ được trình bày ở phần tiếp theo dưới đây. 1.8.1. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng Từ năm 2000, nghiên cứu đầu tiên về quá trình khử độc đất nhiễm chất độc hóa học đã được thực hiện thông qua việc đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin bởi các chủng VSV đã được làm sạch ở quy mô phòng thí nghiệm.Các VSV phân lập từ Đà Nẵng có khả năng phân hủy 39,37% 2,4,5-T (chủng Pseudomonas sp. BDN15) (La Thanh Phương, 2005), 14-86% PAH tùy loại ở nồng 47 độ ban đầu 100 ppm (chủng BDNR1, BDNR4) (Nguyễn Ngọc Bảo, 2010). Dựa trên kết quả nghiên cứu đó, phương án khử độc cho các “điểm nóng” nhiễm dioxin của Việt Nam theo hướng “chôn lấp tích cực” đã được thực hiện tại Ðà Nẵng. Phương pháp “chôn lấp tích cực” dựa trên chôn lấp kết hợp với cô lập, hấp phụ đất ở bên trong các lô xử lý khử độc bằng kích thích quần xã VSV bản địa. Tại sân bay Đà Nẵng đã thực hiện biện pháp phân hủy sinh học ở các quy mô khác nhau, từ 0,5 đến 100 m3 (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). Xử lý ở quy mô 0,5 m3 với 5 công thức từ 0,5DN1-0,5DN5 nhằm tìm ra công thức xử lý phù hợp nhất cho quá trình phân hủy sinh học. Xử lý ở quy mô 1,5 m3 với 5 công thức từ 1,5DN1-1,5DN5 nhằm tìm ra ngưỡng dioxin mà ở đó quá trình phân hủy sinh học vẫn xảy ra. Kết quả cho thấy khi tổng độ độc lên tới 268.000 pg TEQ/g đất vẫn xảy ra quá trình phân hủy sinh học bởi VSV (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). Xử lý ở quy mô 10 m3 (100DNT) và 100 m3(100DNT): Chôn đất ô nhiễm ở 2 quy mô với đối chứng giống hệt nhau trong các vật liệu bền không cho đất, nước trong hố chôn rò rỉ ra ngoài, bọc kín và cho đất cát lên trên bề mặt đã kín của hố chôn. Bổ sung các “chất nuôi” VSV trong quá trình thi công hố. Nước và các chất nuôi VSVđược định kỳ bổ sung thông qua các ống đã đặt sẵn. Khác với Biên Hòa, các hố này chỉ có độ sâu 1m (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). Xử lý ở quy mô 2 m3: Trong khuôn khổ hợp tác với Cục Bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (EPA) do quỹ Ford tài trợ, Viện Công nghệ sinh học (IBT) đã thiết kế các lô kỵ khí chôn lấp tích cực quy mô 2 m3 ở sân bay Đà Nẵng như sau: năm lô xử lý kỵ khí chôn lấp tích cực (được ký hiệu từ P1 – P5) trong đó P1 là mẫu đối chứng kỵ khí, P2, P3, P4 là ba công thức xử lý khác nhau của IBT và công thức P5 của EPA. Các lô xử lý kỵ khí được đặt trong các túi HDPE hàn kín để đảm bảo độ kỵ khí. Đất từ các lô xử lý này cũng được lấy từ mẫu trộn 3 vị trí ô nhiễm khác nhau (Đặng Thị Cẩm Hà, 2010a). Đã có báo cáo rất chi tiết về nghiên cứu cơ bản và nghiên cứu công nghệ với sự đánh giá hiệu quả xử lý quá trình phân hủy sinh học bởi các VSV hiếu khí tại sân bay 48 Đà Nẵng ở các quy mô và thời kỳ khác nhau. Các nghiên cứu cơ bản thực hiện sớm nhất đã cho thấy mặc dù nồng độ dioxin và các chất ô nhiễm khác ở 18 điểm thuộc bãi nhiễm độc tại Ðà Nẵng cao nhưng vẫn tồn tại quần xã VSV không đa dạng về chủng loại song không quá thấp về số lượng. Trong các công thức xử lý, tổng độ độc đã giảm từ 32,84% đến 71,04% sau 1 tháng (quy mô phòng thí nghiệm) và giảm 5070% sau gần 2 năm xử lý (quy mô hiện trường). Sau 14, 24 và 33 tháng, số lượng VSV vẫn duy trì ổn định. Số lượng VSV trong các lô xử lý đã tăng hàng triệu lần so với lô đối chứng và đất trước khi xử lý (Đặng Thị Cẩm Hà, 2008). 1.8.2. Phân hủy sinh học ở lô xử lý tại sân bay Biên Hòa Năm 2009, các nhà khoa học Viện Công nghệ sinh học - Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam đã phối hợp với Bộ Tư lệnh Hóa học - Bộ Quốc phòng tiến hành khử độc thành công 3.384 m3 đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa. Sau 27 tháng xử lý, tổng độ độc của dioxin trong các mẫu đất giảm từ khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất xuống còn 52 ng TEQ/kg đất khô. Hiệu quả xử lý đạt 99,48 % và đã xuống dưới mức quy định cho đất sử dụng sản xuất nông nghiệp (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Để đạt được hiệu quả xử lý như vậy cần duy trì sinh trưởng cũng như tốc độ phân hủy tốt các chất độc của VSV, do đó các chế phẩm chứa “chất nuôi” VSV cần phải bổ sung định kỳ vào các lô xử lý. Trong quá trình thi công hố chôn lấp tích cực tại Biên Hòa, 3 chế phẩm Slow-D, DHS1, DHS2 đã được tưới trộn đều với đất ô nhiễm và các phụ gia, chất độn khác. Tùy thuộc vào từng loại chế phẩm có các đặc điểm khác nhau mà thời điểm bổ sung chế phẩm là khác nhau. Chẳng hạn, chế phẩm Slow-D dạng viên nén rắn, chứa các chất dinh dưỡng cần thiết cho quá trình phân hủy chất diệt cỏ/dioxin ở các điều kiện kỵ khí và kỵ khí tùy tiện của VSV. Các chất dinh dưỡng ở chế phẩm này được giải phóng từ từ vào đất xử lý nên nó được bổ sung chỉ một lần khi thi công. Chế phẩm DHS1 dạng bột, DHS2 dạng lỏng bổ sung định kỳ vào hố chôn theo nhu cầu của VSV và dựa trên kết quả quan trắc tổng hợp của đợt phân tích mẫu trước đó. Để xử lý triệt để các hợp chất hữu cơ chứa clo gây ô nhiễm môi trường cần có sự tham gia của rất nhiều nhóm VSV, trong đó không thể thiếu các nhóm VK KK 49 có khả năng hô hấp loại khử clo. Sự đa dạng của các nhóm VK KK có khả năng loại khử clo phụ thuộc rất nhiều vào độ sâu của lớp đất hay nước. Các lô xử lý cần đảm bảo kỵ khí, đặc biệt là phía dưới đáy hố chôn để tạo điều kiện thuận lợi cho sự sinh trưởng của VK KK. Mức độ kỵ khí cũng tăng lên khi các hố chôn được bổ sung nước theo định kỳ. 1.8.3. Các nghiên cứu về vi khuẩn chuyển hóa và loại khử clo ở Việt Nam Tại các lô xử lý và vị trí ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng, đã có nhiều nghiên cứu cơ bản về các nhóm VSV hiếu khí, kỵ khí tùy tiện và kỵ khí bắt buộc có khả năng sử dụng các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin như nguồn carbon và năng lượng duy nhất hay đồng trao đổi chất. Cụ thể là, một số tác giả đã nghiên cứu chi tiết đặc điểm sinh học, khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ vòng thơm chứa hay không chứa clo. Một số nghiên cứu đã phát hiện được VK Burkholderia, Sphingomonas, Pseudomonas, Terrabacter, Paenibacillus, Arthrobacter và các quần xã VSV phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Ðà Nẵng sử dụng 2,4,5-T là nguồn carbon theo cơ chế đồng trao đổi chất (Kiều Hữu Ảnh, 2003, Hoàng Thị Mỹ Hạnh, 2004, Đặng Thị Cẩm Hà, 2005, La Thanh Phương, 2005, Lê Văn Nhương, 2005).Trong bộ sưu tập giống VSV phân lập từ đất nhiễm ở chất diệt cỏ/dioxin Ðà Nẵng của Viện Công nghệ sinh học, một số chủng đã được định tên bằng cả phương pháp truyền thống kết hợp với xác định trình tự gene 16S rRNA, 18S rRNA bao gồm các chủng nấm sợi, vi khuẩn, xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces, Brevibacillus, Bacillus, Pseudomonas, Aspergillus, Curvularia, Trichoderma, Desulfovibrio. Các chủng VSV thuộc các chi này đều có khả năng phân hủy 2,3,7,8-TCDD, 2,4,5-T, 2,4-D, DBF, PAH v.v. ở các mức độ khác nhau theo cơ chế đồng trao đổi chất hay sử dụng các hợp chất này là nguồn carbon và năng lượng duy nhất (Đặng Thị Cẩm Hà, 2008, Nguyễn Bá Hữu, 2009). Theo nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu, chủng Rhodococcus sp. HDN3 và Terrabacter sp. DMA phân hủy hoàn toàn DBF với nồng độ 4 mM sau 24 và 48 giờ nuôi cấy. Gene dbfA1 mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình oxy hóa DBF có 50 mặt ở chủng Terrabacter sp. DMA và Rhodococcus sp. HDN3. Chủng Terrabacter sp. DMA phân lập từ bãi nhiễm chất diệt cỏ/dioxin có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa 2,4-D, 2,4,5-T như nguồn carbon đồng trao đổi chất. Chủng Paenibacillus sp. Ao3 được phân lập từ bùn ao nhiễm chất diệt cỏ có khả năng sinh trưởng trên môi trường chứa 2,4-DCP, polychlorophenol là nguồn carbon đồng trao đổi (Nguyễn Bá Hữu, 2009). Ngoài ra, các phương pháp sinh học phân tử hiện đại như DGGE, SSCP, MPNPCR đã được sử dụng để nghiên cứu cấu trúc quần xã VSV nói chung, quần xã VK hiếu khí, VK KK không bắt buộc và nhóm Dehalococcoides trong các mẫu bùn hồ, mẫu đất và trầm tích ở một số lô xử lý tại Đà Nẵng (Nguyễn Bá Hữu, 2006, 2007a, 2009). Tuy nhiên, các VK hô hấp loại khử clo như Dehalococcoides mới chỉ được khẳng định là có mặt trong lô xử lý 10 m3 tại Đà Nẵng bằng phương pháp DGGE (Nguyễn Bá Hữu, 2006, 2009). Ngoài ra, khả năng sinh laccase, peroxidase của một số chủng vi khuẩn, xạ khuẩn và nấm sợi phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin và các lô xử lý tại Đà Nẵng cũng đã được nghiên cứu (Nguyễn Thị Sánh, 2005, 2007, Đặng Thị Cẩm Hà, 2009, 2010b, Nguyễn Quang Huy, 2010). Bên cạnh đó, một số nghiên cứu về các gene mã hóa cho enzyme tham gia phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T (tfdA, cfdA, cadA) cũng đã được nghiên cứu ở một số VK hiếu khí, kỵ khí không bắt buộc và xạ khuẩn (Nguyễn Thị Sánh, 2005, Nguyễn Bá Hữu, 2009). Các gene cadA và tfdA mã hóa cho enzyme tham gia vào bước đầu tiên của quá trình phân hủy 2,4-D và 2,4,5-T đã được xác định có mặt ở các chủng Arthrobacter sp. DNB19, Terrabacter sp. DMA, Paenibacillus sp. Ao3 và Rhodococcus sp. HDN3 (Nguyễn Bá Hữu, 2009). So với các lô xử lý ở Đà Nẵng thì lô xử lý ở Biên Hòa được nghiên cứu rất ít về cả VSV hiếu khí và kỵ khí. Cho đến nay, các nghiên cứu mới chỉ tập trung vào sự biến động số lượng VSV hiếu khí, VK KK không bắt buộc có khả năng sử dụng các thành phần của chất diệt cỏ như nguồn carbon duy nhất hay theo cơ chế đồng trao đổi chất (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Tuy nhiên, chưa có một nghiên cứu nào tập trung vào sự đa dạng VK KK bắt buộc và không bắt buộc trong các lô xử lý, đặc 51 biệt là các VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo cũng như các gene mã hóa cho các enzyme tham gia vào quá trình hô hấp loại khử clo. Do đó, luận án này sẽ tập trung vào một số nghiên cứu cơ bản về nhóm VK KK loại khử clo nói chung và các nhóm VK KSF, Dehalococcoides, Pseudomonas nói riêng là đại diện của 3 nhóm hô hấp loại khử clo điển hình. Các kết quả thu được sẽ đóng góp các kiến thức về vị trí và vai trò của VK KK hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin. Trên cơ sở các hiểu biết sâu sắc về VSV và hoạt động sinh lý của chúng để tăng cường hiệu suất, rút ngắn thời gian, giảm chi phí trong xử lý khi áp dụng công nghệ phân hủy sinh học. 52 CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Vật liệu 2.1.1. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng  Hai mẫu đất ở lô xử lý 10 m3 (10DNT), 100 m3 (100DNT) đã xử lý từ năm 2002 (2 năm đầu xử lý sau đó không tác động gì thêm ngoài bổ sung muối khoáng và các acid hữu cơ). Lô đất xử lý kỵ khí có xuất hiện lớp đất dày khoảng 2 cm màu xám phía dưới. Các mẫu này được lấy vào thời điểm 8 năm và 10 năm sau xử lý.  Năm mẫu từ lô xử lý ở điều kiện kỵ khí, quy mô 2 m3 được xử lý theo các công thức khác nhau nằm trong dự án hợp tác giữa Viện Công nghệ sinh học và Cục Bảo vệ môi trường Hoa Kỳ (EPA) được Quỹ Ford tài trợ, ký hiệu là P1, P2, P3, P4, P5. Trong đó mẫu P1 là mẫu đất không xử lý, đào đất sâu đến 1,2-1,3 m (khi gặp đất ngập nước có màu xám), trộn đều với các lớp đất ở phía trên và cho vào hố chôn. Hố này được sử dụng làm mẫu đối chứng. Các mẫu P2, P3, P4 là các công thức xử lý khác nhau bằng phương pháp phân hủy sinh học của Việt Nam. Mẫu P5 là mẫu xử lý của EPA bằng phương pháp phân hủy sinh học kỵ khí, bổ sung 100 kg bùn ở hồ A (hay còn gọi là hồ Sen), chỉnh pH tới trung tính (đất nguyên thủy có độ pH 5-6). Mẫu này có bổ sung 100 kg máu bò khô làm nguồn cung cấp nitơ và hơn 50 kg các chất dinh dưỡng vô cơ khác. Ngoài ra, rơm, trấu cũng được bổ sung vào 5 lô xử lý. Nước được bổ sung cho tới điểm bão hòa và sau đó hàn kín ngay lô xử lý này. Các mẫu này được lấy vào thời điểm sau 6 tháng, 7 tháng và 10 tháng xử lý.  Hai mẫu đất bùn từ hồ A và hồ C, nơi tiếp nhận nước thải chảy ra từ khu nhiễm chất diệt cỏ. Cả 2 hồ đều bị nhiễm chất diệt cỏ/dioxin, trong đó hồ A hay còn gọi là hồ Sen là hồ ô nhiễm nặng nhất trong 3 hồ ở sân bay Đà Nẵng với độ độc khoảng 10.000 ng TEQ/kg bùn. Hồ C là hồ ô nhiễm nhẹ nhất với nồng độ dioxin khoảng 20-40 ppt, đáy hồ chiếm đến 90% là cát (Báo cáo tổng thể, 2011). 2.1.2. Mẫu đất từ lô xử lý ở sân bay Biên Hòa Mười sáu mẫu đất từ lô xử lý sinh học 3.384 m3 tại sân bay Biên Hòa (lô xử lý được chia thành 4 ngăn, mỗi ngăn có thể tích 846 m3 được lấy ở 4 vị trí khác nhau và 53 đồng nhất để phân tích VSV) và được ký hiệu lần lượt từ 1.1 đến 4.4. Các ngăn này được ký hiệu là M1, M2, M3, M4 (Hình 2.1, Phụ lục 1) và được gọi là lô xử lý ở Biên Hòa. Lô xử lý 3.384 m3 có tổng độ độc ban đầu khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất. Đặc điểm của đất ở sân bay Biên Hòa là đất từ nhiều nơi mang đến, rất phức tạp và chứa ít cát, pH trung tính. Phương pháp xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở đây cũng hoàn toàn khác so với các lô xử lý của sân bay Đà Nẵng. Mẫu ở đây được bổ sung chế phẩm Slow-D, DHS1, DHS2 và các phế liệu nông nghiệp với các kích thước khác nhau (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Các mẫu đất ở đây được lấy vào thời điểm 18, 27 và 36 tháng xử lý. Các mẫu đất sử dụng trong nghiên cứu được tổng kết trên Bảng 2.1. Tất cả các mẫu đất ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng được lấy ở độ sâu 1-2 m và bảo quản ở 4°C cho đến khi tiến hành các thí nghiệm tiếp theo. Bảng 2.1. Các mẫu đất đã sử dụng trong nghiên cứu STT 1 2 3 4 Địa điểm lấy mẫu Đà Nẵng Biên Hòa Mẫu đất 10DNT, 100DNT P1, P2, P3, P4, P5 Hồ A, hồ C M1, M2, M3, M4 Thời gian lấy mẫu 8, 10 năm sau xử lý 6, 7,10 tháng sau xử lý Cùng thời điểm với các mẫu P1, P2… 14, 18, 22, 27 và 36 tháng sau xử lý 2.1.3. Trình tự nucleotide của các cặp mồi đã sử dụng Các cặp mồi đã sử dụng trong nghiên cứu được trình bày trên Bảng 2.2. Bảng 2.2. Trình tự các đoạn mồi đã sử dụng trong nghiên cứu STT Gene đích Kích thước gene 1 Nhóm Desulfococcus 860 bp 2 Dùng trong DGGE nhóm VK KSF 3 Nhóm Desulfovibrio 608 bp 4 Dùng trong DGGE cho nhóm VK KSF 5 Vi khuẩn Dehalococcoides 438 bp 6 Vi khuẩn Dehalococcoides 692 bp 7 Vi khuẩn Dehalococcoides 620 bp 8 Toàn bộ gene 16s 1500 bp rRNA của vi khuẩn Tên mồi Trình tự Nucleotide DCC305f 5’-GATCAGCCACACTGG RACTGACA-3’ DCC1165r 5’-GGG GCA GTA TCT TYA GAG TYC-3’ DCC305f + 5’-CGCCCGCCGCGCCCCGCGCCC GC GTC CCGCCG CCCCGCCCGCCGAT CAGCCACACTGGRACTGA CA-3’ DSV230f DSV838r DSV230f + GC DHC774f DHC1212r DHC1f DHC692r DET730f DET1350r 27f 1492r TLTK Daly 2000. Daly 2000. 5’-GRG YCY GCG TYY CAT TAG C-3’ 5’-SYC CGR CAY CTA GYRTYCATC -3’ 5’-CGCCCGCCGCGCCCC GCG Daly CCCTCCCGCCGCCC CCG CCCGCC 2000. GRGYCYGCGTYY CAT TAG C-3’ 5’-GGG AGT ATC GAC CCT CTC-3’ Yan 2009 5’-GGA TTA GCT CCA GTTCACACTG-3’ 5’-GAT GAA CGC TAG CGG CG-3’ Yan 2009 5’-TCA GTG ACA ACC TAG AAA AC-3’ 5’-GCG GTT TTC TAG GTT GTC-3’ Bunge 2001 5’-CAC CTT GTC GAT ATG CGG-3’ 5’-AGA GTT TGA TCM TGG CTC AG-3’ Weisbu rg, 5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′ 54 STT Gene đích Kích thước gene Tên mồi Trình tự Nucleotide TLTK 5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3’ 1991 5’-ACG GCT ACC TTG TTA CGA CTT-3’ 10 Vi khuẩn 600 bp 5’-TGT CTT CGA GGA CGA ACG-3’ Bunge Desulfitobacterium 2001 5’-CTC ATA GCT CCC CGA AGG-3’ 11 Vi khuẩn 582 bp 5’-GGA AGA ACG GCA TCT GTG-3’ Bunge Dehalobacter 2001 5’-CTC ATA GCT CCC CGA AGG-3’ 12 Vi khuẩn 1100 bp 5’-GTGGGGGATAACACTTCGAAAGAA Yan Dehalogenimonas GTG C-3’ 2009 BL-DC-1243r 5’-CCGGTGGCAACCCATTGTACC GC-3 Nhóm gene chức năng tceA 13 500 bp tceA500f 5’-TAATATATGCCG CCA CGA ATG G-3’ Fung tceA795R 5-AAT CGTATACCA AGGCCCGAGG-3’ 2007 tceA 14 1500 bp tceAF 5’-GCT TTG GCG GTG ATG ATA AG -3’ Fung 2007 tceAr 5’-TCC ACC ACC CAT CGA GTT AT-3’ DET0318 15 200 bp DET0318 5’-ATG GTG GAT TTA GTA GCA GCG Fung 484F GTC-3’ 2007 DET0318 5’-ATCATCAAGCTCAAGCTCAAGTG 664R CTC CAC-3’ cbrA 16 200 bp CbrAf 5’-CTT ATA TCC TCA AAG CCT GA-3’ Wagner 2009 CbrAr 5’-TGT TGT TGG CAA CTG CTT C-3’ pceA 17 500 bp pceAf 5’-CTG AAA GGA ATA GGT CTG G-3’ pceAr 5’-GTA GAC TGG GAT CCA TGC-3’ pceA 18 1500 bp pceAf 5’-GGT TCT CCC ATC ATA GTT AAC GAC AAA TTG G-3’ pceAr 5’-TTC ATC AGC GCT TTG GAG TCA CTC C-3’ 9 Toàn bộ gene 16s 1500 bp rRNA của vi khuẩn Fd1 Rp2 DES436f DES1027r DRE445f DRE1027r BL-DC-142f 2.1.4. Các hóa chất và thiết bị máy móc Các thiết bị máy móc được sử dụng bao gồm máy của Phòng Công nghệ sinh học tái tạo môi trường và Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Gen – Viện Công nghệ sinh học. Các thiết bị bao gồm: máy ly tâm lạnh CT15RE HiMac (Hitachi), máy PCR G-Storm (United Kingdom), thiết bị DGGE Bio-Rad DCodeTM, bể ổn nhiệt Memmert, tủ lạnh thường GR-K22EA (Toshiba) và tủ lạnh sâu -20 Alaska, box cấy Biocyt ESI Flufrance (Pháp), tủ ấm Friocell, thiết bị nuôi cấy kỵ khí BBL GasPak (Mỹ), kính hiển vi quang học Labomed (Mỹ), kính hiển vi điện tử quét JEOL5410 LV (Mỹ), cân phân tích Shimadzu AY220, máy đọc trình tự gene tự động ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer. Ngoài ra, một số thiết bị phân tích hóa học khác cũng được sử dụng như máy HPLC VWRTM Hitachi Elite LaChrom, 55 thiết bị GC7890A/MSD5975C (Agilent, Mỹ) để phân tích nồng độ các đồng phân của PCDD/Fs. Các hợp chất chứa clo hữu cơ như 2,4-D, 2,4,5-T, 2,4,5-TCP, 2,4-DCP, DDT (Merk). Dịch chiết đất (DCĐ) chứa các thành phần 2,4-D, 2,4,5-T, một số sản phẩm phân hủy chất diệt cỏ và đặc biệt là chứa 2,3,7,8-TCDD được chiết từ đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin từ sân bay Đà Nẵng. 2.1.5. Thành phần môi trường nuôi cấy và dung dịch đã sử dụng 2.1.5.1. Thành phần môi trường nuôi cấy Môi trường Posgate B được sử dụng để làm giàu và phân lập VK KSF (Postgate, 1984). Thành phần môi trường (g/l): KH2PO4 0,5, NH4Cl 1, MgSO4 1, CaSO4 1, NaCl 1, Na-lactate 2,75, H2O 1000 ml, pH 6,5-7. Môi trường được bổ sung 10 ml FeSO4 1%, dung dịch NaHCO3 5% để chỉnh pH, Na2S 10% đến xám nhạt. Các dung dịch vitamin I, vi lượng I, vitamin C mỗi loại 1 ml/l. Môi trường SH1 được sử dụng để nuôi cấy VK KK phân hủy dioxin (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). Thành phần môi trường (g/l): KH2PO4 0,5, CaSO4 1, NH4Cl 1, MgSO4 2, NaCl 1, K2HPO4 0,5, NH4NO3 1, natri acetate 1, natri lactate 1, H2O 1000 ml. Các acid hữu cơ được bổ sung gồm butyric acid 10 l, propionic acid 10 l, isobutyric 1 l, succinic acid 3,5 l. Các chất bổ sung bao gồm 10 ml FeSO4 1%, dung dịch NaHCO3 5% để chỉnh pH, Na2S 10% đến xám nhạt. Các dung dịch vitamin I, vi lượng I, vitamin C, cao men 10% mỗi loại 1 ml/l. Môi trường khoáng kỵ khí M204 được dùng để làm giàu một số VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo (Ewald, 2007). Thành phần bao gồm (g/l): MgSO4.7H2O 0,069, MgCl2.6H2O 0,053, CaCl2.2H2O 0,12, NH4HCO30,42, cao nấm men 0,05, H2O 1000, 1 ml/l dung dịch vi lượng I, rasazurin 0,1%. Môi trường được đun sôi và làm nguội đến nhiệt độ phòng dưới dòng khí nitơ. Điều chỉnh pH 7-7,2 bằng NaHCO3 tinh thể dưới dòng khí N2 để đảm bảo môi trường kỵ khí. Khử trùng môi trường ở 121oC, 20 phút. Trước khi bổ sung môi trường vào các mẫu nuôi cấy, bổ sung thêm nguồn carbon (bao gồm pyruvate, formate, furmarate, lactate với nồng độ 5 mM), 1 ml/l vitamin II, Na2S, NaHCO3 (điều chỉnh lại pH), Ti-(III)-citrate, FeS 56 0,15 mM. Các chất hữu cơ chứa clo được sử dụng làm chất nhận điện tử như 2,4DCP, 2,4,5-T (nồng độ 100 ppm) và DCĐ (2% v/v) để làm giàu VK KK hô hấp loại clo bao gồm cả Dehalococcoides (Ewald, 2007). 2.1.5.2. Các dung dịch đã sử dụng Dung dịch vi lượng I (mg/l): nitrilotriethanol 12800, FeCl2.4H2O 2, ZnCl2 70, MnCl2.2H2O 80, H3BO3 6, CoCl2.6H2O 190, CuCl2.2H2O 2, NiCl2.6H2O 24, Na2MoO4.2H2O 36, H2O 1000 ml, NaOH bổ sung đến pH 6,0. Dung dịch vitamin I (mg/l): Biotin 1, p-aminobenzoic acid 5, vitamin B12 5, thiaminechloride 10, H2O 1000 ml. Dung dịch vitamin II (mg/l): L-liponic acid 5, D(+)-biotin 2, nicotinic acid 5, Ca-D(+)-pantothenate 5, pyridoxinhydrochloride 10, thiaminechloridechloride 5, folic acid 2, riboflavin 5, cyanocobalamine 50, p-aminobenzoic acid 5, H2O 1000 ml. Dung dịch Sol I: Tris HCl 1M, pH8 1,25 ml; EDTA 0,5M 1 ml; glucose 1M 2,5 ml, H2O 45,25 ml. Khử trùng và bảo quản ở 4oC. Dung dịch Sol II: NaOH 10 N 20l; SDS 20% 50 l; dH2O 930 l. Pha ngay khi sử dụng, ở nhiệt độ phòng. Dung dịch Sol III: CH3COOK 14,7 g; CH3COOH glacial 5,75 ml; H2O đến 50 ml, pH 5,2. Khử trùng và bảo quản ở 4oC. Các dung dịch Sol I, II, III được sử dụng để tách dòng VK và plasmid. Lysis buffer Tris HCl 1M, pH8 300 l; SDS 20% 15 l; EDTA 0,5M pH8 600 l; NaCl 5M l; H2O 27,3 ml. TAE 50x Tris base 242 g; CH3COOH glacial 57,1 ml; EDTA 0,5M, pH8 100 ml; H2O đến 1000 ml. Dung dịch lysis bufer được sử dụng để tách DNA tổng số theo phương pháp sử dụng chloroform. Dung dịch TAE được sử dụng để điện di sản phẩm PCR và DGGE. 2.2. Phƣơng pháp 2.2.1. Chiết các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin từ đất Đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Đà Nẵng được sử dụng để chiết các thành phần theo quy trình sau: (1) Sấy khô đất hoàn toàn ở 105oC, rây nhỏ để loại bỏ đất đá và các loại hạt to. (2) Trộn đều với Na2SO4 khan đến khi thấy màu trắng của Na2SO4 để làm khô kiệt mẫu. (3) Chia đất vào các lọ vial sau đó bổ sung hỗn hợp methanol : toluene = 1 : 4 vào lọ. (4) Đậy kín nắp và lắc đều cho đất thấm đều dung môi. (5) Siêu âm trong 30 phút ở 30-35oC, tốc độ 90 sonic. (6) Lắc đều để đất 57 không bám vào đáy bình. (7) Lắc trên máy lắc 110 vòng/phút qua đêm. (8) Để lắng trong khoảng 7 giờ sau đó hút lấy dịch trong. (9) Bổ sung H2SO4 đặc, lắc đều nhiều lần đến khi dung dịch nguội để loại bỏ hết tạp chất. (10) Để lắng qua đêm, hút dịch nổi sang bình đựng DCĐ. DCĐ thu được chứa 2,4,5-T, 2,4-D, TCP, DCP… và dioxin với độ độc khoảng 3.500 pg TEQ/ml. DCĐ thu được sẽ sử dụng cho các nghiên cứu làm giàu và nuôi cấy tiếp theo. 2.2.2. Tách DNA tổng số DNA tổng số từ các mẫu môi trường được tách và làm sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất Fast soil microbe DNA kitTM (MP Biomedical). DNA tổng số của mẫu làm giàu vi khuẩn hô hấp kỵ khí dùng cho phân tích Metagenomics được tách và làm sạch theo hướng dẫn của nhà sản xuất PowerSoilTM DNA Isolation Kit (MoBio). DNA tổng số của VK KSF hay mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại clo được tách theo quy trình sau: (1) Hút dịch nuôi cấy vào ống eppendoft 2 ml, ly tâm nhẹ (1500 vòng/phút trong 2 phút) để bỏ cặn đen của FeS, hút phần dịch ở trên sang eppendoft mới. (2) Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút để thu sinh khối tế bào. (3) Bổ sung 500 l lysis buffer, 25 l lysozyme 10 g/ml, lắc đều, ủ ở 37oC trong 30 phút. (4) Bổ sung 25 l protease K 10 g/ml, lắc đều, ủ ở 56oC trong 2 giờ. (5) Thêm phenol bão hòa (theo tỷ lệ 1:1), mix đều, ly tâm 12000 v/p trong 10 phút, thu dịch nổi. (6) Thêm chloroform/isoamylalcohol = 24/1 theo tỷ lệ 1:1, trộn đều, ly tâm 12000 v/p trong 10 phút, thu pha trên. (7) Thêm isopropanol theo tỷ lệ 1:1, để đá qua đêm. (8) Ly tâm 40C, 12000 v/p trong 15phút. (9) Loại bỏ dịch trên, rửa sạch DNA bởi 500 l ethanol 70%. (10) Ly tâm ở 40C 12000 v/p trong 10 min,bỏ dịch, làm khô DNA bằng máy SpeedVax. (11) Hòa tan DNA trong 50 l dH2O. (12) Điện di kiểm tra kết quả. 2.2.3. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí từ các lô xử lý 2.2.3.1. Nested-PCR Các cặp mồi 27F và 1492R hoặc FD1 và RP2 (Bảng 2.2) được sử dụng để nhân toàn bộ gene 16S rRNAtừ DNA tổng số. Sản phẩm PCR được sử dụng làm 58 khuôn để nhân đoạn gene mã hóa 16S rRNA đặc hiệu cho mỗi nhóm VK KK bằng các cặp mồi khác nhau (Bảng 2.2). 2.2.3.2. DGGE Các mẫu được xác định có mặt VK KSF và Dehalococcoides tiếp tục được nhân đoạn 16S rRNA đặc hiệu (sử dụng khuôn là sản phẩm PCR gene 16S rRNA đầy đủ) bằng cặp mồi đặc hiệu tương ứng có gắn đoạn GC. Sản phẩm PCR được sử dụng cho quy trình DGGE nhằm xác định sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides trong các lô xử lý. 80 μl sản phẩm PCR nhân đoạn gen đích được tra vào các giếng trên gel DGGE (6% acrylamide (Sigma), 0,1% bisacrylamide (Sigma) với dải nồng độ chất biến tính 20 - 70% urea (Fluka)/formamide (Sigma)). Polyme hóa 13 ml hỗn hợp acrylamide/bisacrylamide bởi 13 μl TEMED (Sigma) và 130 μl ammonium persulfate-APS (Sigma). Công thức pha gel DGGE được trình bày trên Bảng 2.3. Bảng 2.3. Công thức pha gel DGGE ở các nồng độ biến tính khác nhau Công thức pha gel acrylamide/biacrylamide stock Công thức pha gel acrylamide/Bisacrylamide với các nồng độ biến tính khác nhau Thành phần 0% 100% Thành phần 20% 30% 60% 70% 40% acrylamide/Bis acrylamide (37,5:1) 3 ml 3 ml 0% 12 ml 10,5 ml 6,0 ml 4,5 ml TAE 50X 0,4 ml 0,4 ml 100% 3 ml 4,5 ml 9,0 ml 10,5 ml Formamide 0 8 ml TEMED 10 l 10l 10l 10l Urea 0 8,4 g APS 10% 100 l 100l 100l 100l Nước khử ion Đến 20 ml Đến 20 ml Tổng thể tích 15 ml 15 ml 15 ml 15 ml Mẫu DNA được điện di trên gel ở 70 V, 23 mA, 60oC, 6 giờ trong đệm TAE 1X trên thiết bị Bio-Rad DCodeTM. Sau khi kết thúc điện di, nhuộm DNA trong gel với EtBr, kiểm tra dưới ánh sáng tia UV và chụp ảnh sử dụng thiết bị và phần mềm của hãng Kodak. Các băng đặc trưng được lựa chọn, cắt và thôi DNA qua đêm trong 40 μl nước cất tiệt trùng ở 4oC. Tiến hành PCR lại với cặp mồi đặc hiệu, điện di kiểm tra trên gel agarose. Sản phẩm PCR được làm sạch với enzym exonuclease 59 (Exo/SAP cleaning PCR product). Hỗn hợp phản ứng bao gồm: 0,5 μl exonuclease I (Exo) (Epicontre), 2 μl shrimp alkaline phosphatase (SAP) (Promega), 0,85 μl đệm SAP 10x (Promega) và 5 μl sản phẩm PCR. Ủ hỗn hợp trên ở 37oC trong 15 phút và 80oC trong 15 phút tiếp theo. Bảo quản DNA ở 4oC hoặc -20oC đến khi sử dụng để xác định trình tự nucleotide. 2.2.4. Xác định trình tự nucleotide và xây dựng cây phát sinh chủng loại Trình tự nucleotide được xác định trên máy đọc trình tự nucleotide tự động ABI PRISM 3130xl Genetic Analyzer và được xử lý trên phần mềm Finch TV. Mức độ tương đồng các đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu cho nhóm VK KSF hay vi khuẩn Dehalococoides trong các mẫu đất được so sánh với các trình tự 16S rRNA trên GenBank. Cây phát sinh chủng loại dựa trên so sánh trình tự các đoạn gene 16S rRNA được xây dựng bởi các phần mềm Clustal X, Mega 5. 2.2.5. Đánh giá sự biến động số lượng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại Biên Hòa Để đánh giá sự biến động về số lượng VK KK trong các lô xử lý của sân bay Biên Hòa, các mẫu được sử dụng là 16 mẫu đất lấy ở lô xử lý 3.384 m3 ở 16 vị trí khác nhau, độ sâu 1,5 – 2 m, sau 14, 18, 22 và 27 tháng xử lý. Các VK KK sử dụng dioxin được nuôi cấy trên môi trường SH1 bổ sung DCĐ chứa các hợp chất 2,3,7,8-TCDD, 2,4,5-T, 2,4-D và nhiều hợp chất trung gian khác là chất nhận điện tử cuối cùng. Các VK KSF được nuôi cấy trên môi trường Posgate B có bổ sung DCĐ. Số lượng VK KK và VK KSF được tính theo phương pháp MPN (Most Probable Number) với các ống dương tính là ống xuất hiện màu đen hay xám, đục so với ống đối chứng, sau 10 ngày nuôi cấy ở điều kiện tính, kỵ khí tối. 2.2.6. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí 2.2.6.1. Làm giàu vi khuẩn khử sulfate Các mẫu đất đã lựa chọn (Bảng 2.1) được làm giàu trên môi trường Posgate B chứa 3,2% DCĐ, 10% giống. Các mẫu làm giàu được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh, kỵ khí - tối, ở 28-30oC trong thời gian 1 tháng. Quần xã VK KSF có khả năng phân hủy 60 dioxin thu được sau ba lần làm giàu liên tiếp được sử dụng làm giống cho các nghiên cứu tiếp theo. 2.2.6.2. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo A, Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên 2,4-DCP, 2,4,5-T Các mẫu đất đã lựa chọn (Bảng 2.1) được làm giàu trên môi trường khoáng kỵ khí M204 có bổ sung các chất cho điện tử (pyruvate, formate, acetate, fumarate với nồng độ mỗi chất là 5 mM) và chất nhận điện tử. Các chất nhận điện tử như 2,4,5-T và 2,4-DCP (với nồng độ cuối cùng trong môi trường là 100 ppm) và DCĐ (2% v/v) được bổ sung vào bình làm giàu, làm bay hơi hết dung môi bằng khí N2 vô trùng. Sau đó, đất từ các lô xử lý được bổ sung với nồng độ 30% (w/v) vào bình nuôi dưới dòng khí N2. Cuối cùng, môi trường M204 được bổ sung vào bình nuôi trong điều kiện kỵ khí dưới dòng khí nitơ vô trùng. Đậy kín bằng nút cao su và nút nhôm để đảm bảo kỵ khí. Nuôi cấy tĩnh, kỵ khí, tối ở 28-30°C trong 2 tháng. Sau 3 lần làm giàu liên tiếp, mỗi mẫu được lấy ra 1,5 ml ở các khoảng thời gian khác nhau (9-12 tuần). Ly tâm 6000 vòng/phút trong 5 phút, phần dịch được dùng để xác định khả năng phân hủy hay chuyển hóa các hợp chất chứa clo. Phần sinh khối được sử dụng để tách DNA tổng số phục vụ cho các nghiên cứu xác định sự có mặt của VK KK hô hấp loại khử clo. B, Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin chứa hỗn hợp chất diệt cỏ (2,4-D, 2,4,5T), các sản phẩm phân hủy chất diệt cỏ (2,4-DCP, 2,4,5-TCP), PCDDD/Fs và đặc biệt chứa 2,3,7,8-TCDD đến 99% tổng độ độc được sử dụng làm nguồn ô nhiễm, chất nhận điện tử của các VK KK hô hấp loại khử clo. Đất được sấy ở 105oC đến khô hoàn toàn, nghiền và rây để loại bỏ các hạt to, tạp chất, trộn đều để đồng nhất. Đất được bổ sung vào môi trường khoáng M204 với tỷ lệ 10% (w/v). Quần xã VSV từ các mẫu đất ở 4 ngăn của lô xử lý tại sân bay Biên Hòa được lấy và trộn đều dưới dòng khí N2 vô trùng ở tất cả các điểm lấy mẫu sau 36 tháng xử lý. Quần xã VK từ lô xử lý được bổ sung bằng cách thêm 32 g đất bùn từ lô xử lý sinh học quy mô 3.384 m3 tại sân bay Biên Hòa (2 g đất/vị trí lấy mẫu). Quần xã này được làm giàu ở thể 61 tích 500 ml trên môi trường khoáng kỵ khí M204 có bổ sung đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin có tổng độ độc khoảng 41.000 pg TEQ/g đất khô. Mẫu đối chứng chứa môi trường M204 có bổ sung đất ô nhiễm. Nuôi cấy VK KK trong điều kiện tĩnh, kỵ khí, tối trong thời gian 1 năm. Lấy mẫu thu sinh khối VSV để tách DNA theo hướng dẫn của PowersoilTM DNA Isolation Kit (MoBio) và xác định sự có mặt của các VK KK bằng phương pháp được trình bày ở mục 2.2.12. Phần bùn đất được sử dụng để phân tích các đồng phân dioxin và các sản phẩm phân hủy sinh học của chất diệt cỏ theo phương pháp mô tả ở mục 2.2.11. 2.2.7. Nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường lên sự sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate Các quần xã VK KSF được nuôi cấy trên môi trường Posgate B có bổ sung 3,2% DCĐ (v/v) và 10% giống (v/v). Các quần xã VK KSF được nuôi cấy trong điều kiện tĩnh, kỵ khí, tối, ở 28-30oC. Sau 10 ngày, dịch nuôi cấy được pha loãng ở các nồng độ khác nhau (10-1 – 10-7) và nuôi cấy trên thạch đứng chứa môi trường Posgate B và 3,2% DCĐ (v/v) để xác định số lượng khuẩn lạc VK KSF. Sinh trưởng của quần xã VK KSF được xác định theo lgN (N là số lượng khuẩn lạc mọc trên thạch đứng). Các yếu tố môi trường được khảo sát bao gồm nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl, nồng độ DCĐ, một số nguồn carbon (acetate, lactate, pyruvate, benzoate, oxalate, citrate, formate, fumarate, tartrate) và một số chất hữu cơ chứa clo (một số đồng phân DCP, 2,4,5-T, DDT, DCĐ). 2.2.8. Làm sạch vi khuẩn khử sulfate Sau ba lần làm giàu liên tiếp, các mẫu được pha loãng ở các nồng độ khác nhau (10-1-10-9). Nuôi cấy riêng rẽ các mẫu trên môi trường Posgate B thạch đứng cũng chứa 3,2% DCĐ (v/v). Các khuẩn lạc mọc riêng rẽ được tách riêng bằng pipet Pasteur. Mỗi khuẩn lạc được nuôi cấy trong một ống chứa môi trường Posgate B dịch có DCĐ. Các mẫu nuôi cấy được kiểm tra sơ bộ về độ tinh sạch, sự khác nhau giữa các tế bào trong các mẫu bằng cách nhuộm Gram và quan sát dưới kính hiển vi 62 quang học. Các chủng lựa chọn được cấy truyền sang bình nuôi để giữ giống và sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo. 2.2.9. Quan sát hình thái tế bào vi khuẩn Tế bào VK KSF hay các VK KK trong mẫu làm giàu trên môi trường khoáng M204 được cố định trong glutaraldehyde 2,5%. Hình thái tế bào được quan sát và chụp ảnh dưới kính hiển vi điện tử quét JEOL5410 LV ở các độ phóng đại khác nhau (5000 – 20.000 lần). Kỹ thuật này được thực hiện tại Viện 69, Bộ Tư lệnh Lăng. 2.2.10. Tách dòng đoạn gene mã hóa 16S rRNA Kỹ thuật tách dòng được sử dụng để phân loại, định tên hay xác định sự có mặt của các vi khuẩn không nuôi cấy được và các gene quan tâm trong quần xã VSV. Sản phẩm PCR nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của Dehalococcoides từ mẫu làm giàu P5T được sử dụng để tách dòng theo Kit pJET của Invitrogen. Các bước tách dòng bao gồm tạo DNA tái tổ hợp, biến nạp DNA tái tổ hợp vào tế bào E.coli và tách DNA plasmid. Các bước được thực hiện theo hướng dẫn của Kit pJET. Kiểm tra plasmid mang đoạn gene mong muốn bằng cách tiến hành PCR với khuôn là DNA plasmid tái tổ hợp. Nếu plasmid tái tổ hợp mang đoạn gene mong muốn thì sẽ nhận được một băng DNA khoảng 600 bp khi kiểm tra trên điện di đồ. 2.2.11. Đánh giá khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo (đa) vòng thơm 2.2.11.1. Đánh giá khả năng phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ trên máy GC/MS Thành phần của chất diệt cỏ/dioxin của mẫu nuôi cấy VK KSF được chiết theo quy trình sau: (1) Kiểm tra pH của dung dịch nuôi cấy (mẫu) bằng giấy chỉ thị pH, chỉnh đến pH ~ 7 - 8. (2) Siêu âm mẫu trong bể siêu âm khoảng 15 phút. (3) Bổ sung dichloromethane vào mẫu theo tỷ lệ 1:2 (v/v). Lắc hỗn hợp ở tốc độ lắc 300 vòng/phút trong 30 phút. Để lắng, tiếp tục lắc ở tốc độ lắc 300 vòng/phút trong 30 phút. Gạn lấy phần dung dịch và lọc lấy phần dichloromethane, để riêng. (4) Điều chỉnh pH phần dung dịch đến pH < 2 bằng H2SO4 6N. Tiếp tục bổ sung 63 dichloromethane và lắc như bước 3. Gạn, lọc lấy phần dichloromethane. (5) Gộp toàn bộ phần dichloromethane và làm khan bằng Na2SO4. (6) Cô đuổi dung môi trên máy cất quay đến V~0,5 ml. Chuyển phần còn lại vào ống nghiệm, làm bay hơi đến khô phần dung môi còn lại bằng dòng không khí nóng. Định mức chính xác bằng MeOH. (7) Chạy SCAN trên thiết bị Sắc ký khí khối phổ để xác định thành phần định tính mẫu nghiên cứu. Thành phần của chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo trên đất ô nhiễm được chiết theo quy trình sau: (1) Cân chính xác 5g đất/mẫu, chuyển vào ống chứa mẫu của bộ chiết Soxlet. (2) Chiết mẫu bằng 200 ml acetone trongvòng 8 giờ, mỗi giờ đảm bảo từ 4-6 lần dung môi tràn qua ống chứa mẫu. (3) Cô đuổi dung môi trên máy cất quay đến V~ 1ml, chuyển vào ống nghiệm nhọn đáy có chứa 50l MeOH. (4) Tiếp tục làm bay hơi dung môi dưới dòng không khí nóng đến V ~50l. Định mức bằng 0,5 ml MeOH. (5) Chạy SCAN trên thiết bị Sắc ký khí khối phổ để xác định thành phần định tính mẫu nghiên cứu. Sau khi chiết theo các quy trình trên, các chất được xác định bằng phương pháp scanning (quét) trên máy GS7809A/MSD 5975C theo chương trình sau: Nhiệt độ đầu 60C (giữ 1 phút), tăng 8C/phút đến 320C (giữ ở nhiệt độ này từ 5 phút). Nhiệt độ Injector: 280C, Interface: 280C. Bơm 1l dung dịch mẫu theo kiểu không chia dòng (Splitless). Detectơ hoạt động theo chế độ quét (SCAN) từ 35 đến 550 amu. Cột phân tích DB5-MS (60m x 250m x 0,25m). Xác nhận các sản phẩm căn cứ vào thư viện phổ - cấu trúc NIST 98. Các mẫu này được phân tích tại phòng phân tích dioxin – trung tâm Nhiệt đới Việt Nga. 2.2.11.2. Đánh giá khả năng phân hủy các đồng phân dioxin trong mẫu làm giàu trên máy GC/MS Đất từ mẫu nuôi cấy làm giàu VK KK và mẫu đối chứng sấy khô đến khối lượng không đổi. Mẫu đất được phân tích xác định nồng độ 17 đồng loại độc của dioxin/furan theo phương pháp EPA 8280 đã được cải biến. Cụ thể, mẫu được thêm các chất chuẩn nội đánh dấu đồng vị 13C12-PCDD/PCDF (EDF-2520), chiết soxhlet 64 với toluene. Dung dịch chiết được thêm chất chuẩn đánh dấu đồng vị 37Cl4-2,3,7,8TCDD; làm sạch lần lượt bằng các dung dịch H2SO4 đặc, NaCl, KOH, NaCl; làm sạch trên “cột đa lớp” chứa silicagen, silicagen tẩm axít, silicagen tẩm kiềm. Phân đoạn PCDD/PCDF được tách trên cột than hoạt tính chuyên dụng, cột nhôm ôxít, thêm các chất chuẩn đánh dấu đồng vị 13C12-PCDD. Xác định hiệu suất thu hồi sau đó phân tích trên thiết bị GC 7890A/MSD 5975C của Agilent (Mỹ). Xử lý số liệu. Nồng độ độc tương đương 2,3,7,8-TCDD là tổng tích số nồng độ mỗi chất với hệ số độc tương ứng theo quy ước năm 1998 của Tổ chức Y tế thế giới (WHO) đối với người. Tính nồng độ độc tương đương theo công thức sau: TEQ   n1 C PCDDi  TEFi    n 2 C PCDFi  TEFi  Trong đó: TEQ: nồng độ độc tương đương 2,3,7,8-TCDD CPCDDi: nồng độ các chất độc của polyclodibenzo-p-dioxin CPCDDi: nồng độ các chất độc của polyclodibenzofuran 2.2.11.3. Xác định 2,4,5-T và 2,4-DCP trên máy HPLC Sau 9 và 12 tuần làm giàu các VK KK trên môi trường khoáng M204, các mẫu được lấy dịch ra, ly tâm lấy sinh khối để tách DNA. Phần dịch lọc được giữ ở -20oC để phân tích hàm lượng 2,4,5-T và 2,4-DCP tương ứng. Trước khi phân tích, mẫu được làm ấm ở 37oC trong 5 phút, quy trình xác định tiếp theo như sau: (i). Xác định 2,4-DCP và sản phẩm chuyển hóa 2-chlorophenol (2-CP) và 4chlorophenol (4-CP): chuyển 500 µM mẫu vào lọ lấy mẫu tự động (autosample vial), 4-DCP và 4-CP được thôi khỏi cột trong methanol:H2O (65:35 hoặc 60:40%, v/v) ở 210 nm, trong 10 phút. Thời gian lưu của mẫu được so sánh với thời gian lưu 4,25; 4,59 và 8 phút của các chất chuẩn tương ứng đã biết 2-CP, 4-CP và 2,4-DCP. (ii). Xác định 2,4,5-T và 2,4,5-trichlorophenol (2,4,5-TCP): chuyển 600 µl mẫu vào lọ lấy mẫu tự động màu nâu có chứa 150 µl acetonitrile và 50 M 4-chloro-2 methyl-phenoxy acetic acid (MCPA, chất nội chuẩn). Điều kiện tối ưu cho phân tích HPLC để xác định các hợp chất 2,4,5-T và 2,4,5-TCP là 0% acetonitrile (isocratic, 5 65 phút), 0-50% acetonitrile (linear, 5 phút), 50% acetonitrile (isocratic, 20 phút), 500% acetonitrile (linear, 6 phút) (Rice, 2005). Xác định độ hấp thụ của các hợp chất ở bước sóng 210 nm. Thời gian lưu của mẫu được so sánh với thời gian lưu 16,7; 19 và 21,2 phút của các chất chuẩn tương ứng đã biết MCPA, 2,4,5-T và 2,4,5-TCP. Các hợp chất được định lượng dựa trên đường chuẩn với 4 nồng độ 12,5; 25; 50 và 100 µM. Phân tích thành phần và hàm lượng các chất hữu cơ chứa clo được thực hiện trên máy HPLC VWRTM Hitachi Elite LaChrom (tại phòng thí nghiệm VSV, Đại học Halle, Đức) sử dụng cột C18 (LiChrospher, 250 x 4 mm, 5 µm), tốc độ dòng là 1 ml/phút, nhiệt độ 30oC. 2.2.12. Đánh giá sự đa dạng vi khuẩn kỵ khí và gene chức năng trong mẫu làm giàu Mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại clo từ lô xử lý của Biên Hòa sau 36 tháng xử lý được nuôi trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sau 1 năm ở điều kiện tĩnh, tối với nhiệt độ phòng được sử dụng để tách DNA tổng số theo hướng dẫn của Kit MOBio. DNA tổng số được xác định nồng độ, độ tinh sạch và sử dụng để xác định trình tự trên máy Roche 454 GS Junior theo hướng dẫn của nhà sản xuất. Quy trình sử dụng công cụ Metagenomics bao gồm quá trình tách DNA/RNA, giải trình tự bằng thiết bị công năng cao, phân tích các yếu tố trong hệ sinh học, sử dụng các công cụ tin sinh học phù hợp để xử lý các trình tự thu được, sắp xếp, phân tích thống kê, lưu trữ và chia sẻ số liệu trên hệ thống tin sinh học (Meyer, 2008, Thomas, 2012, Uroz, 2013). Trình tự thô của mẫu được xử lý bởi hệ thống phân tích tự động MG-RAST (Uroz, 2013, Meyer, 2008). Phân tích tổ hợp trình tự được thực hiện bởi phần mềm Newbler. Cấu trúc quần xã được phân tích dựa trên so sánh với 2 cơ sở dữ liệu M5RNA (M5 non-redundent multiscore ribosome RNA annotation) và M5NR (M5non-redundent protein) trong MG-RAST. Các phương pháp đã sử dụng trong nghiên cứu được tóm tắt ở Bảng 2.4. 66 Bảng 2.4. Tổng hợp các phương pháp đã sử dụng trong nghiên cứu STT 1 2 3 4 5 6 Phương pháp nghiên cứu Mục đích nghiên cứu Mẫu đất 10DNT, 100DNT Nested-PCR, Xác định đa dạng các VK KK P1, P2, P3, P4, P5 Phương pháp DGGE loại khử clo từ các lô xử lý Hồ A, hồ C sinh học phân tử M1, M2, M3, M4 Metagenomics - Xác định đa dạng các VK KK từ mẫu làm giàu Hỗn hợp M1, M2, - Đánh giá sự đa dạng gene M3, M4 sau 1 năm chức năng trong mẫu làm giàu làm giàu Làm giàu VK KSF Nghiên cứu đặc điểm sinh học 10DNT, 100DNT của quần xã VK KSF P1, P2, P3, P4, P5 Phương pháp Phân lập, phân loại nuôi cấy truyền thống Làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo trên 2,4-DCP, 2,4,5-T, DCĐ Làm giàu VK KK hô hấp loại khử clo trên đất ô nhiễm Đặc điểm sinh học của chủng sạch Phương pháp phân tích hóa học - Đánh giá khả năng phân hủy chất vòng thơm chứa clo - Xác định sự có mặt của Dehalococcoides - Đa dạng VK KK và đa dạng gene chức năng. - Khả năng phân hủy các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin Phân tích các thành - Phân tích 17 đồng phân phần hóa học của dioxin/furans trên máy GC/MS mẫu nuôi cấy -Phân tích các hợp chất 2,4DCP, 2,4,5-T trên máy HPLC M1, M2, M3, M4 10DNT 100DNT P1, P5, Hồ A M1, M2, M3, M4 M1, M2, M3, M4 - Mẫu làm giàu trên đất ô nhiễm - Mẫu làm giàu trên 2,4-DCP, 2,4,5-T 67 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU Như đã trình bày ở phần Tổng quan, sự đa dạng về cấu trúc quần xã VSV và đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn được làm sạch từ các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Đà Nẵng và Biên Hòa đã được nghiên cứu. Tuy nhiên, hầu hết những nghiên cứu đã thực hiện từ trước chủ yếu tập trung vào nhóm VSV hiếu khí như nấm sợi, VK và xạ khuẩn, chỉ một số ít nghiên cứu về VK KK không bắt buộc đã được tiến hành. Trong luận án này, các kết quả sẽ được lần lượt trình bày là:  Đa dạng các VK kỵ khí tham gia hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý: - Đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo nói chung; - Đa dạng nhóm VK KSF, đa dạng VK Dehalococcoides; - Đa dạng VK KK hô hấp loại khử clo trong mẫu làm giàu; - Biến động số lượng của VK KK trong các lô xử lý ở sân bay Biên Hòa.  Sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào: - Sự có mặt của gene reductive dehalogenase trong các lô xử lý và mẫu làm giàu; - Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào phát hiện bằng Metagenomics.  Đặc điểm sinh học của VK KSF: - Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sinh trưởng của nhóm VK KK; - Phân lập, phân loại 1 chủng VK KSF đại diện.  Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu.  Khả năng chuyển hóa hay phân hủy các hợp chất chứa clo: - Khả năng phân hủy 17 đồng phân dioxin, furan và các hợp chất vòng thơm; - Khả năng phân hủy 2,4,5-T, 2,4-DCP bởi quần xã VK KK; - Khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm bởi chủng VK KSF đã làm sạch; Luận án đã sử dụng phương pháp nuôi cấy, làm giàu VK KK truyền thống với nguồn ô nhiễm là chất diệt cỏ và DCĐ là hỗn hợp của dioxin, chất diệt cỏ và các chất trao đổi (metabolites) vẫn còn độc. Một số kỹ thuật sinh học phân tử như PCR, DGGE, Metagenomics và phương pháp phân tích trên máy sắc ký lỏng cao áp (HPLC), sắc ký khí ghép nối khối phổ (GC/MS) đã được sử dụng để đạt mục tiêu đề ra. 68 3.1. Đa dạng vi khuẩn loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 3.1.1. Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung trong các lô xử lý Như đã trình bày ở mục 1.6, có nhiều phương pháp khác nhau để xác định sự đa dạng của các VSV trong đất. Tùy thuộc vào đặc điểm của đối tượng nghiên cứu, phương pháp PCR-DGGE 1, 2 hoặc 3 bước có thể được sử dụng để xác định sự đa dạng của các nhóm VSV trong đất (Dar 2005; Wang 2013). Trong nghiên cứu này, phương pháp nested-PCR hai bước và DGGE được sử dụng để đánh giá sự có mặt của một số nhóm VK có khả năng loại khử clo trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa. Các mẫu được lựa chọn để nghiên cứu bao gồm 5 mẫu P1, P2, P3, P4, P5 sau xử lý 10 tháng, các mẫu 10DNT và 100DNT lấy vào thời điểm 10 năm sau xử lý, mẫu hồ A và hồ C được thu thập vào cùng thời điểm với mẫu ở các lô xử lý tại Đà Nẵng. Các mẫu M1, M2, M3, M4 tại Biên Hòa sau 18 và 27 tháng xử lý. Kết quả về sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý được trình bày ở Bảng 3.1. Bảng 3.1. Sự có mặt của một số VK hô hấp loại khử clo trong các mẫu nghiên cứu STT Tên mẫu Chi DES Chi DCC Mẫu từ lô xử lý và 2 hồ của sân bay Đà Nẵng P1 + 1 P2 + 2 P3 + 3 P4 + + 4 P5 + + 5 Hồ A + 6 Hồ C 7 10 DNT + + 8 100 DNT + + 9 Mẫu từ lô xử lý của sân bay Biên Hòa M1/2 + + 10 M2/2 + 11 M3/2 + 12 M4/2 + + 13 M1/4 + + 14 M2/4 + 15 M3/4 + 16 M4/4 + + 17 Chi DSV Chi DHG Chi DHC Chi DRE + + + + + + + + + - + + + + + + + + + - + + + + + + + + - + + + + + + + + - Chú thích: +: có mặt VK, -: không có mặt VK, Mx/2: mẫu đất ở lô xử lý thứ x ở lần lấy mẫu thứ 2 (18 tháng); Mx/4: mẫu đất ở lô xử lý thứ x ở lần lấy mẫu thứ 4 (27 tháng); Chi DES: cặp mồi DES436f/DES1027r đặc hiệu cho nhóm Desulfitobacterium; Chi DSV: cặp mồi DSV230f/DSV838r đặc hiệu cho chi Desulfovibrio, Desulfomicrobium; Chi DCC: cặp mồi DCC305f/DCC1165r đặc hiệu cho chi Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema, Chi DHG: Cặp mồi BL-DC142f/BL-DC1243r đặc hiệu cho chi Dehalogenimonas, Chi DHC: cặp mồi DHC730f/DHC1350r hay DHC774f/DHC1212r 69 đặc hiệu cho chi Dehalococcoides, Chi DRE: cặp mồi DRE445f/DRE1248r đặc hiệu cho chi Dehalobacter Kết quả Bảng 3.1 cho thấy trong các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin có mặt nhiều nhóm VK KK có khả năng loại khử clo. Hai chi VK Dehalococcoides và Desulfitobacterium được nhiều nghiên cứu chứng minh chúng tham gia vào quá trình loại khử clo của các hợp chất vòng thơm. Các đại diện của hai chi trên đều có mặt trong các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa. Một số nhóm VK KSF khác như Desulfovibrio, Desulfomicrobium từ các lô xử lý cũng đã được phát hiện có mặt ở tất cả các mẫu đất của Đà Nẵng và ở cả hai đợt lấy mẫu của Biên Hòa chứng tỏ VK nhóm này có mật độ cao. Các chi Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema chỉ được phát hiện trong lô số 1, số 4 của cả hai đợt lấy mẫu ở Biên Hòa và trong mẫu P4, P5, 10DNT, 100DNT ở Đà Nẵng. 3.1.2. Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý Như đã trình bày ở trên, nhiều VK có khả năng hô hấp loại khử clo đã được phát hiện bằng các cặp mồi đặc hiệu trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, trong đó có một số chi thuộc nhóm VK KSF. Do đó, sự đa dạng của VK KSF đã được nghiên cứu kỹ và chi tiết hơn bằng phương pháp DGGE với cặp mồi DCC305f kẹp đoạn GC và DSV838r đặc hiệu tương ứng cho các chi Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema và Desulfovibrio, Desulfomicrobium. Mẫu 10DNT, 100DNT sau xử lý 10 năm, 5 mẫu P1, P2, P3, P4, P5 sau xử lý 10 tháng tại sân bay Đà Nẵng và 4 mẫu M1, M2, M3, M4 được thu thập vào thời điểm 18 tháng sau xử lý tại Biên Hòa đã được lựa chọn cho nghiên cứu đa dạng VK KSF. Kết quả về sự đa dạng VK KSF từ các lô xử lý phân tích bằng kỹ thuật DGGE được trình bày ở Hình 3.1. Nhìn chung, VK KSF phát hiện được bằng DGGE ở Đà Nẵng đa dạng hơn so với Biên Hòa. Trên điện di đồ cho thấy có từ 7-13 băng DNA trên mỗi lô xử lý ở Đà Nẵng (Hình 3.1A). Số lượng các băng DNA của VK KSF ở Biên Hòa ít hơn, từ 5-7 băng và các băng thu được không nét (Hình 3.1B). Từ kết quả phân tích DGGE, các băng đậm nét và đặc trưng cho các mẫu được lựa chọn để xác định trình tự. Cây phát 70 sinh chủng loại dựa trên trình tự đoạn gene 16S rRNA cho thấy các VK KSF ở Biên Hòa và Đà Nẵng có quan hệ gần với các chi Desulfovibrio, Desulfococcus, Desulfosarcinar, Desulfobacterium (Hình 3.2). A B Hình 3.1. Điện di đồ DGGE với cặp mồi DCC305f/DSV838r đặc hiệu cho VK KSF từ các mẫu ở lô xử lý tại Đà Nẵng (A) và Biên Hòa (B) Chú thích: P1, P2, P3, P4, P5: Các mẫu đất ở lô xử lý 2 m3 sau 10 tháng; 10DNT, 100DNT: các mẫu đất ở lô xử lý 10 m3 và 100 m3 sau 10 năm; M1, M2, M3, M4: các mẫu đất ở lô xử lý 3.384 m3 sau 18 tháng xử lý; Marker: 1kb. Tất cả các dòng VK KSF lựa chọn đã được đăng ký trên GenBank với mã số như đã trình bày trên Bảng 3.2. Số liệu ở Bảng 3.2 thể hiện mối quan hệ giữa một số dòng VK KSF trong các lô xử lý so với các dòng VK gần gũi. 71 Hình 3.2. Cây phát sinh chủng loại của VK KSF trong các lô xử lý. Thanh bar thể hiện sự sai khác giữa các nucleotide (2/100 nucleotide) Bảng 3.2. Mối quan hệ giữa một số dòng VK KSF tại các lô xử lý và một số VK gần gũi Đà Nẵng Biên Hòa STT Địa điểm 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Dòng SRBBH1 SRBBH2 SRBBH3 SRBBH4 SRBDNP1 SRBDNP2.3 SRBDNP2.5 SRBDNP3 SRBDNP4 SRBDNP5 SRBDN10DNT SRBDN100DNT Mã số trên GenBank KC985170 KC985168 KC985169 KF358993 KF358996 KF358991 KF358995 KF358990 KF358989 KF358994 KF358992 KF358997 Vi khuẩn/dòng gần gũi Desulfococcus multivoransclone 2059 Desulfovibrio sp. BDN100T Desulfovibrio sp. BH3 Desulfosarcina sp. SD1 Desulfosarcina variabilis Desulfosarcina cetonica 480 Desulfovibrio sp. BDN10DNT Desulfobacterium indolicum In04 Desulfobacteriu mindolicum In04 Desulfovibrio sp. GY2 clone 1 Desulfococcus sp. DSM 8541 Desulfovibrio sp. BH3 % tương đồng 99% 99% 99% 98% 99% 98% 98% 97% 99% 98% 99% 99% 72 3.1.3. Đa dạng vi khuẩn Dehalococcoides trong các lô xử lý Dehalococcoides được xem là “thợ khử clo” nhưng chúng thường có số lượng thấp, rất khó phân lập và nuôi cấy bằng các kỹ thuật truyền thống. Trong nghiên cứu này, kỹ thuật nested-PCR và DGGE đã được sử dụng để đánh giá sự đa dạng của nhóm Dehalococcoides trong các lô xử lý. Kết quả về sự đa dạng Dehalococcoides được trình bày trên Hình 3.3. Hình 3.3. Điện di đồ DGGE phân tích sự đa dạng VK Dehalococcoides ở các lô xử lý Chú thích: 4.4, 3.4, 3.3, 2.2, 1.2, 1.1: các vị trí lấy mẫu tại lô xử lý 3.384 m3 ở Biên Hòa; P5: lô xử lý 2 m3 tại Đà Nẵng, 100DNT, 10DNT: lô xử lý 100 m3, 10 m3 tại Đà Nẵng; HC, HA: mẫu từ hồ C và hồ A tại Đà Nẵng. M: Marker 1kb Từ Hình 3.3 ta thấy, nhóm VK Dehalococcoides được phát hiện ở các vị trí 1.1, 1.2, 2.2, 3.3, 3.4 và 4.4 ở các lô xử lý Biên Hòa, các lô xử lý P5, 10DNT, 100DNT và hồ A, hồ C ở Đà Nẵng. Dehalococcoides trong các mẫu ở vị trí 4.4, 1.1 của Biên Hòa có độ đa dạng trung bình, chỉ 3 đến 4 băng DNA xuất hiện. Trong lô xử lý 1.2 tại Biên Hòa và lô xử lý P5 tại Đà Nẵng, VK Dehalococcoides đa dạng nhất (11 – 13 băng DNA). Kết quả thu được cho thấy quá trình loại khử clo xảy ra ở lô 1 vị trí lấy mẫu số 2 (1.2) của Biên Hòa và lô xử lý P5 của Đà Nẵng vào thời điểm lấy mẫu nghiên cứu là tốt nhất. 73 Từ kết quả phân tích bằng DGGE, 9 băng DNA đậm nét (4 băng ở Đà Nẵng và 5 băng ở Biên Hòa), đặc trưng cho các mẫu đã được lựa chọn để xác định trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại (Hình 3.4). Hình 3.4. Cây phát sinh chủng loại của Dehalococcoides trong các lô xử lý. Thanh bar thể hiện sự sai khác giữa các nucleotide (2/100 nucleotide) BDNP5 band 6 BDNP5 band 7 BDNP5 band 11 BDNHC band 1 BBH1.2 band 6 BH1.2 band 9 BBH1.2 band 10 BBH1.1 band 2 BBH1.1 band 3 Mã số trên GenBank IQ677673 IQ677609 IQ677671 IQ677608 IQ677670 IQ677605 IQ677672 IQ677607 IQ677606 Biên Hòa Dòng Địa điểm Đà Nẵng Bảng 3.3. Sự tương đồng của các dòng VK loại khử clo trong các lô xử lý với 6 chủng VK Dehalococcoides Chủng D. mccartyi MB 99% 99% 100% 91% 100% 98% 100% 96% 90% VS CBDB1 BAV1 99% 99% 99% 99% 99% 99% 100% 100% 99% 91% 91% 91% 100% 99% 99% 98% 97% 97% 100% 99% 99% 96% 96% 96% 90% 90% 90% FL2 98% 98% 99% 91% 99% 98% 99% 96% 90% 195 98% 98% 99% 91% 99% 98% 99% 96% 90% Trình tự các băng DNA của Dehalococcoides đã được đăng ký trên GenBank và được trình bày ở Bảng 3.3. Kết quả trên Hình 3.4 và Bảng 3.3 cho thấy các VK Dehalococcoides tại Biên Hòa và Đà Nẵng có độ tương đồng cao với nhau và tương 74 đồng khá cao (trên 90%) với các chủng Dehalococcoides đã phân lập được (Loffer, 2013). Tóm lại, sự đa dạng các VK KK tham gia vào quá trình hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý tại Đà Nẵng và Biên Hòa đã được xác định bằng nested-PCR và DGGE. Các chi Desulfitobacterium, Dehalococcoides, nhóm Desulfovibrio, Desulfonema và nhóm Desulfococcus, Desulfosarcinar, Desulfomicrobium đã được phát hiện bằng nested-PCR trong các lô xử lý. Bằng phương pháp DGGE đã xác định VK KSF trong các lô xử lý khá đa dạng và thuộc các chi Desulfovibrio, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfobacterium, chúng đều thuộc nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc. Bằng phương pháp DGGE, VK loại khử clo bắt buộc Dehalococcoides cũng được xác định khá đa dạng trong các lô xử lý. 3.2. Sự đa dạng vi khuẩn trong mẫu làm giàu 3.2.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại clo trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin Để xác định sự đa dạng và khả năng phân hủy hay chuyển hóa các thành phần trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bởi quần xã VK KK loại khử clo, các VK KK từ lô xử lý ở Biên Hòa (sau 36 tháng xử lý) được làm giàu trên môi trường khoáng kỵ khí M204 bổ sung đất ô nhiễm chứa hỗn hợp PCDD/Fs, chất diệt cỏ (2,4-D, 2,4,5-T) và các sản phẩm phân hủy sinh học của chúng (chlorophenol) với tổng độ độc lên đến 41.265pg TEQ/g đất khô. Quần xã VK này được gọi là VK KK trên đất ô nhiễm. Đây là thí nghiệm lần đầu tiên được thực hiện trên nguồn đất ô nhiễm đã biết chứa hỗn hợp của dioxin và các chất diệt cỏ với độ độc rất cao (Hình 3.5) để xác định cấu trúc quần xã VK KK cũng như gene chức năng bằng công cụ Metagenomics. Sau 1 năm nuôi cấy làm giàu trong điều kiện tĩnh, kỵ khí, tối, ở 28-30oC cho thấy đất ở mẫu đối chứng vẫn có màu vàng còn đất trong mẫu nuôi cấy đã chuyển sang màu xám đen. Kết quả thu được chứng tỏ đã có sự sinh trưởng của quần xã VK KK trong mẫu làm giàu. Sau khi thu sinh khối từ mẫu làm giàu, DNA tổng số đã được tách, làm sạch bằng Kit chuyên dụng (BiO MO), sau đó DNA được kiểm tra độ tinh sạch và nồng độ trên máy NanoDrop ND-2000. Mẫu DNA đủ chất lượng đã được giải trình tự bằng máy Roche 454 GS Junior. Các kết quả thu được từ trình tự của metagenome 75 sau khi xử lý bằng công cụ tin sinh học bởi hệ thống phân tích tự động MG-RAST được trình bày lần lượt ở các mục tiếp theo. Hình 3.5. VK KK hô hấp loại khử clo từ đất ở 16 vị trí trong lô chôn lấp tích cực tại Biên Hòa sau 36 tháng xử lý được làm giàu trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin rất nặng 3.2.2. Sự đa dạng vi khuẩn trong mẫu làm giàu Các thông số cơ bản về metagenome của mẫu làm giàu VK KK trên nguồn đất ô nhiễm nặng dioxin được trình bày ở Bảng 3.4, 3.5. Bảng 3.4. Các thông số của metagenome từ mẫu làm giàu VK trên đất ô nhiễm được phân tích bởi máy Roche 454 GS Junior bằng Newbler STT 1 2 3 4 5 6 7 Thôngsố Tổng số reads Kích thước metagenome Số reads trong contigs Số contigs Reads/contigs Độ dài contig lớn nhất Độ dài contig N50 128.030 56 Mbp 71.997 (56,23%) 1674 43,01 bp 26.165 bp 4861 Ghi chú: Read:1 trình tự đọc được bởi máy đọc trình tự. Một trình tự ở số liệu cuối là kết quả của việc loại trừ các read tương đồng Contig (đoạn ghép nối): kết quả của việc tổ hợp các đoạn đơn. Một contig gồm ít nhất 2 trình tự nối với nhau. Hit:1 read hoặc 1 phần của read có thể đối chiếu với cơ sở dữ liệu Bảng 3.5. Dữ liệu metagenome trong mẫu làm giàu được phân tích bằng MG-RAST STT 1 2 3 4 5 6 7 Thông số Số đoạn trình tự Tổng chiều dài của các trình tự Độ dài trung bình một trình tự Số đoạn trình tự chứa gene rRNA Số đoạn trình tự mã hóa cho protein đã biết chức năng Số đoạn trình tự mã hóa cho protein chưa biết chức năng Số đoạn trình tự không chứa gene rRNA hoặc protein 5.817 2.849.689 bp 489 bp 43 (0,7%) 3.449 (59,3%) 1.051 (18,1%) 495 (8,5%) 76 Kết quả thu được cho thấy kích thước DNA của metagenome không lớn, chỉ khoảng 56 Mbp. Đây là mẫu làm giàu VK KK ở nồng độ dioxin cao nên số lượng các VK sinh trưởng được trong điều kiện này không nhiều, lượng DNA thu được không lớn so với các mẫu DNA metagenome trong đất (Uroz, 2013). Trong số 5.817 trình tự thu được chỉ có 59,3% trình tự đã biết chức năng, 0,7% trình tự chứa gene rRNA và 18,1 % các đoạn trình tự chưa biết chức năng với kích thước các đoạn trình tự trung bình khoảng 489 bp. Trong mẫu làm giàu có 4 giới trong đó vi khuẩn chiếm ưu thế (khoảng 98,78%). Các trình tự còn lại tương ứng với các giới khác là vi khuẩn cổ (0,04%), Eucaryota (0,94%), virus (0,24%) (Bảng 3.6). Các VK có mặt trong mẫu làm giàu rất đa dạng, chúng thuộc về nhiều ngành, lớp, bộ, họ và chi khác nhau. Tuy nhiên, trong khuôn khổ luận án, chúng tôi sẽ tập trung phân tích và trình bày sự đa dạng của ngành, lớp và chi VK KK liên quan đến quá trình chuyển hóa hay phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo. Trong metagenome của mẫu làm giàu có đủ cả 4 ngành Proteobacteria, Bacteroidetes, Firmicute, Chloroflexi với nhiều chi VK đại diện tham gia vào quá trình hô hấp loại khử clo đã được công bố (Hiraishi, 2008; Maphosa 2010). Trong số 4 ngành trên thì ngành Proteobacteria chiếm ưu thế đến 74,22% (Bảng 3.6, Hình 3.6). Hình 3.6. Đa dạng VK trong mẫu làm giàu VK KK trên đất ô nhiễm (Abundance: một trình tự khi so sánh với cơ sở dữ liệu có nhiều hơn một trình tự tương đồng) 77 Trong ngành Proteobacteria thì lớp -Proteobacteria chiếm đa số (khoảng 65,09%). Ngành Proteobacteria bao gồm các đại diện tham gia vào quá trình loại khử clo chủ yếu thuộc nhóm loại khử clo không bắt buộc và đồng trao đổi chất. Ngoài ra còn có các ngành Bacteroidetes (7,13%) chưa được nghiên cứu nhiều, chúng có một số đại diện thuộc nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất, ngành Firmicutes (5,71%) có các đại diện thuộc nhóm loại khử clo không bắt buộc và bắt buộc, ngành Chloroflexi (3,8%) có các đại diện chủ yếu thuộc nhóm loại khử clo bắt buộc, ngành Actinobacteria (2,57%) và một số ngành khác có số lượng ít hơn 2% nhưng đã có nhiều nghiên cứu hơn và có các đại diện có khả năng loại halogen. Bảng 3.6. Tỷ lệ các VK có mặt trong mẫu làm giàu STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 Giới Tỷ lệ Ngành (%) Bacteria 98.78 Proteobacteria Archaea 0.04 Bacteroidetes Eukaryota 0.94 Firmicutes Virus 0.24 Chloroflexi Actinobacteria Euryarchaeota Acidobacteria Spirochaetes Deinococcus Cyanobacteria Thermotogae Chlorobi Planctomycetes Tenericutes Verrucomicrobia Tỷ lệ (%) 74.22 7.13 5.71 3.80 2.57 1.80 0.88 0.61 0.56 0.33 0.31 0.27 0.27 0.19 0.19 Lớp Gammaproteobacteria Betaproteobacteria Bacteroidia Deltaproteobacteria Clostridia Anaerolineae Actinobacteria (class) Alphaproteobacteria Bacilli Cytophagia Chloroflexi (class) Solibacteres Sphingobacteriia Flavobacteriia Dehalococcoidetes Methanomicrobia Spirochaetia Thermomicrobia Epsilonproteobacteria Methanobacteria Deinococci Mollicutes Thermotogae (class) Acidobacteriia Chlorobia Synergistia Anthozoa Planctomycetia Halobacteria Aquificae (class) Erysipelotrichi Fusobacteriia Methanococci Chrysiogenetes Dictyoglomia Negativicutes Gemmatimonadetes Spartobacteria Tỷ lệ (%) 65.09 6.33 5.70 4.51 4.22 1.46 1.23 1.17 0.77 0.65 0.54 0.42 0.42 0.40 0.33 0.31 0.27 0.17 0.17 0.15 0.15 0.15 0.15 0.15 0.10 0.10 0.10 0.10 0.08 0.06 0.06 0.06 0.06 0.04 0.04 0.04 0.04 0.04 Chi Pseudomonas Bacteroides Geobacter Azotobacter Anaerolinea Parabacteroides Clostridium Bordetella Comamonas Prevotella Vibrio Burkholderia Bacillus Xanthomonas Achromobacter Klebsiella Azoarcus Porphyromonas Aeromonas Desulfotomaculum Shewanella Pelobacter Pelotomaculum Treponema Desulfitobacterium Enterobacter Aromatoleum Desulfovibrio Acidovorax Candidatus Dechloromonas Streptomyces Methylobacterium Geobacillus Lactobacillus Rhodopseudomonas Dehalococcoides Acinetobacter Tỷ lệ (%) 59.77 2.73 2.45 1.98 1.26 1.06 0.99 0.78 0.53 0.53 0.48 0.46 0.44 0.44 0.43 0.34 0.31 0.31 0.29 0.29 0.29 0.27 0.27 0.27 0.26 0.26 0.24 0.24 0.22 0.22 0.22 0.22 0.20 0.19 0.19 0.17 0.15 0.14 78 STT Giới Tỷ lệ (%) Ngành Tỷ lệ (%) Lớp Tỷ lệ (%) Chi Anaeromyxobacter Dehalogenimonas Chlorobium Chloroflexus Corynebacterium Deinococcus Dethiosulfovibrio Desulfatibacillum Desulfobulbus Desulfohalobium Desulfomicrobium Desulfonatronospira Desulfotalea Desulfurispirillum Rhodococcus Sulfurimonas Sulfurospirillum Desulfococcus Desulfurococcus 39 40 41 42 43 44 45 46 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 Tỷ lệ (%) 0.14 0.07 0.07 0.07 0.07 0.05 0.05 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.03 0.02 0.02 Các VK được phát hiện bằng các phương pháp khác nhau trong nghiên cứu này có thể được phân loại theo đặc tính trao đổi các hợp chất chứa clo của chúng, so sánh với nghiên cứu của Đào Thị Ngọc Ánh (2013) và trình bày ở Bảng 3.7. Bảng 3.7. Các VK trong metagenome của mẫu làm giàu theo khả năng loại khử clo STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 Nhóm VK hô hấp loại khử clo bắt buộc VK hô hấp loại khử clo không bắt buộc VK loại khử clo đồng trao đổi chất VK đã được xác định có mặt trong lô xử lý ở Biên Hòa bằng DGGE (Đào Thị Ngọc Ánh, 2013) Tên chi Metagenomics Nested-PCR Dehalococcoides + + Dehalogenimonas + KPH Geobacter + KXĐ Desulfotomaculum + + Desulfitobacterium + + Desulfovibrio + + Sulfurospirillum + KXĐ Desulfococcus + + Desulfuromonas + KXĐ Anaeromyxobacter + KXĐ Pseudomonas + KXĐ Clostridium + KXĐ Bacillus + KXĐ Shewanella + KXĐ Dechloromonas + KXĐ Enterobacter + KXĐ Methanosarcina + KXĐ Escherichia + KXĐ Helicobacter + KXĐ Desulfobacterium + KXĐ Bacteroides + KXĐ Deinococci + KXĐ Achromobacter + KXĐ Klebsiella + KXĐ Methylobacterium + KXĐ DGGE + KXĐ KXĐ + KXĐ + KXĐ + KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ + KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ KXĐ Chú thích: +: có mặt VK; KXĐ: không xác định; KPH: không phát hiện 79 Kết quả trình bày trên Bảng 3.7 một lần nữa khẳng định công cụ Metagenomics đã đánh giá được đầy đủ các VK có mặt trong mẫu mà các phương pháp như nested-PCR và DGGE không phản ánh hết được. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu còn phụ thuộc vào chất lượng và số lượng DNA của cả quần xã VSV có trong mẫu. Ngoài ra, dựa vào đặc điểm trao đổi chất, các VK trong mẫu làm giàu còn được chia thành 3 nhóm là VK hiếu khí, VK KK bắt buộc và kỵ khí tùy tiện (Bảng 3.8). Các VK trên chiếm tỷ lệ khác nhau trong metagenome nhưng chúng có liên quan đến quá trình loại khử các hợp chất chứa clo và phân hủy các hợp chất vòng thơm. Bảng 3.8. Phân loại VK có mặt trong mẫu làm giàu theo khả năng hô hấp STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 VK hiếu khí Pseudomonas Azotobacter Bordetella Comamonas Burkholderia Bacillus Xanthomonas Achromobacter Acidovorax Streptomyces Geobacillus Thermus Acinetobacter Marinobacter Rhizobium Dyadobacter Mycobacterium Nematostella Alcanivorax Chromohalobacter Rhodococcus Tỷ lệ (%) 59,77 1,98 0,78 0,53 0,46 0,44 0,44 0,43 0,22 0,22 0,19 0,15 0,14 0,14 0,14 0,12 0,1 0,1 0,1 0,1 0,03 VK KK bắt buộc Tỷ lệ (%) Bacteroides 2,73 Geobacter 2,45 Anaerolinea 1,26 Parabacteroides 1,06 Clostridium 0,99 Desulfitobacterium 0,26 Desulfotomaculum 0,29 Pelobacter 0,27 Dechloromonas 0,22 Paludibacter 0,2 Dehalococcoides 0,15 Methanosarcina 0,1 Methanocaldococcus 0,1 Dehalogenimonas 0,07 Chlorobium 0,07 Chloroflexus 0,07 VK KK tùy tiện Tỷ lệ (%) Prevotella 0,53 Vibrio 0,48 Klebsiella 0,34 Azoarcus 0,31 Porphyromonas 0,31 Aeromonas 0,29 Shewanella 0,29 Pelotomaculum 0,27 Treponema 0,27 Enterobacter 0,26 Roseiflexus 0,26 Aromatoleum 0,24 Desulfovibrio 0,24 Candidatus Solibacter 0,22 Methylobacterium 0,2 Lactobacillus 0,19 Delftia 0,17 Rhodopseudomonas 0,17 Ralstonia 0,15 Anaeromyxobacter 0,14 Colwellia 0,12 Frankia 0,12 Photobacterium 0,12 Campylobacter 0,1 Eubacterium 0,1 Deinococcus 0,05 Desulfobulbus 0,03 Desulfohalobium 0,03 Desulfomicrobium 0,03 Desulfonatronospira 0,03 Desulfotalea 0,03 Desulfurispirillum 0,03 Sulfurimonas 0,03 Sulfurospirillum 0,03 Desulfococcus 0,02 Desulfurococcus 0,02 80 3.3. Sự biến động số lƣợng vi khuẩn kỵ khí trong lô xử lý tại sân bay Biên Hòa Ngoài đa dạng về chủng loại VK KK, sự biến động về số lượng của chúng trong các lô xử lý cũng đã được khảo sát. Sự biến động về số lượng VK KK ở các lô xử lý tại Đà Nẵng đã được đánh giá trong các nghiên cứu của Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005, 2010a) nên trong phạm vi đề tài luận án chỉ đánh giá sự biến động số lượng của VK KK tại lô xử lý ở Biên Hòa. 3.3.1. Sự biến động vi khuẩn kỵ khí sử dụng chất diệt cỏ/dioxin trong lô xử lý Số lượng VK KK sử dụng dioxin được đánh giá bằng cách nuôi cấy trên môi trường dịch SH có bổ sung DCĐ ở nồng độ 2% (v/v). Sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin được trình bày trên Hình 3.7A. A B Hình 3.7. Sự biến động số lượng VK KK nói chung (A) và VK KSF (B) sử dụng chất diệt cỏ/dioxin ở lô xử lý Biên Hòa Kết quả thu được cho thấy, số lượng VK KK sử dụng dioxin ở lô 1 tăng mạnh vào đợt thứ hai, giảm nhẹ vào đợt thứ ba và tăng nhẹ vào đợt thứ 4. Số lượng VK KK ở lô 2 ổn định hơn qua cả 4 đợt lấy mẫu với số lượng khoảng 106-107 MPN/g đất và có chiều hướng tăng nhẹ vào đợt lấy mẫu sau. Ở lô số 3, số lượng VK KK tăng nhanh vào đợt lấy mẫu thứ 2, giảm nhẹ và duy trì ổn định ở nồng độ 107 MPN/g đất. Ở lô số 4, số lượng VK KK cũng ổn định ở mức 106-107 MPN/g đất. Số lượng VK KK có giảm nhẹ vào đợt thứ 2 và tăng nhẹ vào đợt 4. Nhìn chung, số lượng VK KK trung bình của cả 4 lô khá ổn định qua cả 4 đợt lấy mẫu với số lượng VK nằm trong khoảng 106-107 MPN/g đất. 81 3.3.2. Sự biến động số lượng vi khuẩn khử sulfate trong lô xử lý Vì VK KK thuộc nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc luôn có số lượng lớn so với các nhóm khác, đặc biệt là nhóm VK KSF nuôi cấy được nên nghiên cứu này cũng đánh giá sự biến động của VK KSF trong các lô xử lý. Sự biến động số lượng VK KSF trong lô xử lý được đánh giá bằng cách nuôi cấy trên môi trường dịch Posgate B bổ sung DCĐ với nồng độ 2% (v/v). Kết quả về sự biến động VK KSF trong lô xử lý qua 4 đợt lấy mẫu được trình bày trên Hình 3.7B. Số lượng VK KSF khá ổn định qua các đợt lấy mẫu và duy trì ở mức độ 104105 MPN/g đất. Cụ thể như sau: ở lô số 1 số lượng VK KSF tăng nhẹ ở đợt thứ 2, duy trì ổn định ở đợt 3 và 4 với nồng độ 102-103 MPN/g đất. Ở lô số 2, số lượng VK KSF tăng ở đợt thứ 2 và 3, duy trì ở mức 104-105 MPN/g đất. Ở lô số 3, số lượng VK KSF duy trì ổn định ở 104-105 MPN/g đất. Ở lô số 4, số lượng VK KSF duy trì ở nồng độ 104-105 MPN/g đất, tăng nhẹ ở đợt lấy mẫu thứ 3. Trung bình, số lượng VK KSF tăng từ đợt lấy mẫu 1 đến đợt 3 và giảm nhẹ ở đợt 4 (Hình 3.7B). Như vậy, số lượng VK KK có khả năng sử dụng dioxin trong các mẫu ở lô xử lý của Biên Hòa luôn cao hơn số lượng VK KSF ở các đợt lấy mẫu. Số lượng các VK KK nói chung và VK KSF nói riêng được duy trì khá ổn định qua các đợt lấy mẫu, thường tăng nhẹ vào đợt lấy mẫu thứ 2 và ổn định vào đợt lấy mẫu thứ 3 và thứ 4. Để xử lý triệt để các chất hữu cơ chứa clo là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin cần có sự kết hợp của nhiều VSV. Đặc biệt, các VK KK có khả năng loại khử clo thường sống thành quần xã trong đó mỗi VK có vai trò khác nhau trong quá trình loại khử clo. Do đó, các nghiên cứu tiếp theo được thực hiện với cả quần xã VK KK (bao gồm Dehalococcoides) và quần xã VK KSF nhằm có những thông số kỹ thuật cơ bản ở mức độ chi tiết hơn để áp dụng vào quá trình xử lý cũng như nâng cao hiệu quả khử độc ở quy mô hiện trường. 3.4. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào 3.4.1. Sự có mặt của các gene reductive dehalogenase (rdhA) trong các lô xử lý và trong mẫu làm giàu Theo các tài liệu đã công bố, gene rdhA có mặt ở các VK hô hấp loại khử clo kỵ khí bắt buộc như Dehalococcoides, Dehalobacter, Desulfitobacterium. Do đó, 82 các mẫu được xác định có mặt VK Dehalococcoides hay Desulfitobacterium được lựa chọn để xác định sự có mặt của gene rdhA. Mặt khác, sự có mặt của các gene khác nhau ở các chủng, các chi khác nhau là khác nhau trong đó VK Dehalococcoides là nhóm mang nhiều gene rdhA nhất. Do đó, các mẫu đã được xác định có mặt Dehalococcoides được ưu tiên nghiên cứu. Từ DNA tổng số của các mẫu đất tại các lô xử lý ở sân bay Đà Nẵng, Biên Hòa và các mẫu làm giàu VK hô hấp loại khử clo kỵ khí bắt buộc (các mẫu đã được xác định có mặt VK Dehalococcoides như đã trình bày ở trên) được lựa chọn để nhân đoạn gene rdhA bằng các cặp mồi khác nhau như trình bày ở Bảng 2.2. Trong nghiên cứu này, 5 cặp mồi khác nhau đặc hiệu cho các đoạn gene chức năng rdhA khác nhau như pceA, tceA, cbrA, DET0318 (Bảng 2.2) đã được sử dụng. Tuy nhiên, với tất cả các cặp mồi sử dụng với điều kiện tối ưu cho phản ứng PCR nhưng chưa đoạn gene rdhA nào được phát hiện. 3.4.2. Sự đa dạng một số nhóm gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào phát hiện bằng Metagenomics Ngoài DNA mã hóa cho gene 16S rRNA, 23S rRNA của các VSV, trong metagenome của mẫu làm giàu còn chứa DNA mã hóa cho các thành phần protein tham gia vào các quá trình của tế bào (Hình 3.8). Hình 3.8. Phân bố và tỷ lệ các gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào 83 Từ trình tự metagenome của mẫu làm giàu VK KK, so sánh với các trình tự hiện có trên GenBank cho thấy có 1883 gene chức năng đã được phát hiện. Các gene này được đối chiếu trên cơ sở hệ thống phụ các nhóm chức năng. Kết quả thu được cho thấy ngoại trừ các gene liên quan đến quang hợp, các protein mã hóa bởi các gene chức năng phát hiện được tham gia vào hầu hết các chu trình tế bào với mức độ khác nhau (Hình 3.8). Danh sách các enzyme được mã hóa bởi các gene liên quan đến quá trình chuyển hóa các hợp chất vòng thơm có mặt trong mẫu làm giàu được trình bày ở Bảng 3.9. Bảng 3.9. Các enzyme được mã hóa bởi các gene tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm STT Quá trình phân hủy Hợp chất Catechol 1 Phân hủy hiếu khí Gentisate, salicylate Homogentisate Enzyme Beta-ketoadipateenol-lactone hydrolase, Muconatecycloisomerase, Muconolactoneisomerase, Acetaldehyde dehydrogenase, acetylating in gene cluster for degradation of phenols, cresols, catechol, Catechol 2,3-dioxygenase putative 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase, Fumarylacetoacetase 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase; Fumarylacetoacetase; Homogentisate 1,2dioxygenase, yếu tố điều hòa sao mã họ IclR Protocatechuate Beta-ketoadipateenol-lactone hydrolase Carbazol 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase Biphenyl 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase, Acetaldehyde dehydrogenase, Acetaldehyde dehydrogenase, acetylating, nhóm gene phân hủy phenols, cresols, catechol Phenol Phenol hydroxylase, FAD- and [2Fe-2S]-chứa thành phần DmpP; Phenol hydroxylase, P3 oxygenase component DmpN, điều hòa quá trình phân hủy phenol n-Phenylalkanoic 3-hydroxyacyl-CoA dehydrogenase 3- acid hydroxybutyryl-CoA epimerase Delta(3)-cisdelta(2)-trans-enoyl-CoA isomerase Enoyl-CoA hydratase; acid béo chuỗi dài CoA ligase enoyl-CoA hydratase, R-specific 2 Phân hủy kỵ khí Benzoate, Methylglutaconyl-CoA hydratase, Acetyl-CoA acetyltransferase, Glutaryl-CoA 84 STT Quá trình phân hủy Hợp chất chlorobenzoate 7 Loại clo của hợp chất Hợp chất chứa clo chứa clo dạng acid Enzyme dehydrogenase, Acetyl-CoA, C-acyl transferase, Muconatecycloisomerase, Muconolactoneisomerase, 1,2-dihydroxy cyclohexa-3,5-diene-1-carboxylate dehydrogenase; Benzoate 1,2-dioxygenase protein vận chuyển benzoate, yếu tố hoạt hóa operon của quá trình sao mã Haloacid dehalogenase dạng acid Trong số các gene tham gia vào các chu trình tế bào, các cụm gene liên quan đến trao đổi hợp chất vòng thơm được lưu tâm nhất bởi chúng có liên quan chặt chẽ đến các quá trình chuyển hóa và phân hủy những hợp chất gây ô nhiễm có mặt trong mẫu nghiên cứu. Với nhóm gene trao đổi các hợp chất vòng thơm, các gene chức năng mã hóa cho enzyme có thể liên quan đến 40 phản ứng xúc tác phân hủy hợp chất thơm. Các enzyme này chủ yếu thuộc vào các nhóm phân hủy các hợp chất vòng thơm, đa vòng thơm chứa hay không chứa clo ở điều kiện hiếu khí (catechol, gentisate, homogentisate v.v.) và kỵ khí (benzoate, chlorobenzoate). Trong nghiên cứu này cũng phát hiện ra sự có mặt của haloacid dehalogenase là enzyme tham gia vào quá trình loại clo của các hợp chất chứa clo ở dạng acid. Enzyme này tham gia cắt liên kết C-X (X là halogen) dưới tác dụng của H2O tạo thành hợp chất chứa nhóm hydroxyl (thay cho nhóm halogen). Enzyme này có mặt ở cả VK hiếu khí như Pseudomonas (Kurihara, 2000), Xanthomonas (Pieretti, 2009) và kỵ khí như Bacteroides (Huang, 2011). Để so sánh trình tự gene mã hóa cho một số enzyme tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm chứa clo với các đoạn gene của các chủng đã nghiên cứu, trình tự một số đoạn gene haloacid dehalogenase và gene phân hủy hợp chất vòng thơm đã được lựa chọn để phân tích sâu hơn. 3.4.3. So sánh trình tự một số gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình phân hủy kỵ khí các hợp chất vòng thơm Từ dữ liệu metagenome của mẫu làm giàu VK KK, trình tự đoạn gene haloacid dehalogenase được xác định bằng công cụ Metagenomics và so sánh đoạn 85 trình tự này trên ngân hàng gene. Cây phát sinh chủng loại đã được xây dựng dựa vào phần mềm Cluxtal X và Mega5 (Hình 3.9). Trong metagenome của mẫu làm giàu VK KK hô hấp loại clo sau 1 năm cho thấy có 2 đoạn trình tự tương đồng với gene haloacid dehalogenase, ký hiệu là haloacid dehalogenase 1 và haloacid dehalogenase 2 (Hình 3.9). Hình 3.9. Mối quan hệ của 2 gene haloacid dehalogenase với các gene của Pseudomonas Trình tự đoạn gene haloacid dehalogenase 1 tương đồng 85-86% với trình tự đoạn gene này của một số chủng thuộc loài P. stutzeri như ATCC17588, A1501, RCH2, DSM 4166. Trình tự đoạn gene haloacid dehalogenase 2 tương đồng 83-86% với trình tự đoạn gene này của một số chủng thuộc loài P. aeruginosa như PA7, M18, RP73, DK2 v.v. Mối quan hệ giữa các gene mã hóa các enzyme tham gia quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm được trình bày trên Hình 3.10. Trình tự đoạn gene mã hóa cho các enzyme beta-ketoadipate enol-lactone hydrolase tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm như catechol, protocatechuate có độ tương đồng 96-97% với các enzyme 3-oxoadipate enollactone của các chủng P. aeruginosa RP73, M18, chủng P. putida KT2440, trình tự đoạn gene này cũng tương đồng 98% với gene mã hóa enzyme beta-ketoadipate enol-lactone hydrolase chủng P. stutzeri DSM10701. Enzyme 1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene-1-carboxylate dehydrogenase tham gia vào quá trình phân hủy benzoate, chlorobenzoate, phenylpropionate có độ tương đồng 96-97% với các 86 enzyme 1,6-dihydroxycyclohexa-2,4-diene-1-carboxylate dehydrogenase của các chủng thuộc chi Pseudomonas. Hình 3.10. Mối quan hệ giữa một số enzyme tham gia vào quá trình phân hủy hợp chất vòng thơm do các gene chức năng có mặt trong mẫu làm giàu mã hóa 87 3.5. Một số đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate 3.5.1. Làm giàu quần xã vi khuẩn khử sulfate Để nghiên cứu sự giống và khác nhau về đặc điểm sinh học giữa các quần xã VK KSF tại lô xử lý ở Biên Hòa và Đà Nẵng, hai quần xã VK KSF tại hai vị trí tương ứng được làm giàu 3 lần liên tiếp trên môi trường Posgate B chứa DCĐ và được phối trộn theo tỷ lệ bằng nhau giữa các mẫu từ nguồn khác nhau (mỗi mẫu làm giàu riêng lẻ được lấy 10 ml dịch nuôi, trộn đều tạo thành quần xã). Quần xã VK KSF ở Đà Nẵng (gọi tắt là VK KSF từ Đà Nẵng) là hỗn hợp các VK KSF được làm giàu từ các mẫu 10DNT, 100DNT sau xử lý 8 năm, các mẫu từ P1 đến P5 sau xử lý 6, 7 tháng. Quần xã VK KSF ở Biên Hòa (gọi tắt là VK KSF từ Biên Hòa) là hỗn hợp các VK KSF được làm giàu từ các mẫu M1, M2, M3, M4 sau 18 tháng xử lý. Các quần xã này được sử dụng cho một số nghiên cứu về đặc tính quần xã VK KSF trong các nghiên cứu tiếp theo. 3.5.2. Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate Các yếu tố môi trường ảnh hưởng lớn đến sự sinh trưởng của VSV nói chung và quần xã VK KK nói riêng. Tuy nhiên, do quần xã VK KK bắt buộc khó nuôi cấy, khó xác định sinh trưởng nên việc nghiên cứu các yếu tố môi trường gặp nhiều khó khăn. Trong phạm vi đề tài luận án này, các yếu tố môi trường ảnh hưởng đến sinh trưởng của quần xã VK KSF đã được chọn để nghiên cứu. Các yếu tố môi trường bao gồm nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl, nồng độ chất độc chứa clo (DCĐ), các hợp chất chứa clo khác và một số nguồn carbon thay thế đã được khảo sát. Trong nghiên cứu này, hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa được sử dụng để nghiên cứu. Để khảo sát ảnh hưởng của các yếu tố nhiệt độ, pH, nồng độ NaCl, nguồn carbon thay thế đến sinh trưởng của VK KSF, hai quần xã VK KSF được nuôi cấy trên môi trường Posgate B chứa 3,2 % DCĐ (v/v). Sinh trưởng của quần xã VK KSF được xác định sau 10 ngày nuôi cấy. 88 3.5.2. 1. Ảnh hưởng của nhiệt độ Nhiệt độ là một trong nhiều yếu tố ảnh hưởng đến sự sinh trưởng của thế giới VSV trong đó có VK KSF. Dải nhiệt độ được nghiên cứu là 4, 25, 30, 35, 40 và 45oC và kết quả được trình bày ở Hình 3.11. Kết quả trình bày ở Hình 3.11 cho thấy, nhiệt độ ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của quần xã VK KSF. Cả hai quần xã VK KSF trong các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa có khả năng sinh trưởng ở dải nhiệt độ 15-40oC và tối ưu ở nhiệt độ 30oC. Tuy nhiên, sự sinh trưởng của mỗi quần xã tại cùng một nhiệt độ lại khác nhau. Ở trên 30oC, sinh trưởng của quần xã VK KSF ở Biên Hòa giảm chậm nhưng sinh trưởng của quần xã ở Đà Nẵng giảm nhanh hơn. Ở Hình 3.11. Sinh trưởng của hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng ( ) và Biên Hòa ( )ở các nhiệt độ khác nhau 25oC, sinh trưởng của quần xã VK KSF ở Đà Nẵng lại cao hơn so với ở Biên Hòa. Kết quả thu được có thể giải thích do ở hố chôn lấp của Biên Hòa sâu tới 2,5 m, có 5 lớp bọc nên nhiệt độ ổn định hơn so với nhiệt độ trong các lô xử lý khác nhau của Đà Nẵng chỉ sâu 1,2-1,5 m và chỉ có 1-2 lớp bọc đất xử lý. Sinh trưởng của cả hai quần xã VK bị ức chế hoàn toàn ở nhiệt độ 10oC và 45oC. 3.5.2.2. Ảnh hưởng của pH pH là một trong các yếu tố ảnh hưởng rất lớn đến sự sinh trưởng của VSV nói chung và VK KSF nói riêng. Các giá trị pH ban đầu được nghiên cứu là 4, 5, 6, 7, 8, 9 và kết quả được trình bày ở Hình 3.12. 89 Kết quả trên Hình 3.12 cho thấy cả hai quần xã VK KSF có khả năng sinh trưởng trên môi trường Posgate B chứa DCĐ ở dải pH từ 5 đến 9 và hoàn toàn bị ức chế ở pH 4. Sinh trưởng của quần xã VK KSF từ Đà Nẵng tối ưu ở pH 5-7 và từ Biên Hòa là pH 7. Ở pH cao hơn 7, sinh trưởng của quần xã từ Đà Nẵng giảm nhanh tuyến tính trong khi sinh trưởng của quần xã từ Biên Hòa giảm chậm. Hình 3.12. Sinh trưởng của hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng ( ) và Biên Hòa ( ) ở các pH khác nhau 3.5.2.3. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl Nồng độ NaCl là một yếu tố môi trường không chỉ ảnh hưởng đến khả năng sinh trưởng của quần xã VSV mà còn cho ta biết về khả năng ứng dụng các VSV này trong các điều kiện môi trường khác nhau như nước ngọt, nước lợ hay nước mặn. Ảnh hưởng của nồng độ NaCl lên sự sinh trưởng của hai quần xã VK KSF được khảo sát với dải nồng độ từ 0-10% và được trình bày ở Hình 3.13. Hình 3.13. Sinh trưởng của quần xã VK KSF ở Đà Nẵng ( các nồng độ NaCl khác nhau ) và Biên Hòa ( ) với Từ Hình 3.13 ta thấy, cả hai quần xã VK KSF có khả năng sinh trưởng ở nồng độ NaCl từ 0-5%. Chúng sinh trưởng tốt ở nồng độ NaCl từ 0 đến 1% trong đó nồng độ NaCl tối ưu cho sinh trưởng là 0,1%. Ở nồng độ NaCl trên 1%, sinh trưởng của 90 cả hai quần xã giảm dần. Tuy nhiên, sinh trưởng của quần xã VK KSF ở Biên Hòa tốt hơn so với quần xã VK KSF ở Đà Nẵng với nồng độ NaCl cao hơn 1%. Theo những kết quả điều tra gần đây nhất cho thấy các khu vực ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin mới phát hiện tại Tây Nam sân bay Biên Hòa nằm dưới mực nước biển 2 m (Phung Khac Huy Chu, 2012), chúng có liên quan đến sinh thái nước lợ với nồng độ NaCl cao hơn 1%. Các khu vực đã xử lý của nghiên cứu này có thể liên quan ít nhiều đến nước lợ nên quần xã VK KSF ở đây có thể phát triển tốt ở nồng độ NaCl 1%. Kết quả nghiên cứu thu được cho thấy quần xã VK KSF ở Biên Hòa nằm trong lô xử lý có thể “làm giống” để xử lý khu vực ô nhiễm mới này và một số vị trí ô nhiễm khác có nồng độ NaCl cao hơn đất và trầm tích thông thường. 3.5.2.4. Ảnh hưởng của nguồn carbon Trong quá trình hô hấp loại clo, VK KSF sử dụng các muối của acid hữu cơ làm nguồn carbon và chất cho điện tử. Một số muối natri của acid hữu cơ được sử dụng thay cho nguồn carbon là lactate trong môi trường Posgate B đã được khảo sát nhằm tạo điều kiện cho sinh trưởng của VK KSF tốt nhất. Chọn được nguồn carbon có tác dụng kích thích sự sinh trưởng của quần xã VK KSF và kinh tế nhất có thể ứng dụng để xử lý ở quy mô hiện trường là một trong các nghiên cứu được quan tâm trong đề tài này. Sinh trưởng của VK KSF trên các nguồn carbon thay thế được trình bày ở Hình 3.14. Hình 3.14. Sinh trưởng của quần xã VK KSF ở Đà Nẵng ( ) và Biên Hòa ( ) trên các nguồn carbon khác nhau 91 Kết quả Hình 3.14 cho thấy, cả hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa có khả năng sinh trưởng tốt trên các nguồn carbon là lactate, acetate, pyruvate và sinh trưởng kém hơn trên môi trường chứa tartrate, fumarate, formate, benzoate và hoàn toàn bị ức chế trên môi trường chứa citrate, oxalate. 3.5.2.5. Ảnh hưởng của nồng độ dịch chiết đất Ngoài các yếu tố đã kể trên, sinh trưởng của quần xã VK KSF có khả năng loại khử clo còn bị ảnh hưởng bởi nồng độ các chất ô nhiễm, đặc biệt là 2,3,7,8-TCDD, 2,4,5-T, 2,4-D và các chất trao đổi khác có trong DCĐ. Thông thường, các hợp chất có độ độc cao sẽ ức chế sự sinh trưởng của quần xã VSV nói chung và VK KSF nói riêng. Do đó, ảnh hưởng của nồng độ DCĐ tới 2 quần xã VK KSF cũng được khảo sát. Trong nghiên cứu này, nồng độ DCĐ được sử dụng lần lượt là 0; 1,6; 3,2; 4,8; 6,4; 8 % (v/v). Ảnh hưởng của nồng độ DCĐ đến sinh trưởng của hai quần xã VK KSF được trình bày ở Hình 3.15. Kết quả ở Hình 3.15 cho thấy, quần xã VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa có khả năng sinh trưởng trên môi trường có nồng độ DCĐ chứa chất diệt cỏ/dioxin khá cao. Ở môi trường không chứa DCĐ, quần xã VK KSF vẫn sinh trưởng và ở mức trung bình. Sinh trưởng của quần xã VK KSF cao nhất Hình 3.15. Ảnh hưởng của nồng độ DCĐ đến sinh ở nồng độ 3,2% DCĐ và giảm trưởng của quần xã VK KSF ở Đà Nẵng ( ) và Biên dần ở nồng độ lớn hơn 4,8%. Hòa ( ) 3.5.2.6. Ảnh hưởng của một số hợp chất chứa clo hữu cơ Các chất hữu cơ chứa clo cũng ảnh hưởng đáng kể đến sự sinh trưởng và quá trình hô hấp loại khử clo của VK KSF (Boyle, 1999a; Dar, 2005). Trong nghiên cứu 92 này, ảnh hưởng của một số chất hữu cơ chứa clo như các chất diệt cỏ 2,4,5-T, 2,4-D, các chất đã bị chuyển hóa thành các hợp chất phenol như 2,3-DCP, 2,4-DCP, 2,5DCP, 3,5-DCP và DDT với nồng độ 100 ppm đến sinh trưởng của quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa đã được khảo sát. Sinh trưởng của các quần xã VK KSF trên một số nguồn clo hữu cơ được trình bày ở Hình 3.16. Kết quả trên Hình 3.16 cho thấy, cả hai quần xã VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa có khả năng sinh trưởng trên môi trường Posgate B có chứa các hợp chất clo hữu cơ có độ độc khác nhau ở nồng độ 100 ppm. Kết quả này chứng tỏ cả hai quần xã VK Hình 3.16. Ảnh hưởng của một số chất hữu cơ chứa clo đến sinh trưởng của quần xã VK KSF ở Đà Nẵng ( ) và Biên Hòa ( ) KSF đều tồn tại và có khả năng sử dụng một số hợp chất vòng thơm chứa clo. Như vậy, quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa có thể sinh trưởng tối ưu trên môi trường Posgate B ở nhiệt độ 30-35oC, pH 7, nồng độ NaCl 0,1% và nồng độ DCĐ 3,2%. Chúng có thể sinh trưởng trên nguồn chất clo hữu cơ riêng rẽ với độ độc khác nhau ở nồng độ 100 ppm. Cả hai quần xã VK KSF từ Đà Nẵng và Biên Hòa có khả năng sử dụng một số chất hữu cơ khác ngoài lactate làm nguồn carbon và chất cho điện tử như acetate, pyruvate, benzoate, tartrate, fumarate, formate. Tuy nhiên, chúng không thể sinh trưởng trên nguồn carbon là citrate và oxalate. 3.5.3. Phân lập, phân loại vi khuẩn khử sulfate Để làm rõ liệu VK KSF và đặc biệt là chủng đã làm sạch thuộc chi nào và có khả năng phân hủy các hợp chất vòng thơm có trong DCĐ hay không, nghiên cứu chi tiết về nhóm này đã được thực hiện. Từ các quần xã VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa, các chủng VK KSF đã được phân lập. Một chủng VK KSF từ lô xử lý 93 10DNT tại sân bay Đà Nẵng, ký hiệu là BDN10T được lựa chọn để nghiên cứu chi tiết hơn về một số đặc điểm sinh học cũng như khả năng phân hủy và chuyển hóa hợp chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin. Để xác định chủng VK KSF BDN10T đã phân lập được thuộc chi nào và có quan hệ như thế nào với các chi đã được công bố, chủng này được phân loại dựa vào đặc điểm hình thái và xác định trình tự 16S rRNA. 3.5.3.1. Hình thái tế bào chủng BDN10T Chủng BDN10T phân lập từ Đà Nẵng có tế bào dạng dấu phẩy, không tạo bào tử, không có tiên mao. Kích thước tế bào từ (0,5-1) x (3-4,5) m (Hình 3.17). Hình 3.17. Hình thái tế bào chủng VK KSF BDN10T phân lập từ Đà Nẵng (độ phóng đại 10.000 lần) 3.5.3.2. Trình tự đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu cho vi khuẩn khử sulfate Gene 16S rRNA của chủng BDN10T được khuếch đại từ DNA tổng số bằng cặp mồi 27F/1492R và trình tự của gene này đã được xác định. Dựa vào trình tự gene 16S rRNA của chủng BDN10T, cây phát sinh chủng loại được xây dựng trên phần mềm Clustal X2, Finch TV và Mega 5 và được trình bày ở Hình 3.18. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của chủng BDN10T tương đồng 99% với trình tự đoạn gene 16S rRNA của BDNM33, BDNE21 cũng được phân lập tại lô xử lý ở Đà Nẵng. Trên cây phát sinh chủng loại, chủng này có quan hệ xa hơn với chủng Desulfovibrio sp. PA35E4, chủng Desulfovibrio sp. UIV. Dựa vào một số đặc điểm hình thái và trình tự gene 16S rRNA, chủng BDN10T phân lập từ Đà Nẵng được xếp vào chi Desulfovibrio và đặt tên Desulfovibrio sp. BDN10T, với mã số đã được đăng ký trên GenBank là JN314424. Chi Desulfovibrio có rất nhiều chủng đại diện có khả năng hô hấp loại clo như đã trình bày ở phần Tổng quan. Kết quả này khẳng 94 định thêm vai trò hô hấp loại clo của chi Desulfovibrio nói riêng và của nhóm VK KSF nói chung. Hình 3.18. Cây phát sinh chủng loại của chủng BDN10T. Thanh bar thể hiện sự sai khác 2 nucleotide giữa 100 nucleotide so sánh 3.6. Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu Các VK KK bắt buộc cũng có vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin, đặc biệt là Dehalococcoides. Đây là VK khó nuôi cấy và phân lập ở dạng chủng sạch nhưng đã được xác định là có mặt trong lô xử lý cũng như tại vị trí ô nhiễm (mẫu P1, hồ A) bằng nested-PCR và DGGE. Vậy, chúng có thực sự có mặt và có liên quan như thế nào với các chủng đã được công bố, sự có mặt của Dehalococcoides trong các mẫu làm giàu được xác định. 95 3.6.1. Làm giàu vi khuẩn kỵ khí loại khử clo trên nguồn DCĐ, 2,4,5-T, 2,4-DCP Các mẫu được lựa chọn bao gồm mẫu P1, P5 sau xử lý 10 tháng, mẫu 100DNT sau xử lý 10 năm, mẫu hồ A lấy cùng thời điểm với mẫu P1, P5 ở Đà Nẵng; các mẫu M1, M2, M3, M4 ở Biên Hòa sau 27 tháng. Các mẫu được làm giàu trên môi trường khoáng kỵ khí M204 với các chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp loại clo là DCĐ, 2,4,5-T và 2,4-DCP. Quá trình làm giàu nhóm VK KK hô hấp loại clo trong đó có VK Dehalococcoides được đánh giá định tính bằng sự thay đổi màu sắc của các bình nuôi với chất chỉ thị màu là resaruzine (Ewald, 2007). Khi có mặt oxy, mẫu sẽ chuyển sang màu hồng và khi không có oxy (có sự sinh trưởng của nhóm VK KK), mẫu sẽ có màu từ đen nhạt đến đen đậm. Vi khuẩn hô hấp loại khử clo ở Đà Nẵng và Biên Hòa đã làm giàu được trình bày ở Hình 3.19. A B Hình 3.19. VK KK hô hấp loại khử clo được làm giàu trên môi trường chứa 2,4-DCP, 2,4,5-T từ các mẫu đất ở Đà Nẵng (A) và Biên Hòa (B) Từ Hình 3.19 cho thấy các bình nuôi cấy làm giàu đều có màu đen, bình đối chứng có màu hồng. Như vậy, các bình nuôi cấy làm giàu đều đảm bảo độ kỵ khí và đã có sự sinh trưởng của nhóm VK KK. Tuy nhiên, VK KK có khả năng sinh trưởng trên các hợp chất hữu cơ chứa clo khá phong phú, VK Dehalococcoides thường sống trong quần xã có nhiều VK KK khác có hoặc không có khả năng loại khử clo. Các VK không có khả năng loại khử clo thường lên men các nguồn carbon hữu cơ tạo ra chất dinh dưỡng như pyruvate, formate và hydro (có vai trò là chất cho điện tử), vitamine B12 cung cấp cho Dehalococcoides sinh trưởng. Mặt khác, các VK khác trong quần xã còn duy trì điều kiện kỵ khí cho Dehalococcoides sinh trưởng và thực hiện chức năng loại khử clo các hợp chất ô nhiễm (Hug, 2012). Do 96 đó, các VK được làm giàu có mặt Dehalococcoides hay không sẽ được xác định ở nghiên cứu tiếp theo. Dehalococcoides nói riêng và VK hô hấp loại khử clo ở điều kiện kỵ khí bắt buộc không dễ dàng nuôi cấy và phân lập bằng phương pháp truyền thống. Vì vậy, việc xác định hình thái tế bào cũng như nhân đoạn gene 16S rRNA với các cặp mồi đặc hiệu đã được sử dụng để xác định sự tồn tại của VK Dehalococcoides. 3.6.2. Hình thái một số tế bào vi khuẩn trong mẫu làm giàu trên các chất ô nhiễm Hình thái tế bào của các VK ở mẫu P1D (mẫu từ lô đối chứng) và P5T (mẫu từ lô xử lý đã bổ sung 100 kg bùn từ hồ Sen) được quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét và được trình bày trên Hình 3.20. Kết quả trên Hình 3.20 cho thấy, trong các mẫu làm giàu có mặt nhiều VK KK có hình thái khác nhau. Trong mẫu P1 làm giàu trên 2,4-DCP có ba loại VK điển hình là VK có tế bào hình que dài, que ngắn và hình đĩa. Trong mẫu P5 làm giàu trên 2,4,5-T có tế bào VK hình hạt đậu, hình que dài, que ngắn và hình đĩa. A Tế bào vi khuẩn Dehalococcoides B Tế bào vi khuẩn Dehalococcoides Hình 3.20. Các tế bào VK có mặt trong mẫu P1 làm giàu trên MT chứa 2,4-DCP (A) và P5 làm giàu trên MT chứa 2,4,5-T (B) Đặc biệt, trong mẫu P1 làm giàu trên MT chứa 2,4-DCP đã có mặt tế bào của chủng VK có dạng hình đĩa dẹt, kích thước khoảng 0,8 m, xuất hiện riêng lẻ,bề mặt tế bào không nhẵn và giống với tế bào của chủng Dehalococcoides mccartyi 97 MB (Cheng, 2009). Kết quả thu được gợi ý cho ta thấy ở đất nguyên thủy lấy sâu dưới 80 cm đã có mặt của Dehalococcoides. Trong mẫu P5 làm giàu trên MT chứa 2,4,5-T tế bào VK có dạng đĩa, lõm ở giữa, dày 1 m xuất hiện. Bề mặt tế bào tương đối nhẵn và giống với tế bào của chủng D. mccartyi BAV1 (Löffler, 2013). Tuy nhiên, bằng phương pháp quan sát dưới kính hiển vi điện tử quét, VK giống với Dehalococcoides đã phát hiện ở mẫu P1 nhưng chưa được tìm thấy ở mẫu P5. Để có thêm bằng chứng về sự có mặt của VK Dehalococcoides trong mẫu P1D và P5T, kỹ thuật PCR nhân đoạn gene 16S rRNA với cặp mồi đặc hiệu cho Dehalococcoides đã được thực hiện trong thí nghiệm tiếp theo. 3.6.3. Nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của vi khuẩn Dehalococcoides DNA tổng số từ các mẫu làm giàu trên nguồn ô nhiễm là 2,4-DCP, 2,4,5-T đã được tách và sử dụng làm khuôn để nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của VK Dehalococcoides bằng cặp mồi DET730F và DET1350R. Theo tính toán lý thuyết, kích thước của đoạn gene đặc hiệu cho Dehalococcoides là 620 bp. Kết quả nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu được trình bày ở Hình 3.21. DNA của chủng Dehalococcoides sp. DCMB5 (do Phòng thí nghiệm VSV - Đại học Martinluther, Halle, Đức cung cấp) làm Hình 3.21. Điện di đồ nhân đoạn gene 16S rRNA của VK Dehalococcoides từ mẫu làm giàu VK hô hấp loại khử clo ở Đà Nẵng. P1D: mẫu P1 làm giàu trên MT chứa 2,4-DCP, P5T: mẫu P5 làm giàu trên MT chứa 2,4,5-T đối chứng dương. Kết quả trên Hình 3.21 cho thấy, mẫu P1 trên môi trường (MT) chứa 2,4-DCP (P1D) và mẫu P5 trên MT chứa 2,4,5-T (P5T) nhân được đoạn gene đặc hiệu của VK Dehalococcoides. Để xác định chính xác trình tự Dehalococcoides, sản phẩm nhân đoạn gene 16S rRNA được sử dụng để tách dòng và đọc trình tự. 3.6.4. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu 98 Sau khi tách được 5 dòng và tách plasmid của các dòng VK Dehalococcoides từ mẫu P5T, trình tự của đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu đã được so sánh với các dữ liệu tương ứng trên GenBank và xây dựng cây phát sinh chủng loại (Hình 3.22). Hình 3.22. Cây phát sinh chủng loại của VK Dehalococcoides có mặt ở mẫu làm giàu P5T Trình tự đoạn gene 16S rRNA của hai dòng VK Dehalococcoides sp. P5T enrichment clone 1 và clone 2 đã được đăng ký trên GenBank với mã số lần lượt là KF305118 và KF305119. Từ kết quả nhân đoạn gene 16S rRNA đặc hiệu của VK Dehalococcoides và quan sát hình thái tế bào có thể khẳng định, VK KK bắt buộc Dehalococcoides đã được làm giàu trong các mẫu đất P1 và P5 từ lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng trên MT chứa 2,4,5-T và 2,4-DCP. Tóm lại, trong điều kiện phòng thí nghiệm đã làm giàu được VK KK hô hấp loại khử clo, kỵ khí bắt buộc như Dehalococcoides trên nguồn ô nhiễm là 2,4,5-T và 2,4-DCP. Hai dòng VK Dehalococcoides trong mẫu P5 làm giàu trên 2,4,5-T đã được xác định trình tự và đăng ký trên GenBank với mã số KF305118 và KF305119 99 3.7. Khả năng phân hủy hay chuyển hóa các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin bởi quần xã vi khuẩn và chủng sạch 3.7.1. Khả năng phân hủy và chuyển hóa PCDD/Fs trong mẫu làm giàu Sau 1 năm làm giàu VK KK (từ hỗn hợp mẫu đất lấy ở 16 vị trí khác nhau của lô xử lý ở sân bay Biên Hòa sau 36 tháng) trên môi trường khoáng kỵ khí M204 chứa đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở nồng độ cao (đã được đồng nhất theo quy chuẩn). Đối chứng cho nghiên cứu này là môi trường chỉ chứa đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin đã được sấy khô, đồng nhất và không bổ sung đất chứa VSV từ 16 vị trí lấy mẫu của lô xử lý. Hiệu quả phân hủy 17 đồng phân PCDD/PCDF đã được xác định bằng sắc ký khí khối phổ (GC/MS). Do nồng độ của 2,3,7,8-TCDD (chất quyết định tổng độ độc) và OCDD (chất chỉ thị cho phân hủy sinh học kỵ khí) trong mẫu rất cao và đây là hai đồng phân có ý nghĩa quan trọng nhất so với các đồng phân còn lại. Vì vậy, kết quả phân tích đã được tách ra và trình bày trên Hình 3.23. A B Hình 3.23. Hiệu suất phân hủy, chuyển hóa 2,3,7,8-TCDD và OCDD (A) và 15 đồng phân PCDD/Fs còn lại (B) bởi quần xã VK KK ở Biên Hòa Kết quả ở Hình 3.23 cho thấy đất ô nhiễm sử dụng trong nghiên cứu này có độ độc rất cao, với tổng độ độc ban đầu là 41.265 TEQ. Trong đó, tỷ lệ đồng phân 2,3,7,8-TCDD chiếm đến 99,3%. Tổng độ độc của đất ô nhiễm sử dụng trong nuôi cấy làm giàu quần xã VK KK cao gấp 4 lần so với tổng độ độc trung bình trước khi xử lý tại sân bay Biên Hòa (khoảng 10.000 pg TEQ/g đất khô). Tuy nhiên, quần xã 100 VK KK từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa đã phân hủy và chuyển hóa 2 đồng phân độc nhất (với tổng độ độc tương đương là 1) lên đến 55% đối với 2,3,7,8-TCDD (Hình 3.23A) và 55,9% đối với 1,2,3,7,8-PeCDD (Hình 3.23B) sau 1 năm nuôi cấy làm giàu. Hơn thế nữa, tất cả 15 đồng phân còn lại của PCDD/PCDF cũng bị phân hủy với tỷ lệ rất khác nhau, từ 14 – 57,6% (Hình 3.23B). Trong đó, hiệu suất phân hủy của các đồng phân PCDD (32-57,6%) cao hơn so với các đồng phân PCDF (14-50,9%). Cả 17 đồng phân của PCDD/PCDF có mặt trong mẫu với các nồng độ và độ độc khác nhau đều bị phân hủy hay chuyển hóa ở các mức độ không giống nhau. Đặc biệt, OCDD được xem là chỉ thị sinh học cho quá trình phân hủy sinh học kỵ khí (vì đồng phân này hầu như không hay ít bị phân hủy bởi các VSV hiếu khí), đã bị phân hủy và chuyển hóa đến 57,3% bởi quần xã VK KK trong mẫu làm giàu sau 1 năm. Với mục đích làm rõ hơn sự phân hủy của quần xã VK KK trong mẫu làm giàu đối với các chất diệt cỏ và sản phẩm chuyển hóa vẫn còn độc của các chất diệt cỏ, đánh giá sự thay đổi thành phần hóa học trong mẫu làm giàu đã được tiến hành bằng kỹ thuật quét trên máy GC/MS. Kết quả nghiên cứu cho thấy 2,4-D, 2,4,5-T không xác định được vì kỹ thuật quét trên máy GC/MS không đặc hiệu cho việc xác định các hợp chất này. Kết quả phân hủy hay chuyển hóa các chất hữu cơ trong mẫu làm giàu được trình bày trên Bảng 3.10. Bảng 3.10. Sự biến đổi thành phần các chất ô nhiễm giữa mẫu đối chứng (Đ/C) và mẫu làm giàu (% Speak) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 Số C 6C 6C 8C 6C 6C 6C 8C 6C 7C 3C 4C Thành phần 2,4-Dichlorophenol 2,4,5-Trichlorophenol 1,2-Benzenedicarboxylic acid Phthalic acid 2,5-Hexadione 1-Hexene-3,5-dione 6-Methyl-3,5-Heptadien-2-one 3,5-dimethyl-2-Cyclohexene-1-one Cyclohexananecarboxylic acid Propane 3,3-Dimethyl-1-Butene Mẫu đối Mẫu làm giàu Hiệu suất chứng (ĐC) (BH-DHC) (%) 81,15 1.91 0.36 85,51 4.97 0.72 4.11 0.11 1.73 0.35 1.25 0.16 0.21 0.09 0.17 0.06 5.45 1.6 0.06 101 STT 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 Số C 5C 4C 3C 5C 2C 8C 5C 14C 9C 11C 4C 17C 11C 15C 14C 6C 18C 7C Thành phần 2H-Pyran-2-ol 2-Butenoic acid Propionic acid 2-Pentanone Acetic acid 2-Octanone 1,3-Cyclopentanedione 2,5-Dimethyl-1,6-methano annule Pentan-1,3-dioldiisobutyrate Undecane Butanoic acid Heptadecane n-Octanoic acid isopropyl ester Pentadecanoic acid 3-Methyl-tridecane n-Hexadecanoic acid Octadecaneoic acid Cyclotrisiloxane Mẫu đối chứng (ĐC) 4.13 1.22 0.95 25.99 2.18 Mẫu làm giàu Hiệu suất (BH-DHC) (%) 0.05 0.61 0.24 86.98 0.57 0.08 0.07 0.16 0.15 0.08 0.14 0.16 0.11 0.05 0.05 1.72 0.2 0.04 Từ số liệu trình bày trên Bảng 3.10 cho thấy, mẫu làm giàu và mẫu đối chứng đã có sự thay đổi lớn về thành phần các chất hóa học có trong mẫu. Một số sản phẩm phân hủy sinh học trong tự nhiên như 2,4-DCP, 2,4,5-TCP và một số sản phẩm đã cắt vòng khác có sẵn trong cả 2 mẫu do việc sử dụng nguồn đất ô nhiễm tự nhiên. Hàm lượng 2,4,5-TCP và 2,4-DCP trong mẫu làm giàu (BH-DHC) giảm so với mẫu đối chứng (ĐC). Ở mẫu làm giàu, sản phẩm phân hủy trung gian xuất hiện nhiều hơn so với mẫu đối chứng. Một số sản phẩm không có mặt ở mẫu đối chứng nhưng đã có mặt trong mẫu làm giàu chứng tỏ đã có quá trình phân hủy sinh học tạo ra các hợp chất bị cắt vòng với số lượng carbon trong phân tử ít hơn hoặc tương đương. Trong số các sản phẩm phân hủy của mẫu làm giàu có nhiều chất là sản phẩm của cả quá trình phân hủy thiếu khí và kỵ khí. Tóm lại, quần xã VK KK làm giàu trên đất ô nhiễm nặng chất diệt cỏ/dioxin sau 1 năm đã phân hủy và chuyển hóa được 17 đồng phân độc của PCDD/F với các mức độ khác nhau, từ 14% đến 57,6%. Hai đồng phân có tổng độ độc cao nhất là 2,3,7,8-TCDD và 1,2,3,7,8-PeCDD cũng bị phân hủy trên 55%. Đặc biệt, OCDD là 102 chất chỉ thị sinh học cho quá trình phân hủy kỵ khí cũng bị phân hủy và chuyển hóa tới 57,3%. Ngoài ra, các hợp chất vòng thơm như 2,4,5-TCP và 2,4-DCP cũng bị phân hủy trên 81% bởi quần xã VK KK này sau 1 năm. 3.7.2. Khả năng phân hủy và chuyển hóa 2,4,5-T và 2,4-DCP trong mẫu làm giàu Từ các mẫu làm giàu VK hô hấp loại khử clo kỵ khí bắt buộc của Đà Nẵng và Biên Hòa trên môi trường khoáng M204 chứa 2,4,5-T hoặc 2,4-DCP, các mẫu được phân tích hàm lượng các chất hữu cơ chứa clo còn lại sau khi nuôi cấy trên máy HPLC. Do điều kiện không cho phép nên động học quá trình phân hủy 2,4,5-T và 2,4-DCP chưa được xác định. Sự chuyển hóa của 2,4,5-T và 2,4-DCP ở các mẫu làm giàu được phân tích sau 9 và 12 tuần nuôi cấy. 3.7.2.1. Khả năng chuyển hóa 2,4,5-T Khả năng phân hủy và chuyển hóa 2,4,5-T bởi quần xã VK KK từ lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa sau 12 tuần làm giàu được thể hiện trên Hình 3.24. Kết quả trên Hình 3.24A cho thấy 100% 2,4,5-T đã bị chuyển hóa ở các mẫu 100DNT, P1 và P5 của Đà Nẵng, riêng mẫu hồ A vẫn còn khoảng 20% 2,4,5-T sau 12 tuần nuôi cấy. Cả 4 mẫu không xuất hiện 2,4,5-TCP và đều có một sản phẩm trung gian có thời gian lưu 18 phút với hàm lượng nhỏ sau 12 tuần. Từ Hình 3.24B ta thấy 2,4,5-T và sản phẩm trung gian giả định 2,4,5-TCP đều không phát hiện được ở các mẫu M2, M3, M4 làm giàu chứng tỏ 2,4,5-T đã bị chuyển hóa sau 12 tuần nuôi cấy. Ở mẫu M1, 2,4,5-T không phát hiện được nhưng xuất hiện một lượng nhỏ 2,4,5-TCP. Tuy nhiên, các sản phẩm trung gian có thời gian lưu 18 phút chưa xác định được với hàm lượng khác nhau cũng có mặt ở cả 4 mẫu. Kết quả thu được chứng tỏ quá trình chuyển hóa 2,4,5-T xảy ra sau 12 tuần ở các mẫu của Đà Nẵng và Biên Hòa với tốc độ và con đường khác nhau.Tuy nhiên, cần có nhiều nghiên cứu sâu sắc hơn để xác định động học và con đường chuyển hóa 2,4,5-T và 2,4-DCP của các VK KK trong các mẫu làm giàu. 103 A 2,4,5-T còn lại B Hình 3.24. Phổ sắc ký khả năng phân hủy, chuyển hóa 2,4,5-T ở các mẫu Đà Nẵng (A) và Biên Hòa (B) 3.7.2.2. Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP Sau 9 tuần làm giàu (với các mẫu của Đà Nẵng) và 12 tuần (các mẫu của Biên Hòa) trên MT khoáng M204 có bổ sung 2,4-DCP với nồng độ 100 ppm, khả năng chuyển hóa 2,4-DCP trong mẫu làm giàu VK KK bắt buộc từ các lô xử lý được trình bày trên Bảng 3.11. 104 Bảng 3.11. Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP bởi VK KK trong các mẫu làm giàu từ Đà Nẵng Nồng độ ban đầu (ppm) Nồng độ sau 9 tuần (ppm) 2,4-DCP 4-CP 2-CP 2,4-DCP 4-CP 2-CP 100 DNT 100 0 0 0 43,7 0 Hồ A 100 0 0 0 75 P1 100 0 0 0 63 0 P5 100 0 0 0 42 Ghi chú: -: có mặt ở nồng độ rất thấp, không định lượng được 4-CP: 4-chlorophenol; 2-CP: 2-chlorophenol Tên mẫu Kết quả ở Bảng 3.11 cho thấy 2,4-DCP không phát hiện được ở tất cả các mẫu và sản phẩm loại khử clo chủ yếu của 2,4-DCP là 4-CP đã được tìm thấy sau 9 tuần. Tuy nhiên, sản phẩm trung gian 2-CP chỉ có mặt với lượng rất nhỏ ở mẫu hồ A và P5, không có mặt ở hai mẫu 100DNT và P1. Kết quả thu được chứng tỏ sản phẩm chính của quá trình loại khử clo 2,4-DCP ở các mẫu làm giàu là 4-CP. Đối với mẫu làm giàu từ lô xử lý ở Biên Hòa, các chất chuyển hóa trung gian như 4-CP, 2-CP cũng như 2,4-DCP không phát hiện được sau 12 tuần nuôi cấy. Tóm lại, quần xã VK KK làm giàu trên 2,4,5-T và 2,4-DCP cũng có khả năng phân hủy và chuyển hóa khoảng 80% (mẫu hồ A) và 100% (các mẫu còn lại) đối với 2,4,5-T sau 12 tuần, chuyển hóa 100% 2,4-DCP ở tất cả các mẫu sau 9-12 tuần. Tuy nhiên, tốc độ chuyển hóa và sản phẩm trung gian tạo ra có sự khác nhau giữa các mẫu nghiên cứu. 3.7.3. Khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo của vi khuẩn khử sulfate BDN10T đã được làm sạch Để tìm hiểu khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất ô nhiễm trong môi trường có DCĐ của VK KSF, chủng BDN10T có khả năng sinh trưởng tốt nhất trên môi trường Posgate B chứa DCĐ đã được lựa chọn để nghiên cứu. Khả năng phân hủy một số thành phần trong DCĐ của chủng BDN10T so với mẫu đối chứng (ĐC) không có VSV được khảo sát bằng kỹ thuật quét trên máy GC-MS và được trình bày ở Bảng 3.12. Kết quả trình bày trên Bảng 3.12 cho thấy, chủng BDN10T có khả năng phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo trong DCĐ (Bảng 3.12). Dioxin, 2,4-D và 2,4,5-T đều không phát hiện trong cả 2 mẫu vì phương pháp quét trên máy GC/MS không đặc hiệu cho việc xác định các hợp chất này. Nồng độ 2,4,5-TCP và 2,4-DCP trong mẫu BDN10T giảm rõ rệt (> 86 %) so với mẫu đối chứng. 105 Bảng 3.12. Sự biến đổi thành phần hóa học trong mẫu nuôi cấy chủng BDN10T so với không có VSV (ĐC) (% Speak) STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 Thành phần 2,4-Dichloro phenol (2,4-DCP) 2,4,5-Trichloro phenol (2,4,5-TCP) 2-Methoxy phenol Benzoic acid Benzenaxetic acid 1,2-Benzenedicarboxylic acid 2,2’- Dimethylbiphenyl 1-Methyl-4-phenylmethyl-benzen 1,1’-Methylenebis(4methyl)-benzen 4,4’-(1-Methylethylidene) bis-phenol Dichlorometan 3-Ethyl-2-hydroxy-2-cyclopenten-1-one Pentan-1,3-dioldiisobutyrate 3,4-Dimethyl cyclopentenolone (3,4-DMCP) 2,6,10,14,18,22-Tetracosahexanene Dimethyltriphenylmethane Di-n-octyl phthalate Pentadecanoic acid Hexadecanoic acid Tetradecanoic acid Diisoamylene Propanoic acid Butanoic acid Hexanoic acid ĐC 2,82 6,84 2,51 0,34 0 8,9 0 0 0 0,44 3,26 1,11 1,14 1,57 3,34 5,88 3,63 0 0 0 0 0 0 2,87 Hiệu suất BDN10T (%) 86,52 0,38 89,77 0,7 4,36 8,96 9,14 4,51 49,32 0,47 0,88 0,83 0 100,0 0 100,0 0 100,0 0 100,0 0 100,0 0 100,0 0 100,0 0 100,0 0,59 0,68 2,54 0,82 0,82 1,98 2,38 17,07 Tóm lại, quần xã VK KK hô hấp loại clo được làm giàu trên đất ô nhiễm không chỉ có khả năng phân hủy và chuyển hóa 55 - 57% các đồng phân PCDD/F mà còn phân hủy hơn 81% các hợp chất vòng thơm chứa clo khác như 2,4,5-TCP và 2,4-DCP. Đây là sự kết hợp của rất nhiều VSV khác nhau có mặt trong mẫu làm giàu với tổng độ độc lên tới 41.265 pg TEQ/g đất khô để cuối cùng khử độc có hiệu quả cao loại hình ô nhiễm phức tạp và nặng nề như ở điểm nóng Biên Hòa và Đà Nẵng. Các VK KK được làm giàu trên MT chứa 2,4,5-T và 2,4-DCP có khả năng phân hủy 100% 2,4,5-T và 2,4-DCP sau 12 tuần nuôi cấy. Chủng Desulfovibrio sp. BDN10T cũng có khả năng phân hủy và chuyển hóa trên 86% các hợp chất vòng thơm như 2,4-DCP, 2,4,5-TCP và nhiều hợp chất khác tạo ra các acid hữu cơ. Kết quả chứng tỏ tiềm năng rất lớn của quần xã VK KK hô hấp loại khử clo có mặt trong đất, trầm tích nơi bị ô nhiễm bởi hỗn hợp các chất chứa clo. 106 CHƢƠNG 4. BÀN LUẬN Như phần Kết quả nghiên cứu đã trình bày, VK KK hô hấp loại khử clo và các gene tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất hữu cơ chứa clo rất đa dạng. Tuy nhiên, với mỗi phương pháp nghiên cứu khác nhau thì kết quả nhận được về sự đa dạng VK KK không giống nhau. Để thấy rõ sự khác nhau đó, phần Bàn luận sẽ được trình bày lần lượt như sau:  Sự đa dạng các VK KK  Sự đa dạng các gene chức năng  Đặc điểm sinh học của VK KSF  Sự có mặt của Dehalococcoides trong mẫu làm giàu  Khả năng chuyển hóa và phân hủy các chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin.  Sự đa dạng các VK KK Trong nghiên cứu này, khi sử dụng phương pháp nested-PCR để đánh giá sự đa dạng các VK KK trong các lô xử lý phát hiện được các chi Desulfitobacterium, Dehalococcoides và nhóm Desulfovibrio-Desulfomicrobium, Desulfococcus- Desulfosarcinar- Desulfonema. Phương pháp nested-PCR chưa phát hiện được các VK KK thuộc chi Dehalogenimonas, Dehalobacter. Đây là hai chi VK đã được chứng minh khả năng loại khử clo rất nhiều hợp chất vòng thơm và mạch thẳng chứa clo (Boyle, 1999; Drzyzga, 2001; Grostern, 2006; Bunge, 2009; Moe, 2009; Yan, 2009; Maphosa, 2010, 2012; Duret, 2012; Löffler, 2013). Kết quả nhận được có thể giả định rằng hai chi Dehalogenimonas và Dehalobacter không tồn tại hay số lượng của chúng không đủ lớn cho nên phương pháp nested-PCR chưa phát hiện được trong các mẫu đất ở các lô xử lý. Các kết quả về đa dạng VK KK loại khử clo trong nghiên cứu này đã chỉ ra rằng sự có mặt của Dehalococcoides và một số VK KSF như Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfomicrobium, Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema có vai trò trong quá trình chuyển hóa chất diệt cỏ, các đồng phân của dioxin chứa nhiều clo đến các đồng phân chứa ít clo hơn. Quá trình này giúp cho các VSV hiếu khí 107 tiếp tục cắt vòng, loại clo và cuối cùng là khoáng hóa hoàn toàn các chất độc trong các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa. Dehalococcoides đã được chứng minh là nhóm loại khử clo rất tiềm năng bao gồm cả dioxin (Adrian, 2007; Bunge, 2003, 2008; Hendrickson, 2002; Hiraishi, 2005a,b 2008; Liu, 2014b; Yoshida, 2005). Tuy nhiên, nhóm vi khuẩn này có kích thước rất nhỏ, có kiểu trao đổi chất trong điều kiện sống rất giới hạn, phụ thuộc vào nguồn cung cấp H2 có vai trò là chất cho điện tử trong quá trình hô hấp clo từ các nhóm vi khuẩn khác. Hơn nữa, chúng còn là vi khuẩn loại khử clo bắt buộc trong điều kiện kỵ khí vô cùng nghiêm ngặt nên rất khó nuôi cấy (Loffer, 2013). Mặc dù đã được gọi là thợ khử clo nhưng vai trò thực sự trong quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin trong các lô xử lý mà đề tài thực hiện thì thợ khử clo chưa chắc thuộc về Dehalococcoides. Tuy không có mặt ở hầu hết các vị trí trong lô xử lý nhưng sự có mặt của Desulfococcus, Desulfosarcina, Desulfonema cùng với việc chiếm ưu thế của các VK KSF khác như Desulfitobacterium, Desulfovibrio, Desulfomicrobium đã minh chứng cho vai trò của nhóm VK KSF trong quá trình chuyển hóa và phân hủy chất diệt cỏ/dioxin. Theo nhiều nghiên cứu, VK KSF có mặt ở hầu hết các môi trường sinh thái như trong nước biển, nước ngọt và cả trầm tích, đất, đặc biệt là những nơi có nồng độ sulfate cao. Đồng thời, các VK KSF có khả năng hô hấp loại khử clo không bắt buộc (Barton, 2007) và sử dụng H2, các hợp chất hữu cơ như acetate, formate, lactate v.v. làm nguồn carbon và chất cho điện tử trong quá trình sinh trưởng (Holliger, 1994). Vi khuẩn KSF rất đa dạng và phần lớn trong số chúng đã được chứng minh có khả năng sử dụng các hợp chất hữu cơ chứa clo làm chất nhận điện tử trong quá trình hô hấp loại clo (Boyle, 1995; Reineke, 2001; Muyzer, 2008; Angelo, 2010). Trong nghiên cứu này, chủng VK KSF BDN10T được phân lập và làm sạch từ lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Đà Nẵng đã loại bỏ được 85-86% các hợp chất 2,4,5-TCP và 2,4-DCP. Theo Nguyễn Thị Sánh (2007), quần xã VK KSF SETDN20 có khả năng loại bỏ 17,9% tổng độ độc trong 60 ngày trong đó đồng phân 2,3,7,8-TCDD giảm từ 4.299 ng TEQ/kg đất khô xuống còn 3.528 ng TEQ/kg đất khô. Nhóm VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa có sự đa dạng khá cao và chiếm ưu thế hơn so với các nhóm vi khuẩn khác. Các kết quả 108 thu được cho thấy nhóm VK KSF có thể đã góp phần đáng kể làm tổng độ độc trung bình của các lô xử lý giảm. Cụ thể là ở 4 lô xử lý bằng phân hủy sinh học tại Biên Hòa, tổng độ độc từ khoảng 10.000 ng TEQ/kg đất khô đã giảm xuống còn 52 ng TEQ/kg đất sau 27 tháng (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Tuy nhiên, để khẳng định mức độ tham gia của nhóm VK KSF trong quá trình phân hủy hỗn hợp chất diệt cỏ/dioxin ở điều kiện in situ trong các lô chôn lấp tích cực ở Đà Nẵng và Biên Hòa cần thêm rất nhiều nghiên cứu cơ bản về sinh học kết hợp với phân tích hóa học ở mức độ cao. Khi sử dụng phương pháp DGGE để xác định sự đa dạng VK KSF trong các lô xử lý cho thấy tại Đà Nẵng xuất hiện 4 chi Desulfosarcinar, Desulfococcus, Desulfovibrio và Desulfobacterium còn tại Biên Hòa chỉ xuất hiện 3 trong 4 chi được đề cập ở trên (Hình 3.1). Các dữ liệu thu được chứng tỏ sự đa dạng của VK KSF không cao trong cả 4 lô xử lý (khối lượng 846 m3/lô) của toàn bộ khu vực nghiên cứu ở Biên Hòa khi sử dụng phương pháp xử lý, điều kiện sinh thái gần như nhau. Chính vì vậy, sự đa dạng VK KSF ở các lô xử lý này khá giống nhau. Khác với các lô xử lý ở Biên Hòa, VK KSF ở các lô xử lý tại sân bay Đà Nẵng có sự đa dạng hơn. Sự khác biệt quan trọng nhất giữa các mẫu nghiên cứu là ở Biên Hòa có cùng thời gian và phương thức xử lý, còn ở Đà Nẵng có quy trình xử lý và thời gian xử lý hoàn toàn khác nhau. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của dòng VK KSF SRBDNP2.5 ở lô xử lý P2 của Đà Nẵng tương đồng 99% với dòng VK không nuôi cấy ACS48 và chủng Desulfovibrio sp. PA35E4 (Hình 3.2). Trình tự đoạn gene 16S rRNA của dòng VK SRBDNP5 tương đồng 98% với chủng Desulfovibrio sp. GY2 có khả năng loại clo của penta-, tetra-brominated biphenylether, polychlorinated biphenyl và cũng tương đồng 98% với dòng SB20 đã được chứng minh có khả năng phân hủy n-alkane (Lee, 2013). Trình tự đoạn gene 16S rRNA của dòng SRBBH2 và SRBBH3 tương đồng 99% với chủng Desulfovibrio sp. BBH1.3 phân lập và nuôi cấy được từ mẫu của Biên Hòa, chủng Desulfovibrio sp. BDN100T phân lập từ lô xử lý của Đà Nẵng (Hình 3.2). Một 109 số dòng VK từ các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa không chỉ có sự tương đồng với nhau (99%) mà còn tương đồng cao với các đại diện thuộc chi Desulfovibrio. Khả năng chúng không phải cùng loài cũng đã được thể hiện trên cây phân loại. Các trình tự đoạn gene 16S rRNA của các dòng SRBDN10DNT và SRBBH1 có quan hệ gần gũi với nhau và tương đồng 99% với trình tự đoạn gene 16S rRNA của một số loài thuộc chi Desulfococcus (Bảng 3.2) như D. multivorans DSM 2059, D. biacutus DSM 5651 và chủng Desulfococcus sp. DSM8541. Kết quả thu được từ phân tích trình tự đoạn gene 16S rRNA của một số dòng VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa cho thấy các dòng này có quan hệ gần gũi với các dòng VK Desulfococcus, Desulfovibrio và Desulfobacterium. Một số đại diện của các chi kể trên đã được công bố là có khả năng hô hấp loại khử clo (Boyle, 1995, 1999b; Sun, 2000; Haggbloom, 2006). Mối quan hệ phát sinh chủng loại của các dòng VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa (Hình 3.2) cho thấy chúng có quan hệ xa với các nhóm loại khử clo bắt buộc và không bắt buộc như Dehalococcoides, Dehalobium, Dehalobacter, Desulfitobacterium, Clostridium. Đặc biệt, giữa các dòng VK KSF phát hiện được ở Đà Nẵng và Biên Hòa có sự tương đồng đến 99% như các dòng SRBDNP4, SRBDNP3, SRBDN10DNT thuộc Đà Nẵng tương đồng với dòng SRBBH1 thuộc Biên Hòa. Hai dòng SRBBH3, SRBBH2 của Biên Hòa tương đồng 99% với dòng SRBDN100DNT ở Đà Nẵng. Kết quả thu được cho thấy VK KSF ở Đà Nẵng và Biên Hòa cùng ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin với điều kiện sinh thái không hoàn toàn giống nhau nhưng VK thuộc nhóm này vẫn có sự tương đồng cao. Kết quả thu được chứng tỏ nhóm này phân bố rộng, số lượng lớn ở các lô xử lý tại Biên Hòa và Đà Nẵng. Chúng đóng vai trò quan trọng trong quá trình loại khử clo các hợp chất vòng thơm trong đó có dioxin. Đối với chi Dehalococcoides, trình tự đoạn gene mã hóa 16S rRNA của các dòng VK Dehalococcoides tại lô xử lý P5 và mẫu 1.2 tương đồng trên 98% với các chủng D. mccartyi 195, CBDB1, BAV1, MB, FL2 (Hình 3.4) chứng tỏ chúng tương đối giống với các chủng này. Tất cả các chủng Dehalococcoides trên đều biết đến với khả năng loại khử clo của PCE, TCE cũng như các hợp chất hữu cơ vòng thơm, 110 đa vòng thơm chứa nhiều clo như polychlorobenzene, polychlorophenol, 1,2,3,4TCDD như đã trình bày ở phần Tổng quan (Bunge, 2003; Löffler, 2013). Một số dòng như BDNHC band 1 từ mẫu hồ C ở Đà Nẵng, BBH1.1 băng 2, BBH1.1 băng 3 ở lô số 1 vị trí 1 chỉ tương đồng trên 90% - 96% với các chủng đã đề cập ở trên. Từ kết quả thu được có thể giả thiết rằng Dehalococcoides trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Việt Nam có sự khác biệt so với các chủng đã công bố trên thế giới. Những khác biệt giữa các VK Dehalococcoides có thể được thể hiện ở số bản sao gene chức năng rdhA tham gia quá trình loại khử clo. Trong nghiên cứu này, các gene rdhA giống với các gene đã được công bố trên thế giới chưa được phát hiện có thể do bản chất ô nhiễm tại Việt Nam hoàn toàn không giống với các chất ô nhiễm mà các chủng Dehalococcoides đã được phân lập ở các châu lục khác. Các hợp chất chứa clo được sử dụng trong nghiên cứu này là hỗn hợp của 2,3,7,8-TCDD, các chất diệt cỏ 2,4,5-T, 2,4-D và các chất trao đổi khác. Đây là những hợp chất chưa được sử dụng ở bất kỳ nghiên cứu nào trong các công bố quốc tế. Do đó, khi sử dụng các cặp mồi đặc hiệu cho gene rdhA đã được các công trình nghiên cứu đăng tải để xác định sự có mặt của chúng trong các lô xử lý của Việt Nam đã không thu được kết quả. Khả năng cao nhất là do chúng không đặc hiệu đối với gene rdhA của Dehalococcoides trong các lô xử lý. Kết quả thu được hoàn toàn phù hợp với những minh chứng cho rằng các chủng Dehalococcoides khác nhau là do khả năng sử dụng các hợp chất chứa clo với các cấu trúc hóa học khác nhau (Löffler, 2013). Vì VK KK hô hấp loại khử clo rất đa dạng và thuộc cả 3 nhóm như đã trình bày ở phần Tổng quan. Tuy nhiên, đất ô nhiễm của Việt Nam chứa rất nhiều hợp chất dioxin/furan khác nhau trong đó có các đồng phân độc nhất như 2,3,7,8-TCDD, 1,2,3,7,8-PeCDD và nhiều hợp chất chứa clo vòng thơm khác. Vậy, nhóm VK KK nào mới thực sự đóng vai trò chủ đạo trong quá trình phân hủy và chuyển hóa các thành phần của chất diệt cỏ/dioxin vẫn còn là một ẩn số. Với các phương pháp nghiên cứu đa dạng VK KK ở trên đã trình bày vẫn còn nhiều hạn chế nên bức tranh về sự đa dạng VSV cần phải tiếp tục nghiên cứu bằng các công cụ tiên tiến và thực hiện trên nhiều mẫu nghiên cứu hơn. Do đó, phương pháp xác định sự phân bố và 111 đa dạng các quá trình trao đổi chất của VSV bằng công cụ hiện đại nhất cho đến thời điểm này là Metagenomics đã được thực hiện. Đây là một kết quả hết sức quan trọng mà luận án đã thu được. Sau khi nhận được kết quả về hiệu suất khử độc dioxin của quần xã VK KK từ lô xử lý ở Biên Hòa (sau 36 tháng) ở mẫu làm giàu 1 năm với độ độc gấp 4 lần mẫu hiện trường ban đầu, nghiên cứu đã được đã tiến hành giải trình tự và phân tích bằng các phần mềm chuyên dụng cho Metagenomics. Số liệu thu được cho thấy quần xã VK tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin vô cùng phong phú. Nhìn vào sự phân bố của các VK và các gene chức năng trong mẫu làm giàu thì không phải Dehalococcoides và các gene rdhA đóng vai trò quan trọng nhất như các nhà khoa học đã dự đoán mà quần xã VK khác mới thực sự đóng vai trò chính và sự đa dạng của các gene khác mới làm nên quá trình khử độc thành công. Trong metagenome của mẫu làm giàu có 4 ngành VK KK với các đại diện thuộc 3 nhóm vi khuẩn hô hấp loại khử clo, đó là nhóm hô hấp loại khử clo bắt buộc như Dehalococcoides, Dehalogenimonas; nhóm hô hấp loại khử clo không bắt buộc như Desulfovibrio, Desulfococcus, Geobacter v.v.; nhóm loại khử clo đồng trao đổi chất bao gồm Pseudomonas, Bacteroides, Shewanella, Clostridiumv.v. (Bảng 3.7). Đây là kết quả rất thú vị vì có nhiều nhà khoa học cho rằng chỉ một vài loài VK đã có thể làm sạch được dioxin và các chất tương tự. Ngoài các nhóm VK loại khử clo đã được chứng minh là có mặt trong lô xử lý, các VK khác có khả năng chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo ở các mức độ khác nhau cũng đã được phát hiện. Với các VK này đã được thông báo là có khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm (Reineke, 2001). Đây là các VK thuộc nhóm VK hiếu khí (Burkholderia, Xanthomonas, Achromobacter v.v.), kỵ khí bắt buộc (Bacteroides, Anaerolinea, Pelobacter, Parabacteroides v.v.) hay tùy tiện (Azoarcus, Aeromonas, Desulfotomaculum, Aromatoleum, Campylobacter v.v.). Hầu hết các VK này đã được chứng minh có khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm cũng như các hợp chất hữu cơ chứa clo (Reineke, 2001). Sự góp mặt của từng VK trong số này tuy không nhiều nhưng số lượng của tất cả các 112 chi cộng lại lại chiếm tỷ lệ tương đối cao trong metagenome. Điều đáng chú ý là các chi VK trên chủ yếu thuộc nhóm kỵ khí tùy tiện. Cùng với phân tích bằng nestedPCR và DGGE, các kết quả thu được từ metagenome của mẫu làm giàu đã phản ánh được sự đa dạng của quần xã vi khuẩn kỵ khí loại khử clo cũng như các nhóm vi khuẩn khác tham gia trong quá trình chuyển hóa các hợp chất hữu cơ (bao gồm cả vòng thơm) có và không chứa clo. Tuy nhiên, những dữ liệu thu được bằng công cụ Metagenomics đã cho ta thấy một bức tranh toàn diện hơn về quần xã vi khuẩn sinh trưởng trên nguồn đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Những kết quả này một lần nữa khẳng định vai trò của các nhóm vi khuẩn, đặc biệt là nhóm vi khuẩn kỵ khí tùy tiện trong quá trình chuyển hóa chất diệt cỏ, dioxin và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong lô xử lý ở sân bay Biên Hòa. Một điều rất bất ngờ và thú vị về sự đóng góp của các vi khuẩn trong mẫu làm giàu là sự chiếm ưu thế của chi Pseudomonas với tỷ lệ cao nhất (59,77%). Theo một số nghiên cứu đã công bố về sự đa dạng VSV tại các lô xử lý được phân tích bằng DGGE, SSCP cũng cho thấy chi Pseudomonas chiếm đa số trong lô xử lý ở các quy mô khác nhau tại Đà Nẵng (Nguyễn Bá Hữu, 2007b, 2007c, 2008, 2009). Do đó, kết quả thu được của các nghiên cứu trước đây và cả trong nghiên cứu này chứng tỏ VK Pseudomonas luôn có mặt và có thể có vai trò rất quan trọng đối với quá trình phân hủy hay chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo trong các lô xử lý. Pseudomonas là VK hiếu khí nhưng có khả năng sinh trưởng trong điều kiện có rất ít hay hoàn toàn không có oxy (Reineke, 2001, Nguyễn Thị Sánh, 2005). Chúng có thể loại khử clo theo cơ chế đồng trao đổi chất hoặc chuyển hóa và phân hủy hợp chất hữu cơ chứa clo theo các cơ chế khác (Hiraishi 2008; Reineke, 2001). Do đó, Pseudomonas thực sự là chi có tiềm năng rất lớn và chiếm ưu thế trong quá trình phân hủy rất nhiều hợp chất vòng thơm, đa vòng thơm chứa clo hoặc không chứa clo như atrazine, toluene, benzoate, carbazol, 4-chlorobenzoate, 2,3,6-TCB, DCB v.v. (Hiraishi 2008; Reineke, 2001). Các minh chứng thu được trong nghiên cứu này chứng tỏ VK Pseudomonas chiếm đa số trong mẫu làm giàu VK KK là hoàn toàn phù hợp. Những dữ liệu thu được cũng cho thấy có thể Pseudomonas đã sử dụng 113 hết lượng oxy rất nhỏ có trong mẫu làm giàu tạo điều kiện cho các VK KK khác sinh trưởng đồng thời nhóm vi khuẩn này cũng góp phần quan trọng trong quá trình tẩy độc chất diệt cỏ/dioxin và các sản phẩm chuyển hóa của chúng trong lô xử lý. Ngoài sự chiếm ưu thế của Pseudomonas, Bacteroides có mặt với tỷ lệ khá cao (2,73%) so với các chi khác trong metagenome của mẫu làm giàu. VK này cũng đã được chứng minh có mặt trong lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE (Đào Thị Ngọc Ánh, 2013; Nguyễn Bá Hữu, 2007, 2008). Một số chủng Bacteroides cũng đã được chứng minh tham gia vào quá trình phân hủy TCE, một số hợp chất chứa clo vòng thơm (Richardson, 2002) hoặc có khả năng sinh trưởng trên DCĐ chứa 2,4,5-T, 2,4-D và 2,3,7,8-TCDD (Nghiêm Ngọc Minh, 2008). Nguyễn Bá Hữu (2007b, 2008) đã phát hiện các dòng VK Bacteroides trong các công thức khử độc quy mô 0,5 và 1,5 m3 ở Đà Nẵng. Bacteroides cũng đã được phát hiện ở các vị trí ô nhiễm các hợp chất chứa clo vòng thơm (Arochlor 1260, DCP, PCP, dioxin) cùng với các VK khác (Mannisto, 2001; Kimura, 2003; Hiraishi, 2005; Bedard, 2007). Do đó, kết quả thu được trong nghiên cứu này chứng tỏ chi Bacteroides có một vai trò nhất định trong quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất có mặt trong đất ô nhiễm. Tuy nhiên, cho đến nay chưa có bất kỳ công bố nào liên quan đến sự phân hủy 2,3,7,8-TCDD hay các chất tương tự dioxin bởi Bacteroides. Hơn thế nữa, cơ chế trao đổi chất của chúng ra sao trong môi trường ô nhiễm phức tạp như ở Việt Nam vẫn còn là một bài toán cần nhiều lời giải và nghiệm số. Nếu các nghiên cứu cơ bản thành công thì việc tăng hiệu quả của quá trình làm sạch chất diệt cỏ/dioxin sẽ đạt hiệu suất cao hơn. Trong một nghiên cứu gần đây của Đặng Thị Cẩm Hà và cộng sự (chưa công bố), công cụ Metagenomics được sử dụng để đánh giá sự đa dạng về quần xã VSV cũng như các nhóm gene chức năng của mẫu bùn hồ ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin với độ độc tương tự như ở các lô xử lý cho thấy có rất nhiều nhóm VSV thuộc các lớp, ngành khác nhau. Chúng bao gồm cả VSV hiếu khí và kỵ khí đã được phát hiện có mặt trong mẫu đất bùn ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Các VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo cũng khá đa dạng trong mẫu đất bùn ô nhiễm bao gồm các lớp 114 Clostridiales, Dehalococcoidetes, Bacteroidetes hay các ngành Proteobacteria, Firmicute, Chloroflexi, nhiều chi, lớp thuộc nhóm VK KSF v.v. Số liệu thu được trong nghiên cứu này cho thấy có sự trùng hợp về sự đa dạng chủng loài VSV giữa mẫu làm giàu và mẫu ô nhiễm tự nhiên. Ngoài 3 nhóm VK KK đã được phân loại, trong mẫu làm giàu còn có mặt các VK KK khác như Deinococci, Klebsiella. Đây là các chi đã được xác định là có mặt trong đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp DGGE (Đào Thị Ngọc Ánh, 2013). Tuy có ít nghiên cứu về khả năng hô hấp loại khử clo của Klebsiella nhưng chúng thực sự có vai trò trong quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo. Chủng Klebsiella sp. BDNS2 có khả năng phân hủy 30,15% 2,4-DCP sau 60 ngày nuôi cấy ở điều kiện kỵ khí. Chủng này cũng có khả năng sinh trưởng và chuyển hóa các chất độc như 2,4,5-T, 2,4-D, dioxin, trinitrotoluene và các hydrocacbon thơm đa nhân như anthracene, phenanthrene, fluoracene, pyrene (Nghiêm Ngọc Minh, 2009). Klebsiella còn có khả năng phân hủy DDT thành DDE (Singh, 1999). Về sự biến động số lượng của VK KK trong lô xử lý tại Biên Hòa, số lượng VK KK sử dụng dioxin nói chung và VK KSF nói riêng tăng khoảng 10 lần vào đợt lấy mẫu thứ 2 (18 tháng) do đã bổ sung nước để độ ẩm tăng đáng kể, các VK KK đã dần thích nghi với các “thức ăn” bổ sung vào lô xử lý và đạt số lượng lớn nhất. Các đợt lấy mẫu thứ 3 (22 tháng) và thứ 4 (27 tháng), nguồn “thức ăn” bổ sung đã được VK KK sử dụng và dẫn đến số lượng VSV giảm từ 5-10 lần (Hình 3.10). Có thể nhiều VK đã thích nghi với điều kiện sử dụng chất ô nhiễm khi nguồn “thức ăn” bổ sung đã giảm nên số lượng VK KK duy trì khá ổn định. Tuy nhiên, số lượng VK KK sử dụng dioxin luôn lớn hơn số lượng VK KSF chứng tỏ ngoài VK KSF còn có các VK KK khác có khả năng sử dụng dioxin. Mặt khác, số liệu thu được trong nghiên cứu trình bày ở đây cũng chỉ ra sự biến động về số lượng các VK KK nuôi cấy được trên môi trường muối khoáng chứa DCĐ trong đó có dioxin. Các VK này có thể chỉ chiếm từ 0,01-1% số lượng các VK thực sự có mặt trong lô xử lý (Smalla, 2007; Maira, 2010). Tuy nhiên, kết quả 115 nghiên cứu này cũng đã phần nào phản ánh sự biến động về số lượng VK KK sử dụng dioxin có thể nuôi cấy trong phòng thí nghiệm hoàn toàn không thấp như chúng ta thường hình dung trước đó.  Sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào các quá trình của tế bào So sánh trình tự của 1883 gene chức năng trong metagenome với các dữ liệu trên ngân hàng gene cho thấy có 28 nhóm gene chức năng với tỷ lệ đóng góp khác nhau trong chu trình tế bào. Các gene đó được chia thành các nhóm chức năng bao gồm gene tham gia vào quá trình hô hấp, trao đổi chất lưu huỳnh, trao đổi chất protein, phân hủy các hợp chất vòng thơm. Trong luận án này, các gene tham gia vào quá trình hô hấp, trao đổi chất lưu huỳnh, phân hủy các hợp chất vòng thơm được quan tâm hơn do chúng có liên quan trực tiếp đến các VK KK và các quá trình phân hủy hợp chất vòng thơm mà các VK tham gia. Trong số các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm, phần lớn các gene đã được công bố thuộc chi Pseudomonas. Kết quả này phù hợp vì VK Pseudomonas chiếm tỷ lệ lớn trong metagenome của mẫu làm giàu với tổng độ độc của 2,3,7,8TCDD tới 41.265 pg TEQ/g đất khô. Các gene tham gia trực tiếp vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm được xác định trình tự và xây dựng cây phát sinh chủng loại như trình bày ở Hình 3.8. 3.9. Hầu hết các gene này có liên quan gần gũi với các gene thuộc chi Pseudomonas đã công bố. Một số gene mã cho các enzyme như 1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene-1carboxylate dehydrogenase, putative 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase, tiểu đơn vị alpha của benzoate 1,2-dioxygenase có khả năng tham gia vào quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm, trong đó có cả chlorobenzoate đã được phát hiện. Một số gene chức năng quan trọng mã hóa cho các enzyme khác như catechol 2,3-dioxygenase, 4hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, beta-ketoadipateenol-lactone hydrolase có khả năng phân hủy và cắt vòng các hợp chất thơm khác như phenol, catechol, chloroaromatic, protocatechuate cũng có mặt trong metagenome. Tuy vậy, trong số các gene chức năng tìm thấy, chỉ có acetyl-CoA acetyltransferase, glutaryl-CoA dehydrogenase, 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase là có khả năng tham gia vào quá 116 trình phân hủy kỵ khí benzoate. Có thể nhận thấy rằng, hầu hết các enzyme tham gia vào trao đổi chất hợp chất thơm đều thuộc nhóm VSV có thể sinh trưởng ở điều kiện hiếu khí và thiếu khí như Pseudomonas. Sự hiện diện của các gene chức năng mã hóa cho enzyme tham gia vào con đường phân hủy biphenyl và benzoate chứng tỏ đã có sự phân hủy các hợp chất đa vòng thơm đã xảy ra trước đó. Như đã đề cập ở trên, Pseudomonas chiếm tới 59,77% các VK trong metagenome của mẫu làm giàu nên các enzyme phát hiện được trong mẫu nghiên cứu chủ yếu thuộc chi VK “phàm ăn” này. Đây là VK hiếu khí nhưng chúng có thể sống trong điều kiện thiếu oxy hay hoàn toàn không có oxy và có khả năng loại khử clo đồng trao đổi chất. Đây là phát hiện rất lý thú mà chỉ có công cụ Metagenomics mới giúp chúng ta chứng minh được hiện tượng này. Các gene chức năng của chúng cũng được sao mã tùy theo điều kiện sống của chúng. Các enzyme catechol 2,3dioxygenase, 4-hydroxyphenylpyruvate dioxygenase, beta-ketoadipateenol-lactone hydrolase, homogentisate 1,2-dioxygenase, 1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene-1carboxylate dehydrogenase, tiểu đơn vị alpha của benzoate 1,2-dioxygenase đã được chứng minh là có mặt ở các chủng Pseudomonas có khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm chứa hay không chứa clo (Kaschabek, 2002; Gohil, 2011). Trong nghiên cứu này chưa phát hiện được sự có mặt của gene rdhA trong metagenome của mẫu làm giàu VK KK trên đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin với nồng độ cao có thể do gene này mã hóa cho các enzyme tham gia vào giai đoạn đầu tiên của quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo, đặc biệt là dioxin trong điều kiện kỵ khí (mẫu này được nghiên cứu sau một năm làm giàu). Quá trình này rất quan trọng để tạo ra các hợp chất không hoặc chứa ít clo hơn, giúp cho quá trình khoáng hóa hoàn toàn các hợp chất này trong điều kiện hiếu khí. Trong quá trình loại khử clo, các chất cho điện tử có vai trò rất quan trọng. Sau một năm nuôi cấy, các chất cho điện tử trong môi trường nuôi cấy đã dần cạn kiệt và quá trình loại khử clo đã không xảy ra. Đây có thể là một trong những nguyên nhân đã không phát hiện được sự có mặt của gene rdhA trong mẫu làm giàu sau một năm nuôi cấy. Do 117 đó, để thúc đẩy nhanh quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo như dioxin thì phải định kỳ bổ sung nguồn chất cho điện tử để duy trì quá trình loại khử clo. Tuy nhiên, vấn đề này cũng đã được thực hiện khi xử lý ở quy mô hiện trường. Mặt khác, chất ô nhiễm được sử dụng trong nghiên cứu là hỗn hợp của rất nhiều chất khác nhau bao gồm cả các chất đa vòng thơm và rất độc (PCDD/F), các chất hữu cơ chứa clo vòng thơm (2,4,5-T, 2,4,5-TCP, 2,4-D, 2,4-DCP v.v.) và rất nhiều sản phẩm phân hủy đã bị cắt vòng. Đây là sự khác biệt của các nghiên cứu đã được thực hiện ở Việt Nam. Các sản phẩm phân hủy sinh học đã cắt vòng thường dễ bị phân hủy nên quá trình này xảy ra nhanh hơn, số lượng các VK và các gene tham gia vào quá trình này sẽ chiếm ưu thế. Đây có thể là một nguyên nhân nữa chưa phát hiện ra gene rdhA trong mẫu làm giàu. Trong metagenome của mẫu làm giàu có mặt các gene chức năng liên quan đến quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm chìa khóa trong cả hai điều kiện hiếu khí (catechol, gentisate, homogentisate, protocatechuate) và kỵ khí (benzoate, chlorobenzoate) đã phần nào chứng minh được giả thiết đã đề cập ở trên. Kết quả thu được trong nghiên cứu này đã chứng minh rằng quá trình loại khử clo có thể đã xảy ra theo cả 3 cơ chế bởi cả 3 nhóm VK KK, tạo ra các hợp chất không chứa hoặc chứa ít clo trong phân tử giúp cho quá trình phân hủy chúng và đi vào con đường phân hủy trung tâm trong điều kiện hiếu khí và kỵ khí được thuận lợi. Sự có mặt của gene tham gia vào các con đường chuyển hóa là phù hợp với sự có mặt của các VK trong mẫu làm giàu. Ngoài ra, các enzyme của nhóm trao đổi chất lưu huỳnh, sắt và nhóm hô hấp cũng có mặt trong mẫu làm giàu. Các enzyme có thể liên quan trực tiếp hay gián tiếp đến các quá trình phân hủy những hợp chất ô nhiễm khác. Chẳng hạn, các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất thứ cấp như 1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene1-carboxylate dehydrogenase, acetaldehyde dehydrogenase, 4-hydroxy-2-oxovalerate aldolase, quinolinate synthetase đã chứng tỏ có quá trình phân hủy hoàn toàn các hợp chất vòng thơm tạo ra các chất thứ cấp của chu trình tế bào. Enzyme butyryl-CoA dehydrogenase tham gia vào quá trình hô hấp kỵ khí, các enzyme NADH-ubiquinone 118 oxidoreductase tham gia vào phức hệ hô hấp của các VSV, các enzyme tham gia vào quá trình sinh tổng hợp ATP, cytochrome là các enzyme tham gia vào quá trình hô hấp của tế bào (Bảng 3.14). Các enzyme tham gia vào quá trình trao đổi chất lưu huỳnh như ferredoxin, beta-galactosidase, 4Fe-4S ferredoxin v.v. cũng có thể gián tiếp tham gia vào các quá trình phân hủy các hợp chất vòng thơm bởi các VK KSF có mặt trong mẫu làm giàu.  Đặc điểm sinh học của vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý Để có thêm cơ sở hỗ trợ cho việc xử lý bằng phân hủy sinh học ở quy mô hiện trường, hoạt động của các VK KK loại khử clo với đại diện là VK KSF thông qua việc xác định một số đặc điểm sinh học đã được thực hiện. Từ các kết quả trình bày ở mục 3.4 cho thấy VK KSF từ 2 khu vực xử lý có một số đặc tính sinh học đáng quan tâm. Các yếu tố môi trường có ảnh hưởng quan trọng và rõ rệt đến các quần xã VK KSF trong hố chôn lấp tích cực tại Đà Nẵng và Biên Hòa. Cả hai quần xã VK KSF có khả năng sinh trưởng ở nhiệt độ 15-40oC, pH 5-9, nồng độ NaCl 0-5%. Tuy nhiên, điều kiện sinh trưởng tốt nhất cho cả hai quần xã này là 30oC, pH 7, nồng độ NaCl 0,1%. Số liệu thu được tương tự với kết quả nghiên cứu của một số tác giả khác về VSV từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng như chủng VK KK SETDN1 phân lập ở đây sinh trưởng được ở dải nhiệt độ từ 25-35oC, pH 6-9, nồng độ NaCl 0,1-1% và điều kiện tối ưu cho sự sinh trưởng của chủng này là 30oC, pH 7, nồng độ NaCl 0,1% (Nguyễn Thị Sánh, 2005). Chủng vi khuẩn BDN15 sinh trưởng được ở nhiệt độ từ 20-37oC, pH 6-11, nồng độ NaCl 0-1% và điều kiện sinh trưởng tối ưu là 30oC, pH8, nồng độ NaCl 0,1% (La Thị Thanh Phương, 2005). Các nghiên cứu trên các đối tượng là xạ khuẩn, nấm sợi và VK khác phân lập từ những địa điểm trên cũng cho kết quả tương tự (Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). Các nghiên cứu về chủng VSV đã được làm sạch và quần xã VSV ở Biên Hòa chưa có nhiều nhưng điều kiện nhiệt độ ở các lô xử lý khá ổn định trong khoảng 25-35oC. Đất ô nhiễm ở Đà Nẵng có pH 5,5-6,5 còn ở Biên Hòa đất ô nhiễm có pH ban đầu trung tính. Hơn thế nữa, khi hàm lượng chất độc giảm do hoạt động phân hủy của VSV bản địa thì pH tăng dần đến trung tính (Hoàng Thị Mỹ Hạnh, 2004; Đặng Thị Cẩm Hà, 2005). Do đó, điều 119 kiện sinh trưởng tối ưu của VK KSF nhận được trong nghiên cứu này là phù hợp với đặc điểm thổ nhưỡng của 2 vùng đất này. Các yếu tố khác cũng ảnh hưởng đến sinh trưởng của hai quần xã VK KSF là nguồn carbon, nồng độ DCĐ. Hầu hết các VK KSF không thể sinh trưởng trên các hợp chất hữu cơ chứa clo là nguồn carbon duy nhất (Barton, 2007). Theo một số công bố của các tác giả khác (Muyzer, 2008; Reineke, 2001), VK KSF thuộc chi Desulfovibrio có khả năng sử dụng các muối lactate, pyruvate và fumarate làm chất cho điện tử trong quá trình hô hấp loại khử clo. Kết quả của nghiên cứu có thể được giải thích do cấu trúc phân tử của các nguồn carbon không giống nhau. Các chất như acetate, lactate, pyruvate là các nguồn carbon dễ được hấp thu hơn đối với VK trong đó có VK KSF. Kết quả thu được cung cấp cho chúng ta cơ sở khoa học để lựa chọn hợp lý nguồn carbon như acetate và các chất khác cho xử lý kỵ khí dioxin và các hợp chất tương tự. Đặc biệt là nguồn carbon có thể được nhiều nhóm VSV sử dụng và cũng là nguồn chất cho điện tử trong chuỗi hô hấp của nhiều VK KK có khả năng hô hấp loại khử clo trong đó có VK Dehalococcoides. Các chất ô nhiễm khi ở nồng độ cao thường ức chế sự sinh trưởng của VSV nói chung và VK KSF nói riêng. Trong nghiên cứu này, nồng độ DCĐ lớn hơn 4,8% (với nồng độ độc khoảng 16.800 pg TEQ/ml) đã ức chế sinh trưởng của VK KSF. Kết quả này một lần nữa khẳng định vai trò của nồng độ cũng như độ độc của các chất ô nhiễm phù hợp cho quy trình xử lý đạt hiệu quả cao. Cả hai quần xã VK KSF đều sinh trưởng trên môi trường chứa chất diệt cỏ và các đồng phân DCP với các mức độ khác nhau. Chất diệt cỏ 2,4,5-T, 2,4-D và các sản phẩm phân hủy sinh học của chúng như TCP, DCP luôn có mặt trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở các điểm nóng của Việt Nam. Do đó, quần xã VK KSF có thể sinh trưởng trên môi trường chứa các chất này là hoàn toàn phù hợp với đặc tính sinh hóa đã được chọn lọc tự nhiên. Tuy nhiên, vị trí của nguyên tử clo trong phân tử ảnh hưởng đến khả năng phân hủy của VSV. Nhiều VK KSF có khả năng loại halogen ở vị trí ortho- và para- của các hợp chất chứa halogen vòng thơm tốt hơn vị trí meta- (Reinke, 2001). Chẳng hạn, chủng Desulfovibrio sp. TBP có khả 120 năng loại halogen của 2-bromo-, 4-bromo-, 2,4-dibromo- và 2,6-dibromo-phenol nhưng lại không loại halogen của 3-bromo-, 2,3-dibromo-phenol (Reinke, 2001). Trong nghiên cứu này, vị trí của các nguyên tử clo trong phân tử cũng ảnh hưởng rõ rệt đến sự sinh trưởng của nhóm VK này. Sinh trưởng của VK KSF tốt nhất trên môi trường chứa 2,4-DCP và sinh trưởng kém nhất trên môi trường chứa 3,5-DCP. Cả hai quần xã VK KSF trong nghiên cứu này cũng sinh trưởng trên nguồn clo hữu cơ là DDT (chất không có mặt ở khu vực ô nhiễm) với nồng độ 100 ppm chứng tỏ chúng có thể sinh trưởng trên nguồn clo hữu cơ không phải là thành phần của chất diệt cỏ. Kết quả thu được có thể giải thích là do cấu trúc vòng thơm và vị trí nguyên tử clo trong phân tử của DDT và 2,4,5-T tương tự nhau và các VK KSF chứa các gene mã hóa cho các enzyme tham gia xúc tác cho quá trình phân hủy này. Kết quả thu được một lần nữa cho chúng ta thấy vai trò của VK KSF trong quá trình hô hấp loại khử clo không chỉ dioxin, các chất diệt cỏ mà cả các chất như DDT cũng đang là vấn đề khá nghiêm trọng ở Việt Nam. Tuy nhiên, có thể độ độc của 2,4-D và 2,4,5-T cao hơn nên khả năng sinh trưởng của cả hai quần xã này giảm so với hợp chất dichlorophenol. Để xử lý hiệu quả các khu vực ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin này bằng công nghệ phân hủy sinh học, việc cung cấp nguồn “thức ăn” trong tương tác qua lại bởi các chất trao đổi chung và riêng biệt của mỗi quần xã VSV là chìa khóa nhằm tạo ra các điều kiện mini sinh thái phù hợp là con đường duy nhất để khoáng hóa chất ô nhiễm. Số liệu thu được đã cho thấy điều kiện xử lý bằng công nghệ phân hủy sinh học tại các lô xử lý ở Đà Nẵng và Biên Hòa có mức độ phù hợp khác nhau với các quần xã VK KSF bản địa có mặt trong đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin.  Sự có mặt của vi khuẩn Dehalococcoides trong mẫu làm giàu Ngoài VK KSF đã được phân lập và phân loại, đề tài luận án đã xác định sự có mặt của VK KK bắt buộc Dehalococcoides trong mẫu làm giàu trên MT chứa 2,4DCP, 2,4,5-T. Số liệu thu được chỉ ra rằng trong mẫu làm giàu với 2 nguồn chất nhận điện tử là 2,4,5-T và 2,4-DCP đã có mặt VK Dehalococcoides. Có thể lượng DNA của VK Dehalococcoides trong các mẫu còn lại chưa đủ lớn để nhân được 121 đoạn gene mong muốn. Mặt khác, có thể 2 chất chứa clo 2,4,5-T và 2,4-DCP riêng lẻ dễ bị phân hủy và chuyển hóa nhanh hơn các chất khác như 2,3,7,8-TCDD có trong DCĐ nên sự sinh trưởng của VK KK trên DCĐ có thể chậm hơn. Lượng DNA trong các mẫu khác có thể ít hơn nên sự có mặt của VK Dehalococcoides ở tất cả các mẫu chứa nguồn clo là DCĐ chưa phát hiện được. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của dòng VK làm giàu từ mẫu P5T có độ tương đồng cao (99%) với trình tự đoạn gene 16S rRNA của các VK Dehalococcoides đã được công bố (chủng D. mccartyi 195, VS, GT và một số dòng VK Dehalococcoides được làm giàu khác) chứng tỏ dòng VK này là Dehalococcoides. Trình tự đoạn gene 16S rRNA của VK Dehalococcoides trong mẫu làm giàu P5T tương đồng 99% với các dòng VK Dehalococcoides không nuôi cấy BDNP5-6 có mặt ở lô xử lý P5 của Đà Nẵng và dòng VK BBH1.2-10 có mặt ở Biên Hòa. Trên cây phát sinh chủng loại (Hình 3.22), hai dòng VK Dehalococcoides trong mẫu làm giàu tương đồng với nhau đến 99% và có quan hệ gần gũi với các dòng VK không nuôi cấy có mặt trong mẫu 100DNT của Đà Nẵng. Kết quả thu được cho thấy VK Dehalococcoides có mặt ở các vị trí ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tương tự nhau. Kết quả này cũng phù hợp với công bố trước đây của Löffler (2013) khẳng định VK Dehalococcoides đều thuộc cùng một loài. Cho đến nay, VK Dehalococcoides chỉ có 1 loài duy nhất với 6 chủng thuộc loài này đã được phân lập và xác định đặc điểm. Chúng thường sống trong quần xã có nhiều VK KK khác. Các VK này có thể loại khử clo hay không nhưng chúng có thể lên men các chất hữu cơ có sẵn trong môi trường để sinh ra H2 làm nguồn cho điện tử cho VK Dehalococcoides sinh trưởng. Kết quả nhận được từ nghiên cứu này cho thấy trong mẫu làm giàu P1 từ lô đối chứng trên môi trường chứa chất ô nhiễm là 2,4-DCP và mẫu P5 đã xử lý trên chất ô nhiễm là 2,4,5-T đã phát hiện thấy có mặt Dehalococcoides và một số VK KK khác. Vai trò của các VK KK này như thế nào cần rất nhiều nghiên cứu chi tiết hơn nữa. So sánh với kết quả xác định sự có mặt của Dehalococcoides trong các lô xử lý bằng phương pháp DGGE cho thấy trong vị trí ô nhiễm (mẫu hồ A, mẫu P1) và ở các lô xử lý đã có mặt Dehalococcoides. Kết quả nhận được ở đây khẳng định thêm 122 sự có mặt thực sự của Dehalococcoides trong mẫu ô nhiễm không chỉ ở tự nhiên mà có cả trong lô xử lý. Các VK này đã thực sự làm giàu được trong phòng thí nghiệm. Mặt khác, mẫu P5 có sự đa dạng VK KK hơn mẫu P1 (mẫu đối chứng không xử lý). Nguyên nhân chủ yếu bởi vì mẫu P5 đã được bổ sung thêm 100 kg bùn từ hồ Sen (A) nên ngoài VSV bản địa tại vị trí ô nhiễm còn có các VK KK khác có mặt trong bùn hồ Sen đã được bổ sung thêm (mẫu này đã phát hiện có mặt Dehalococcoides). Kết quả này cũng chứng tỏ VK từ hồ Sen đã có thể sinh trưởng ở môi trường xử lý kỵ khí trong lô chôn lấp 2 m3. Kết quả nghiên cứu của Nguyễn Bá Hữu (2007a) cũng đã tìm thấy VK hô hấp loại khử clo bắt buộc Dehalococcoides ở hồ Sen. Các chất bổ sung để xử lý khử độc loại bỏ chất diệt cỏ/dioxin và môi trường phù hợp đã tạo nên sự kỵ khí đến mức tốt nhất để các VK KK bắt buộc sinh trưởng và hoạt động.  Khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin Nếu chúng ta chỉ dừng lại ở việc tìm hiểu sự có mặt và đa dạng quần xã VK hô hấp loại clo trong các hố xử lý và không xử lý thì vẫn chưa đủ thuyết phục. Chính vì vậy, khả năng chuyển hóa các thành phần của đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin sẽ làm sáng tỏ hơn về vai trò của quần xã VK này. Kết quả trên Hình 3.22 và Bảng 3.9 cho thấy khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo bởi quần xã VK KK từ 16 vị trí thu mẫu ở lô xử lý của Biên Hòa trong thí nghiệm làm giàu VK từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Quần xã VK nêu trên không chỉ có khả năng phân hủy và chuyển hóa các hợp chất vòng thơm là chất diệt cỏ và chất trao đổi chất của chúng mà các VK này còn có khả năng phân hủy và chuyển hóa 17 đồng phân PCDD/Fs. Với nồng độ ô nhiễm ban đầu rất cao, lên tới 41.265 pg TEQ/g (hay 41.265 ng TEQ/kg) đất khô nhưng các VK trong mẫu này có thể phân hủy và chuyển hóa được từ 55 đến 57,3% các đồng phân PCDD/Fs, từ 81 đến 85% 2,4,5-TCP và 2,4-DCP. Kết quả trình bày ở trên chỉ ra rằng quần xã VK KK từ lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở Biên Hòa đóng vai trò hết sức quan trọng trong việc loại bỏ dioxin và các chất ô nhiễm tương tự tại khu vực này. Những dữ liệu thu được từ nghiên cứu này một lần nữa minh chứng cho khả năng phân hủy sinh học bởi quần xã VSV 123 trong đó có VK KK. Sau 27 tháng, chất ô nhiễm ở Biên Hòa đã bị loại bỏ 99,48% (tổng độ độc còn lại là 52 pg TEQ/g đất khô) (Đặng Thị Cẩm Hà, 2012). Sau 40 tháng xử lý, tổng độ độc đã giảm còn 14,12 pg TEQ/g đất khô, hiệu quả xử lý đạt 99,84%. Độ độc của đất đã ở dưới ngưỡng cho phép đối với đất canh tác nông nghiệp hàng năm (40 pg TEQ/g đất khô - Quy chuẩn QCVN45:2012/BTNMT). Đây là tiêu chuẩn cao nhất hiện nay không chỉ do Việt Nam đặt ra và không phải nước nào trên thế giới cũng đưa ra tiêu chuẩn này đối với đất nông nghiệp sử dụng thường xuyên. Đối với mẫu làm giàu trên 2,4,5-T, khả năng phân hủy và chuyển hóa 2,4,5-T sau 12 tuần bởi quần xã VK KK từ lô xử lý ở Biên Hòa và Đà Nẵng không giống nhau (Hình 3.23). Sau 12 tuần, mẫu hồ A ở Đà Nẵng còn khoảng 20% 2,4,5-T nhưng không thấy sản phẩm trung gian xuất hiện. Mẫu P1 ở Đà Nẵng lại xuất hiện sản phẩm trung gian giống như sản phẩm của các mẫu tại Biên Hòa nhưng có hàm lượng ít hơn. Các mẫu P5 và 100DNT của Đà Nẵng không xuất hiện sản phẩm trung gian cũng như sản phẩm ban đầu. Các mẫu ở Biên Hòa đều xuất hiện một sản phẩm trung gian chưa xác định với hàm lượng khác nhau. Riêng mẫu m1 của Biên Hòa có xuất hiện một lượng nhỏ 2,4,5-TCP sau 12 tuần. Kết quả thu được cho thấy, mặc dù nồng độ các chất ban đầu và điều kiện nuôi cấy như nhau nhưng đã có các sản phẩm khác nhau tạo ra, chứng tỏ có sự hiện diện của quần xã VK KK khác nhau trong mẫu làm giàu. Kết quả có xuất hiện một lượng nhỏ 2,4,5-TCP trong môi trường nuôi cấy mẫu M1, Biên Hòa (Hình 3.23) có thể là do sản phẩm trung gian tạo thành từ 2,4,5-T chưa được chuyển hóa hết thành các chất trung gian tiếp theo. Các kết quả thu được trong nghiên cứu này đã chỉ ra rằng 2,4,5-TCP có thể là hợp chất trung gian giả định đầu tiên tồn tại với thời gian ngắn trong môi trường nuôi cấy và được loại bỏ một phân tử clo để chuyển hóa thành một hợp chất trung gian tiếp theo. Với mẫu M1, 2,4,5-TCP được tạo thành có thể không được tiếp tục chuyển hóa và tích lũy ở môi trường nuôi cấy. Hoặc chất trung gian đầu tiên của quá trình chuyển hóa 2,4,5T có thể là một hợp chất dichlorophenoxyacetic acid được tạo thành trực tiếp từ hợp 124 chất này đã bị loại một phân tử clo sau 12 tuần ở cả 4 mẫu làm giàu. Để khẳng định các sản phẩm chuyển hóa trung gian từ 2,4,5-T trong điều kiện kỵ khí bắt buộc ở các mẫu làm giàu cần phải có những phân tích động học của quá trình chuyển hóa đồng thời kết hợp với các phương pháp phân tích hiện đại như GC/MS và GC/MS/MS ở những nghiên cứu sâu hơn tiếp theo. Qua đó, các kết quả thu được sẽ phần nào làm sáng tỏ con đường loại khử clo của chất diệt cỏ trong điều kiện kỵ khí nói chung và trong các lô xử lý chất diệt cỏ/chứa dioxin nói riêng. Theo một số nghiên cứu đã công bố, quá trình chuyển hóa hiếu khí 2,4,5-T đã được chứng minh ở cả mẫu làm giàu và ở chủng sạch (Karns, 1983, Haugland, 1990, Rice, 2005). Tuy nhiên, có rất ít thông tin về quá trình chuyển hóa 2,4,5-T trong các mẫu làm giàu ở điều kiện kỵ khí. Một số tác giả đã ghi nhận quá trình loại khử clo của 2,4,5-T trong bùn thải, trầm tích ao, vi khuẩn sinh metan trong nước ngầm và đất (Chang, 1998, Mikesell, 1985, Gibson, 1990). Sản phẩm loại khử clo đầu tiên từ 2,4,5-T đã được xác định là 2,4-D hoặc 2,5-D. Các hợp chất trung gian tiếp theo như monochlorophenoxyacetic acids, tri-, di- và monochlorophenol cũng như phenol đã được phát hiện (Mikesell, 1985, Gibson, 1990, Chang 1998). Tuy nhiên, quá trình chuyển hóa 2,4,5-T bởi các quần xã chưa được thích nghi với hợp chất này thường diễn ra chậm. Quá trình chuyển hóa 2,4,5-T ban đầu cũng có thể thông qua cắt liên kết ete để tạo thành 2,4,5-TCP đã được phát hiện trong bùn thải và trầm tích vùng cửa sông trong điều kiện kỵ khí (Mikesell, 1985). Tuy nhiên, 2,4,5-TCP có thể tồn tại bền vững trong một số quần xã vi khuẩn kỵ khí được làm giàu từ trầm tích, bùn của tầng nước ngầm (Gibson, 1990). Đối với mẫu làm giàu trên 2,4-DCP, hàm lượng 4-CP ở mẫu hồ A và P1 là khá cao so với mẫu 100DNT và P5 sau 9 tuần nuôi cấy (Bảng 3.11). Kết quả này chứng tỏ ở mẫu làm giàu 100DNT là đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin đã được xử lý 10 năm, mẫu P5 là mẫu được xử lý kỵ khí bằng công nghệ phân hủy sinh học tăng cường sau 10 tháng nên số lượng VK KK tham gia hô hấp loại khử clo nhiều hơn, đa dạng hơn và quá trình chuyển hóa 4-CP xảy ra nhanh hơn. Kết quả thu được cũng giải thích tại sao hiệu quả xử lý ở lô P5 tại hiện trường đạt hiệu quả cao trong 6 tháng đầu 125 (giảm tới 54,8%) so với các công thức xử lý khác chỉ giảm 30%. Theo thời gian thì hiệu quả xử lý ở P5 chậm lại (Đặng Thị Cẩm Hà, 2010b). Mẫu P1 là mẫu đối chứng của lô xử lý và mẫu hồ A là mẫu nguyên thủy. Nhóm VK loại khử clo cũng đã xuất hiện ở cả hai mẫu này nhưng số lượng ít hơn nên quá trình loại khử clo xảy ra chậm hơn. Ở hai mẫu hồ A và P5, chất trung gian 2-CP có xuất hiện với hàm lượng rất nhỏ trong khi mẫu 100DNT và P1 không có hợp chất này. Kết quả này có thể giả thiết rằng trong hồ A có một nhóm VK loại khử clo theo con đường khác với các VK trong hai mẫu P1 và 100 DNT. Tuy nhiên, 100% 2,4-DCP cũng đã bị chuyển hóa sau 9 tuần. Có thể một phần sản phẩm đó đã bị chuyển hóa hoặc loại khử clo hoàn toàn thành sản phẩm không chứa clo. Đối với các mẫu từ lô xử lý của Biên Hòa làm giàu trên 2,4-DCP, do không có điều kiện nên các mẫu chỉ được phân tích vào thời điểm 12 tuần. Kết quả nhận được cho thấy các sản phẩm trung gian như 2-CP, 4-CP và sản phẩm ban đầu không xác định được sau 12 tuần. Kết quả thu được có thể do các VK KK đã chuyển hóa hoàn toàn các hợp chất này sau 12 tuần. So với khả năng chuyển hóa 2,4-DCP bởi VK KK làm giàu từ mẫu ở Đà Nẵng thì kết quả thu được trong nghiên cứu này hoàn toàn phù hợp vì sau 9 tuần, hàm lượng 2-CP và 2,4-DCP trong các mẫu ở Đà Nẵng gần như không còn, hàm lượng 4-CP cũng đã bị chuyển hóa một phần. Theo một số nghiên cứu (Chang 1995), hoạt tính loại clo của các hợp chất chlorophenol đã được ghi nhận xảy ra ở trong bùn, đất và trầm tích sông. Một số vi khuẩn kỵ khí, hầu hết thuộc về chi Desulfitobacterium và Dehalococcoides có khả năng loại khử clo của các hợp chất này để sinh trưởng trong quá trình hô hấp các hợp chất hữu cơ chứa clo (Breitenstein, 2001, Wildeman, 2003, Adrian, 2007). Do đó, kết quả thu được trong nghiên cứu này chỉ ra rằng 2,4-DCP có thể đã bị chuyển hóa hoàn toàn bởi quần xã vi khuẩn loại khử clo bao gồm Dehalococcoides và Desulfitobacterium đã được làm giàu trong 12 tuần. Để đánh giá được chính xác khả năng chuyển hóa 2,4-DCP và các sản phẩm của nó trong các mẫu làm giàu vi khuẩn kỵ khí loại khử clo cần phải xác định động học quá trình chuyển hóa trong những nghiên cứu sâu hơn. 126 Những kết quả thu được trong nghiên cứu này đã cung cấp thêm bằng chứng về khả năng phân hủy hay chuyển hóa các hợp chất vòng thơm mà cụ thể là 2,4,5-TCP và 2,4-DCP bởi đại diện của chi Desulfovibrio. Kết quả nghiên cứu cho thấy các hợp chất là sản phẩm phân hủy của các chất ô nhiễm như benzoate, benzenacetic acid trong mẫu đối chứng thấp hơn hẳn so với mẫu có chủng BDN10T (Bảng 3.11) chứng tỏ các chất 2,4,5-TCP và 2,4-DCP đã bị chuyển hóa thành các acid hữu cơ vòng thơm. Ngoài các hợp chất vòng thơm chứa clo, trong DCĐ cũng có chứa một số hydrocacbon mạch thẳng, mạch vòng và hợp chất chứa clo mạch thẳng (dichloromethane). Tuy nhiên, các hợp chất này cũng được chủng BDN10T chuyển hóa thành các acid hữu cơ mạch thẳng hay phân hủy hoàn toàn (không phát hiện được ở mẫu BDN10T). Kết quả này một lần nữa khẳng định vai trò của nhóm VK KSF nói chung và một số đại diện thuộc chi Desulfovibrio nói riêng trong quá trình hô hấp loại clo. Những số liệu thu được ở nghiên cứu này hỗ trợ cho việc thiết kế kỹ thuật nhằm xử lý chất diệt cỏ/dioxin trong các khu xử lý chôn lấp tích cực có hiệu quả cao hơn. Chi Desulfovibrio là chi VK hô hấp loại halogen, có khả năng hô hấp loại clo, brom của một số hợp chất halogen hữu cơ. Khả năng loại khử clo của chúng đã được đề cập ở phần Tổng quan. 127 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN 1. Đối với các mẫu thuộc sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng: (a) đã phát hiện được cả 3 nhóm vi khuẩn hô hấp loại khử clo bao gồm loại khử clo bắt buộc như Dehalococcoides, Dehalogenimonas; loại khử clo không bắt buộc như Desulfovibrio, Desulfitobacterium, Desulfuromonas, Desulfobacterium và loại khử clo đồng trao đổi chất như Pseudomonas, Shewanella, Clostridium v.v. Đồng thời, đã chứng minh được sự có mặt của cả ba nhóm vi khuẩn hiếu khí, kỵ khí tùy tiện và kỵ khí bắt buộc tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất là thành phần của chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu vi khuẩn trên nguồn ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin với độ độc rất cao. (b) đã xác định được sự đa dạng VK KSF (bao gồm các chi Desulfovibrio, Desulfococcus, Desulfobacterium, Desulfosarcinar) trong các lô xử lý bằng phương pháp DGGE đồng thời các điều kiện sinh trưởng tốt nhất cho quần xã VK KSF tại các lô xử lý của Đà Nẵng và Biên Hòa cũng đã được xác định. (c) Đã xác định sự đa dạng Dehalococcoides bằng phương pháp DGGE và làm giàu được VK này từ lô xử lý cũng như tại vị trí ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. Các dòng Dehalococcoides trong các lô xử lý và trong mẫu làm giàu có độ tương đồng cao với các chủng Dehalococcoides mccartyi 195, VS, CBDB1 đã phân lập có khả năng loại khử clo của các hợp chất hữu cơ chứa clo vòng thơm. 2. Bằng công cụ Metagenomics đã xác định được 30/1883 gene chức năng mã hóa cho enzyme xúc tác cho phản ứng phân hủy các hợp chất vòng thơm, bao gồm: (a) các gene tham gia chuyển hóa các hợp chất trung gian chìa khóa của quá trình phân hủy hiếu khí (gentisate, homogentisate, protochatechuate, catechol) và kỵ khí (benzoate) các hợp chất vòng thơm chứa hay không chứa clo; (b) các 128 gene mã hóa cho enzyme tham gia vào quá trình hô hấp, trao đổi chất lưu huỳnh. 3. Quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo trong mẫu sau 1 năm làm giàu trên chất diệt cỏ/dioxin đã chuyển hóa và phân hủy được 55% tổng độ độc với nồng độ độc ban đầu là 41.265 pg TEQ/g đất, trong đó 2,3,7,8-TCDD và OCDD đã bị phân hủy 55% và 57,3%. Các hợp chất như 2,4,5-T, 2,4-DCP với nồng độ 100 ppm đã bị chuyển hóa 100% sau 12 tuần nuôi cấy bởi quần xã vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo. 4. Chủng vi khuẩn khử sulfate BDN10T đã phân hủy trên 86% các hợp chất hữu cơ chứa clo (2,4,5-TCP, 2,4-DCP) và tạo ra các sản phẩm chuyển hóa trung gian như acid hữu cơ, các sản phẩm bị cắt vòng thơm sau 7 tháng. KIẾN NGHỊ 1. Xác định vai trò của các VK nhóm hô hấp loại khử clo đồng trao đổi chất và vai trò của VK Bacteroides trong quá trình chuyển hóa hay phân hủy chất diệt cỏ/dioxin. 2. Phân tích metagenome của mẫu đất ở lô xử lý để so sánh với mẫu làm giàu để thấy được vai trò của các VSV trong quá trình xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở quy mô hiện trường. 3. Tiếp tục nuôi cấy và phân lập VK Dehalococcoidesvà Desulfitobacterium trong các mẫu làm giàu. Từ đó xác định gene chức năng tham gia loại khử clo của VK này khi sinh trưởng trên đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin. 4. Xác định động học quá trình chuyển hóa PCDD/PCDF và một số hợp chất vòng thơm như 2,4-DCP, 2,4,5-T, từ đó xác định con đường phân hủy kỵ khí các hợp chất này bởi quần xã VK KK hô hấp loại khử clo. 129 DANH MỤC CÁC CÔNG TRÌNH ĐÃ CÔNG BỐ 1. Đàm Thúy Hằng, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Nguyên Quang, Nguyễn Thị Tâm Thƣ, Phùng Khắc Huy Chú, Đặng Thị Cẩm Hà (2010) Nghiên cứu đa dạng VSV trong mẫu đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCR-DGGE. Tạp chí Khoa học Công nghệ Quân sự 10, 74-80. 2. Nguyễn Thị Tâm Thƣ, Đào Thị Ngọc Ánh, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate làm giàu từ lô đất xử lý bằng phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng. Tạp chí độc học 21, 12-22. 3. Nguyễn Thị Tâm Thƣ, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Ảnh hưởng của một số yếu tố môi trường đến sự sinh trưởng của quần xã vi khuẩn khử sulfate làm giàu từ các lô đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa đã xử lý bằng phân hủy sinh học. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 50(2B), 23-32. 4. Nguyễn Thị Tâm Thƣ, Nguyễn Nguyên Quang, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2013) Đặc điểm sinh học của một số chủng vi khuẩn khử sulfate phân lập từ đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại căn cứ quân sự cũ của sân bay Đà Nẵng.Tạp chí Công nghệ sinh học. Có xác nhận đăng. 5. Nguyễn Thị Tâm Thƣ, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2013) Khả năng chuyển hóa 2,4-DCP, 2,4,5-T của Dehalococcoides và tập đoàn vi khuẩn kỵ khí bắt buộc từ các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng. Tạp chí Công nghệ sinh học.Có xác nhận đăng. 6. Đào Thị Ngọc Ánh,Nguyễn Thị Tâm Thƣ, Lê Việt Hưng, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2013) Sự đa dạng vi khuẩn thuộc nhóm Dehalococcoides tại các khu xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở sân bay Biên Hòa và Đà Nẵng bằng PCRDGGE. Tạp chí Công nghệ sinh học. Có xác nhận đăng. 7. Nguyễn Thị Tâm Thƣ, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2013) Đa dạng vi khuẩn khử sulfate trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa. Đã gửi đăng tại Tạp chí Công nghệ sinh học. 130 8. Nguyễn Thị Tâm Thƣ, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2013) Đánh giá sự đa dạng và khả năng chuyển hóa 2,4,5-T của vi khuẩn kỵ khí hô hấp loại khử clo trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa. Đã gửi đăng tại Tạp chí Công nghệ sinh học. 131 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Kiều Hữu Ảnh, Trần Văn Tuấn, Võ Viết Cường (2003) Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng phân giải chất diệt cỏ 2,4-D. Những vấn đề nghiên cứu cơ bản trong Khoa học Sự sống: Báo cáo khoa học hội nghị toàn quốc lần thứ hai, nghiên cứu cơ bản trong sinh học, nông nghiệp, y học, 815-817. 2. Đào Thị Ngọc Ánh, Lê Việt Hưng, Đặng Thị Cẩm Hà (2013) Đa dạng vi khuẩn trong lô xử lý bằng phân hủy sinh học chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Biên Hòa. Tạp chí Khoa học và Công nghệ. Đã chấp nhận đăng. 3. Nguyễn Ngọc Bảo (2010) Nghiên cứu khả năng phân hủy hydrocarbon thơm và các gene chức năng của một số tập đoàn vi khuẩn. Luận án Tiến sĩ kỹ thuật. Đại học Bách Khoa Hà Nội. 4. Báo cáo tổng thể về tình hình ô nhiễm dioxin tại 3 điểm nóng sân bay Biên Hòa, Đà Nẵng và Phù Cát (2011). Dự án: Xử lý ô nhiễm dioxin tại các vùng nóng ở Việt Nam. Văn phòng ban chỉ đạo 33. 5. Bộ Tài nguyên và Môi trường (2006). Kế hoạch quốc gia thực hiện Công ước Stokholm về các chất hữu cơ khó phân hủy (POPs). 6. Phùng Khắc Huy Chú, Đào Thị Ngọc Ánh, Lê Việt Hưng, Đinh Thị Thu Hằng, Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Phân lập, phân loại chủng vi khuẩn BHNA1 và xác định gene tfdA mã hóa cho enzyme phân hủy 2,4-D từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin thuộc khu vực Tây Nam sân bay Biên Hòa. Tạp chí độc học 21, 2-11. 7. Đặng Thị Cẩm Hà (2012) Xử lý khu nhiễm chất độc hóa học chứa dioxin tại sân bay Biên Hòa, tình Đồng Nai, Gói thầu: Mua vật tư sinh học tiến hành bổ sung năm thứ hai và kiểm soát độ phân hủy dioxin. Báo cáo nghiệm thu. 8. Đặng Thị Cẩm Hà, Harry Allen (2010a) Xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin ở quy mô pilot tại Đà Nẵng bằng công nghệ phân hủy sinh học. Báo cáo kết quả dự án. 9. Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Harry Allen, Vance Fong, Đàm Thúy Hằng, Nguyễn Nguyên Quang, Nguyễn Quang Huy (2010b) Kết quả nghiên cứu xử lý dioxin bằng phân hủy sinh học tại Đà Nẵng. Hội nghị Khoa học kỷ niệm 35 năm Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, 377-381. 132 10. Ðặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Bá Hữu, Mai Anh Tuấn, Nguyễn Ðương Nhã, Nguyễn Quốc Việt, Nguyễn Nguyên Quang (2008). Khảo sát VSV trong vùng nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở khu vực sân bay Ðà Nẵng và khử độc đất nhiễm ở điều kiện phòng thí nghiệm.Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6(4A), 138-143. 11. Đặng Thị Cẩm Hà, Nguyễn Quang Huy, Nguyễn Thanh Thủy (2009) Đặc điểm của vi khuẩn phân lập từ xử lý sinh học tẩy độc nước thải bị ô nhiễm 2,4,6Trinitrotoluene. Tạp chí Công nghệ sinh học 7(3), 389-396. 12. Đặng Thị Cẩm Hà, Phạm Hữu Lý, Nguyễn Bá Hữu, Nguyễn Thị Đệ, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Đương Nhã, Mai Anh Tuấn, La Thanh Phương, Nguyễn Thị Sánh, Nguyễn Thu Thủy, Đỗ Bích Thanh, Đỗ Ngọc Tuyên, Nguyễn Văn Minh, Nguyễn Văn Hồng (2005). Nghiên cứu phát triển công nghệ phân hủy sinh học và kỹ thuật nhả chậm làm sạch chất độc hóa học trong đất, Báo cáo nghiệm thu đề tài nhà nước thuộc chương trình 33, Hà Nội. 13. Hoàng Thị Mỹ Hạnh, Nguyễn Thanh Thủy, Ngô Xuân Quý, Nghiêm Xuân Trường, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2004) Khả năng phân hủy 2,4-D và dibenzofuran của chủng nấm sợi FDN20, Tạp chí Công nghệ sinh học, 2(4), 517528. 14. Nguyễn Quang Huy, Đặng Thị Cẩm Hà (2010) Chọn lọc vi khuẩn sinh tổng hợp laccase, peroxidase và nghiên cứu một số đặc tính của chủng vi khuẩn BDNP2. Tạp chí Công nghệ Sinh học 8(3A), 833-839. 15. Nguyễn Bá Hữu (2009) Nghiên cứu đa dạng vi sinh vật và một số gene liên quan đến khả năng phân hủy 2,4,5-T và dioxin trong đất nhiễm chất độc hóa học. Luận án Tiến sĩ sinh học. Viện Công nghệ sinh học. 16. Nguyễn Bá Hữu, Đàm Thúy Hằng, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2007a) Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn khử loại chlor Dehalococcoides trong mẫu bùn hồ khu vực nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng bằng kỹ thuật PCRDGGE. Tạp chí Nông nghiệp và phát triển nông thôn 16, 41-45. 17. Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2008) Nghiên cứu sự biến động cấu trúc tập đoàn vi sinh vật trong quá trình xử lý đất bị nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở quy mô hiện trường bằng công nghệ phân hủy sinh học. Tạp chí Sinh học 30(1), 55-61. 133 18. Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà, Dietmar H. Pieper (2007b) Xác định cấu trúc tập đoàn vi khuẩn trong đất nhiễm chất độc hóa học dựa trên phân tích đa hình cấu trúc sợi đơn gene 16S rRNA. Tạp chí Công nghệ sinh học 5(1), 123-132. 19. Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà, Nông Văn Hải, Dietmar H. Pieper (2007c) Tính đa dạng cấu trúc tập đoàn vi khuẩn trong quá trình xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin ở quy mô hiện trường nhỏ. Tạp chí Công nghệ sinh học 5(2), 255-264. 20. Nguyễn Bá Hữu, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2006) Xác định nhóm vi khuẩn khử chlor Dehalococcoides trong xử lý tẩy độc đất nhiễm chất dioxin. Tạp chí Công nghệ Sinh học, 4(4), 519-526. 21. Phạm Ngọc Long, Nguyễn Văn Bắc, Đặng Thị Cẩm Hà, Nghiêm Ngọc Minh (2009) Phân lập và định tên chủng vi khuẩn HR5.1 từ đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin xử lý bằng bioreactor hiếu khí. Tạp chí Khoa học và Công nghệ 57(9), 41-45. 22. Nghiêm Ngọc Minh, Phạm Ngọc Long, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2008) Nghiên cứu một số đặc điểm phân loại chủng vi khuẩn kỵ khí không bắt buộc BDNS3 phân lập từ đất nhiễm chất diệt cỏ chứa dioxin tại khu vực sân bay Đà Nẵng. Tạp chí Công nghệ sinh học 6(3), 391-396. 23. Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Viết Tiến, Nguyễn Bá Hữu, Đặng Thị Cẩm Hà (2009) Nghiên cứu đặc điểm phân loại và khả năng phân hủy chất diệt cỏ chứa dioxin của chủng vi khuẩn kỵ khí tùy tiện. Hội nghị Công nghệ sinh học toàn quốc, 933-937. 24. Lê Văn Nhương, Nguyễn Lan Hương, Khuất Hữu Thanh (2005) Phân lập và tuyển chọn một số chủng vi khuẩn có khả năng phân giải 2,4-dichlorophenoxyacetat (2,4D), Tạp chí Khoa học và công nghệ, 43(1), 68-73. 25. La Thị Thanh Phương, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2005) Một số đặc điểm sinh học và khả năng sử dụng 2,4,5-T của chủng vi khuẩn BDN15 phân lập từ vùng đất ô nhiễm chất độc hóa học. Tạp chí Công nghệ sinh học 3(3), 389-396. 26. Quy chuẩn kỹ thuật Quốc gia về ngưỡng dioxin trong đất nông nghiệp và phi nông nghiệp (2012) QCVN/BTNMT. 27. Quy chuẩn kỹ thuật quốc gia về giới hạn cho phép của dioxin trong một số loại đất (2012) QCVN 45:2012/BTNMT. QCVN/BTNMT. 134 28. Nguyễn Thị Sánh, Nghiêm Ngọc Minh, Đặng Thị Cẩm Hà (2005) Phân loại và nghiên cứu một số yếu tố ảnh hưởng lên sự phát triển của chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN1 từ đất nhiễm độc hóa học tại Đà Nẵng. Tạp chí Công nghệ sinh học 3(2), 257-264. 29. Nguyễn Thị Sánh, Nghiêm Ngọc Minh, Nguyễn Quốc Việt, Đặng Thị Cẩm Hà (2007) Nghiên cứu khả năng phân hủy dioxin và phân loại gene mã hóa dioxin dioxygenase của hỗn hợp chủng vi khuẩn kị khí không bắt buộc SETDN20 từ đất nhiễm độc hóa học tại Đà Nẵng. Tạp chí Sinh học 29(4), 64-69. Tiếng Anh 30. Adrian L, Hansen SK, Fung JM, Gorisch H, Zinder SH (2007) Growth of Dehalococcoides strains with chlorophenols as electron acceptors. Environ Sci Technol 41, 2318–2323. 31. Aly HA, Nguyen Ba Huu, Victor W, Howard J, Dietmar DH (2008) Two angular dioxygenases contribute to the metabolic versatility of the dibenzofuran degrading Rhodococcus sp. strain HA01, Appl Environ Microbiol, 74(12), 3812-22. 32. Angelo ED, Andres N (2010) Effect of environmental conditions on polychlorinated biphenyl transfomations and bacterial communities in a river sediment. J Soils Sediments 10, 1186-1199. 33. Barton LL, Hamilton WA (2007) Sulphate-reducing bacteria environmental and engineered systems. Cambridge university press. 34. Bedard DL, Bailey JJ, Reiss BL, Jerzak GVS (2006) Development and characterization of stable sediment-free anaerobic bacterial enrichment cultures that dechlorinate aroclor 1260. Appl Environ Microbiol 72(4), 2460-2470. 35. Bisaillon A, Beaudet R, Le´pine F, De´ziel E, Villemur R (2010) Identification and characterization of a novel CprA reductive dehalogenase specific to highly chlorinated phenols from Desulfitobacterium hafniense strain PCP-1. Appl Environ Microbiol 76(22), 7536-7540. 36. Boyle AW, Haggblom MM, Young LY (1995) Dehalogenation of lindane (γ hexachloroxyclohexane) by anaerobic from marine sediments and by sulfatereducing bacteria. FEMS Microbiol Ecol 29, 379-387. 135 37. Boyle AW, Knight VK, Häggblom MM, Young LY (1999a) Transformation of 2,4dichlorophenoxyacetic acid in four different marine and estuarine sediments: effects of sulfate, hydrogene and acetate on dehalogenation and sidechain cleavage, FEMS Microbiol Ecol, 29, 105-113. 38. Boyle AW, Phelps CD, Young LY (1999b) Isolation from estuarine sediments of a Desulfovibrio strain which can grow on lactate coupled to the reductive dehalogenation of 2,4,6-tribromphenol. Appl Environ Microbiol. 65, 1133-1140. 39. Breitenstein A, Saano A, Salkinoja-Salonen M, Andreesen JR, Lechner U (2001) Analysis of a 2,4,6-trichlorophenol-dehalogenating enrichment culture and isolation of the dehalogenating member Desulfitobacterium frappieri strain TCP-A. Arch Microbiol. 175 , 133– 142. 40. Bryant F (1992) Biodegradation of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5trichlorophenoxyacetic acid by dichlorophenol-adapted microorganisms from freshwater, anaerobic sediments, Appl Microbiol Biotechnol, 38, 276-281. 41. Bunge M, Adrian L, Kraus A, Opel M, Lorenz WG, Andreesen JR, Gorisch H, Lechner U (2003) Reductive dehalogenation of chlorinated dioxins by an anaerobic bacterium, Nature, 421, 357–360. 42. Bunge M, Lechner U (2009) Anaerobic reductive dehalogenation of polychlorinated dioxins. Appl Microbiol Biotechnol 84(3), 429-444. 43. Bunge M, Wagner A, Fischer M, Andreesen JR, Lechner U (2008) Enrichment of a dioxin-dehalogenating Dehalococcoides species in two-liquid phase cultures. Environ Microbiol 10, 2670–2683. 44. Cermiglia CE, Morgan JC, Gibson DT (1979) Bacterial and fungal oxidation of dibenzofuran. Biochem J, 180, 175-185. 45. Chang BV, Chiang CW, Yuan SY (1998) Dechlorination of pentachlorophenol in anaerobic sewage sludge. Chemosphere 36, 537–545. 46. Chang HL, Alvarez-Cohen L (1995) Model for the Cometabolic Biodegradation of Chlorinated Organics. Environ Sci Technol 29, 2357-2367. 47. Chang YS (2008) Recent developments in microbial biotransformation and biodegradation of dioxins. J Mol Microbiol Biotech, 15, 152–171 136 48. Cheng D, He J (2009) Isolation and characterization of Dehalococcoides sp. strain MB which dechlorinates tetrachloroethene to trans-1,2-dichloroethene. Appl Microbiol Environ 75(18) 5910-5918. 49. Cvančarová M, Křesinová Z, Filipová A, Covino S, Cajthaml T (2012) Biodegradation of PCBs by ligninolytic fungi and characterzation of the degradation products. Chemosphere. 88(11), 1317-1323. 50. Dar SA, Kuenen JG, Muyzer G (2005) Nested PCR-denaturing gradient gel electrophoresis approach to determine the diversity of sulfate reducing bacteria in complex microbial communities. Appl Environ Microbiol 71, 2325-2330. 51. Drzyzga O, Hellen EG, Jan C, Gottschal JA (2001) Coexistence of a sulfateereducing Desulfovibrio species and the dehalorespiring Desulfitobacteriumfrappieri TCE1 in defined chemostat cultures grown with various combinations of sulfatee and tetrachloroethene. Environ Microbiol 3(2), 92-99. 52. Duret A, Holliger C, Maillard J (2012) The physiological opportunism of Desulfitobacterium hafniense strain TCE1 towards organohalide respiration with tetrachloroethene. Appl Environ Microbiol 78(17), 6121-6127. 53. EPA (2006) Evaluation of the role of Dehalococcoides organisms in the natural attenuation of chlorinated ethylenes in ground water. 54. Ewald EM, Nuenhuie I, Wagner A, Richnow HH, Lechner U (2007) Microbial dehalogenation of trichlorinated dibenzo-p-dioxins by a Dehalococcoides containing mixed culture is coupled to carbon isotope fractionation. Environ Sci Technol 41, 7744-7751. 55. Fennell DE, Nijenhuis I, Wilson SF, Zinder SH and Haggblom MM (2004) Dehalococcoides ethenogenes strain 195 reductively dechlorinates diverse chlorinated aromatic pollutants. Environ Sci Technol 38, 2075-2081. 56. Field JA, Sierra-Alvarez R (2008) Microbial degradation of chlorinated dioxins, Chemosphere 71, 1005–1018. 57. Fukumori F, Hausinger dichlorophenoxyacetate RP (1993) monooxygenase dioxygenase. J Bacteriol, 175, 2083-2086. Alcaligeneseutrophus is an JMP134 2,4- a-ketoglutarate-dependent 137 58. Futagami T, Masatoshi G, Furukawa K (2008) Biochemical and genetic bases of dehalorespiration. Chem rec, 8, 1-12. 59. Gibson SA, Suflita JM (1990) Anaerobic biodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid in samples from a methanogenic aquifer: Stimulation by short-chain organic acids and alcohols. Appl Environ Microbiol 56,1825-1832 60. Gohil H (2011) Optimization of anaerobic degradation of 1,1,1-trichloro-2,2-di(4chlorophenyl)ethane (DDT), 1-Chloro-4-[2,2-Dichloro-1-(4-Chlorophenyl)ethyl] benzene (DDD) and 1,1-Bis-(4-Chlorophenyl)-2,2-Dichloroethene (DDE) in organic muck soil of lake Apopka. The Thesis PhD, University of Florida. 61. Grostern A, Edward EA (2006) Growth of Dehalobacter and Dehalococcoides spp. during degradation of chlorinated ethanes. Appl Environ Microbiol 72 (1) 428-436. 62. Habe H, Chung JS, Lee JH, Kasuga K, Yoshida T, Nojiri H, Omori T (2001) Degradation of chlorinated dibenzofurans and dibenzo-p -dioxins by two types of bacteria having angular dioxygenases with different features, Appl Environ Microbiol, 67, 3610–3617. 63. Häggblom MM, Fennell DE, Ahn YB, Beth R, Lee JK (2006) Anaerobic dehalogenation of halogenated organic compounds: novel strategies for bioremediation of contaminated sediments Earth Environ Sci 69, 505-521. 64. Hartmann EM, Armengaud J (2013) Shotgun proteomics suggests involvement of additional enzymes in dioxin degradation by Sphingomonas wittichii RW1. Environ Microbiol doi: 10.1111/1462-2920.12264. 65. Hatfield Consultant Company Canada (2011) Báo cáo đánh giá hiện trạng ô nhiễm dioxin lên môi trường và sức khỏe con người tại sân bay Biên Hòa. 66. Hatfield Consultants (2009), Comprehensive assessment of dioxin contamination in Da Nang Airport, Vietnam: Environmental levels, Human exposure and options for mitigating impact (final report). Office of the National Committee 33, MONRE, Hanoi, Vietnam. 67. Haugland RA, Schlemm DJ, Lyons RP, Sferra PR, Chakrabarty AM (1990) Degradation of the chlorinated phenoxyacetate herbicides 2,4- 138 dichlorophenoxyacetic acid and 2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid by pure and mixed bacterial cultures. Appl Environ Microbiol 56, 1357-1362. 68. Hendrickson ER, Payne JA, Young RM, Starr MG, Perry MP, Fahnesstock S, Ellis DE, Ebersole RC (2002). Molecular analysis of Dehalococcoides 16S ribosomal DNA from chloroethene contaminetad sites throughout North America and Europe. Appl Environ Microbiol, 68, 485-495. 69. Hidayat A, Tachibana S (2013) Degradation of 2,4,8-trichlorodibenzofuran by a new isolate of Cerrena sp. F0607. Inter Biodeter Biodegra 77, 51-55. 70. Hiraishi A (2003) Biodiversity of dioxin-degrading microorganisms and potential utilization in bioremediation. Microbes Environ 18(3), 105 – 125. 71. Hiraishi A (2008) Biodiversity of dehalorespiring bacteria with special emphasis on polychlorinated biphenyl/dioxin dechlorinators. Microbes Environ 23 (1), 1 – 12. 72. Hiraishi A, Kaiya S, Miyakoda H, Futamata H (2005) Biotransformation of polychlorinated dioxins and microbial community dynamics in sediment microcosms at different contamination levels. Microbes Environ 20, 227-242. 73. Hiraishi A, Miyakoda H, Lim BR., Hu HY, Fujie K, Suzuki J (2001), Toward the bioremediation of dioxin-polluted soil: structural and functional analyses of in situ microbial populations by quinone profiling and culture-dependent methods. Appl Microbiol Biotech, 57, 248–256. 74. Hong HB, Hwang SH, Chang YS (2000) Biosorption of 1,2,3,4tetrachlorodibenzop-dioxin and polychlorinated dibenzofurans by Bacillus pumilus, Water Research, 34, 349–353. 75. Hong HB, Nam IH, Murugesan K , Kim YM, Chang YS (2004) Biodegradation of dibenzo-p-dioxin, dibenzofuran, and chlorodibenzo-p-dioxins by Pseudomonasveronii PH-03, Biodegradation, 15, 303–313. 76. Huang H, Patskovsky Y, Toro R, Farelli JD, Pandya C, Almo SC, Allen KN, Dunaway-Mariano D (2011) Divergence of structure and function in the haloacid dehalogenase enzyme superfamily: Bacteroides thetaiotaomicron BT2127 is an inorganic pyrophosphatase. Biochem. 50(41):8937-8949. 139 77. Hug LA, Beiko RG, Rowe AR, Richardson RE, Edwards EA (2012) Conparative Metagenomics of three Dehalococcoides – containing enrichment cultures: the role of the non-dechlorinating community. BMC Genomics 13, 327-345. 78. Itoh K, Tashiro Y, Uobe K, Kamagata Y, Suyama K, Yamamoto H (2004) Root nodule Bradyrhizobium spp. harbor tfdA  and cadA, homologous with genes encoding 2,4-dichlorophenoxyacetic acid-degrading proteins, Appl Environ Microbiol, 70, 2110-2118. 79. Johnson T (2008) Bioremediation and detoxification of polychlorinated dioxin contaminated environments, MMG 445 Bas Biotech J, 4, 19-25. 80. Karns JS, Duttagupta S, Chakrabarty AM (1983) Regulation of 2,4,5-trichloro phenoxyacetic acid and chlorophenol metabolism in Pseudomonas cepacia AC1100. Appl Environ Microbiol. 46(5): 1182–1186. 81. Kaschabek SR Kuhn B, Mu¨ller D, Schmidt E, Reineke W (2002) Degradation of aromatics and chloroaromatics by Pseudomonas sp. strain B13: purification and characterization of 3-Oxoadipate:Succinyl-Coenzyme A (CoA) Transferase and 3Oxoadipyl-CoA Thiolase. J Bacteriol 184(1), 207-215. 82. Kim J, Yeom J, Jeon CO, Park W (2009) Intracellular 2-keto-3-deoxy-6phosphogluconate is the signal for carbon catabolite repression of phenylacetic acid metabolism in Pseudomonas putida KT2440. Microbiol 155, 2420-2428. 83. Kimura N, Shinozhaki Y, Lee TH, Yonezawaj Y (2003) The microbial community in a 2,4-dichlorophenol digesting reactor as revealed by 16S rDNA gene analysis. J Biosci Bioeng 76(1), 70-75. 84. Kirk JL, Beaudette LA, Hart M, Moutoglis P, Klironomos JN, Lee H, Trevors JT (2004) Methods of studying soil microbial diversity, J Microbiol Method, 58, 169– 188. 85. Kitagawa W, Takami S, Miyauchi K, Masai E, Kamagata Y, Tiedje JM, Fukuda M (2002) Novel 2,4-dichlorophenoxyacetic acid degradation genes from oligotrophic Bradyrhizobium sp. strain HW13 isolated from a pristine environment. J Bacteriol 184 (2), 509-518. 86. Klecka GM, Gibson DT (1980) Metabolism of dibenzo-p-dioxin and chlorinated 140 dibenzo-p-dioxins by a Beijerinckia species. Appl Environ Microbiol 39, 288-296. 87. Krajmalnik-Brown R (2005) Genetic identification of reductive dehalogenase genes in Dehalococcoides. The thesis PhD. Georgia Institute of Technology. 88. Kranzioch I, Stoll C, Holbach A, Chen H, Wang L, Zheng B, Norra S, Bi Y, Schramm KW, Tiehm A (2013) Dechlorination and organohalide-respiring bacteria dynamics in sediment samples of the Yangtze Three Gorges Reservoir. Environ Sci Pollut Res Int 20(10), 7046-7056. 89. Kube M, Beck A, Zinder SH, Kuhl H, Reinhardt R, Adrian L (2005) Genome sequence of the chlorinated compound-respiring bacterium Dehalococcoides species strain CBDB1. Nat Biotechnol, 23, 1269-1275. 90. Kubota M, Kawahara K, Sekiya K, Uchida T, Hattori Y, Futamata H, Hiraishi A (2005) Nocardioides aromaticivorans sp. nov., a dibenzofuran-degrading bacterium isolated from dioxin-polluted environments. Syst Appl Microbiol 28, 165–174 91. Kurihara T, Esaki N, Soda K (2000) Bacterial 2-haloacid dehalogenases: structures and reaction mechanisms. J Mol Catal B Enzym 10, 57–65. 92. Lee LK, Ding C, He J (2013) Bacterial dehalorespiration with penta-/tetrabrominated diphenyl ether and polychlorinated biphenyls. Inpress. 93. Lee PKH, Johnson DR, Holmes VF, He J, Cohen LA (2006) Reductive dehalogenase gene expression as a biomarker for physiological activity of Dehalococcoides spp. Appl Environ Microbiol 72 (9), 6161-6168. 94. Löffler FE, Yan J, Ritalahti KM, Adrian L, Edwards EA, Konstantinidis KT, Müller JA, Fullerton H, Zinder SH, Spormann AM (2013) Dehalococcoides mccartyi gen. nov., sp. nov., obligate organohalide-respiring anaerobic bacteria, relevant to halogene cycling and bioremediation, belong to a novel bacterial class, Dehalococcoidetes classis nov., within the phylum Chloroflexi. Int J Syst Evol Microbiol.63, 625-635. 95. Mai P, Jacobsen OS, Aamand J (2001) Mineralization and co-metabolic phenoxyalkanoic acid herbicide by a pure bacterial culture isolated from an aquifer, Appl Microbiol Biotech, 56, 486-490. 141 96. Maira MA, Escolano J, Montesinos E, Gaju N (2010) Diversity of the bacterial community in the surface soil of a pear orchard based on 16S rRNA gene analysis. Int microbiol 13, 123-134. 97. Mannisto MK, Salkinoja-Salonnen MS, Puhakka JA (2001) Insitu polychlorophenol bioremediation potential of the indigenous bacterial community of boreal ground water. Water Res 35(10), 2496-2504. 98. Maphosa F, de Vos WM, Smidt H (2010) Exploiting the ecogenomics toolbox for environmental diagnostics of organohalide-respiring bacteria. Trend Biotech, 28 (6), 806-814. 99. Maphosa F, Lieten SH, Dinkla I, Stams AJ, Smidt H, Fennell DE (2012) Ecogenomics of microbial communities in bioremediation of chlorinated contaminated sites. Front Microbiol. 3 (351), 1-14. 100. Marzorati M, Francesca de Ferra, Raemdonck HV, Borin S, Allifranchini E, Carpani G, Serbolisca L, Verstraete W, Boon N, Daffonchio D (2007) A novel reductive dehalogenase, identified in a contaminated groundwater enrichment culture and in Desulfitobacterium dichloroeliminans strain DCA1, is linked to dehalogenation of 1,2-dichloroethane. Appl Environ Microbiol 73(9), 2990-2999. 101. Meyer F, Paarmann D, D'Souza M, Olson R, Glass EM, Kubal M, Paczian T, Rodriguez A, Stevens R, Wilke A, Wilkening J, Edwards RA (2008) The Metagenomics RAST server – a public resource for the automatic phylogenetic and functional analysis of metagenomes. BMC Bioinformatics 9, 386-393. 102. Mikesell MD, Boyd SA (1985) Reductive dechlorination of the pesticides 2,4-D, 2,4,5-T and pentachlorophenol in anaerobic sludges. J Environ Quali 14, 337-340. 103. Mitsevich EV, Mitsevich IP, Perelygin VV, Do Ngoc Lan, Nguyen Thu Hoai (2000) Microorganisms as possible indicators of general soil pollution by dioxincontaining defoliants. Appl Biochem Microbiol 36(6), 582-588. 104. Moe WM, Yan J, Nobre MF, Dehalogenimonaslykanthroporepellens dehalogenating bacterium isolated Milton gen. from SC, nov., sp. chlorinated Rainey nov., FA a (2009) reductively solvent-contaminated groundwater. Int J Syst Evol Microbiol 59, 2692–2697. 105. Mohammadi M, Sylvestre M (2005) Resolving the profile of metabolites 142 generated during oxidation of dibenzofuran and chlorodibenzofurans by the biphenyl catabolic pathway enzymes Chemis Biol 12,thaotrung68 835–846. 106. Muyzer G, Stams AJM (2008) The ecology and biotechnology of sulfate reducing bacteria. Nature 6, 441-452. 107. Nam IH, Hong HB, Kim YM, Kim BH, Murugesan K, Chang YS (2005) Biological removal of polychlorinated dibenzo-p-dioxins from incinerator fly ash by Sphingomonas wittichii RW1.Water Research 39, 4651–4660. 108. Nam IH, Kim YM, Schmidt S, Chang YS (2006) Biotransformation of 1,2,3-tri- and 1,2,3,4,7,8-hexachlorodibenzo-p-dioxin by Sphingomonas wittichii strain RW1. Appl Environ Microbiol 72, 112–116. 109. Nguyen LH, Itoh K, Suyama K (2007) Diversity of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid (2,4,5-T)-degrading bacteria in Vietnamese soils. Microbiol Environ 22(3), 243-256. 110. Ovreas L (2000) Population and community level ap proaches for analysing microbial diversity in natural environments. Ecol Lett 3, 236–251. 111. Phung Khac Huy Chu, Pham Ngoc Canh, Dinh Ngoc Tan, Pham Van Au (2012) Research on level distribution of toxic isomers 2,3,7,8-TCDD of agent orange/dioxin in Western – South area of Bien Hoa airbase, Dong Nai, Vietnam. Organo Comp 74, 1336-1339. 112. Picton P, Farenhorst A (2004) Factors influencing 2,4-D sorption and mineralization in soil. J Environ Sci Heal Part B, 39(3), 367–379. 113. Pieretti I, Royer M, Barbe V, Carrere S, Koebnik R, Cociancich S, Couloux A, Darrasse A, Gouzy J, Jacques MA, Lauber E, Manceau C, Mangenot S, Poussier S, Segurens B, Szurek B, Verdier V, Arlat M, Rott P (2009) The complete genome sequence of Xanthomonas albilineans provides new insights into the reductive genome evolution of the xylem-limited Xanthomonadaceae. BMC Genomics 10, 616-618. 114. Postgate JR (1984) The sulfate reducing bacteria. Cambridge University Press, Cambridge, England. 115. Reineke W (2001) Biodegradation and persistence. Bergische Universität, 1-161. 143 116. Rice JF, Menn FM, Hay AG, Sanseverino J, Sayler GS (2005) Natural selection for 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid mineralizing bacteria in agent orange contaminated soil. Biodegradation 16, 501-512. 117. Richardson RE (2013) Genomic insights into organohalide respiration. Curr Opin Biotechnol 24, 498-505. 118. Richardson RE, Bhupathiraju VK, Song DL, Goulet TA, Alvarez-Cohen L. (2002). Phylogenetic characterization of micro-bial communities that reductively dechlorinate TCE based upon a com-bination of molecular techniques. Environ Sci Technol 36, 2652-2662. 119. Ritalahti KM, Löffler FE (2004) Populations implicated in anaerobic reductive dechlorination of 1,2-dichloropropane in highly enriched bacterial communities, Appl Environ Microbiol 70(7), 4088–4095. 120. Rowe AR, Lazar BJ, Morris RM, Richardson RE (2008) Characterization of the community structure of a dechlorinating mixed culture and comparisons of gene expression in planktonic and biofloc-associated “Dehalococcoides” and Methanospirillum species. Appl Environ Microbiol 74(21), 6709-6719. 121. Ryan TP, Bumpus JA (1989) Biodegradation of 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid in liquid culture and in soil by the white rot fungus Phanerochaete chrysosporiu., Appl Microbiol Biotech 31(3), 302-307. 122. Schecter A, Birnbaum L, Ryan J, Constable JD (2006) Dioxins: An overview. Environ Research 101, 419-428. 123. Schloss PD, Handelsman J (2003) Biotechnological prospects from Metagenomics. Curr Opin Biotech , 14:303–310. 124. Seshadri R, Adrian L, Fouts DE, Eisen JA, Phillippy AM, Methe BA (2005) Genome sequence of the PCE-dechlorinating bacterium Dehalococcoides ethenogenes. Science 307, 105–108. 125. Singh BK, Kuhad RC, Singh A, Lal R, Tripathi KK (1999) Biochemical and molecular basis of pesticide degradation by microorganisms. Crit Rev Biotechnol 19(3):197-225. 126. Smalla K, Oros-Sichler M, Milling A, Heuer H, Aumgarte S, Becker R, Neuber G, Kropf S, Ulrich A, Tebbe CC (2007) Bacterial diversity of soils assessed by 144 DGGE, T-RFLP and SSCP fingerprints of PCR-amplified 16S rRNA gene fragments: Do the different methods provide similar results. J Microbiol Methods 69(3), 470-479. 127. Smidt H, Akkermans ADL, John van der Oost, Willem M de Vos (2000) Halorespiring bacteria – molecular characterization and detection. Enzym Microb Technol 27, 812-820. 128. Smidt H, de Vos WM (2004) Anaerobic microbial dehalogenation. Annu Rev Microbiol 58, 43–73. 129. Sonoki S, Hisamatsu S, Takagi S (2006) Transgenic plants capable of dioxin degradation, transformed with dioxin degrading enzyme coding genes of white rot fungi, Jpn Kokai Tokkyo Koho CODEN: JKXXAF JP 2006333758 Patent. 130. Sowers KR, May HD (2013) In situ treatment of PCBs by anaerobic microbial dechlorination in aquatic sediment: are we there yet? Current Opinion Biotechnology 24(3), 482-488. 131. Suenaga H (2011) Targeted metagenomics: a high-resolution Metagenomics approach for specific gene clusters in complex microbial communities. Environ Microbiol 14(1):13-22. 132. Ssebugere P, Kiremire BT, Henkelmann B, Bernhöft S, Wasswa J, Kasozi GN, Schramm KW (2013) PCDD/Fs and dioxin-like PCBs in surface sediments from Lake Victoria, East Africa Sci Total Environ, 454-455, 528-533. 133. Suflita JM, Stout J, Tiedje JM (1984) Dechlorination of 2,4,5-trichlorophenoxy acetic acid by anaerobic microorganisms. J Agri Food Chemis 32, 18-221. 134. Sun B, Cole JR, Sanford RA, Tiedje JM (2000) Isolation and characterization of Desulfovibrio dechloracetivorans sp. nov., a marine dechlorinating bacterium growing by coupling the oxidation of acetate to the reductive dechlorination of 2chlorophenol Appl Environ Microbiol 66(6), 2408-2413. 135. Suyama A, Iwakiri R, Kai K, Tokunaga T, Sera N, Furukawa K (2001) Isolation and characterization of Desulfitobacterium sp. strain Y51 capable of effient dehalogenation of tetrachloroethene and polychloroethanes. Biosci Biotechnol Biochem 65(7), 1674-1481. 145 136. Tas N, Miriam HA van Eekert, Willem M de Vos, Schraa G, Smidt H (2009) Tracking functional guilds: “Dehalococcoides” spp. in European river basins contaminated with Hexachlorobenzene. Appl Environ Microbiol 75 (14), 4696-4704. 137. Thomas T, Gilbert J, Meyer FK (2012) Metagenomics - a guide from sampling to data analysis. Microb Inform Exper 2(3), 1-12. 138. Townsend DI (1983) Change of isomer ratio and fate of polychlorinated dibenzo-p-dioxins in the environment. Chemos 12, 637-643. 139. UNEP (United Nations environment programme), (2005) Review of emerging, innovative technologies for the destruction and decontamination of POPs and the identification of promising technologies for use in developing countries, New Zealand. 140. Uroz S, Ioannidis P, Lengelle J, Cébron A, Morin E, Buée M, Martin F (2013) Functional assay and metagenomic analyses reveals differences between the microbial communities inhabiting the soil horizons of a norway spruce plantation. PlosOne 8(2), 1-13. 141. Van den Berg M, Birnbaum LS, Denison M, De Vito M, Farland W, Feeley M, Fiedler H, Hakansson H, Hanberg A, Haws L, Rose M, Safe S, Schrenk D, Tohyama C, Tritscher A, Tuomisto J, Tysklind M, Walker N, Peterson RE (2006) The 2005 World health organization reevaluation of human and mammalian toxic equivalency factors for dioxins and dioxin-like compounds. Toxic Sci 93(2), 223–241. 142. Vargas C, Fennell DE, Haggblom MM (2001) Anaerobic reductive dechlorination of chlorinated dioxins in estuarine sediments. Appl Microbiol Biotechnol 57, 786–790. 143. Vroumsia T, Steiman R, Seigle-Murandi F, Benoit-Guyod JL, Groupe pour l´E´tude du Devenir des Xe´nobiotiques dans l´Environnement (GEDEXE) (2005) Fungal bioconversion of 2,4-dichlorophenoxyacetic acid (2,4-D) and 2,4dichlorophenol (2,4-DCP). Chemos 60, 1471–1480. 144. Wagner A, Kleinsteuber S, Andreesen JR, Lechner U (2009) Transcription analysis of genes encoding homologues of reductive dehalogenases in “Dehalococcoides” sp. strain CBDB1 by using terminal restriction fragment length polymorphism and quantitative PCR Appl Environ Microbiol 75 (7) 1876-1884. 146 145. Waller AS, Krajmalnik-Brown R, Löffler FE, Edwards EA (2005) Multiple reductive-dehalogenase-homologous genes are simultaneously transcribed during dechlorination by Dehalococcoides-containing cultures Appl Environ Microbiol 71 (12) 8257-8264. 146. Wang S, He J (2013) Phylogenetically distinct bacteria involve extensive dechlorination of Aroclor 1260 in sediment-free cultures. Plos One 8(3), 1-12. 147. Warner KA, Gilmour CC, Capone DG (2002) Reductive dechlorination of 2,4- dichlorophenol and related microbial processes under limiting and nonlimiting sulfate concentration in anaerobic mid-Chesapeake Bay sediments. FEMS Microb Ecol 40, 159-165. 148. Weisburg WG, Barns SM, Pelletier DA, Lane DJ (1991) 16S ribosomal DNA amplication for phylogenetic study. J Bacteriol 173: 697-703. 149. Wildeman DS, Diekert G, Van Langenhove H, Verstraete W (2003) Stereoselective microbial dehalorespiration with vicinal dichlorinated alkanes. Appl Environ Microbiol. 69:5643-5647 150. Yan J, Rash BA, Rainey FA, Moe WM (2009) Detection and quantification of Dehalogenimonas and “Dehalococcoides” populations via PCR-based protocols targeting 16S rRNA genes. Appl Environ Microbiol 75 (23), 7560–7564. 151. Yoshida N, Takahashi N, Hiraishi A (2005) Phylogenetic characterization of a polychlorinated dioxin dechlorinating microbial community by use of microcosm studies. Appl Environ Microbiol 71, 4325–4334. 152. Zeyaullah M, Kamli MR, Islam B, Atif M, Benkhayal FA, Nehal M, Rizvi MA, Arif A (2009). Metageneomicss-An advanced approach for non-cultivable microorganisms. Biotechnol Mol Biol, 4 (3), 49 – 54 153. Zhang X, Wiegel J (1990) Sequential anaerobic degradation of 2,4- dichlorophenol in freshwater sediments. Appl Environ Microbiol 56, 1119-1127. 154. Zharikova N, Markusheva T, Galkin E, Korobov V, Zhurenko E, Sitdikova L, Kolganova T, Kuznetsov B, Turova T(2006) Raoultella planticola, a new strain degrading 2,4,5-trichlorophenoxyacetic acid. Appl Biochem Microbiol 42(3), 258-262. 147 SUMMARY Study of community diversity of anaerobic bacteria in bioremediated herbicide/dioxin cells More than 40 years after the US-Vietnam War, spilled Agent Orange defoliant solution containing traces of the dioxins, tetrachlorodibenzodioxin (TCDD) and octachlorodibenzodioxin (OCDD), remains in the soil and in lake sediment contaminated by polluted soil, which had been carried by run off from the former military airbases in Danang and Bienhoa. Natural attenuation of the herbicides and dioxins has not been effective in detoxifying the soil or sediment. There are 4 mechanisms have been proposed in degradation and transformation of polychlorinated compounds by microbes as follows: (1) ring cleavage; (2) dechlorination of ring-broken products; (3) catalysis by extracellulase enzyme such as laccase, MnP, LiP or laccase-like etc; (4) reductive dechlorination by anaerobic bacteria. At least 18 diferent genera show reductive dechlorination ability with PCB, polychloroethene, herbicide/dioxin, have been found. They belong to 3 groups: obligate dehalorespiring bacteria (Dehalobacter, Dehalogenimonas, Dehalococcoides); facultatively dehalorespiring bacteria (Desulfitobacterium, Sulfurospirillum, Desulfomonile, Desulfuromonas, Geobacter, Anaeromyxobacter, Desulfovibrio); co-metabolic reductive dehalorespiring bacteria (Propionigenium, Pseudomonas, Bacterioides, Shewanella, Desulfobacterium, Acetobacterium, Clostridium, Methanosarcina, Enterobacter etc.). Numerous of international groups have concluded that bioremediation is the most environmentally responsible and cost-effective remedy for cleaning up Agent Orange residues at the former military bases in Vietnam. Bioremediation, which utilizes the microorganisms to degrade and detoxify herbicide/dioxin and their metabolites was applied with pilot scale in Danang (0.5-100 m3) and full treatment in Bienhoa (3,384 m3). Biodegradation of TCDD has been reported from laboratory to pilot scale in Vietnam from 1999 up to now. The obtained results from these researches shown that microbes are capable in degrading dioxins, herbicides and other toxicants were 148 dominant. Microbial community structure of contaminated soil and sediment (Sen Lake and other lakes), initially and over the course of bioremediation was observed by DGGE varying in Danang and Bienhoa former military bases. Culturable and non-culturable microbes and their distribution over some main phylogenetic groups inhabiting in herbicide/dioxin contaminated soil befote treatment and during 27 month detoxification by bioremediation in “active landfill” of Bienhoa airbase. Number of fungi, actinomycetes, aerobic and anaerobic bacteria changed depending on the water content and nutrient products supplied during bioremediation. Their degradation capability of 2,3,7,8-TCDD, dibenzofuran, PAH in purified cultures as well as consortia and biotreatments had detected by HPLC, GC/MS, DRCALUX and other methods. Characterization of bacteria, actinomycetes, filamentous fungi and some their functional genes were also ịnvestigated. More than 300 sequences of 16S rRNA, 18S rRNA, dioxin dioxygenase, C23O (encode for catechol-2,3-dioxygenase C230), cadA, dbfA1, tfdA genes were deposited at GeneBank. Morever, isolation and identification of microbes producing oxidoreductase enzymes (laccase, manganese peroxidase - MnP, lignin peroxidase LiP) and their activity from different herbicide/dioxin, TNT, DDT, HCH contaminated sites were archived. Aerobic laccase-like enzyme-producing bacteria and actinomycetes playing a certain role for the oxidation of chlorinated compounds during bioremediation were reported in Bienhoa. Specially, genus Dehalococcoides, obligated anaerobic microbes recognizing as “dechlorinating workers”, was detected by DGGE method in different original herbicide/dioxin sediments and soil of bioremediated cells in Danang and Bienhoa. This bacterial group was detected in all Bienhoa bioremediated cells may be involved in reductive dechlorination of dioxin as well as other chlorinated pollutants.However, the role of Dehalococcoides as well as other dehalorespiring bacteria in the transformation and detoxification of a wide range of halogenated compounds, e.g., chlorophenols, chloroethenes, chlorobenzenes, biphenyls (PCBs), PCDD/Fs and polybrominated diphenylethers (PBDEs) have not been investigated. 149 In Vietnam, soil and sediment contamination by mixture of dioxin, herbicide (2,4,5-T, 2,4-D) and other chlorinated biodegradation products. Dioxin 2,3,7,8TCDD congener is a main substarte causes high toxicity of the soil. In the frame of all researches were carried out here used the media containing soil extract with the mixture chlorinated compouds above. This research aimed to understand microbial community structutre and physiological activity of dehaloganting bacteria including Dehalococcoides in Danang and Bienhoa bioremediated cells. The research focused on diversity of anaerobic dehalogenating bacteria in Danang and Bienhoa bioremediated cells by nested-PCR and DGGE methods, charracterization of sulfate-reducing bacteria, transformation and degradation of halogenated compounds including dioxins and their congener by pure and enrichment cultures using HPLC and GC/MS analysis, diversity of anaerobic bacteria and their function genes related to these processes in enrichment containing heavy herbicides and dioxins as well as their metabolites by Metagenomics tools. Using nested-PCR, the diversity of dehalorespiring bacteria in bioremediated herbicide/dioxin cells in Danang and Bienhoa airbases has been verified. Dehalorespiring bacteria inhabited in those cells belong to Desulfovibrio, Desulfococcus, Desulfitobacterium, Dehalococcoides. Two genera that are obligatory dehalorespiring bacteria Dehalogenimonas and Dehalobacter have not been detected in these cells. Sulfate-reducing bacteria (SRB) and Dehalococcoides diversity within Danang and Bienhoa bioremediated cells were found by DGGE when using 16S rRNA gene specific primers. They belong to Desulfosarcinar, Desulfococcus, Desulfobacterium, Desulfovibrio genera. Sequences of 16S rRNA gene of SRB in Bienhoa showed high homology from 97 to 98% in comparision with those in Danang. However, SRB in Danang are more diverse than those in Bienhoa. The sequences of these bands were deposited in GenBank with accession numbers from KC985168 to KC985170 and from KF358989 to KF358997. The diversity of Dehalococcoides was also detected by DGGE, especially in P5 bioremediated cell in Danang and BH1.2 in Bienhoa was highest. In contrast, Dehalococcoides 150 diversity was detected in 100DNT bioremediated cell in Danang after 10 year old of treatment was low. The lowest diversity of these bacteria was detected in sediments of A, C lakes in Danang and BH3.4 of bioremediated cells in Bienhoa. Most of sequences from obtained bands showed high homology (98%) to 16S rRNA gene sequence of Dehalococcoides strains of data in the GenBank. These DGGE band sequences were deposited in GenBank with accession numbers from IQ677605 to IQ677673. Analysing by Metagenomics method also demonstrated that dehalorespiring bacterial community enriched on heavy herbicide/dioxin contaminated soil contained 3 groups: co-metabolic dehalogenating bacteria (Pseudomonas, Bacterioides, Clostridium…), facultatively dehalorespiring bacteria (Desulfovibrio, Desulfitobacterium, Desulfuromonas…), obligately dehalorespiring bacteria (Dehalococcoides, Dehalogenimonas). Whereas, co-metabolic dehalogenating bacteria which could play an important role in dioxin degradation and detoxification were dominant in the enrichment. Using Metagenomics analysis, series of functional genes coding the enzymes, which could be involved in degradation of aromatic compounds under anaerobic condition, were presented. All of them belong to Pseudomonas genus, which is the majority of metagenome.They are 1,2-dihydroxycyclohexa-3,5-diene-1-carboxylate dehydrogenase, putative 4-hydroxybenzoyl-CoA thioesterase, benzoate 1,2- dioxygenase, catechol 2,3-dioxygenase. In addition, haloacid dehalogenase, which acts on halide bonds in carbon-halide compounds and participates in gammahexachlorocyclohexane degradation, was also exposed. The obtained results provided scientific evidences for the dehalogenating bacteria community and their functional genes coding for enzymes involved in metabolism of the chlorinated compounds as well as bio-transformation and biodegradation of these substrates depending on their chemical structure and toxicity in herbicide/dioxin contaminated sites. SRB are recognized as one of interesting groups of anaerobic dehalorespiration bacteria. They are facultative dehalorespiring bacteria that play an important role in 151 persistently organic pullutant (POP) degradation, including herbicide’s compounds. In this study, effect of environmental factors on the sulfate reducing bacterial consortium was shown. The optimal growth of the bacterial consortium was detected at temperature of 30-35oC, pH 7, 0.1% NaCl. They could also grow in medium with the presence of different halogenated organic compounds, such as 2,4-D, 2,4,5-T, DCPs, DDT with an initial concentration at 100 ppm. In the Posgate B medium, the sulfate reducing bacterial consortium could grow in medium containing either sodium -lactate, acetate, pyruvate, or benzoate, except for sodium-citrate and oxalate. Sulfate reducing bacteria BDN10T which was isolated from bioremediated herbicide/dioxin cell in former DaNang military bases belonged to Desulfovibrio genus. This strain was named Desulfovibrio sp. BDN10Twith the accession numbers in GenBank is JN314424.These results affirmed the present as well as the role of sulfate reducing bacterial group and some strains of Desulfovibrio genus in dehalorespiration. Morever, this finding could provide scientific base for enhancing the rate of herbicide/dioxin detoxification in bioremediated cells. From the bioremediated herbicide/dioxin anaerobic cells the former Danang and Bienhoa military airbase, Dehalococcoides and other dehalorespiring bacteria were enriched in M204 anaerobic medium containing 2,4-DCP, 2,4,5-T or soil extract. Several different anaerobic bacteria that differ from morphology including Dehalococcoides were detected in 2,4-DCP and 2,4,5-T enrichments from P1 and P5 samples, respectively. Sequences of two Dehalococcoides clones that were enriched from P5 sample in M204 anaerobic medium containing 2,4,5-T were deposited in GenBank with accession numbers KF305118 and KF305119. Using HPLC analyse, 100% of 2,4-DCP was reductively dehalogenated by the enrichments, which come from bioremediated herbicide/dioxin cells in Danang and Bienhoa samples, after 9 and 12 weeks, respectively. 80-100 % of 2,4,5-T was also reductively dehalogenated after 12 weeks. This is the first finding in Vietnam about transformation of 2,4-DCP and 2,4,5-T by enrichment cultures driving to defind kinetics and pathway of reductive dehalogenation. 152 The dehalogenating community degraded and transformed above 55% of PCDD/Fs with total equivalent quantity of 41.265 pg TEQ/g soil. Especially, OCDD, which is a biomarker for biodegradation (it is only degraded in anaerobic condition), was degraded 57% after 1 year-enrichment. In addition, other aromatic compounds such as 2,4-DCP, 2,4,5-TCP are also degraded and transformed. Other bioremediated intermediates such as benzoic acid, acetic acid, phthalic acid, 2,5hexadione, propionic acid, etc. were demontrated to be degraded almost completely. Chemical composition of Desulfovibrio sp. BDN10T pure culture in the medium containing soil extract scanned by GC-MS analysis indicated that some of components existing in the soil extract, which include 2,4-DCP (2,4-dichorophenol) and 2,4,5-TCP (2,4,5-trichlorophenol) were be transformed and degraded by the examined strain. [...]... loại khử clo trong các lô xử lý đất ô nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại Đà Nẵng và Biên Hòa, chúng tôi thực hiện đề tài: Nghiên cứu đa dạng quần xã vi khuẩn kỵ khí trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin bằng phương pháp phân hủy sinh học Luận án được thực hiện với các mục đích và nội dung chính sau đây: Mục đích nghiên cứu  Đánh giá sự đa dạng VK KK trong các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin và trong mẫu làm... của luận án 1.3.2.2 Phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin Theo Field (2008), trong số các nghiên cứu về VK phân hủy các hợp chất PCDD và PCDF có tới 84% kết quả nghiên cứu công bố về phân hủy hiếu khí các hợp chất dioxin chứa 1 hoặc 2 clo Hiện nay, phân hủy sinh học các dioxin chứa ba hay bốn clo đang được quan tâm nghiên cứu Nhìn chung, quá trình phân hủy sinh học của các hợp chất dioxin chứa clo... – 2450 ppt 1.3 Phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo Nhiều nghiên cứu về quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo đã được công bố Trong phần này sẽ đề cập chi tiết về cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo bởi VSV, các nghiên cứu về phân hủy chất diệt cỏ, dioxin bởi các VSV hiếu khí và kỵ khí 1.3.1 Cơ chế phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa... clo trong các lô xử lý bằng phương pháp nested-PCR  Nghiên cứu sự đa dạng VK KSF và Dehalococcoides từ các lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin tại sân bay Đà Nẵng và Biên Hòa bằng phương pháp DGGE  Đánh giá sự biến động số lượng VK KK sử dụng dioxin và VK KSF trong lô xử lý 3.384 m3 tại Biên Hòa 3  Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của quần xã VK KSF và một chủng đại diện được làm giàu, phân. .. mà còn khó bị phân hủy bởi vi sinh vật (VSV) Xử lý ô nhiễm các chất hữu cơ chứa clo nói chung và chất diệt cỏ/dioxin nói riêng bằng biện pháp phân hủy sinh học (bioremediation) đã và đang được nghiên cứu do chi phí thấp và thân thiện đối với môi trường Các nghiên cứu về quá trình phân hủy sinh học các hợp chất hữu cơ chứa clo đã chứng minh có 4 con đường phân hủy, chuyển hóa bởi VSV Trong số đó có... hiếu khí Để có bức tranh tổng thể về quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất hữu cơ chứa clo nói chung và các hợp chất dioxin nói riêng, sự đa dạng các VSV tham gia vào quá trình chuyển hóa, phân hủy chất diệt cỏ/dioxin ở điều kiện hiếu khí và vai trò của các VK KK trong quá trình loại khử clo sẽ được đề cập 1.3.2 Phân hủy hiếu khí chất diệt cỏ/dioxin 1.3.2.1 Phân hủy hiếu khí các chất diệt cỏ... hô hấp loại khử clo bằng phương pháp sinh học phân tử  Đánh giá sự đa dạng các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa các hợp chất chứa clo vòng thơm trong mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo từ mẫu đất ở lô xử lý của Biên Hòa  Đánh giá khả năng phân hủy chất diệt cỏ/dioxin trong mẫu làm giàu bởi quần xã VK KK hô hấp loại khử clo Nội dung nghiên cứu  Xác định sự có... giàu, phân lập từ các lô xử lý chất diệt cỏ/dioxin ở Vi t Nam  Đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các đồng phân PCDD/Fs và các hợp chất vòng thơm từ mẫu làm giàu quần xã VK KK hô hấp loại khử clo và VK KSF  Sử dụng công cụ Metagenomics để nghiên cứu sự đa dạng của quần xã VK KK cũng như các gene chức năng tham gia vào quá trình phân hủy và chuyển hóa chất diệt cỏ/dioxin có mặt trong mẫu làm giàu... số yếu tố môi trường đến khả năng sinh trưởng của các VK này 3 Phương pháp hóa học: phân tích các thành phần hóa học trên máy HPLC và GC/MS để đánh giá khả năng phân hủy hay chuyển hóa các chất là thành phần của chất diệt cỏ như các đồng phân của dioxin, 2,4,5-T và sản phẩm phân hủy sinh học của chúng như 2,4-DCP bởi các VK KK trong các mẫu làm giàu từ đất của lô xử lý ở Đà Nẵng, Biên Hòa NHỮNG ĐÓNG... hủy hoàn toàn PCDD/Fs bởi các quần xã VK trong quá trình phân hủy sinh học (Hiraishi, 2003) Trong quá trình phân hủy sinh học các chất hữu cơ chứa clo, quá trình loại khử clo là bước mở đầu, bước khử độc ở điều kiện kỵ khí tạo điều kiện cho sự khoáng hóa hoàn toàn các hợp chất này ở điều kiện hiếu khí Tuy nhiên, một số VSV vẫn có khả 17 năng chuyển hóa hay phân hủy các hợp chất như 2,4-D, 2,4,5-T trong .. .VI N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI T NAM VI N CÔNG NGHỆ SINH HỌC Nguyễn Thị Tâm Thư NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG QUẦN XÃ VI KHUẨN KỴ KHÍ TRONG CÁC LÔ XỬ LÝ CHẤT DIỆT DIỆT CỎ/DIOXIN BẰNG PHƯƠNG PHÁP... khuẩn loại khử clo lô xử lý đất nhiễm chất diệt cỏ/dioxin 68 3.1.1 Đa dạng vi khuẩn hô hấp loại khử clo nói chung lô xử lý 68 3.1.2 Đa dạng vi khuẩn khử sulfate lô xử lý 69 3.1.3 Đa dạng vi khuẩn. .. phân hủy sinh học chất diệt cỏ chứa dioxin Vi t Nam 45 1.8.1 Phân hủy sinh học lô xử lý sân bay Đà Nẵng 46 1.8.2 Phân hủy sinh học lô xử lý sân bay Biên Hòa 48 1.8.3 Các nghiên cứu vi khuẩn chuyển