ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS LUẬN VĂN THẠC SỸ KHOA HỌC MỞ ĐẦU Hà Nội, 2015 ĐẠI HỌC QUỐC GIA HÀ NỘI TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC TỰ NHIÊN --------------------- Đặng Thị Thanh Nhàn NGHIÊN CỨU BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE CỦA HIV-1 TRÊN NẤM MEN PICHIA PASTORIS Chuyên nghành: Di truyền học Mã số: 60420121 LUẬN VĂN THẠC SĨ KHOA HỌC NGƢỜI HƢỚNG DẪN KHOA HỌC: TS. Đinh Nho Thái TS. Nguyễn Thị Hồng Loan Hà Nội, 2015 LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tôi xin phép bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới TS. Đinh Nho Thái, người thầy đã tận tình chỉ bảo, tạo điều kiện và giúp đỡ tôi trong suốt quá trình làm thí nghiệm và viết luận văn. Thầy đã không ngại khó khăn hướng dẫn, giúp đỡ tôi làm quen từ những nguyên tắc và thao tác đầu tiên trong nghiên cứu khoa học. Tôi xin chân thành cảm ơn TS. Nguyễn Thị Hồng Loan, đã tận tình hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình hoàn thành luận văn này. Trong quá trình học tập và nghiên cứu, tôi đã nhận được sự giúp đỡ của các cán bộ, thành viên trong nhóm nghiên cứu tại bộ môn Di truyền học, Khoa Sinh học và phòng protein tái tổ hợp, phòng thí nghiệm trọng điểm công nghệ enzym và protein, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN. Tôi xin chân thành cảm ơn về sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn các thầy, cô giáo trong bộ môn Di truyền học cũng như các thầy, cô giáo trong Khoa Sinh học, Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, ĐHQGHN đã giảng dạy và chỉ bảo cho tôi những kiến thức và kỹ năng cần thiết trong quá trình học tập và làm luận văn tốt nghiệp. Tôi xin cảm ơn Ban lãnh đạo cùng các đồng nghiệp tại Trường THPT Nguyễn Du, Thanh Oai, HN, đã ủng hộ, tạo điều kiện cho tôi trong thời gian học tập vừa qua. Lời cuối cùng, tôi xin được bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến cha mẹ, chồng, con, những người thân trong gia đình tôi đã chia sẻ, động viên và hết lòng giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu hoàn thành luận văn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày tháng năm 2014 Học viên: Đặng Thị Thanh Nhàn MỤC LỤC MỞ ĐẦU .....................................................................................................................1 CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU .....................................................................3 1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV ........................................................................3 1.1.1. Lịch sử hình thành AIDS ...........................................................................3 1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1 ............................................................................4 1.1.3. Cấu trúc hình thể và hệ gen của HIV-1 .....................................................5 1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay .....................................................9 1.2. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 ..............................................................12 1.2.1. Protease HIV-1 ..........................................................................................12 1.2.2. Chức năng của protease HIV – 1. ............................................................13 1.2.3. Sơ lƣợc về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới. ..............13 1.2.4. Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt Nam ....................................16 1.3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P. PASTORIS ...........................................................17 1.3.1. Đặc điểm của P. pastoris .........................................................................18 1.3.2. Ƣu nhƣợc điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris .................................19 1.3.3. Chủng nấm men P. pastoris biểu hiện protease HIV-1 ...........................20 1.3.4. Vector nhân dòng và biểu hiện ở P. pastoris ...........................................21 1.3.5. Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris ..............................22 1.3.6. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris ..........................................22 Chƣơng 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU........................24 2.1. NGUYÊN LIỆU .................................................................................................24 2.1.1. Chủng vi sinh vật .....................................................................................24 2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác ................................................................24 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......................................................................25 2.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR .............25 2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose ..................................................................27 2.2.3. Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện: ..................28 2.2.4. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid ..................................................30 2.2.5. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 ..................................31 2.2.6. Biến nạp vector vào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện ..................32 2.2.7. Điện di protein trên gel polyacyamide (SDS-PAGE) .............................33 2.2.8. Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) ................................................34 2.2.9. Phƣơng pháp biểu hiện và thu nhận protein.............................................35 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………………………37 3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1. ............................37 3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR ...........................37 3.1.2. Tinh sạch plasmid pPIC9 từ E. coli .........................................................39 3.1.3. Cắt sản phẩm PCR và cắt mở vòng plasmid bằng enzym giới hạn .........40 3.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 bằng phản ứng ligase ..................................................................................................................41 3.1.5. Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của protease HIV-1 trong vector biểu hiện pPIC9 .........................................................................................................42 3.2. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRÊN P. PASTORIS. ................................................................................................................44 3.2.1. Tạo dòng nấm men P. pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 ...................................................................................................44 3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P. pastoris ........47 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ...................................................................................53 1. KẾT LUẬN ...........................................................................................................53 2. KIẾN NGHỊ ...........................................................................................................53 TÀI LIỆU THAM KHẢO .........................................................................................54 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1......................................................................6 Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1......................................................................7 Hình 3. Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1................... ..............................12 Hình 4. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9.... ...................................................................21 Hình 5. Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus HIS4 giữa bộ gen của tế bào với vector biểu hiện....................................................................................................................22 Hình 6. Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR.................38 Hình 7. Điện di sản phẩm tách chiết plasmid...........................................................39 Hình 8. Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid và sản phẩm PCR bằng các enzym giới hạn NotI và EcoRI..............................................................................................40 Hình 9. Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E. coli DH5α............................42 Hình 10. So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết..43 Hình 11. Sự hình thành khuẩn lạc trên P. pastoris SMD1168................................45 Hình 12. Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men............................................................................................................................46 Hình 13. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng P. pastoris SMD1168 sau khi biểu hiện ở môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian…………………………49 Hình 14. Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng tái tổ hợp SMD1168..................................................................................................50 Hình 15. Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western Blot...........51 DANH MỤC CÁC BẢNG BIỂU Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp............................................................................................................................20 Bảng 2. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR.................................................26 Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR.........................................................................27 Bảng 4. Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn..................................................28 Bảng 5. Thành phần gel tách và gel cô trong SDS-PAGE ......................................33 Bảng 6. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp thông qua chỉ số OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm 3 lần.............................................48 BẢNG KÝ HIỆU CÁC CHỮ VIẾT TẮT AIDS Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải (Acquired Immuno Deficiency Syndrome) ART Liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus(Antiretroviral drug therapy) AOX Alcohol oxidase Amp Ampicillin BMGY Buffered Minimal Glycerol Yeast Bp Base pair DNA Axit deoxyribonucleic ddNTP dideoxyribonucleotide – triphosphate E. coli Escherichia coli HIV Virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (Human immunodeficiency virus) HIS: Histidine KLPT Khối lƣợng phân tử kb Kilobase kDa Kilo Dalton LB Luria-Bertani mRNA RNA thông tin (Messenger RNA) MM: Môi trƣờng Minimal Methanol P. pastoris Pichia pastoris PCR Phản ứng chuỗi Polymerase (Polymerase Chain Reaction) PI Chất ức chế protease (Protease Inlibitor) RNA Axit ribonucleic SDS Sodium dodecyl sunfat SDS-PAGE: phƣơng pháp điện di trên gel polyacrylamid có SDS (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) UNAIDS Chƣơng trình HIV/AIDS của Liên hiệp quốc ( United Nation Program on HIV/AIDS) MỞ ĐẦU Virus gây suy giảm miễm dịch ở ngƣời (Human Immuno Deficiency VirusHIV) là nguyên nhân chính gây nên hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải ở ngƣời (AIDS). Đây là một trong các bệnh đã làm nhiều ngƣời chết nhất trong lịch sử loài ngƣời [49]. Có hai type HIV gây nên AIDS là HIV type 1 (HIV-1) và HIV type 2 (HIV - 2), nhƣng HIV-1 độc hơn HIV-2 và là nguyên nhân chính của các ca nhiễm HIV trên toàn thế giới từ khi xuất hiện cho tới nay [28]. Để tồn tại và phát triển, HIV-1 cần đến 3 enzym quan trọng không thể thiếu trong sao chép, đóng gói và hình thành virus hoàn chỉnh đó là: enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Nếu một trong ba enzym này bị ức chế chu kì sống của HIV sẽ bị ảnh hƣởng, chính vì vậy hƣớng nghiên cứu tìm ra chất ức chế các enzym trên để sản xuất thuốc điều trị cho các bệnh nhân AIDS đã đƣợc rất nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm. Các điều trị theo hƣớng sử dụng chất ức chế 3 enzym đó gọi là liệu pháp dùng thuốc chống retrovirus ART (antiretroviral drug therapy) [28]. Enzym protease của HIV-1 (đƣợc gọi tắt là protease HIV-1) đƣợc mã hoá bởi gen pol của virus có chức năng cắt các chuỗi polyprotein (gag, gag – pol) thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus có thể tiếp tục lây nhiễm. Nếu protease bị mất hoạt tính, HIV-1 sẽ không đƣợc đóng gói phù hợp để tạo virus hoàn chỉnh [19]. Tuy nhiên, do HIV-1 có tốc độ sinh sản nhanh, có khoảng 10 triệu hạt virus mới đƣợc tạo ra mỗi ngày và tỷ lệ sai sót của enzym reverse transcriptase là 1/10.000 base dẫn đến tình trạng kháng thuốc phổ biến ở những bệnh nhân nhiễm bệnh thậm chí khi chƣa điều trị. Ngày càng có nhiều chất ức chế protease (PI) chống HIV đƣợc phát triển và thƣơng mại hóa nhƣng vẫn chƣa tìm đƣợc chất ức chế nào thực sự có hiệu quả. Vì vậy, việc nghiên cứu tìm ra chất ức chế protease một cách hiệu quả là nhiệm vụ quan trọng góp phần đẩy lùi HIV/AIDS. Quá trình nghiên cứu nhằm tìm ra chất ức chế protease này cần một lƣợng lớn protease nên việc sản xuất, tinh sạch protease HIV-1 là rất cần thiết. 1 Cho đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 trên toàn thế giới. Trong thực tế nghiên cứu, protease HIV-1 không dễ dàng biểu hiện trong tế bào vật chủ do đặc tính gây độc tế bào, khó tan, lƣợng protease thu đƣợc sau biểu hiện thƣờng thấp, khó phát hiện. Do đó, cần có những nghiên cứu để sản xuất protease HIV-1 có tính tan và hiệu quả hơn. Phần lớn các công trình nghiên cứu sản xuất protease HIV-1 ở Escherichia coli (E. coli), vì đây là hệ thống biểu hiện đơn giản, dễ nuôi cấy [3; 18; 41]. Tuy nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn (có chức năng cải biến protein sau tổng hợp). Nhiều protein của sinh vật nhân chuẩn khi biểu hiện ở E. coli không tạo thành dạng protein hoàn chỉnh có chức năng bởi những cải biến sau dịch mã không diễn ra. Hạn chế này đƣợc khắc phục bằng cách sử dụng các hệ thống biểu hiện ở sinh vật nhân chuẩn nhƣ nấm men và động vật có vú. Nấm men có cấu trúc đơn giản, nhƣng chúng mang đầy đủ các đặc điểm của một cơ thể và là một mô hình tiêu biểu cho cấu trúc tế bào nhân chuẩn. Nhiều protein của tế bào nhân thực đã đƣợc sản xuất thành công bằng hệ thống biểu hiện nấm men Saccharomyces cerevisiae (S. cerevisiae) [10]. Ngoài S. cerevisiae, nấm men Pichia pastoris (P. pastoris) cũng bắt đầu đƣợc quan tâm sử dụng để biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn, đặc biệt từ khi promoter alcohol oxidase đƣợc phân lập và tạo dòng. P. pastoris còn là hệ thống biểu hiện đáng tin cậy và có tiềm năng hơn E. coli hay S. cerevisiae để sản xuất protein ngoại lai dạng hòa tan [27]. Để tạo ra chế phẩm protease HIV-1 nhằm phát triển chất ức chế sự nhân lên của virus HIV-1, làm cơ sở cho việc nghiên cứu tìm ra thuốc điều trị HIV/AIDS, cùng với thuận lợi của hệ thống biểu hiện của nấm men P. pastoris so với E. coli, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu đề tài: “Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease của HIV-1 trên nấm men P. pastoris” với các nội dung: - Nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện. - Nghiên cứu sự biểu hiện của gen mã hóa protease HIV-1 trên nấm men P. pastoris. 2 CHƢƠNG 1 - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV 1.1.1. Nguyên nhân hình thành AIDS Thuật ngữ AIDS (Acquired Immune Deficiency Syndrome - Hội chứng suy giảm miễn dịch mắc phải) đƣợc đề xuất trong cuộc họp tại Washington của các nhà lãnh đạo cộng đồng ngƣời đồng tính, các quan chức và CDC (trung tâm kiểm soát và phòng ngừa dịch bệnh Hoa kỳ) để thay thế cho GRID (suy giảm miễn dịch liên quan đến đồng tính) vào tháng 7 năm 1982 [11]. Đến tháng 8 năm 1982, AIDS đã trở thành tên gọi về hội chứng suy giảm miễn dịch ở ngƣời do tác nhân HIV gây nên [38]. Virus gây suy giảm miễn dịch đƣợc phát hiện lần đầu vào năm 1959 tại Châu Phi, và phân lập đầu tiên do Luc Montagnier và tập thể ở Viện Pasteur Paris thực hiện năm 1983 với tên gọi ban đầu là virus liên quan tới viêm hạch (LAV). Năm 1986, virus này đƣợc Uỷ ban Quốc tế thống nhất gọi tên là HIV [24]. Cũng vào 1986, L. Montagnier lại phân lập đƣợc một loại virus tƣơng tự ở Tây Phi và đặt tên là HIV type 2 (HIV-2), đây là loại virus gốc của HIV-1. Cả HIV-1 và HIV-2 đều làm suy giảm hệ thống miễn dịch của ngƣời nên đƣợc đặt tên chung là HIV. Chúng giống nhau về cách thức truyền bệnh, các hình thức nhiễm bệnh cơ hội và phƣơng pháp điều trị nhƣng ngƣời nhiễm HIV-2 ít phát sinh bệnh hơn so với HIV-1 và HIV-2 chủ yếu thấy ở các vùng Châu Phi [28]. Bởi vậy, bệnh AIDS hiện nay đƣợc hình thành do tác nhân chính là virus HIV-1. Theo phân loại, HIV thuộc họ Retrovirus, chi Lentivirus, có hai loại là HIV1 và HIV-2. Retrovirus là họ gây ung thƣ cho ngƣời và động vật. HIV-1 có 4 nhóm chính là M (main), N (new) và O (outlier) và nhóm P [40]. Trong đó, nhóm M xuất hiện tới 90% tổng số các ca lây nhiễm HIV trên toàn thế giới, nhóm này có 9 phân type (subtypes or clades) đƣợc kí hiệu bằng các chữ cái A; B; C; D; E; F; G; H; J; K và 49 dạng tái tổ hợp khác gọi tắt là các phân nhóm CRF (circulating recombinant forms) [6]. Sự khác nhau giữa phân nhóm này và phân nhóm khác là trình tự axit amin của protein vỏ và có thể vƣợt quá 30%. Vị trí địa lý có thể ảnh hƣởng đến sự 3 lây nhiễm các phân nhóm khác nhau nhƣ phân nhóm B phổ biến ở Mỹ, Tây Âu và Austalia, còn ở các nƣớc đang phát triển nhƣ Châu Á và Châu Phi, nơi mà có nhiều ngƣời bị nhiễm HIV-1 đang sinh sống thì lại phổ biến các phân nhóm không thuộc nhóm B. Cụ thể, theo ghi nhận của Ngân hàng Gen HIV Hoa Kỳ, kiểu gen CRF25_CPX thƣờng chỉ xuất hiện ở Châu Phi [53]. Những nghiên cứu ban đầu về dịch tễ học phân tử của HIV đã xác định đƣợc phân týp chính lƣu hành tại Việt Nam đó là phân týp CRF01_AE (96,7%) và phân týp B (3,3%) [10]. Năm 2013, Phạm Đức Minh và cộng sự đã công bố kết quả phân typ AE và B ở Việt Nam lần lƣợt là 98,53% và 1,33%. [6] 1.1.2. Thực trạng nhiễm HIV-1 Sau gần nửa thế kỷ phát hiện ra HIV đến nay, HIV/AIDS vẫn là đại dịch thế kỷ chƣa có vaccine phòng ngừa hay thuốc chữa trị đặc hiệu. Với tốc độ lây lan nhanh, HIV/AIDS đã lan rộng trên toàn thế giới, đặc biệt là ở khu vực Châu Phi và các nƣớc Châu Á. Theo ƣớc tính của chƣơng trình HIV/AIDS Liên hiệp quốc UNAIDS, trung bình mỗi ngày trên thế giới có thêm khoảng 7000 ngƣời nhiễm HIV. UNAIDS đã công bố báo cáo thống kê trong năm 2012 thế giới có khoảng 2,3 triệu các trƣờng hợp nhiễm mới HIV ở ngƣời lớn và trẻ em, giảm 33% so với năm 2001, các trƣờng hợp tử vong liên quan đến AIDS cũng giảm 30% so với mức đỉnh năm 2005 [49]. Đây là kết quả của sự nỗ lực không ngừng trong công tác truyền thông phòng, chống HIV và việc mở rộng tiếp cận điều trị theo hƣớng kháng virus làm giảm số ngƣời tử vong, kéo dài sự sống cho ngƣời bệnh. Những con số thống kê này cho thấy hy vọng có thể ngăn chặn và đẩy lùi đại dịch HIV/AIDS trên toàn cầu khi nâng cao hơn nữa tính hiệu quả của các phƣơng pháp điều trị phòng và chống HIV/AIDS. Tuy nhiên, theo công bố của WHO, HIV vẫn tiếp tục là một vấn đề y tế công cộng quan trọng toàn cầu. Đến hết năm 2013 trên toàn thế giới, có khoảng 1,5 triệu ngƣời chết vì các nguyên nhân liên quan đến HIV, 33,2 - 37,2 triệu ngƣời sống chung với HIV với hơn 2,1 triệu ngƣời nhiễm mới. Trong đó, Sahara Châu Phi là khu vực có số ngƣời nhiễm HIV lớn nhất thế giới với trên 24,7 triệu ngƣời sống 4 chung với HIV, số ngƣời nhiễm mới cũng chiếm gần 70% tổng số ngƣời nhiễm trên toàn cầu [56]. Ở Việt Nam, năm 1990 phát hiện bệnh nhân dƣơng tính với HIV đầu tiên. Theo báo cáo của Cục phòng chống AIDS, giữa những năm 2000 đến 2007, số ngƣời nhiễm HIV đã tăng gấp đôi từ 122.000 đến 290.000 ngƣời và mỗi năm có khoảng 40.000 ngƣời nhiễm mới. Tính đến 30/9/2010 trên cả nƣớc có 180.631 ngƣời nhiễm HIV, đến ngày 30/9/2013 cả nƣớc có 218.427 ngƣời nhiễm HIV, trong đó có 66.729 ngƣời ở giai đoạn AIDS, 66.116 trƣờng hợp tử vong do HIV/AIDS, và trung bình mỗi ngày cả nƣớc phát hiện thêm 34 ngƣời nhiễm HIV [49]. Theo báo cáo mới nhất của cục phòng chống HIV/AIDS, tính đến ngày 30/4/2014, toàn quốc hiện có 219.163 trƣờng hợp báo cáo hiện nhiễm HIV (trong đó số bệnh nhân chuyển sang giai đoạn AIDS là 67.557), đến 31/8/2014 có 223.130 ngƣời nhiễm HIV đƣợc phát hiện. Đây chỉ là số ngƣời nhiễm HIV đƣợc phát hiện và xác nhận, số ngƣời nhiễm thực tế có thể lớn hơn [49]. Nhìn chung, đại dịch HIV/AIDS vẫn trong giai đoạn tập trung và xảy ra chủ yếu trong các nhóm có hành vi nguy cơ cao, đặc biệt nhóm tiêm chích ma túy và mại dâm ở các thành phố lớn. 1.1.3. Hình dạng cấu trúc và hệ gen của HIV-1 1.1.3.1. Hình dạng cấu trúc của HIV-1 HIV-1 và HIV-2 có cấu trúc hình thể không khác nhau nhiều mà chỉ khác biệt với nhau về khối lƣợng của các protein và các gen phụ trợ. Chúng đều nhân bản trong tế bào lympho CD4 và cùng gây bệnh ở ngƣời, nhƣng mức độ suy giảm miễn dịch do HIV-1 gây ra nhiều hơn so với HIV-2 [28]. 5 Hình 1. Cấu trúc của một hạt virus HIV-1 [28] Về cấu tạo (Hình 1), HIV-1 có dạng hình cầu, có đƣờng kính 100 nm và đƣợc bao quanh bởi màng lipoprotein. Lớp ngoài cùng của virus là lớp lipit kép với nhiều protein Env gắn vào và nhô lên. Protein Env gồm hai phần là phần chỏm (gp120) và phần thân (gp41). Trong quá trình nảy chồi, các protein khác nhau từ màng của tế bào vật chủ có thể đƣợc gắn vào màng lipoprotein của virus, (chẳng hạn nhƣ protein HLA lớp I và II, hay protein bám dính ICAM) tạo điều kiện cho virus tiếp xúc, gắn vào các tế bào mục tiêu. Bên trong màng lipoprotein là protein P17, tiếp đến là lõi của virus. Lõi có dạng hình trụ đƣợc bao bọc bởi lớp capsid đƣợc tạo thành từ 2000 bản sao của protein p24. Bên trong lõi có hai bản sao của RNA HIV-1, các enzym phiên mã ngƣợc và integrase [28]. 1.1.3.2. Cấu tạo hệ gen của HIV Virus HIV-1 có hệ gen nằm trong phần lõi với hai sợi RNA (+) đơn, trên mỗi sợi có 9 gen mã hoá cho 15 protein khác nhau và có chiều dài khoảng 9,8 kb. Mỗi sợi RNA (Hình 2), có 3 gen cấu trúc là gen gag “group- antigen (kháng nguyên nhóm)”; gen pol “polymerase” và gen env “envelope - vỏ”. Các gen gag và env mã hoá cho nucleocapsid và glycoprotein của màng virus; gen pol mã hoá cho 3 enzym 6 reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease. Ngoài 3 gen chính, HIV1 còn có 6 gen khác (tat, rev, nef, vif, vpr và vpu) chứa thông tin mã hóa cho các protein có khả năng kiểm soát sự tái bản, các cách lây nhiễm hoặc nguy cơ nhiễm các loại bệnh khác nhau [28]. Hình 2. Cấu tạo của hệ gen virus HIV-1 [28] Bao gồm 9 gen: gag, pol, vif, vpr, vpu, env, tat, rev và gen nef. Gal, pol, env là 3 gen cấu trúc mã hóa các protein cấu tạo vỏ và lõi virus HIV-1 Tat, rev, vif, vpr, vpu và nef là 6 gen phụ 1.1.3.3. Sự xâm nhiễm vào tế bào và nhân lên của HIV-1 HIV truyền nhiễm theo các con đƣờng bao gồm quan hệ tình dục không an toàn với ngƣời nhiễm HIV, truyền máu và các sản phẩm của máu (có thể qua thụ tinh nhân tạo, ghép da và ghép tạng), dùng lại kim tiêm không tiệt trùng của ngƣời nhiễm và từ mẹ sang con [28]. Virus HIV xâm nhiễm vào tế bào vật chủ thông qua các thụ thể. Phân tử CD4 là thụ thể chính của HIV-1, HIV-2 và SIV, đã đƣợc mô tả từ năm 1984 [20]. CD4 có thể thấy trên bề mặt của 60% các tế bào: lympho T; các tế bào tiền thân của lympho T trong tủy xƣơng, tuyến ức; trên các tế bào đơn, đại thực bào, bạch cầu ƣa 7 kiềm, tế bào tua (dendritic cell) và các tế bào thần kinh đệm (microglial cell) [28]. Các tế bào này có vai trò rất quan trọng trong hệ thống miễn dịch của cơ thể, chúng nhận diện, báo động và huy động các tế bào lympho tấn công và tiêu diệt vi sinh vật lạ xuất hiện trong cơ thể. Chu trình nhân bản của HIV gồm 6 bƣớc: I) gắn và xâm nhập, II) cởi bỏ lớp vỏ bên ngoài, III) phiên mã ngƣợc, IV) gắn provirus, V) tổng hợp protein virus và lắp ráp, VI) nảy chồi. Toàn bộ con đƣờng sao chép của HIV có thể đƣợc chia thành 3 sự kiện chính: virus gắn vào tế bào, quá trình hoạt hóa và dung hợp. Quá trình lây nhiễm HIV đƣợc bắt đầu khi protein bề mặt vỏ gp120 gắn vào thụ thể CD4 trên bề mặt tế bào đích. Sự liên kết đầu tiên của gp120 với CD4 để lộ ra các vùng đặc hiệu trên vòng V3 của gp120 để gp120 có thể gắn với các đồng thụ thể chemokine (CCR5, CXCR4) trên bề mặt tế bào đích. Tiếp đó phân tử gp41 qua thụ thể gắn vào màng tế bào đích và hòa tan màng, HIV-1 cởi bỏ lớp vỏ lipid bên ngoài và bơm vật liệu di truyền RNA của nó cùng với enzym reverse transcriptase vào tế bào chất của tế bào vật chủ. Nhờ enzym reverse transcriptase mà sợi RNA của virus đƣợc tổng hợp thành sợi DNA bổ sung (cDNA). Tiếp đến là sự kết hợp của RNA virus với sợi cDNA thành chuỗi RNA/DNA - chuỗi lai này chuyển thành 2 sợi DNA xoắn mạch thẳng, sau đó chuyển thành DNA xoắn dạng vòng chui qua màng nhân vào trong nhân tế bào. Nhờ enzym integrase mà sợi DNA virus đƣợc chèn vào DNA nhiễm sắc thể của tế bào chủ. DNA virus đƣợc hợp thành có thể tồn tại ở trạng thái tiềm tàng trong nhiều giờ hoặc nhiều năm trƣớc khi trở thành dạng hoạt động mà không có biểu hiện bệnh [26]. Sau khi lây nhiễm vào vật chủ, hệ gen của virus HIV-1 sẽ đƣợc sao chép nhờ sự điều khiển phức tạp của một số protein nhƣ Tat và các yếu tố sao chép DNA của tế bào vật chủ. Do hệ gen vật chủ bị thay đổi cấu trúc khi DNA của virus chèn vào, DNA của virus chỉ thị cho tế bào phiên mã ra RNA virus nhờ enzym DNA polymerase tế bào vật chủ. Số lƣợng RNA của virus đƣợc tăng lên, tiếp tục tổng hợp các protein virus nhờ ribosome của tế bào vật chủ, chúng cùng di chuyển ra tế bào chất hoặc màng tế bào, sau đó là quá trình nảy chồi tạo thành các viron nằm trên màng hoặc tách ra khỏi tế bào chủ, đi vào máu và tiếp tục gắn vào các tế bào lympho T khác [26; 28]. 8 1.1.4. Các thuốc điều trị HIV/AIDS hiện nay Lý do khiến cho việc phát triển vaccine phòng chống nhiễm HIV-1 gặp rất nhiều khó khăn và thƣờng thất bại do thời gian ủ bệnh của HIV-1 dài, lại thƣờng xảy ra đột biến ở vùng gen mã hóa cho kháng nguyên. Sau nhiều nghiên cứu, đến ngày 6 tháng 3 năm 2012, các nhà nghiên cứu sinh học hàng đầu Cuba đã thử nghiệm thành công một loại vaccine mới với tên Teravac chống HIV/AIDS trên chuột, đã sẵn sàng để thử nghiệm trên con ngƣời. Vaccine đƣợc triển khai từ một protein tái tổ hợp có những phân tử giống virus, kích thích đáp ứng miễn dịch. Tuy nhiên, theo Iglesias, trƣởng nhóm nghiên cứu vaccine Teravac, vaccine này ban đầu phải đƣợc thử nghiệm lâm sàng với số lƣợng nhỏ, trên một nhóm bệnh nhân AIDS đang ở giai đoạn đầu và cũng không nên hy vọng quá cao vào vaccine này. Tiếp theo là các cuộc thử nghiệm nhằm kiểm tra độ an toàn của vaccine, và việc phát triển một vaccine hiệu quả đòi hỏi nhiều năm nghiên cứu trong phòng thí nghiệm trƣớc khi đƣa ra loại vaccine có thể thử nghiệm trên ngƣời lành [17]. Vì nhiều nguyên nhân trên mà việc sản xuất vaccine phòng HIV theo phƣơng pháp truyền thống gặp rất nhiều khó khăn. Ngƣời nhiễm HIV-1 muốn kéo dài cuộc sống chỉ có cách duy nhất là dùng thuốc ức chế sự sao chép và nhân lên của HIV-1. Việc điều trị HIV/AIDS phức tạp, tốn kém và chỉ giúp kéo dài sự sống mà không chữa khỏi đƣợc bệnh. Các loại thuốc điều trị HIV/AIDS có thể hƣớng đến các đích khác nhau dựa trên cơ sở hiểu biết về quá trình nhiễm và nhân lên của HIV trong tế bào nhƣ: Ức chế quá trình nảy chồi; ức chế quá trình hoà màng và xâm nhập của HIV-1. Phƣơng pháp phổ biến nhất là liệu pháp dùng thuốc kháng retrovirus (ART) đƣợc áp dụng từ những năm 1987 bao gồm thuốc ức chế enzym reverse transcriptase, enzym integrase và enzym protease [28]. ART là liệu pháp điều trị sử dụng các thuốc kháng virus hay còn gọi là thuốc ARV (Anti-retrovirus). Các thuốc ARV có tác dụng làm chậm sự nhân lên của HIV trong cơ thể, do đó tăng khả năng miễn dịch và ít mắc các nhiễm trùng cơ hội. Các thuốc kháng retrovirus ức chế sự phát triển và nhân lên của HIV ở những giai đoạn khác nhau trong vòng đời của virus. Hiện có một số nhóm nhƣ: 9 + Các chất ức chế reverse transcriptase tương tự nucleoside (NRTI): NRTI ức chế sự sao chép của enzym phiên mã ngƣợc reverse transcriptase. Nhóm thuốc này gồm zidovudine, lamivudine, didanosin, zalcitabine, stavudine và abacavir. Đặc tính của thuốc nucleoside cũng gây ra các rối loạn về chuyển hoá đặc biệt là teo mỡ. Có thể chúng liên quan đến ức chế hoạt động của ty thể do hoạt động chức năng của ty thể cần đến nucleoside. Qúa trình chuyển hóa trong ty thể bị rối loạn do phải sử dụng các nucleoside “giả” dẫn đến sự thoái hoá của ty thể [25]. + Các chất ức chế protease (PI): Đây là nhóm thuốc gây cản trở sự nhân lên của HIV bằng cách tác động vào enzym protease của virus, làm cho cấu trúc HIV bị rối loạn và không gây nhiễm. Tuy nhiên, khi điều trị bằng PI, bệnh nhân thƣờng phải uống nhiều lần thuốc trong một ngày và việc điều trị kéo dài gây ra một số tác dụng phụ nhƣ: bệnh dạ dày, ruột, giảm chức năng gan, rối loạn lipid máu, loạn nhịp tim [13]. Những hạn chế này cũng đã đƣợc khắc phục khi PI mới (PI tăng cƣờng) ra đời. Thuốc PI tăng cƣờng đƣợc phân biệt với thuốc PI bằng chữ “r” thêm vào sau tên thuốc. Các thuốc trong nhóm gồm saquinavir, ritonavir, indinavir, nelfinavir, amprenavir, lopinavir và atazanavir. + Các chất ức chế reverse transcriptase không nucleoside (NNRTI). Những thuốc này phong bế hoàn toàn vị trí gắn các chất hoạt hóa enzym reverse transcriptase bằng cách gắn trực tiếp với enzym này, làm giảm quá trình tổng hợp axit nucleic. Nhóm thuốc này gồm các thuốc nevirapine, delavirdine và efavirenz. Một số nghiên cứu cho rằng nếu đảm bảo đã ức chế đƣợc virus thì có thể dùng NNRTI điều trị thay cho PI. Trong trƣờng hợp này, sử dụng NNRTI đôi khi đem lại hiệu lực tốt hơn việc tiếp tục điều trị bằng các thuốc PI [28]. + Các chất ức chế enzym reverse transcriptase nucleoside (NtRTI): Hoạt động của nhóm thuốc này rất giống với NRTI nhƣng tác dụng nhanh hơn. Tenofovir là thuốc duy nhất trong nhóm này có thể ức chế cả HIV và viêm gan B, đặc biệt lại có có hiệu quả ngay cả ở bệnh nhân đã kháng NRTI. 10 + Các chất ức chế hoà nhập: Nhóm thuốc này không cho virus nhân lên bằng cách ngăn không cho màng virus hoà nhập với màng của tế bào khỏe mạnh. Thuốc đầu tiên trong nhóm này là enfuvirtide. Để tăng hiệu quả và hạn chế tác dụng phụ, các loại thuốc thƣờng đƣợc dùng phối hợp trong điểu trị cho các bệnh nhân HIV/AIDS. Thực tế cho thấy, HIV/AIDS rất khó điều trị triệt để. Thời gian ƣớc lƣợng có thể xoá sạch các tế bào mang HIV-1 là 73,3 năm, nghĩa là HIV-1 không thể chữa khỏi hoàn toàn [44]. Đối mặt với nhiều khó khăn, cùng với sự biến đổi phức tạp của HIV-1, các nhà khoa học vẫn đang nỗ lực không ngừng, nghiên cứu và tìm ra thuốc chống HIV mới, hiệu quả hơn mang lại hy vọng sống cho nhiều bệnh nhận HIV/AIDS. 11 1.2. TỔNG QUAN VỀ PROTEASE HIV-1 1.2.1. Protease HIV-1 Protease HIV-1 là enzym có vai trò phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trƣởng thành của virus. Protease HIV-1 đƣợc mã hóa bởi gen pol trong hệ gen của HIV-1 và là một protease aspartyl (chứa aspartyl trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A2, đƣợc tạo ra khi HIV-1 nhiễm vào tế bào vật chủ. Protease HIV-1 là một dimer, chứa hai tiểu phần giống hệt nhau đƣợc sắp xếp gần nhƣ theo kiểu đối xứng, mỗi tiểu phần có khối lƣợng khoảng 11 kDa gồm 99 axit amin. Mỗi tiểu phần tạo thành các phiến gấp nếp β và một đoạn xoắn α ngắn gần đầu C [47]. Trung tâm hoạt động của protease nằm tại mặt phân giới của dimer, chứa bộ ba Asp25-Thr26-Gly27. Trong đó, mỗi monomer đều có một bộ ba Asp-Thr-Gly với vị trí axit amin tƣơng ứng nhƣ sau: 25 (25’) - 26(26’) 27 (27’) và phân tử Asp cần thiết cho cả cấu trúc và hoạt tính xúc tác của protease [36]. Protease HIV-1 có cấu tạo gồm ba vùng chính: vùng dimer hóa, vùng lõi và vùng mũ. Trung tâm hoạt động Hình 3. Mô hình cấu trúc bậc hai của protease HIV-1 [47] Một tiểu phần bao gồm: βa(1-4); βb(9-15); βc(16-27); βd(30-35); βa’(43-49); βb’(52-56); βc’(69-78); βd’(83-85); Đoạn xoắn αh(86-94); chuỗi thẳng q(95-99) ở đầu C Vùng dimer hóa gồm các axit amin: Chuỗi βa(1-4), βq(95-99), và axit amin 24-29; Vùng lõi gồm các axit amin nằm ở 4 phần đầu sợi β : 10-32, 63-85, chứa trung tâm hoạt động Vùng mũ gồm các axit amin từ 33-43 và 63-85 bao quanh trung tâm hoạt động. 12 1.2.2. Chức năng của protease HIV – 1 Về mặt sinh học, protease HIV-1 có vai trò quan trọng trong chu trình nhân lên của HIV-1. Các chuỗi polyprotein (gag, gag-pol) là cơ chất đặc hiệu của protease HIV-1, các polyprotein này đƣợc protease HIV-1 cắt thành các protein cấu trúc và chức năng cần thiết cho virus hoàn chỉnh. Cụ thể, protease HIV-1 có thể nhận biết và cắt các liên kết khác nhau trên chuỗi polypeptide gag để tạo thành các protein cấu trúc: matrix P17 (MA), capsid p24 (CA), nucleocapsid p7 (NC) có vai trò quan trọng hình thành lớp capsid và các protein bao bọc lõi tạo virus hoàn chỉnh; protease HIV-1 còn thủy phân polypeptide gag-pol tạo thành ba enzym: protease, reverse transcriptase và integrase cần thiết cho sự sao chép của HIV trong quá trình lây nhiễm [25]. Ngoài ảnh hƣởng đến quá trình lây nhiễm, protease HIV-1 còn đóng vai trò quan trọng trong quá trình sinh bệnh. Khi đã xâm nhiễm vào tế bào ngƣời, protease HIV-1 không chỉ phân cắt các polypeptide của chính nó mà còn có thể thủy phân rất nhiều protein của vật chủ nhƣ actin, procaspase 8, Bcl2 (protein điều hòa chết theo chƣơng trình - apoptosis) [43]. Khi protease HIV-1 xuất hiện, gây độc và làm rối loạn các hoạt động trong tế bào vật chủ. Nhiều nghiên cứu cũng khẳng định, sử dụng các chất ức chế protease có thể ngăn chặn hiện tƣợng chết theo chƣơng trình do protease HIV-1 gây nên [43]. Nhƣ vậy, Protease HIV-1 có vai trò quan trọng không thể thiếu trong chu trình nhân lên của virus cũng nhƣ quá trình sinh bệnh ở ngƣời. Khi protease HIV-1 bị ức chế hoặc gen mã hóa protease HIV-1 bị đột biến, virus không thể đóng gói thành virion hoàn chỉnh nên không thể xâm nhiễm vào tế bào vật chủ [19]. Một trong những chất ức chế hoạt tính protease HIV-1 đƣợc biết đến đầu tiên là pepstatin A [45]. 1.2.3. Sơ lƣợc về nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trên thế giới Nguyên nhân mà cho đến nay chƣa sản xuất đƣợc vaccine HIV là do sự biến đổi liên tục của kháng nguyên HIV-1, vì thế mà những bệnh nhân nhiễm HIV-1 chỉ 13 còn cách dùng thuốc để duy trì sự sống. Các nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra các chất ức chế sự xâm nhiễm, lây lan của HIV-1. Protease HIV-1 là một trong các đích quan trọng nhất của liệu pháp điều chế thuốc ức chế HIV-1 vì protease HIV-1 có vai trò không thể thiếu trong chu trình sống của HIV-1. Do vậy, cần một lƣợng lớn protease HIV-1 trong quá trình nghiên cứu tìm ra và tổng hợp các chất ức chế, mà lƣợng protease HIV-1 trong virus HIV rất nhỏ nên việc tách chiết trực tiếp gần nhƣ không thể thực hiện. Ngoài ra, protease HIV-1 cắt cơ chất rất đặc hiệu nên việc dùng các protease khác làm mô hình cũng không có hiệu quả. Protease HIV-1 đã đƣợc nghiên cứu sản xuất dƣới dạng tái tổ hợp bằng cách biểu hiện trên vi khuẩn E. coli, trên nấm men S. cerevisiae hoặc bằng cách tổng hợp hóa học các monomer 99 axit amin. Vi khuẩn E. coli đƣợc sử dụng khá phổ biến trong nhiều nghiên cứu đầu tiên. Sau đó một số loại nấm men đã đƣợc chọn bởi một số ƣu thế so với vi khuẩn E. coli trong biểu hiện protease HIV-1. Năm 1989, một số nhà nghiên đã biểu hiện protease HIV-1 bằng việc sử dụng các vector pPRT và pHIVexpo15 có promoter trp trong vi khuẩn E. coli [18; 19]. Protease thu đƣợc sau khi tinh sạch đƣợc xác định khối lƣợng phân tử (KLPT) của một monomer khoảng 11kDa, bao gồm 99 axit amin, có hoạt tính phân cắt protein gag p55 thành p24 và p17 cũng nhƣ phân cắt cơ chất tổng hợp [19]. Tuy nhiên, protease HIV-1 biểu hiện thấp, chỉ chiếm 0,02% protein tổng số của tế bào, và băng protease chỉ phát hiện đƣợc bằng thẩm tách miễn dịch với kháng thể đặc hiệu. Đến năm 1990, Cheng và tập thể đã sử dụng hệ thống vector pET3AM với promoter T7 để biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 ở tế bào E. coli JM105 đồng nhiễm với phage αCE6 [15]. Tuy nhiên, với hệ thống biểu hiện này thì việc lây nhiễm phage vào tế bào vi khuẩn là bắt buộc mà sự có mặt của phage có thể không thích hợp cho quá trình lên men để sản xuất lớn [46]. Năm 1992, Rangwala và tập thể đã nghiên cứu các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình biểu hiện protease HIV-1 ở vi khuẩn E. coli. Nghiên cứu chỉ ra rằng, protease HIV-1 tái tổ hợp không thể biểu hiện một cách đơn giản nhƣ các protein tái tổ hợp khác ở vi khuẩn E. coli [41]. 14 Năm 1993, Leuthardt và Roesel nghiên cứu gắn thêm 3 gốc histidine (3xHIS) ở đầu N và đầu C của protease trong nhân dòng, biểu hiện và tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp bằng hệ thống vector pDS56/3H-3H trên E. coli. Việc gắn thêm 6 gốc HIS là một cải tiến tạo thuận lợi cho quá trình tinh sạch [31]. Kết quả của nghiên cứu cho thấy 90% protease HIV-1 sau biểu hiện đƣợc thu ở phân đoạn tủa của tế bào (pellet) và đƣợc hòa tan hiệu quả bằng đệm ly giải có guanidine 6M. Protease HIV-1 đã đƣợc nhiều nhóm nghiên cứu biểu hiện trên vi khuẩn E. coli bằng cách thiết kế các vector khác nhau. Tuy nhiên, các nghiên cứu này cũng cho thấy biểu hiện protease HIV-1 có hoạt tính là gây độc giết chết tế bào [18]. Các nhà nghiên cứu đƣa ra nhiều lý do giải thích, trong đó có dự đoán rằng protease HIV-1 có thể thủy phân các protein chức năng của tế bào vi khuẩn E. coli [18]. Nhằm tìm cách khắc phục tính độc này, một số nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu hiện protease HIV-1 bằng cách sử dụng các hệ thống và quy trình biểu hiện khác nhau nhƣ sử dụng các promoter trp, λPL, ara BAD và tac [19; 46]. Một số nghiên cứu đã tiến hành biểu hiện protease HIV-1 ở nấm men S. cerevisiae [39]. Pichuantes và tập thể (1989) đã biểu hiện thành công protease HIV-1 tái tổ hợp ở nấm men [39]. Protease tạo ra cũng có hoạt tính tự cắt khỏi dạng protein dung hợp để giải phóng protease HIV-1 99 axit amin cũng nhƣ có hoạt tính cắt cơ chất protein gag tự nhiên. Theo kết quả công bố của nhiều nhóm nghiên cứu về biểu hiện protease HIV-1 cho thấy rằng quá trình sản xuất protease này vẫn còn gặp nhiều khó khăn: Thứ nhất do protease HIV-1 có hoạt tính gây độc với tế bào chủ và chủ yếu đƣợc biểu hiện ở dạng không hòa tan (90% dạng thể vùi) [15; 31]; Thứ hai do hàm lƣợng protease này thu đƣợc chƣa cao, một số nghiên cứu chỉ có thể phát hiện đƣợc bằng phƣơng pháp thẩm tách miễn dịch [37]; Thứ ba là protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ có hoạt tính khi ở dạng dimer [19; 46]. Tuy rằng, một số nhà nghiên cứu đã đƣa plasmid pLysS hay pLysE vào tế bào E. coli để hạn chế tính độc và dung hợp protease với các protein khác nhằm làm tăng hiệu suất biểu hiện, tăng tính tan và thuận tiện cho tinh sạch cũng nhƣ đảm bảo hoạt tính [46]. 15 Trong những năm cuối thế kỉ 20, đầu thế kỉ 21, đã có nhiều công trình nghiên cứu về biểu hiện của protease HIV-1 tái tổ hợp mang những đột biến đặc hiệu nhằm làm sáng tỏ cơ chế kháng thuốc, ái lực của protease đột biến với cơ chất, hoặc nghiên cứu phân tích cấu trúc tinh thể của các dạng protease trong phức hợp nhằm tìm ra các chất PI mới có hiệu lực cao [50]. Từ năm 2012 đến nay, những nghiên cứu về protease HIV-1 vẫn đƣợc các nhà khoa học trên thế giới cũng nhƣ các trung tâm nghiên cứu rất quan tâm. Tuy nhiên, hƣớng nghiên cứu chủ yếu về sự khác biệt trong tính đặc hiệu của protease HIV-1 và protease HIV-2 [48]. Ngoài ra, một số nghiên cứu nhằm tìm hiểu các đột biến của gen mã hóa protease HIV-1 khiến HIV-1 có thể kháng đƣợc thuốc ức chế, từ đó tìm ra loại thuốc ức chế mới hiệu quả hơn [14] Nhƣ vậy, các nghiên cứu về protease HIV-1 chủ yếu đƣợc biểu hiện ở vi khuẩn E. coli. Trong khi, protease HIV-1 là protease của virus HIV-1 chỉ tạo ra ở tế bào sinh vật nhân chuẩn, cần có quá trình biến đổi sau dịch mã mà E. coli lại không thể đáp ứng đƣợc điều kiện này. Tuy đã có một số nghiên cứu trên thế giới đã biểu hiện thành công protease HIV-1 trên nấm men S. cerevisiae. Hiện tại chƣa có công bố nào về biểu hiện protease HIV-1 trên nấm men P. pastoris ở Việt Nam. 1.2.4. Thực trạng sản xuất protease HIV-1 ở Việt Nam Những nghiên cứu về các enzym của HIV-1 ở Việt Nam có thể kể đến các công trình nhƣ: Phan Trọng Hoàng và tập thể (2007) đã nhân dòng và biểu hiện đƣợc gen mã hóa tiểu đơn vị P66 của reverse transcriptase của HIV-1 ở E. coli để dùng cho các phản ứng tổng hợp cDNA từ RNA và tạo bộ kit chẩn đoán nhiễm retrovirus [1]; Đồng Văn Quyền và tập thể (2008), Bạch Thị Nhƣ Quỳnh và tập thể (2011) cũng đã biểu hiện thành công 3 gen mã hóa cho các kháng nguyên GP41, GP120 và P24 của HIV ở E. coli [7; 8]. Từ năm 2003, Việt Nam đã sử dụng thuốc ức chế protease (PI) nhập nội để điều trị cho bệnh nhân HIV/AIDS [49]. Việc tự sản xuất protease HIV-1 vẫn còn trong thời gian nghiên cứu và thử nghiệm. Các nghiên cứu chủ yếu nhằm phát hiện 16 HIV trong huyết thanh, xác định các nhóm virus HIV gây bệnh và các đột biến liên quan đến tính kháng thuốc, hoặc phát triển kit chẩn đoán HIV ở Việt Nam [3; 6; 9]. Nhằm thiết kế thuốc PI mới phù hợp với các chủng HIV lƣu hành tại Việt Nam, năm 2010, các nhà khoa học của Phòng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ Enzym và Protein, Khoa Sinh học, trƣờng ĐH Khoa học Tự nhiên, ĐH Quốc gia Hà Nội, do Giáo sƣ Phan Tuấn Nghĩa chỉ đạo, đã bắt tay vào nghiên cứu đề tài “Nghiên cứu protease virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV) phân lập tại Việt Nam”, nhằm mở ra khả năng tự sản xuất PI chống HIV ở Việt Nam. Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có tính hệ thống, bài bản về phân lập, nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 tái tổ hợp từ chủng CRF01-AE của Việt Nam trong E. coli [54]. Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc thu nhận từ bệnh nhân nhiễm HIV tại Việt Nam, tác giả đã biểu hiện thành công gen mã hóa protease HIV-1 trong E. coli bằng vector pET32a, xây dựng đƣợc quy trình tinh sạch protease HIV-1 tái tổ hợp chỉ với hai bƣớc và nghiên cứu một số tính chất của protease HIV-1 [3]. Trong nghiên cứu này, tác giả cũng đã cải tiến gắn vào đầu N trình tự tự cắt là 7 axit amin của protein gag-pol và đuôi 6xHIS tại đầu C của protease HIV-1. Với cải tiến này, protease HIV-1 sau tổng hợp sẽ là chuỗi polypeptide bắt đầu bằng axit amin Pro, và đuôi 6x HIS tạo thuận lợi cho quá trình tinh sạch. Tuy nhiên, E. coli là một sinh vật nhân sơ và thiếu các cơ quan nội bào chẳng hạn nhƣ mạng lƣới nội chất và bộ máy golgi nhƣ trong sinh vật nhân chuẩn. Cho đến nay, Ở Việt nam chƣa có nghiên cứu nào biểu hiện protease HIV-1 trong nấm men P. pastoris để có thể so sánh và chọn ra một hệ thống tối ƣu nhất trong ứng dụng sản xuất protease HIV-1 trong nƣớc. 1.3. GIỚI THIỆU CHUNG VỀ P. PASTORIS Tế bào nấm men đƣợc chọn là một giải pháp tốt cho việc biểu hiện protein của sinh vật nhân chuẩn với hƣớng ứng dụng vào sản xuất lớn. Có hai hệ thống biểu hiện nấm men là S. cerevisiae và P. pastoris. Trong đó, S. cerevisiae đã đƣợc nghiên cứu biểu hiện từ những năm 1980, hệ thống này có nhƣợc điểm nhƣ protein tạo ra có gắn đoạn oligosaccharide khá dài, từ 50-100 đƣờng manose [37]. Tuy mới đƣợc phát triển 17 gần đây, P. pastoris đã cho thấy tiềm năng lớn trong việc sản xuất protein. Cho đến nay, đã có nhiều nghiên cứu về biểu hiện protein trên hệ thống P. pastoris [52]. 1.3.1. Đặc điểm của P. pastoris Nấm men P. pastoris thuộc họ Saccharomycetaceae, có khả năng sử dụng methanol nhƣ nguồn dinh dƣỡng carbon chính. Tuy nhiên, nồng độ methanol không đƣợc quá nhiều và phải đƣợc điều khiển chặt chẽ để tránh tổn hại và gây độc đối với tế bào nấm men. P. pastoris là sinh vật nhân chuẩn nên có nhiều ƣu thế khi dùng để biểu hiện các protein của các sinh vật nhân chuẩn, ví dụ nhƣ có quá trình gấp xếp protein và quá trình cải biến sau dịch mã. P. pastoris sử dụng nguồn carbon nhƣ glucose, glycerol và methanol. Nguồn nitrogen sử dụng là nguồn hữu cơ và vô cơ nhƣ: peptone, casein, dịch chiết thịt (meat extract), dịch chiết nấm men (yeast extract) các muối ammonium muối nitrate,… Ngoài ra, nó còn sử dụng các chất khoáng nhƣ: Mn, Zn, P, S,… và các vitamin nhƣ vitamin B12,.. Vì P. pastoris là vi sinh vật hiếu khí, nên cần nguồn oxy để phát triển [23]. Đặc điểm sinh hóa di truyền, P. pastoris có promoter mạnh AOX (promoter alcohol oxidase), có thể sử dụng methanol nhƣ nguồn carbon, trong môi trƣờng không có glucose bằng cách oxy hóa methanol thành formaldehyde và hydrogen peroxide nhờ sự xúc tác của enzym alcohol oxydase (AOX) [21]. Sự biểu hiện của gen mã hóa enzym AOX theo một nguyên tắc chặt chẽ: khi nấm men phát triển trên glucose hoặc ethanol thì enzym alcohol oxydase ít đƣợc biểu hiện trong tế bào. Tuy nhiên, khi đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng chứa methanol thì enzym này chiếm khoảng 35% tổng protein tế bào. Có hai gen alcohol oxydase là AOX1 và AOX2, các vùng mã hóa protein của các gen này lớn tƣơng đƣơng nhau. Khi nấm men phát triển trên glycerol thì không có các phân tử RNA thông tin của cả hai gen xuất hiện. Promoter của AOX1 và AOX2 có cấu trúc tƣơng tự nhau và cùng một vùng ức chế để kháng lại sự biểu hiện gen [55]. AOX là một promoter mạnh và hoạt động rất chặt chẽ, nó sẽ cảm ứng và điều khiển việc sản xuất các protein ngoại [16]. 18 1.3.2. Ƣu điểm của hệ thống biểu hiện P. pastoris Hệ thống tế nấm men P. pastoris có hạn chế là cần thời gian biểu hiện dài (5-6 ngày), hàm lƣợng tiết protein không cao nhƣ ở E. coli nhƣng vì protease HIV-1 là một protease đƣợc tạo ra trong tế bào sinh vật nhân chuẩn nên chúng tôi chọn chủng tế bào nấm men P. pastoris với những ƣu điểm sau: Trƣớc hết, P. pastoris là một sinh vật nhân chuẩn, nên có thể cung cấp môi trƣờng thích hợp cho protein tái tổ hợp tiết và gấp cuộn cũng nhƣ thực hiện các cải biến sau dịch mã nhƣ tế bào động vật [41], đây là điều cần thiết để bảo đảm protease HIV-1 có hoạt tính. Đặc biệt, với hệ thống P. pastoris, khi protein đƣợc biểu hiện ra nếu gây độc đối với tế bào thì protein đó vẫn đƣợc duy trì sản xuất trong tế bào [16]. Ở hệ thống biểu hiện E. coli, vector mang gen mục tiêu dạng vòng sẽ đƣợc biến nạp vào tế bào vi khuẩn. Nhƣng trong hệ thống biểu hiện P. pastoris, vector biểu hiện mang gen mục tiêu đƣợc cắt bằng enzym giới hạn để tạo ra dạng thẳng và dung hợp vào bộ gen của nấm men P. pastoris theo con đƣờng tái tổ hợp tƣơng đồng tạo ra thể biến nạp ổn định [12]. Hơn nữa, P. pastoris có một promoter mạnh AOX1 (lƣợng protein tạo ra chiếm đến 30% tổng số protein tế bào). Thành phần môi trƣờng nôi cấy đơn giản, chất cảm ứng là methanol - rẻ tiền hơn so với chất cảm ứng của hệ thống biểu hiện E coli. Nhờ khả năng sử dụng methanol nhƣ nguồn carbon chính nên có thể hạn chế đƣợc sự nhiễm các loài vi sinh vật khác bởi sự có mặt nhiều methanol trong môi trƣờng nuôi cấy. Ƣu điểm tiếp theo, P. pastoris có thể phát triển với mật độ cao hơn nhiều lần so với S. cerevisiae [52]. P. pastoris có khả năng phát triển ở pH từ 3 tới 7, do đó có thể điều chỉnh pH để giảm thiểu tối đa hoạt động của protease đối với protein tiết ra [37]. Có thể biểu hiện protein với hàm lƣợng từ milligram tới gram cả trong nghiên cứu phòng thí nghiệm lẫn trong sản xuất quy mô công nghiệp [34]. Một ƣu điểm quan trọng nữa, vector biểu hiện pPIC9 có trình tự nhân tố α giúp protein mục tiêu đƣợc tiết ra ngoài môi trƣờng nên dễ thu nhận hơn so với các hệ thống biểu hiện khác, đồng thời các protein của bản thân loại nấm men này đƣợc tiết ra môi trƣờng ở mức độ thấp nên quá trình tinh sạch và thu nhận protease HIV-1 về sau dễ dàng hơn. 19 1.3.3. Chủng nấm men P. pastoris biểu hiện protease HIV-1 Phần lớn các chủng P. pastoris đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp đều bị gây đột biến gen HIS4 và đều có nguồn gốc từ chủng dại NRRL-Y 11430 (Northern Regional Research Laboratories, Peoria, IL). Những chủng đột biến gen HIS4 không có khả năng tổng hợp histidinol dehydrogenase. Nên để sinh trƣởng đƣợc trên môi trƣờng cơ bản thì cần bổ sung thêm histidine. Do vậy, có mặt gen HIS4- của P. pastoris đƣợc xem là một chỉ thị nhận biết chủng chứa vector biểu hiện sau biến nạp vì trên vector biểu hiện chứa gen HIS4 bình thƣờng. Xét về khả năng sinh trƣởng trên môi trƣờng methanol, các chủng P. pastoris có 3 kiểu hình là Mut+, Muts, Mut- [22; 38]. Chủng có kiểu hình Mut+ mang cả 2 gen AOX1 và AOX2 có khả năng sinh trƣởng mạnh trên môi trƣờng methanol nhƣ dạng kiểu dại và có khả năng biểu hiện protein tái tổ hợp tốt nhờ có promoter AOX1. Các chủng Mut- rất mẫn cảm với nồng độ methanol cao [38]. Do vậy, sự thay đổi đột ngột nồng độ methanol trong môi trƣờng nuôi cấy thƣờng dẫn đến mất hoạt tính enzym AOX và thậm chí có thể giết chết tế bào nếu nồng độ chất này quá cao [51]. Tuy nhiên, nồng độ methanol thấp quá có thể không đủ cảm ứng để bắt đầu phiên mã [21]. Còn chủng Muts không mẫn cảm với nồng độ methanol dƣ thừa cao bởi chủng này vẫn tiêu thụ methanol nhƣng tốc độ thấp. Có nhiều chủng P. pastoris có thể đƣợc sử dụng để biểu hiện một số loại protein tiết khác nhau (Bảng 1) [27]. Bảng 1. Một số chủng P. pastoris phổ biến đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tái tổ hợp [27] Chủng Kiểu gen Y-11430 Kiểu dại GS115 HIS4 GS190 ARG4 GS200 HIS4ARG4 SMD1168 ∆PEP4:URA HIS4 ura3 SMD1165 HIS4 PRB1 SMD1163 PEP4 HIS4 PRB1 20 Chủng nấm men P. pastoris SMD1168 đã đƣợc chúng tôi lựa chọn và sử dụng trong biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1. Ngoài gen HIS4-, P. pastoris SMD1168 còn có gen PEP4 đã bị đột biến ở dạng PEP4-, PEP4 là gen mã hóa cho carboxypeptidase A cần thiết cho sự kích hoạt các protease khác. Cụ thể, gen PEP4 mã hóa protease A trong không bào nấm men. Protease A cần thiết cho sự hoạt hóa các protease không bào khác nhƣ carboxypeptidase Y và protease B. Đột biến gen PEP4 sẽ làm giảm hoạt tính của protease A và carboxypeptidase Y và giảm mạnh hoạt tính của protease B. Nếu đột biến 2 gen PEP4 và PRB1 thì cả 3 protease sẽ giảm hoạt tính [22]. Chính vì vậy, khi gen PEP4 bị bất hoạt sẽ là lợi thế lớn trong việc hạn chế các protease vật chủ cắt protease ngoại lai trong quá trình biểu hiện. 1.3.4. Vector nhân dòng và biểu hiện ở P. pastoris Có 4 loại vector biểu hiện phổ biến ở P. pastoris là pHIL-D2, pPIC3.5, pHIL-S1 và pPIC9. Vector pHIL-D2 và pPIC3.5 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein nội bào, còn pHIL-S1 và pPIC9 đƣợc sử dụng để biểu hiện protein tiết ngoại bào [29]. Vector pPIC9 đƣợc chúng tôi sử dụng trong nghiên cứu này (hình 4). Đầu 5’ promoter AOX1: nucleotide base 1-948 Vị trí mồi 5’ AOX1: nucleotide 855-875 Tín hiệu tiết (nhân tố α) (S): nucleotide 949-1218 Vị trí mồi α: nucleotide 1152-1172 Vùng đa nối: nucleotide 1192-1241 Vị trí mồi đầu 3’ AOX1: nucleotide 1327-1347 Đoạn kết thúc phiên mã 3’AOX1 (TT): nucleotide 1253-1586 Khung đọc mở (ORF) HIS4: nucleotide 4514-1980 Đoạn 3’ AOX1: nucleotide 4870-5626 pBR322 origin: bases 6708-6034 Hình 4. Bản đồ vector biểu hiện pPIC9 [29] Gen kháng Ampicillin: nucleotide 713-6853 21 1.3.5. Cơ chế sát nhập gen ngoại lai vào hệ gen P. pastoris Để vector biểu hiện đƣợc tích hợp vào hệ gen P. pastoris, vector biểu hiện mang gen mục tiêu đƣợc cắt mở vòng bằng enzym giới hạn ở một vị trí đã đƣợc xác định trƣớc trên gen chỉ thị HIS4 hoặc trên đoạn promoter AOX1. Khi vector mở vòng sẽ tạo thành các đầu DNA tƣơng đồng kích thích sự tái tổ hợp của vector biểu hiện với hệ gen của nấm men, dẫn đến sự trao đổi chéo đơn và tích hợp vector vào locus tƣơng đồng [16]. Về lý thuyết khi plasmid đƣợc chuyển vào tế bào có thể xảy ra sự sát nhập vào bộ gen của tế bào theo hai phƣơng thức là chèn gen hoặc thay thế. Việc tích hợp đƣợc thực hiện bằng sự trao đổi chéo đơn giữa gen HIS4 trên vector và locus HIS4 của hệ gen P. pastoris nhờ sự mở vòng vector biểu hiện bằng enzym giới hạn (SalI hoặc StuI) cắt trình tự tƣơng ứng trên gen HIS4. Kết quả là promoter PAOX1 và gen mong muốn đƣợc tích hợp vào hệ gen của P. pastoris tại locus HIS4. Lúc này thể biến nạp có hiểu hình HIS4+. Kiểu hình Mut+ của chủng sau khi tái tổ hợp xảy ra không bị thay đổi so với ban đầu. Hình 5. Cơ chế trao đổi chéo xảy ra tại locus his4 giữa bộ gen của tế bào với vector biểu hiện [29] 22 1.3.6. Quá trình tiết protein ngoại bào ở P. pastoris Các protein sau khi đƣợc tổng hợp ra thƣờng trải qua quá trình biến đổi sau dịch mã. Trong quá trình này, các protein đƣợc hoàn thiện về mặt cấu trúc, hình thành các trung tâm hoạt động và tạo nên cấu trúc bền vững của protein. Các protein tạo ra sau quá trình chế biến có thể đƣợc giữ lại trong tế bào chất hoặc đƣợc tiết ra ngoài tế bào. Những protein đƣợc tiết ra ngoài tế bào gọi là protein ngoại bào. Ở P. pastoris, quá trình tiết của protein ngoại bào cũng đòi hỏi phải có một trình tự tiết gồm các acid amin đặc biệt hay còn gọi là tín hiệu dẫn ở đầu tận cùng N để giúp cho protein có thể đi qua màng tế bào [34]. Tùy thuộc vào tín hiệu dẫn khác nhau mà protein có thể đƣợc vận chuyển đến các bào quan khác nhau hoặc đƣợc tiết khỏi tế bào. Trình tự tiết cho protein ngoại lai đã đƣợc sử dụng rất có hiệu quả trong một số vector biểu hiện, nhờ đó mà một lƣợng lớn protein ngoại lai đã đƣợc tiết ra ở mức độ cao, ví dụ nhƣ tín hiệu dẫn α-MF prepro gồm khoảng 89 acid amin có nguồn gốc từ S. cerevisiae [32]. Tín hiệu này giúp protein đi qua màng của mạng lƣới nội chất dễ dàng. Trong khi chuyển vào lƣới nội chất, trình tự tiết α-MF prepro của protein sẽ đƣợc loại bỏ khỏi sản phẩm dịch mã sơ cấp và protein đƣợc tiết ra môi trƣờng là các protein hoàn chỉnh. Quá trình này đòi hỏi 3 loại enzym phân hủy protein là: (1) peptidase cắt 19 acid amin ở vùng pre; (2) endopeptidase đƣợc mã hóa bởi gen KEX2 sẽ cắt acid amin Lys và Arg ở đầu tận cùng C nối giữa α-MF prepro với protein ngoại lai; (3) enzym dipeptid amino peptidase, sản phẩm của gen STE13, sẽ loại bỏ gốc Glu-Ala từ đầu tận cùng N của protein ngoại lai. Đồng thời trong khi đi vào lƣới nội chất protein ngoại bào còn trải qua sự biến đổi khác nhƣ quá trình glycosyl hóa. Sau khi đƣợc chế biến trong mạng lƣới nội chất, protein sẽ đƣợc vận chuyển đến thể golgi, tại đây chúng sẽ đƣợc bao gói trong các túi tiết và dung hợp với màng tế bào để tiết ra ngoài [4]. 23 Chƣơng 2 - NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. NGUYÊN LIỆU 2.1.1. Chủng vi sinh vật - Chủng vi khuẩn E. coli DH5α và chủng nấm men P. pastoris SMD1168 của hãng Invitrogen. 2.1.2. Các hóa chất, nguyên liệu khác - Đoạn gen mã hóa protease HIV-1 trong vector nhân dòng pCR2.1 là kết quả của nghiên cứu của Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể, 2012. - Plasmid pPIC9 và kit nhân dòng trực tiếp sản phẩm PCR pCR2.1 TA cloning từ hãng Invitrogen: - Enzym giới hạn, nHOT Taq DNA polymerase, hỗn hợp dNTP và Kit PCR từ hãng Enzynomics - Thang chuẩn DNA và protein đƣợc mua từ hãng Fermentas. - Kit tách và tinh sạch plasmid từ vi khuẩn E. coli từ hãng Bioneer và Qiagen - Các hóa chất dùng trong phƣơng pháp nhiệt biến nạp vào E. coli - Thành phần các hóa chất trong điện biến nạp vào P. pastoris - Thành phần hóa chất dùng trong phƣơng pháp điện di SDS-PAGE - Thành phần các hóa chất dùng trong phƣơng pháp lai Western blot + Dung dịch chuyển màng + Phosphate buffer saline (PBS) 1lit – 10X Tất cả hòa tan trong 800ml nƣớc cất, sau đó thêm nƣớc dẫn đến thể tích 1lit + Tween PBS (0.1% Tween) + Dung dịch đệm Alkaline phosphatase (AP) + Dung dịch BCIP + Dung dịch NBT + Dung dịch hiện màu: 10ml dung dịch đệm Alkaline phosphatase + 66µl dung dịch NBT + 33µl dung dịch BCIP + Kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 của hãng gentex (Mỹ) 24 - Thành phần các loại môi trƣờng: + Thành phần môi trƣờng LB: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, nƣớc cất + Thành phần môi trƣờng LB rắn: 0.5% cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, 1.5% agar + Thành phần môi trƣờng BMGY: 1% cao nấm men, 2% peptone, 1.34% yeast nitrogen base, 4x10-5 biotin, 1% glycerol, pH 6.0 + Môi trƣờng MM: 10%YNB; 1% methanol; 1.10-5% biotin + Môi trƣờng MD: 1,34 % YNB; 4.10-5% biotin; 2% glucose Các hóa chất trên và một số hóa chất khác đều có độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử. - Dụng cụ: + Bộ pipetman 10, 20, 200, 1000 µl và đầu tip tƣơng ứng. Các ống eppendorf 0.2ml và 1.5ml, đĩa petri, que cấy, đèn cồn, bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon - Thiết bị Bộ điện di đứng (Biorad), máy chuyển màng khô (Biorad), máy ly tâm lạnh 5417 R (Eppendorf), máy PCR gradient của hãng Kyratec, thiết bị điện di ngang và hệ thống chụp ảnh điện di Geldox (Biorad), tủ an toàn sinh học cấp II (Labtech). 2.2. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.2.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng kỹ thuật PCR Nguyên lý phản ứng PCR: PCR là quá trình khuếch đại một đoạn trình tự DNA đặc hiệu in vitro do sự xúc tác của enzym DNA polymerase cùng với sự có mặt của mồi và nguyên liệu dNTPs. Sự khuếch đại này đƣợc thực hiện nhờ các chu trình nhiệt lặp lại (25-40 lần) gồm biến tính DNA tại 95oC (DNA sợi đôi thành sợi đơn), hạ nhiệt xuống 37– 65oC (mồi bắt cặp với sợi đơn tƣơng ứng) và kéo dài chuỗi ở khoảng 72oC (tổng hợp chuỗi DNA). Nhờ vậy, 1 phân tử DNA sợi đôi, sau n chu kỳ phản ứng, sẽ thành 2n phận tử. 25 Trong nghiên cứu này, để thuận lợi cho bƣớc chèn đoạn gen vào vị trí vùng tạo dòng cũng nhƣ biểu hiện gen nên mồi cho phản ứng PCR đƣợc thiết kế có thêm trình tự nhận biết của các enzym giới hạn và trình tự qui định các axit amin đặc hiệu (tag để sử dụng cho bƣớc tinh sạch). Ngoài ra, dựa theo một số nghiên cứu của các tác giả, trong qúa trình biểu hiện, protease HIV-1 sẽ cắt protein gag - pol tại những vị trí đặc hiệu và giải phóng ra dạng protease có hoạt tính [18; 46]. Hơn nữa, sự mở đầu bằng axit amin Prolin (P) tại đầu N của protease HIV-1 có vai trò rất quan trọng trong hình thành cấu trúc homodimer và quyết định hoạt tính của protease HIV-1. Một số nghiên cứu cũng đã biểu hiện protease HIV-1 thành công khi chèn thêm trình tự tự cắt của enzym tại đầu N [3]. Vì thế, chúng tôi kế thừa kết quả trƣớc, cũng chèn thêm trình tự tự cắt trên mồi. Trình tự tự cắt đƣợc chọn là 18 nucleotide TTCGTATCCTTTAACTTC mã hóa cho 6 axit amin FVSFNF ở đầu C của protein gag. Khi protease đƣợc tạo ra nếu có hoạt tính tự cắt thì sẽ giải phóng ra dạng protease mở đầu bằng Pro. Trình tự các mồi cũng nhƣ mục đích sử dụng trong nghiên cứu đƣợc trình bày ở bảng 2. Bảng 2. Các cặp mồi sử dụng trong phản ứng PCR Tên Trình tự Mục đích Cặp Prot-F1 5’GACTGAATTCGTATCCTTTAACTTC mồi 1 (44 bp) CCTCAGATCACTCTTTGGC-3’ (EcoRI) Nhân bản gen mã hóa (Thiết Prot-R1 5’GGATGCGGCCGCCTAAGCGTAATC protease từ TGGAACATCGTATGGGTAAAAATTTA plasmid pCR2.1 kế) (64 bp) Cặp HIV-1 Prot-F1 mồi 2 AA GTGCAGCCAATC-3’(NotI) 5’GACTGAATTCGTATCCTTTAACTTC Nhân bản gen mã hóa CCTCAGATCACTCTTTGGC-3’ (EcoRI) protease (44 bp) AOX1-R 5’GCAAATGGCATTCTGACATCC3’ Cặp AOX1-F 5’GACTGGTTCCAATTGACAAC 3’ mồi 3 (20 bp) [29] AOX1-R HIV-1 từ khuẩn lạc E. coli tái tổ hợp Nhân bản gen mã hóa protease 5’GCAAATGGCATTCTGACATCC3’ HIV-1 khuẩn lạc P. pastoris SMD1168 tái tổ hợp (21 bp) 26 từ - Thành phần của một phản ứng 25 µl PCR (bảng 3) Bảng 3. Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Đệm nHOT Taq DNA polymerase 10X 2,5 dNTPs 2 mM 2,5 Mồi xuôi 1 Mồi ngƣợc 1 DNA khuôn (15 ng/µl) 1 nHOT-Taq DNA polymerase 1 Nƣớc khử ion khử trùng 16 Tổng 25 - Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR nhân bản gen mã hóa protease HIV-1 từ plasmid pCR2.1: - 94oC – 4 phút - 95oC – 30 giây - 50 - 57oC – 1 phút - 72oC – 30 giây - 72oC – 7 phút - Giữ ở 4oC 35 chu kỳ Sản phẩm của phản ứng PCR sau đó đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% 1,2%. Sau khi kiểm tra sự nhân lên đặc hiệu đoạn gen với kích thƣớc mong muốn, sản phẩm PCR đƣợc tinh sạch sử dụng Kit tinh sạch PCR của Bioneer. 2.2.2. Điện di DNA trên gel agarose Nguyên lý điện di DNA Các phân tử DNA (tích điện âm) dƣới tác dụng của điện trƣờng sẽ di chuyển trong gel từ cực âm sang cực dƣơng. Tốc độ di chuyển trên mạng lƣới gel trong điện trƣờng của DNA phụ thuộc vào kích thƣớc, điện tích, mức độ cuộn xoắn, cấu trúc phân tử. Đoạn DNA có kích thƣớc lớn sẽ di chuyển chậm hơn đoạn DNA có 27 kích thƣớc nhỏ hơn và sẽ tách biệt nhau trong quá trình chạy. Quy trình điện di: - Chuẩn bị gel agarose 1%: hòa tan 1 gram agarose vào 100ml dung dịch TBE 1X, đun sôi cho dung dịch tan hoàn toàn. Để nhiệt độ xuống khoảng 50 – 600 C, đổ dung dịch agarose vào khay điện di, cài lƣợc thích hợp. Sau 20- 40 phút, khi gel đã đông cứng, gỡ lƣợc ra và đặt vào bể điện di, đổ đệm TBE 1X ngập gel, cách mặt gel khoảng 0,5 cm. - Mẫu DNA đƣợc trộn với loading dye (đã pha với ethidium bromide) theo tỷ lệ mẫu và loading dye là 5:1, mẫu đƣợc tra vào các giếng trên gel. Chạy điện di với hiệu điện thế thích hợp ở 100 V trong 30 phút. - Quan sát và chụp ảnh trên máy Bio- Rad với tia UV có bƣớc sóng 320nm. 2.2.3. Gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện 2.2.3.1. Cắt mở vòng vector và sản phẩm PCR bằng enzym giới hạn Sản phẩm PCR sau khi đƣợc kiểm tra sự nhân lên chính xác sẽ đƣợc xử lý với cặp enzym giới hạn có trình tự cắt đặc hiệu đã thiết kế trên cặp mồi số 1 (Bảng 2) để tạo các đầu tƣơng thích ở hai đầu đoạn gen. Đồng thời vector biểu hiện pPIC9 đƣợc xử lý cùng bằng cặp enzym giới hạn với sản phẩm PCR để tạo đầu tƣơng thích tƣơng ứng và cố định chiều của đoạn DNA đƣa vào vector biểu hiện. Thành phần phản ứng cắt bằng enzym giới hạn với 20 µl tổng thể tích (bảng 4). Bảng 4. Thành phần phản ứng cắt enzym giới hạn Thành phần EcoRI NotI SalI DNA (2 µg/ µl) 5 µl 5 µl 5µl Đệm của enzym 10X 2 µl 2 µl 2µl BSA 10X 0 µl 2 µl 0µl Enzym (RE) 0,5 µl 1 µl 0,5µl H2O 12,5 µl 10 µl 12,5µl Tổng 20 µl 20 µl 20 µl 28 Hỗn hợp phản ứng đƣợc vortex và ly tâm nhẹ rồi ủ ở 37 oC trong 2 giờ hoặc qua đêm, sau đó đƣợc kiểm tra trên gel agarose. 2.2.3.2. Tinh sạch sản phẩm cắt enzym giới hạn bằng kít thôi gel của Bioneer Sau khi cắt bằng enzym giới hạn, đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện đang ở dạng mạch hở đƣợc tinh sạch bằng kit thôi gel của Bioneer nhằm loại bỏ các trình tự DNA không mong muốn và tăng nồng độ, chuẩn bị cho phản ứng gắn. Theo qui trình của Bioneer, trƣớc tiên sản phẩm cắt enzym giới hạn đƣợc chạy trên gel agarose 1% để phân tách các băng. Sau đó bản gel đƣợc quan sát dƣới ánh sáng UV, phần gel chứa đoạn DNA với kích thƣớc phù hợp với đoạn gen mã hóa protease HIV-1 (khoảng 360 bp) và vector biểu hiện dạng mạch hở đƣợc cắt và chuyển vào ống eppedorf 2 ml. Bổ sung năm lần thể tích của đệm GB (Gel Binding Buffer) vào một thể tích của miếng gel đã cắt. Hỗn hợp đệm và gel đƣợc ủ ở 60oC trong bể ổn nhiệt khoảng 10 phút để tan hết gel. Sau đó hỗn hợp đƣợc đƣa lên cột thôi gel, cột này sau đó đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút, 4 oC. Phần dịch dƣới cột bị đổ bỏ và cột đƣợc rửa 2 lần bằng 500 µl đệm rửa WB (Washing buffer), kèm theo ly tâm mỗi lần với cùng điều kiện. DNA gắn trên cột đƣợc thu lại bằng cách bổ sung 30-50 µl đệm EB (Elution Buffer). Sau khi ủ ở nhiệt độ phòng khoảng 15 phút, cột đƣợc ly tâm ở tốc độ 13.000 vòng/phút trong 1 phút, nhiệt độ phòng. DNA trong dịch sau ly tâm đƣợc giữ ở -20oC cho đến khi đƣợc dùng. 2.2.3.3. Gắn gen mã hóa protease HIV-1 vào vector biểu hiện Đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector biểu hiện sẽ đƣợc gắn với nhau sau khi đã tinh sạch, việc gắn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 và vector nhờ sự hoạt động của enzym nối T4 DNA ligase. Phản ứng nối ghép đƣợc tiến hành với tổng thể tích phản ứng là 10 µl, thành phần phản ứng nhƣ sau: 2 µl vector; 6 µl sản phẩm PCR; 1µl đệm T4 DNA ligase 10X; 1 µl T4 DNA ligase Hỗn hợp phản ứng đƣợc ủ ở 4oC qua đêm và đƣợc biến nạp vào tế bào khả biến E. coli chủng DH5α ngay sau đó. 29 2.2.3.4. Biến nạp vector bằng phương pháp sốc nhiệt Năm 1928, Griffith phát hiện hiện tƣợng biến nạp (transformation) ở vi khuẩn Diplococus pneumoniae (nay gọi là Streptococus pneumoniae). Năm 1944, T.Avery, Mc Leod và Mc Carty đã xác định rõ DNA là tác nhân chuyển thông tin di truyền trong quá trình biến nạp [2]. Nguyên lý: Tế bào E. coli khi đƣợc xử lý bằng các cation nhƣ calcium, magnesium, rubidium hay hexamine cobalt sẽ bị thay đổi tính thấm của màng, do đó sẽ cho phép DNA đi vào tế bào vi khuẩn E. coli. Việc xử lý các cation cho phép làm trung hòa điện tích âm của màng ngoài tế bào, cho phép DNA cũng tích điện tích âm đi xuyên qua lớp vỏ tế bào để đi vào bên trong. Tế bào sau khi bổ sung DNA đƣợc đặt trên đá để làm ổn định sự tƣơng tác giữa ion Ca2+ và các cấu trúc tích điện âm của màng DNA. Hỗn hợp này sau đó đƣợc đƣa vào bể ổn nhiệt 42oC trong khoảng thời gian rất ngắn để làm thay đổi tính lƣu động của trạng thái bán tinh thể của màng tế bào, qua đó cho phép các phân tử DNA đi vào trong tế bào qua các kênh vận chuyển. Các bước thực hiện: Trƣớc tiên, cần chuẩn bị sẵn tế bào khả biến E. coli chủng DH5α và bảo quản ở -800C. Các tế bào khả biến này đƣợc lấy ra để trên đá 10 phút cho tan dần. Hỗn hợp phản ứng gắn DNA đƣợc bổ sung vào, trộn đều và để lại ngay trên đá trong 20 - 30 phút, tạo điều kiện cho vector bám lên thành tế bào, sau đó hỗn hợp đƣợc sốc nhiệt ở 42oC trong 45 giây và đƣợc chuyển ngay lên đá 2 phút để ổn định tế bào. Bổ sung 300-500 µl môi trƣờng LB lỏng vào hỗn hợp biến nạp. Mẫu sau đó đƣợc giữ trong tủ ấm 37oC trong 10 phút và lắc ở tốc độ 150 vòng/phút, 37oC trong 50 phút. 100 µl hỗn hợp biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa petri LB đặc có bổ sung kháng sinh ampicllin nồng độ 100 µg/ml và nuôi trong tủ ấm 37oC qua đêm. 2.2.4. Tách chiết và định lƣợng DNA plasmid Trong nghiên cứu này, DNA plasmid đƣợc tinh sạch theo công thức của Birnboim & Doly (1979), sử dụng 3 loại đệm: đệm Bib-Do 1 (25 mM Tris pH 8, 10 30 mM EDTA, 50 mM Glucose); đệm Bib-Do 2 (0.2 N NaOH, 1 % SDS) và đệm BibDo 3 (3 M potassium acetate, 11.5 % axit acetic pH 5.2). Quy trình thực hiện như sau: Khuẩn lạc (E. coli) đƣợc cấy vào 4 ml LB lỏng có bổ sung Amp 100 g/ml và đƣợc nuôi lắc ở 37oC khoảng 200 vòng/phút trong 14-16 giờ. Dịch nuôi cấy đƣợc ly tâm với tốc độ 5.000 vòng/phút trong 10 phút, 4 oC để thu tế bào. Sau khi loại bỏ hoàn toàn dịch nổi, cặn tế bào đƣợc hoà trở lại trong 200 l đệm Bib-Do 1 đã đƣợc làm lạnh, trộn đều bằng vortex, ủ ở nhiệt độ thƣờng 10 phút. Tiếp đó 400 l đệm Bib-Do 2 đƣợc bổ sung vào hỗn hợp trên, đảo nhẹ 4 - 6 lần và đặt ở trên đá 5 phút để phá vỡ tế bào giải phóng plasmid. Hỗn hợp đƣợc trung hoà bằng 300 l đệm Bib-Do 3 đã đƣợc làm lạnh, đảo nhẹ 4 - 6 lần, đặt trên đá 10 phút. Dịch nổi đƣợc thu lại bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC và chuyển nhẹ nhàng 750 µl dịch nổi sang ống eppendorf mới. Bổ sung 12 ul dung dịch RNase (1 mg/ml) vào và ủ ở 37oC khoảng 30 phút. Bổ sung 750 µl dung dịch Phenol-ChloroformIsoamy-alcohol (25:24:1). Hỗn hợp đƣợc vortex trong 15 giây và phân tách bằng ly tâm 13.000 vòng/phút trong 15 phút, 4oC. Chuyển nhẹ nhàng 750 µl dịch ở trên sang ống eppendorf mới, 750 µl thể tích isopropanol đƣợc thêm vào, ủ ở - 20oC. Sau đó tiến hành ly tâm 13.000 vòng/phút trong 10 phút, 4oC để kết tủa DNA. Sau đó, DNA đƣợc rửa bằng cồn 70% và làm khô bằng cách mở nắp ống qua đêm. Sau đó, DNA đƣợc hòa tan bằng 40-50 µl nƣớc cất khử ion hoặc đệm TE. DNA plasmid sau tách và tinh sạch đƣợc định lƣợng bằng đo độ hấp thụ ánh sáng tử ngoại ở bƣớc sóng 260nm (A260) bằng cách sử dụng Nanodrop. DNA plasmid đƣợc cho là sạch khi giá trị (A260/A280) nằm trong khoảng 1,8 – 2,0. 2.2.5. Giải trình tự các đoạn gen mã hóa protease HIV-1 Nguyên tắc: Xác định trình tự gen dựa theo phƣơng pháp kết thúc bằng đầu tận cùng chứa dideoxynucleotide (ddNTP). Khi các ddNTP đƣợc gắn vào chuỗi DNA đang tổng hợp thì chúng sẽ làm cho quá trình kéo dài chuỗi bị ngừng lại vì các nucleotide chứa 3’- OH đã bị thay bằng ddNTP chứa 3’- H. Do vậy, từ một đoạn DNA ban đầu, nhiều đoạn sợi đơn mới đƣợc đánh dấu ở một đầu tận cùng 31 bằng ddNTP sẽ đƣợc tổng hợp và các đoạn này có độ dài khác biệt nhau chỉ một nucleotide. Các đoạn sợi đơn mới tổng hợp đƣợc phân tách trên gel điện di acryamide dạng mao quản. Máy đọc trình tự sẽ tự động phân tích các kết quả để đƣa ra trình tự đoạn DNA gốc [42]. Nhằm kiểm tra sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 trong vector biểu hiện pPIC9, chúng tôi đã gửi mẫu đi giải trình tự tại Hàn Quốc. 2.2.6. Biến nạp vector vào nấm men bằng phƣơng pháp xung điện Kỹ thuật xung điện (electroporation) là một phƣơng pháp cơ học đƣợc sử dụng để đƣa các phân tử phân cực vào trong tế bào chủ qua màng tế bào. Kỹ thuật này cũng dựa trên cơ sở biến nạp, nhƣng yếu tố tác động đến tế bào nhận là xung điện. Trong phƣơng pháp này, một xung điện cao thế trong khoảnh khắc (vài phần nghìn giây) có khả năng làm rối loạn cấu trúc màng kép phospholipid, tạo ra các lỗ thủng tạm thời cho phép các phân tử DNA ngoại lai từ môi trƣờng xâm nhập vào bên trong tế bào. Khi các ion đã nạp điện và các phân tử đi qua các lỗ, màng tế bào phóng điện và các lỗ này đóng lại một cách nhanh chóng, màng phospolipid kép phục hồi lại cấu trúc cũ. Lúc này các phân tử mong muốn đã ở trong tế bào và chúng đƣợc sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo [35]. Trong nội dung nghiên cứu này, phƣơng pháp biến nạp bằng kỹ thuật xung điện đƣợc dùng nhằm chuyển vector tái tổ hợp vào nấm men P. pastoris. Các bước thực hiện như sau: + Chuẩn bị môi trƣờng nấm men BMGY, nuôi lắc cho đến khi OD 600 đạt đến khoảng giá trị 1,2 – 1,6. Dịch môi trƣờng đƣợc ly tâm ở 1500 vòng/phút ở 40C trong 5 phút, loại bỏ dịch nổi và rửa tủa 2 lần bằng nƣớc cất đang bảo quản trên đá lạnh. Sau khi ly tâm, tủa đƣợc giữ lại và hòa tan bằng sorbitol 1M lạnh, sau khi tủa tan hoàn toàn, tiếp tục ly tâm để loại dịch nổi. Dùng một lƣợng 100-200 µl sorbitol 1 M lạnh bổ sung vào để hòa tan tủa thu đƣợc, bảo quản tế bào nấm men này trên đá chuẩn bị cho biến nạp. + Các plasmid tái tổ hợp của các cấu trúc đã đƣợc chuẩn bị ở bƣớc tách chiết DNA plasmid và mở vòng bằng enzym Sal I, giới hạn thể tích cuối cùng ở 10 µl. 32 + Lấy 50 µl dịch chứa tế bào nấm men đã chuẩn bị ở trên chuyển vào ống eppendorf chứa plasmid tái tổ hợp. Chuyển hỗn hợp trên vào cuvet + Lần lƣợt đƣa cuvet chứa cấu trúc vào máy xung điện. Mỗi cuvet đƣợc xung điện trong khoảng 4 giây, theo các điều kiện do nhà sản xuất. + Bổ sung 500 µl sorbitol 1 M vào cuvet ngay sau khi phản ứng xung điện kết thúc. Chuẩn bị các đĩa petri để cấy trải sản phẩm biến nạp, sau đó nuôi trong tủ ấm 370C, khoảng 3 - 5 ngày. 2.2.7. Điện di protein trên gel polyacyamide (SDS-PAGE) Nguyên tắc: Các tiểu phần protein đƣợc xác định dựa vào tốc độ di chuyển khác nhau của các tiểu phần protein trong điện trƣờng. Gel polyacryamide gồm 2 lớp: lớp gel tách 15% và lớp gel cô 4%. Ở một số điều kiện nhất định, protein ở dạng ion và có mức độ ion hóa khác nhau, nên có thể tách riêng biệt chúng theo khả năng di động trong trƣờng điện từ về hai cực âm (-) và dƣơng (+). Kết quả nhận đƣợc phổ các vạch protein khác nhau. Phƣơng pháp điện di protein trên gel polyacrylamide có chứa SDS đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp của Laemmli (1970) [30]. Thành phần gel đƣợc trình bày ở bảng sau: Bảng 5. Thành phần gel tách và gel cô trong SDS-PAGE [30] Thành phần Gel tách 15% Gel cô 4% Dung dich acryamide 30% 1,95 ml 0,16 ml 4x Tris HCL/SDS pH 8,8 0,94ml 4x Tris HCL/SDS pH 6,8 0,31 ml Nƣớc cất 0,94ml 0,76 ml APS 10% 30µl 20µl TEMED 7µl 5 µl Quy trình điện di nhƣ sau: - Chuẩn bị bản gel theo thành phần ở trên 33 - Pha mẫu với Protein Sample Buffer 4X theo tỷ lệ 3:1 và biến tính mẫu ở 950C trong 5 phút và làm lạnh ngay trên đá. Dùng 12 µl mẫu tra vào từng giếng và tiến hành điện di trên gel polyacrylamide - Chuẩn bị dung dịch đệm chạy (Running buffer) SDS- PAGE 1X và chạy điện di với hiệu điện thế ổn định. Theo dõi đến khi thấy vạch màu chỉ thị của dung dịch đệm mẫu cách đáy bản gel 0,5-1cm thì kết thúc. - Bản gel đƣợc nhuộm trong dung dịch nhuộm CBB 0,5% (Coomassie Brilliant Blue) trong khoảng từ 30 phút đến 1 giờ. - Tẩy gel bằng cách ngâm bản gel đã nhuộm vào dung dịch tẩy (acid acetic 7%, metanol 20%) đến khi bản gel màu trắng thì kết thúc quá trình tẩy. Thời gian tẩy khoảng 30 phút. Sau đó gel đƣợc bảo quản và chụp ảnh. 2.2.8. Thẩm tách miễn dịch (Western Blotting) - Khái niệm: Western Blotting là kỹ thuật lai giữa protein với protein (giữa kháng nguyên với kháng thể), protein kháng nguyên đƣợc phát hiện qua phản ứng tạo màu hoặc phát huỳnh quang bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzym hoạt hóa phản ứng. - Nguyên tắc: Kỹ thuật Western Blotting đƣợc tiến hành dựa trên sự tƣơng tác đặc hiệu giữa protease (kháng nguyên) và kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1 (thƣơng mại) làm kháng thể sơ cấp, sau đó phức hợp protease HIV-1 và kháng thể tƣơng ứng này lại đƣợc nhận ra bởi kháng thể thứ cấp có gắn enzym phosphatase kiềm Alkaline phosphatase (AP), và cuối cùng phức hợp protease HIV -1 gắn kháng thể sơ cấp và kháng thể thứ cấp đƣợc phát hiện bằng cách cho hỗn hợp này ủ với dung dịch cơ chất NBT và BCIP, enzym gắn trên kháng thể thứ cấp biến đổi cơ chất NBT và BCIP từ không màu thành sản phẩm có màu dễ dàng nhận ra bằng mắt thƣờng [5]. - Các bƣớc cơ bản của phƣơng pháp Western Blotting [5] + Tách protein tổng số, xử lý protein thành cấu trúc bậc 1 bằng cách trộn với đệm biến tính protein và nhiệt độ cao. + Điện di protein trên gel SDS polyacrylamide 34 + Chuyển gel sang màng lai bằng phƣơng pháp thẩm thấu, điện chuyển trong đệm Tris-Glycine có 10% methanol. Trong khi chuyển màng thì vị trí các băng protein đƣợc giữ nguyên. + Xử lý màng lai bằng dung dịch BSA 3% trong đệm PBS pH 7,4 bằng cách lắc nhẹ trong 30 phút đến 1 giờ ở nhiệt độ phòng, hoặc để qua đêm ở 4oC, bƣớc này nhằm lấp đầy khoảng trống trong màng lai nhằm ngăn cản protein lạ bám vào màng lai. Lƣợng BSA thừa sẽ đƣợc rửa 3 lần với đệm PBS 1X có pH 7,4, đã đƣợc bổ sung Tween 80 0,1%. Mỗi lần bổ sung PBS vào màng, lắc nhẹ trong 15 phút. + Lai: màng lai đƣợc lai với kháng thể sơ cấp (mẫu dò 1), mẫu dò dùng lai là kháng thể của protein cần phát hiện (kháng nguyên), trong nghiên cứu này mẫu dò 1 là kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1. + Rửa màng lai 3 lần với PBS 1X có pH 7,4, đã đƣợc bổ sung Tween 80 0,1% để loại bỏ mẫu dò 1 không lai và lai tiếp với kháng thể thứ cấp trên chuột có gắn phosphatase kiềm phân hủy cơ chất tạo màu. Kháng thể thứ cấp là kháng thể kháng với kháng thể sơ cấp. + Phát hiện vị trí lai: rửa loại bỏ kháng thể sơ cấp bằng PBS 1X có pH 7,4, đã đƣợc bổ sung Tween 80 0,1%, lặp lại 3 lần giống rửa kháng thể sơ cấp. + Ủ màng với đệm AP 1X và lắc nhẹ trong 10 phút + Hiện màu các băng protein bằng cách ủ màng trong dung dịch cơ chất NBT và BCIP pha trong đệm AP đến khi nhìn thấy băng. Dung dịch này đƣợc pha nhƣ sau 10ml AP 1X có 66 µl NBT/50 µg/ µl và 33 µl BCIP/ µg/ µl. 2.2.9. Phƣơng pháp biểu hiện và thu nhận protein Các chủng nấm men P. Pastoris SMD1168 nuôi cấy trên đĩa MD, sau khi khẳng định sự có mặt của vector tái tổ hợp pPIC9-Prot và pPIC9 trong hệ gen của nấm men bằng PCR. Chúng tôi chuyển các chủng P. pastoris SMD1168 mang plasmid pPIC9 và pPIC9-Prot sang môi trƣờng BMGY và nuôi cấy song song đến OD600 đạt khoảng 6 -7. Sau đó, các chủng SMD1168 này đƣợc chuyển sang môi trƣờng MM có methanol 0,5%. Methanol đƣợc thêm vào sau mỗi 24 giờ nuôi cấy 35 để cảm ứng biểu hiện protease HIV-1. Điều kiện nuôi lắc là nhiệt độ 30oC, trong 100 giờ ở tốc độ lắc 200 vòng/phút. Dịch môi trƣờng nuôi cấy đƣợc thu nhận ở các thời điểm 24 h, 48 h, 72 h và 96 h trƣớc mỗi lần bổ sung methanol. Sau khi thu dịch môi trƣờng, chúng tôi tiến hành ly tâm ở 5000 vòng / 1 phút để loại tế bào rồi chuyển dịch môi trƣờng sang ống mới. Dịch môi trƣờng đƣợc tủa bằng cách thêm vào 5 ml ethanol nồng độ 100% rồi ly tâm ở 7000 vòng/phút trong 3 phút để thu dịch tủa. Sau khi loại dịch nổi và để khô tủa bằng cách để bay hơi ethanol (ống mở nắp qua đêm), chúng tôi sử dụng đệm tra mẫu (chứa SDS, urea) để hồi tính và hòa tủa rồi chạy điện di trên gel acrylamide (SDS-PAGE). 36 Chƣơng 3 - KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. NHÂN DÒNG ĐOẠN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 3.1.1. Nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR Dựa vào trình tự đã biết của đoạn gen mã hóa protease HIV-1, chúng tôi đã thiết kế cặp mồi (bảng 2) để sử dụng cho quá trình nhân bản đoạn gen này bằng phản ứng PCR. Sản phẩm PCR dự kiến là một đoạn DNA có kích thƣớc 364 bp với các thành phần là: (EcoRI)_ TT tự cắt_ gen mã hóa protease HIV-1 _ TT mã hóa HA_(NotI), gọi tắt là cấu trúc Prot có trình tự theo lý thuyết nhƣ sau: 5’GACTGAATTCGTATCCTTTAACTTCCCTCAGATCACTCTTTGGCAACGACC CCTTGTCACAATAAAAATAGAAGGACAGCTGAAAGAAGCTCTATTAGATACAG GAGCAGATGATACAGTATTAGAAGATATAAATTTGCCAGGAAAATGGAAACC AAAAATGATAGGGGGAATTGGAGGTTTTATCAAGGTAAGGCAATATGATCAG ATACTTATAGAAATTTGTGGAAAAAAGGCTATAGGTACAGTGCTAGTAGGACC TACACCGATCAACATAATTGGACGAAATATGTTGACTCAGATTGGCTGCACTTT AAATTTTTACCCATACGATGTTCCAGATTACGCTTAGGCGGCCGCGGAT-3’ Cấu trúc Prot theo lý thuyết có các thành phần cụ thể: - Đầu tiên từ đầu 5’: Là vị trí nhận biết của enzym giới hạn EcoR I (trình tự đã bôi đen). - Thứ hai là trình tự tự cắt: bao gồm 6 codon mã hóa cho 6 axit amin lần lƣợt là: ProlinValin- Serin- Phenylalanin- Asparagin- Phenylalanin (trình tự đã đƣợc gạch chân). - Thứ ba là gen mã hóa protease HIV-1 có chiều dài 297 nucleotide mã hóa cho một monomer bao gồm 99 axit amin. Trong trình tự gen mã hóa protease HIV-1 có trình tự mã hóa cho vị trí cắt của tín hiệu tiết trong nấm men (trình tự đƣợc in đậm nghiêng). - Thứ tƣ là trình tự mã hóa cho một đoạn peptide là epitope của kháng nguyên vỏ hemagglutinin (HA - phần trình tự in nghiêng đầu 3'). Trình tự này có ý nghĩa trong công đoạn tinh sạch protease HIV-1. - Cuối cùng là trình tự nhận biết của enzym giới hạn NotI (trình tự bôi đen ở đầu 3’). 37 Vector nhân dòng pCR21 mang gen [3] đƣợc dùng làm khuôn cho phản ứng PCR gồm 35 chu kỳ phản ứng: 950C - 30 giây để biến tính DNA, 530C - 1 phút cho gắn mồi và 720C - 30 giây để kéo dài chuỗi. Ngoài ra, để xác định khoảng nhiệt độ gắn mồi tối ƣu, chúng tôi đã tiến hành nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR với các chu trình nhiệt khác nhau ở nhiệt độ gắn mồi. Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 1% để kiểm tra sự nhân lên đặc hiệu của cặp mồi với đoạn gen (Hình 6). Hình 6. Kết quả nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng PCR Giếng 1: Thang chuẩn DNA 100 bp Giếng 2: Sản phẩm PCR cấu trúc Prot với nhiệt độ gắn mồi: 500C Giếng 3: Sản phẩm PCR cấu trúc Prot với nhiệt độ gắn mồi: 530 C Giếng 4: Sản phẩm PCR cấu trúc Prot với nhiệt độ gắn mồi: 570 C. Theo kết quả điện di sản phẩm PCR cho thấy, cặp mồi chúng tôi thiết kế đã nhân bản đƣợc đoạn DNA có băng kích thƣớc khoảng 360 bp. Theo kết quả tính toán trên lý thuyết, đoạn DNA đƣợc nhân lên sẽ có kích thƣớc khoảng 364 bp phù hợp với kết quả điện di sản phẩm PCR (Hình 6). Ngoài ra, ở ba mức nhiệt gắn mồi 50oC, 53oC và 57oC, sản phẩm PCR nhân bản đoạn gen mã hóa protease HIV-1 đều 38 cho băng rõ ràng, sáng nét và ở cùng kích thƣớc phù hợp với lý thuyết. Tuy nhiên, ở mức nhiệt 50oC và 53oC, hiệu quả gắn mồi với đoạn gen cao hơn ở mức nhiệt 57 oC. Dựa vào kết quả này, chúng tôi đã xác định đƣợc khoảng nhiệt độ thích hợp cho cặp mồi đƣợc thiết kế trong việc nhân bản đoạn gen nghiên cứu là 50 - 53oC. 3.1.2. Tinh sạch plasmid pPIC9 từ E. coli Để chuẩn bị cho công đoạn tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1. Chúng tôi đã tiến hành biến nạp plasmid pPIC9 vào tế bào khả biến E. coli DH5α bằng sốc nhiệt, sau đó cấy trải sản phẩm biến nạp trên đĩa LB đặc có chứa Amp. Theo lý thuyết, chỉ có tế bào E. coli chứa pPIC9 mang gen kháng Amp mới có thể phát triển trên môi trƣờng chứa Amp. Trên đĩa LB nuôi cấy xuất hiện nhiều khuẩn lạc, chúng tôi lấy ngẫu nhiên 4 khuẩn lạc và tách chiết plasmid trong các khuẩn lạc này theo công thức Alkaline Lysis và SDS của Birnboim & Doly. Sản phẩm tách chiết đƣợc kiểm tra bằng điện di trên gel agarose 0,8% (Hình 7). Hình 7. Điện di sản phẩm tách chiết plasmid Giếng 1: Thang DNA chuẩn 1 kb Giếng 2 - 5: Plasmid tách chiết từ các khuẩn lạc khác nhau chứa pPIC9 39 Kết quả điện di trên hình 7 cho thấy các plasmid đƣợc tách chiết từ các khuẩn lạc (các giếng 2 - 5) khác nhau đều cho băng DNA sáng, rõ, có độ sạch cao và cùng ở một băng kích thƣớc. Nhƣ vậy, các plasmid pPIC9 đã đƣợc tinh sạch đạt tiêu chuẩn cho các nghiên cứu tiếp theo. 3.1.3. Cắt sản phẩm PCR và cắt mở vòng plasmid bằng enzym giới hạn Sau khi plasmid pPIC9 và sản phẩm PCR đã đƣợc tinh sạch, để chuẩn bị cho việc chèn đoạn gen nghiên cứu vào vector nhân dòng, chúng tôi tiến hành dùng các enzym giới hạn EcoRI và NotI để cắt mở vòng plasmid. Plasmid pPIC9 sau khi cắt bằng cặp enzym giới hạn đƣợc tinh sạch bằng bộ kit của Qiagen nhằm thu đƣợc đúng một băng pPIC9 mở vòng, sạch, làm nguyên liệu cho phản ứng gắn. Kết quả cắt plasmid bằng enzym giới hạn đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% (Hình 8A giếng 3) cho thấy, thu đƣợc băng DNA kích thƣớc khoảng 7,9 kb nhƣ tính toán lý thuyết bằng kích thƣớc của plasmid trừ đi trình tự giữa EcoRI và NotI bị cắt đi. (A) (B) Hình 8. Điện di sản phẩm cắt mở vòng plasmid (A) và sản phẩm PCR (B) bằng các enzym giới hạn NotI và EcoRI (8A): Giếng 1: Thang DNA 1 kb, Giếng 2: pPIC9 không cắt, Giếng 3: pPIC9 sau cắt (8B): Giếng 1: Thang DNA 100bp, Giếng 2: Sản phẩm PCR sau cắt 40 Để tạo sự tƣơng đồng ở hai đầu với pPIC9, gen mã hóa protease HIV-1 cũng đƣợc xử lý cắt bằng hai enzym EcoRI và NotI, kết quả điện di trên gel agarose 1% đã thu nhận đƣợc băng kích thƣớc khoảng 360 bp (Hình 8B- giếng 2). Theo tính toán lý thuyết, sau khi cắt bằng hai enzym trên thì đoạn DNA mang gen mã hóa protease HIV-1 sẽ có kích thƣớc là 356 bp (bằng kích thƣớc gen mã hóa protease HIV-1 sau khi nhân bản trừ đi 4 bp trên mỗi đầu 3' và 5'). 3.1.4. Tạo vector tái tổ hợp pPIC9 chứa gen mã hóa protease HIV-1 bằng phản ứng ligase Sau khi cắt mở vòng plasmid và đoạn gen mã hóa protease HIV-1 bằng cùng một cặp enzym giới hạn để chuẩn bị cho phản ứng ligase. Phản ứng chèn đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào plasmid pPIC9 đƣợc thực hiện nhờ đến enzym T4 DNA ligase, hỗn hợp phản ứng ligase đƣợc ủ qua đêm. Chúng tôi tiến hành biến nạp sốc nhiệt vector tái tổ hợp pPIC9 (sản phẩm ligase) chứa gen mã hóa protease HIV-1 vào tế bào vi khuẩn E. coli DH5α ngay sau khi phản ứng ligase kết thúc. Sản phẩm biến nạp đƣợc cấy trải trên đĩa LB đặc có Amp. Trên pPIC9 có gen kháng Amp nên chỉ có những tế bào E. coli DH5α có mang plasmid tái tổ hợp chứa gen kháng Amp mới có khả năng tạo khuẩn lạc trên môi trƣờng LB có chứa Amp (50 µg/ml). Kết quả biến nạp thu nhận đƣợc đĩa thạch có một số khuẩn lạc trắng. Chúng tôi chọn ngẫu nhiên hai khuẩn lạc và tiến hành kiểm tra bằng phƣơng pháp PCR khuẩn lạc với cặp mồi Prot-F và AOX1-R (cặp mồi 2 - bảng 2). Mồi Prot sẽ xác định đƣợc sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1, còn mồi AOX1-R có thể xác định gen mã hóa protease HIV-1 đã đƣợc chèn đúng chiều vào pPIC9. Theo tính toán, nếu gen mã hóa protease HIV-1 đƣợc chèn đúng chiều vào pPIC9, đoạn DNA đƣợc nhân lên sẽ có chiều dài khoảng 440 bp (bằng 44 bp trình tự mồi Prot-F+ 356 bp của gen Prot + 85 bp trình tự trên pPIC9). Ngƣợc lại, nếu đoạn gen này không đƣợc chèn đúng chiều, sản phẩm PCR sẽ không lên băng. 41 1 2 3 Hình 9. Điện di sản phẩm PCR của các khuẩn lạc E. coli DH5α Giếng 1: Thang DNA 100bp; Giếng 2, 3: Sản phẩm PCR từ các khuẩn lạc mang pPIC9-Prot Kết quả điện di sản phẩm PCR khuẩn lạc (Hình 9) cho thấy các khuẩn lạc đều lên băng có kích thƣớc khoảng 440 tƣơng ứng với kích thƣớc đoạn DNA chứa gen mã hóa protease HIV-1 nhƣ tính toán lý thuyết. Chứng tỏ, chúng tôi đã tạo thành công vector pPIC9 tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 (kí hiệu là pPIC9-Prot). Gen mã hóa protease HIV-1 đã đƣợc chèn đúng chiều và đƣợc nhân lên trong tế bào chủ E. coli DH5α. Để khẳng định này thêm chắc chắn, chúng tôi sử dụng kỹ thuật giải trình tự đối với các khuẩn lạc thu đƣợc ở trên. 3.1.5. Kết quả giải trình tự xác định sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 trong vector biểu hiện pPIC9 Nhằm xác định chính xác việc cài đoạn gen mã hóa protease HIV-1 vào pPIC9 đúng vị trí và đúng chiều hay chƣa, chúng tôi đã tiến hành kiểm tra bằng kỹ thuật giải trình tự. Trƣớc tiên, hai khuẩn lạc trắng bƣớc đầu đã đƣợc khẳng định mang pPIC9Prot bằng PCR đƣợc nuôi cấy cho tinh sạch plasmid theo kit Qiagen. Cả hai plasmid 42 đã tinh sạch (kí hiệu là pPIC9-Prot 1 và pPIC9 - Prot 2) đƣợc pha loãng ở nồng độ thích hợp (khoảng 50 - 100 ng/ µl) và gửi đến Hàn Quốc để giải trình tự. Hình 10. So sánh trình tự cấu trúc Prot trên khuẩn lạc với cấu trúc Prot lý thuyết Kết quả giải trình tự đƣợc so sánh với cấu trúc thiết kế dự tính theo lý thuyết (trên hình 10) cho thấy cấu trúc Prot1 có trình tự trùng khớp với cấu trúc Prot lý thuyết. Khuẩn lạc mang cấu trúc Prot2 bị đột biến mất nucleotide ở vị trí bộ ba mã hóa cho axit amin thứ 6 và đột biến thay thế ở hai vị trí của hai bộ ba mã hóa axit amin thứ 44 và 58,trong 99 axit amin của protease HIV-1. Các đột biến mất và thay thế này đã dẫn đến sự biến đổi về trình tự chuỗi polypeptide, cụ thể đột biến mất ở codon 6 khiến cho axit amin này không đƣợc tổng hợp và làm dịch chuyển khung đọc dẫn đến sản phẩm protein đƣợc dịch mã sai, tức là chuỗi polypeptide đƣợc tổng hợp ra không phải là protease HIV-1. Khi đã bị đột biến mất nucleotide ở codon 6, có thể không cần xét đến đột biến ở codon 44 và 58 nữa. Tuy nhiên, nếu đột biến ở 43 codon 6 không xảy ra, sự biến đổi của codon 44 và 58 dẫn đến axit amin đƣợc hình thành lần lƣợt là Ser (Serin) và Arg (Arginin) khác với các axit amin trong protease HIV-1 là Prolin và glutamic. Theo cấu trúc của protease HIV-1, hai axit amin này nằm trong vùng mũ. Mặc dù chƣa xác định ảnh hƣởng cụ thể của đột biến này, nhƣng theo kết quả của một số nghiên cứu, đột biến xuất hiện ở vùng mũ có thể làm giảm mạnh hoạt tính của protease HIV-1 [47]. Những đột biến xảy ra ở trên có thể là đột biến ngẫu nhiên do sự sai sót của enzym DNA Taq polymerase. Vì lý do trên, để nâng cao hiệu quả biểu hiện chúng tôi chỉ chọn CT-Prot1 của khuẩn lạc mang cấu trúc Prot để tạo dòng và biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 ở P. pastoris. Nhƣ vậy, chúng tôi đã nhân dòng đƣợc gen mã hóa protease HIV-1 vào vector pPIC9. 3.2. TẠO DÒNG VÀ BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA PROTEASE HIV-1 TRÊN P. PASTORIS 3.2.1. Tạo dòng nấm men P. pastoris có chứa plasmid tái tổ hợp mang gen mã hóa protease HIV-1 Trên plasmid pPIC9 có chứa gen HIS4 mã hóa protein histidinol dehydrogenase, HIS4 ORF ở vị trí base 4514 - 1980, trong khoảng này lại có một vị trí nhận biết duy nhất của enzym giới hạn SalI tại base 3177. Chính vì vậy, vector tái tổ hợp pPIC9 mang gen mã hóa protease HIV-1 đã qua kiểm tra đƣợc xử lý bằng enzym cắt giới hạn SalI để tăng khả năng trao đổi chéo giữa plasmid và vùng HIS4trên hệ gen của tế bào nấm men, cũng nhƣ để tạo đƣợc chủng P. pastoris tái tổ hợp dạng Mut+. Vector pPIC9-Prot đã đƣợc cắt mở vòng thành dạng thẳng đƣợc định hƣớng trao đổi chéo và cài toàn bộ cấu trúc biểu hiện gen ngoại lai vào vùng gen HIS4 trong hệ gen tế bào P. pastoris SMD1168 bằng phƣơng pháp điện biến nạp. Vì thế, cấu trúc gen AOX1 trong hệ gen đƣợc bảo toàn để sản xuất enzym alcohol oxidase chuyển hóa nguồn methanol nhƣ nguồn carbon cho nấm men sinh trƣởng. Nhờ vậy, gen mã hóa protease HIV-1 từ plasmid đƣợc chuyển vào và tồn tại ổn định trong bộ gen của tế bào. Song song với việc chuyển vector tái tổ hợp pPIC9Prot vào chủng nấm men SMD1168, chúng tôi cũng tiến hành cài plasmid pPIC9 không chứa gen mã hóa protease HIV-1 vào chủng nấm men này để làm đối chứng, 44 nhằm xác định xem sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 ảnh hƣởng thế nào đến sinh trƣởng của chủng nấm men SMD1168. Sản phẩm biến nạp sau đó đƣợc cấy trải trên môi trƣờng MD (khuyết dƣỡng histidin) trong 3 ngày. Nhiệt độ tăng sinh cho nấm men là 30oC. Kết quả là các khuẩn lạc nấm men đã mọc đều, có màu trắng và tách biệt với nhau (Hình 11). Hình 11. Sự hình thành khuẩn lạc trên P. pastoris SMD1168 (11A) Sản phẩm biến nạp pPIC9 vào nấm men P. pastoris SMD1168; (11B) Sản phẩm biến nạp pPIC9-Prot vào nấm men P. pastoris SMD1168 Với sự có mặt của gen HIS4 trên pPIC9 thì chỉ những tế bào nấm men có mang vector này mới có khả năng mọc trên môi trƣờng khuyết dƣỡng histidine. Những khuẩn lạc mọc trên môi trƣờng MD chứng tỏ chúng có chứa plasmid pPIC9 nên mới có khả năng tổng hợp histidine. Cả hai đĩa nuôi cấy đều xuất hiện các khuẩn lạc trắng vì cùng có mặt pPIC9 trong tế bào. Nhƣ vậy chúng tôi đã biến nạp thành công pPIC9 và vector pPIC9-Prot vào tế bào chủng nấm men P. pastoris SMD1168. Về lý thuyết khi plasmid đƣợc chuyển vào tế bào có thể xảy ra sự sát nhập vào bộ gen của tế bào theo hai phƣơng thức là chèn gen hoặc thay thế gen. Để kiểm tra phƣơng thức sát nhập của vector tái tổ hợp vào hệ gen của nấm men, chiều và vị trí chèn gen, chúng tôi đã chọn ngẫu nhiên mỗi đĩa nuôi cấy một khuẩn lạc và tiến 45 hành kiểm tra bằng phản ứng PCR với cặp mồi số 3 (bảng 2). Theo Kit biểu hiện trên P. pastoris của hãng Invitrogen, sản phẩm PCR của vector pPIC9 khi sử dụng cặp mồi 5’AOX1 sẽ cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 500 bp [29]. Nhƣ vậy, với các khuẩn lạc mang vector pPIC9-Prot, sản phẩm PCR sẽ cho băng DNA có kích thƣớc khoảng 850 bp (500 bp trình tự trên vector + 356 bp trình tự gen mã hóa protease HIV-1). Sản phẩm PCR đƣợc kiểm tra trên gel agarose 0,8% (hình 12). Hình 12. Sản phẩm PCR khuẩn lạc thu đƣợc sau biến nạp vector tái tổ hợp vào nấm men Giếng 1: Thang DNA 1kb; Giếng 2: Đối chứng âm với khuôn là H20 Giếng 3: Sản phẩm PCR khuẩn lạc pPIC9 ; Giếng 4: Sản phẩm PCR khuẩn lạc pPIC9-Prot Kết quả ở hình 12 cho thấy, sản phẩm PCR từ khuẩn lạc nấm men P. pastoris SMD1168 chứa vector tái tổ hợp pPIC9-Prot ở giếng số 4 cho hai băng, trong đó một băng là gen AOX1 trong hệ gen nấm men kích thƣớc khoảng 2,2 kb và một băng là cấu trúc pPIC9-Prot có kích thƣớc khoảng 850 bp nhƣ dự tính lý thuyết. Trên giếng số 3 là sản phẩm PCR khuẩn lạc chứa plasmid pPIC9 không mang gen mã hóa protease HIV-1, xuất hiện hai băng với kích thƣớc tƣơng ứng là 2,2 kb ( gen 46 AOX1 của genome nấm men) và 0,5 kb (trình tự promoter AOX1 bắt cặp với mồi AOX1 nằm trên plasmid pPIC9). Trong khi đó, đối chứng âm với khuôn là H2O không cho băng DNA nào (giếng 2). Nhƣ vậy, chúng tôi đã tạo thành công dòng SMD1168 tái tổ hợp có kiểu hình Mus+ và có thể tiến hành bƣớc cảm ứng biểu hiện protease HIV-1 tiếp theo. 3.2.2. Nghiên cứu biểu hiện gen mã hóa protease HIV-1 trên P. pastoris Các chủng nấm men P. pastoris SMD1168 mang plasmid pPIC9 và pPIC9Prot đƣợc nuôi cấy song song trong môi trƣờng BMGY đến OD600 đạt khoảng 6 -7. Sau đó, các chủng SMD1168 này đƣợc chuyển sang môi trƣờng cảm ứng biểu hiện MM có methanol 0,5%, methanol đƣợc thêm vào sau mỗi 24 giờ. Điều kiện nuôi lắc là nhiệt độ 30oC, trong 100 giờ ở tốc độ lắc 200 vòng/phút. Để theo dõi quá trình sinh trƣởng của các chủng nấm men tái tổ hợp và xem việc chứa gen mã hóa protease HIV-1 trong bộ gen có làm ảnh hƣởng tới sức sống của các thể biến nạp hay không, chúng tôi tiến hành thu dịch môi trƣờng trƣớc mỗi lần thêm methanol và đo phổ hấp phụ của dịch nuôi cấy theo thời gian, ở bƣớc sóng 600 nm (Bảng 6). Kết quả thu đƣợc thể hiện trên đƣờng cong sinh trƣởng (Hình 13). 47 Bảng 6. Khả năng sinh trƣởng của các dòng nấm men tái tổ hợp thông qua chỉ số OD600 theo thời gian lên men, lặp lại thí nghiệm 3 lần 0h 24 h 48 h 72 h 96 h Lặp lại pPIC9 pPIC9-Prot Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình 1,02 1,01 0.92 0,98 2,12 3,59 3,20 2.97 5,81 6,84 5,20 5,95 6.92 8,75 6,52 7,40 7,50 8,98 8,50 8,33 1,02 1,09 0,97 1,02 2,14 3,60 2,55 2,76 6,12 6,84 4,66 5.87 7,25 8,75 6,48 7,49 7,80 8,96 8,32 8.37 Theo kết quả thu đƣợc (trên bảng 7 và hình 13), cả chủng đối chứng mang plasmid pPIC9 và các chủng có mang cấu trúc pPIC9-Prot có đƣờng cong sinh trƣởng tƣơng đối giống nhau. Chứng tỏ, sự có mặt của gen mã hóa protease HIV-1 cũng nhƣ plasmid pPIC9 không ảnh hƣởng tới quá trình sinh trƣởng của chủng P. pastoris tái tổ hợp. 48 Hình 13. Đƣờng cong sinh trƣởng của các chủng P. pastoris SMD1168 sau khi biểu hiện ở môi trƣờng có chứa 0.5% methanol theo thời gian Đƣờng màu xanh là sinh trƣởng của P. pastoris SMD1168 mang pPIC9 (pPIC9). Đƣờng màu đỏ là sinh trƣởng của P. pastoris SMD1168 mang pPIC9-Prot (pPIC9-prot) Trong quá trình biểu hiện, protease HIV-1 sẽ đƣợc tiết ra môi trƣờng. Nếu protease HIV-1 có hoạt tính tự cắt tại đầu N để giải phóng ra protein có axit amin mở đầu là Prolin thì sẽ có kích thƣớc là 108 axit amin (99 axit amin của protease HIV-1 + 9 axit amin trình tự của HA ở đầu C) và có KLPT khoảng 12 kDa. Nhƣ vậy, băng protein của pPIC9-Prot (giếng 3 - hình 14) ghi nhận trong kết quả điện di SDS-PAGE rất có thể là protease HIV-1. Tuy nhiên, mẫu pPIC9 cũng xuất hiện băng có kích thƣớc gần giống với pPIC9-Prot (giếng 2- hình 14). 49 Hình 14. Điện di SDS-PAGE kiểm tra sự có mặt của protease HIV-1 trong chủng tái tổ hợp SMD1168 (72h) Giếng 1: Thang protein; Giếng 2: Dịch môi trƣờng của chủng P. pastoris SMD1168 mang pPIC9; Giếng 3: Dịch môi trƣờng của chủng P. pastoris SMD1168 mang pPIC9+Prot. Vì vậy, để kiểm tra và khẳng định chắc chắn băng protein có kích thƣớc khoảng 12 kDa của chủng nấm men tái tổ hợp trong hình 14 là protease HIV-1, chúng tôi tiến hành kiểm tra tiếp bằng kỹ thuật thẩm tách miễn dịch Western blotting. Các mẫu cũng đƣợc lấy với thể tích tƣơng đƣơng, tiến hành điện di, sau đó đƣợc lai với kháng thể đơn dòng kháng protease HIV-1. Kết quả hiện màu (hình 15) cho thấy mẫu protein của pPIC9-Prot (giếng số 3) xuất hiện tín hiệu dƣơng tính tại vị trí tƣơng ứng với băng protein có KLPT khoảng 12 kDa nhƣ đã ghi nhận trên SDS-PAGE (Hình 14). Băng protein dƣơng tính này chƣa đậm, chứng tỏ hàm lƣợng protease HIV-1 trong mẫu chƣa cao. Điều này có thể là do trong quá trình thí nghiệm, chúng tôi chƣa cô đặc dịch môi trƣờng để làm tăng nồng độ protein. Trong khi đó, protein từ nấm men mang pPIC9 đối chứng không cho băng protein nào (giếng số 2 - hình 15). Nhƣ vậy, bƣớc đầu chúng tôi có thể khẳng định đã biểu hiện đƣợc protease HIV-1 trên vector pPIC9 ở nấm men P. pastoris SMD1168. 50 Hình 15. Kết quả kiểm tra protein bằng thẩm tách miễn dịch Western Blot Giếng 1: Thang chuẩn protein nhuộm sẵn Giếng 2: Dịch môi trƣờng của chủng P. pastoris SMD1168 mang pPIC9 Giếng 3: Dịch môi trƣờng của chủng P. pastoris SMD1168 mang pPIC9-Prot Mặc dù kết quả phân tích bằng SDS-PAGE cho thấy hàm lƣợng protease HIV-1 đƣợc biểu hiện từ chủng SMD1168 chƣa cao và dịch môi trƣờng sau cảm ứng còn có một số protein tạp. Tuy nhiên, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy rằng chủng P. pastoris SMD1168 tái tổ hợp có khả năng biểu hiện protease HIV-1 ở dạng tan tiết vào môi trƣờng. Kết quả này đã phần nào khắc phục đƣợc một số hạn chế của các nghiên cứu trƣớc về tính tan của protease HIV-1. Phần lớn các nghiên cứu biểu hiện protease HIV-1 trƣớc đây đều cho kết quả là protease HIV-1 thƣờng khó tan và thu đƣợc ở phân đoạn tủa tế bào, cụ thể trên thế giới có thể kể tới nhƣ: Cheng và tập thể (1990) [15], Leuthardt và tập thể (1993) [31], và gần đây là Yanchunas và tập thể (2005) [50] đều cho kết quả, protease HIV-1 đƣợc biểu hiện dạng không tan và thu đƣợc ở phân đoạn tủa tế bào. Ở Việt Nam, năm 2012 Nguyễn Thị Hồng Loan và tập thể cũng đã công bố kết quả biểu hiện protease HIV-1 trên E. coli, thu đƣợc ở phân đoạn tủa tế bào dạng không tan. 51 Kết quả này, phù hợp với nghiên cứu của Rangwala và tập thể công bố năm 1992 [41] rằng protease HIV-1 biểu hiện với lƣợng thấp mới dễ tan và thu đƣợc trong dịch chiết của tế bào. Với kết quả thu đƣợc, đã bƣớc đầu khẳng định rằng chúng tôi đã nghiên cứu biểu hiện thành công protease HIV-1 trên chủng nấm men P. pastoris SMD1168 ở dạng tan tiết vào dịch môi trƣờng. Đây cũng là nghiên cứu đầu tiên biểu hiện protease HIV-1 trong nấm men P. pastoris ở Việt Nam. 52 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với những kết quả thu đƣợc trong quá trình thực hiện đề tài, chúng tôi rút ra một số kết luận sau: 1/ Đã nhân dòng thành công gen mã hóa protease HIV-1 vào vector pPIC9. 2/ Bƣớc đầu biểu hiện đƣợc gen mã hóa protease HIV-1 bằng vector pPIC9-Prot trên nấm men P. pastoris SMD1168, protease HIV-1 tiết ra môi trƣờng nuôi cấy ở dạng tan cho băng protein 12 kDa trên SDS-PAGE và thẩm tách miễn dịch. KIẾN NGHỊ Đề tài của chúng tôi có thể tiếp tục phát triển theo hƣớng: 1/ Tối ƣu hóa điều kiện biểu hiện protease HIV-1 trên P. pastoris 2/ Tinh sạch và xác định hoạt tính protease HIV-1 biểu hiện ở P. pastoris 53 TÀI LIỆU THAM KHẢO I. Tài liệu Tiếng Việt 1. Phan Trọng Hoàng, Ngô Văn Trƣờng, Lê Văn sơn, Lê Trần Bình, Chu Hoàng Hà (2007) “Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa tiểu đơn vị p66 của enzym phiên mã ngƣợc của virus HIV-1”, Tạp chí khoa học Công nghệ Sinh học, 5, tr 463-470. 2. Nguyễn Lân Dũng, Phạm Thành Hổ, Chương 20 – Di truyền học vi sinh vật học, giáo trình Vi sinh vật học, NXB Giáo dục Việt Nam. 3. Nguyễn Thị Hồng Loan (2012), Nhân dòng, biểu hiện và nghiên cứu một số tính chất của protease từ HIV-1 tại Việt Nam, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Trƣờng Đại học khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc gia Hà Nội. 4. Đỗ Thị Hồng (2005), Nghiên cứu biểu hiện vùng gen preM-env của virus Dengue typ 2 trong nấm men Pichia pastoris, Luận văn thạc sĩ khoa học sinh học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội. 5. Phan Tuấn Nghĩa (2012), Hóa sinh học thực nghiệm, giáo trình, NXB Giáo dục Việt Nam, tr 91-109. 6. Phạm Đức Minh, Đặng Xuân Kiên, Trần Văn Tuấn, Trần thị Oanh, Lê Bách Quang, (2013), “Đặc điểm phân bố các subtyp HIV-1 tại Việt nam”, tạp chí Y-Dược học quân sự (số 5-2013) tr 33-40. 7. Đồng Văn Quyền, Hoàng Anh, Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Phạm Minh Tuấn, Nguyễn Thanh Tùng, Lê Thị Tâm, Đinh Duy Kháng (2008), “Tách dòng và biểu hiện gen p24 từ chủng HIV lƣu hành ở Việt Nam và nghiên cứu phản ứng của protein tái tổ hợp với kháng thể HIV trong huyết thanh bệnh nhân”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 6, tr 27-34. 8. Bạch Thị Nhƣ Quỳnh, Vũ Thị Hiền, Hà Thị Thu, Nguyễn Phƣơng Hoa, Lê Phƣơng Hằng, Nguyễn Thanh Tùng, Nguyễn Xuân Bắc, Đồng Văn Quyền, Lê Văn Phủng, Đinh Duy Kháng (2011), “ Biểu hiện protein GP41 của virus HIV phân type CRF01_ AE trong E. coli ứng dụng để phát hiện kháng thể kháng HIV trong huyết thanh bệnh nhân bằng Western blot và ELISA”, Tạp chí Công nghệ Sinh học, 9, tr 29-36. 54 9. Bạch Thị Nhƣ Quỳnh (2012), Nghiên cứu tạo protein tái tổ hợp của HIV-1 và ứng dụng để phát triển kit chẩn đoán HIV/AIDS, Luận án Tiến sỹ Sinh học, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn Lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam. 10. Nguyễn Thị Phƣơng Trang, Kim Young-Ho, Đinh Duy Kháng, Đồng Văn Quyền (2007), "Tách dòng và biểu hiện gen mã hóa polymerase của virus viêm gan B trên bề mặt tế bào Sacharomyces", Tạp chí Công nghệ sinh học 5(4), 419-424. II. Tài liệu Tiếng Anh 11. Randy S., (2007), And The Band Played On, St. Martin's Press, pp. 227. 12. Aurel Lupulescu, Maibach Howard I., (1990), Hormone and vitamins in cancer treatment, CRC PR INC, pp. 131 - 133 13. Anson B.D., Weaver J.G., Ackerman M.J., Akinsete O., Henry K., January C.T., Badley A.D.(2005), “Blockade of HERG channels by HIV protease inhibitors”, Lancet 365: pp. 682-686. 14. Chen J., Liang Z., Wang W., Yi C., Zhang S., Zhang Q., (2014), "Revealing origin of decrease in potency of darunavir and amprenavir against HIV-2 relative to HIV-1 protease by molecular dynamics simulations", Sci Rep. Nov 3;4:6872. doi: 10.1038/srep06872. 15. Cheng Y.S.E., McGowan M.H., Kettner C.A., Schloss J.V., Erickson S., Yin F.H. (1990), “High-level synthesis of recombinant HIV-1 protease and the recovery of active enzym from inclusion bodies”, Gen, 87, pp. 243-248. 16. Cereghino L. N., Geoffrey P., Sunga A. J., Lin Cereghino J., and Cregg J. M. (2001), “Expression of foreign gens in the yeast P. pastoris”, Gent. End. 23, pp. 157-16 17. Cuba reports modest progress in HIV -1 (2013), Xinhua via NewsPoints Desk. 18. Danley D.E., Geoghegan K.F., Scheld K.C., Lee S.E., Merson J.R., Hawrylik S.J., Rickett G.A., Atmnirati M.J. and Hobart P.M. (1989), “Crystallizable HIV-l protease derived from expression of the viral pol gen in Escherichia coli”. Biochem Biophys Res Commun, 165, pp. 1043-1050. 55 19. Darke P.L., Leu C.T., Davis L.J., Heimbach J.C., Diehl R.E., Hill W.S., Dixon R.A.F. and Siga I.S. (1989), “Human immunodeficiency virus protease bacterial expression and characterization of the purified aspartic protease”, J. Biol. Chem, 264, pp. 2307-2312. 20. Dalgleish A.G., Beverley P.C., Clapham P.R., “The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus”. Nature 1984, 312: 763-7. http://amedeo.com/lit.php?id=6096719 21. Ellis S. B., Brust, P. F., Koutz, P. J., Waters, A. F., Harpold, M. M., and Gingeras, T. R. (1985), “Isolation of alcohol oxidase and two other methanol regulatable gens from the yeast P. pastoris”, Mol. Cell. Biol, 5, pp. 1111-1121. 22. Jahic M., Veide, A., Charoenrat, T., Teeri, T., and Enfors, S.-O. (2006), “Process technology for production and recovery of heterologous proteins with P. pastoris”, Biotechnol. Prog, 22, pp. 1465–1473. 23. Frank Bruce H., Heiney, Richard E., ( 1995). "Process for transformating a human insulin precursor to human insulin", US Patent 5457066 24. Greene W.C. (2007), "A history of AIDS: looking back to see ahead", Eur. J. Immunol, 37, pp. 94-102. 25. Galli M., Ridolfo A.L., Adorni F., Gervasoni C., Ravasio L., Corsico L., Gianelli E., Piazza M., Vaccarezza M., d'Arminio Monforte A., Moroni M. (2002), "Body habitus changes and metabolic alterations in protease inhibitor-naive HIV-1-infected patients treated with two nucleoside reverse transcriptase inhibitors", AIDS, 29, pp. 21-31. 26. Hare B.C., (2006), "Clinical Overview of HIV Disease", HIV Insite Knowledge Base Chapter- Nguồn www.hivinsite.ucsf.edu. 27. Higgins D.R. and Cregg J.M., (1998), Pichia protocol, Methods in molecular biology, Humana Prees. 28. Hoffmann C., Rockstroh J.K., Kamps B.S. HIV medicine (2007), www. HIV Medicine.com. 56 29. Invitrogen, Pichia Expression Kit: A manual of Method for Expression of Recombinant Protein in P. pastoris. Catalog K1710-01 30. Laemmli U.K. (1970), "Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4", Nature 227, pp. 680-685. 31. Leuthardt A., Roesel J.L.(1993), “Cloning, expression and purification of a recombinant poly-HIStidine-linked HIV-1 protease”, FEBS Lett, 36, pp. 275280. 32. Lin-Cereghino, G.P., Stark, C.M., Kim, D., Chang, J., Shaheen, N., Poerwanto, H., Agari, K., Moua, P., Low, L.K., Tran, N., et al. (2013), “The Effect of?-Mating Factor Secretion Signal Mutations on Recombinant Protein Expression in Pichia pastoris”, Gene 519, pp. 311–317. 33. Marx J.L. (August 1982). "New disease baffles medical community". Science 217 (4560): 618–21. 34. Macauley-Patrick S., Fazenda M.L., McNeil B., and Harvey L.M., (2005), “Heterologous protein production using the P. pastoris expression system”. Yeast, 22, pp. 249–270. 35. McCormac A. C., et al., (1998). “A simple method for the production of highly competent cells of Agrobacterium for transformation via electroporation”. Molecular Biotechnology 9:155-159. 36. Miyeko Mana and David Marcey (2001), HIV-1 Protease, Clu Biology Department. 37. Mike Romanos (1995), “Advances in the use of P. pastoris for high level gen expression”, Current Opinion in Biotechnology, 6, pp. 527-533. 38. Oriol C., Ramon R., Jose Luis M., & Francisco V., (2006), “Monitoring and control of hetorologous protein production in the methylotrophic yeast Pichia pastoris under different promoters”, Bio Med central Operation strategies 57 39. Pichuantes S., Babe L. M., Barr P. l. & Craik C. S. (1989), “Recombinant HIVl protease secreted by Saccharomyes cerevisiae correctly processes myristylated gag polyprotein”, Proteins: Struct Funct Gent 6, 324-337. 40. Plantier, J.C. (2009) ''A new human immunodeficiency virus derived from gorillas'', Nature Medicine, 2nd August. 41. Rangwala S.H., Finn R.F., Smith C.E., Berberich S.A., Salsgiver W.J., Stallings W.C., Glover G.I., Olins P.O. (1992), “High-level production of active HIV-1 protease in Escherichia coli”, Gen, 122, pp. 263-269. 42. Sanger F., Nicklen S. and Coulson A.R. (1977), “DNA sequencing with chain terminator inhibitors”, Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 74, pp. 5463-5467. 43. Shedlock D.J., Daniel H., Andy Y.C., Christopher W.C., Karuppiah M., David B.W. (2008), "HIV-1 viral gen and mitochondria apoptosis", Apoptosis, 13, pp. 1088-1099. 44. Siliciano J.D., Kajdas J., Finzi D., Quinn T.C., Chadwick K., Margolick J.B., Kovacs C., Gange S.J., Siliciano R.F. (2003), "Long-term follow-up studies confirm the stability of the latent reservoir for HIV-1 in resting CD4+ T cells", Nat. Med, 9, pp. 727-728 45. Seelmeier S., Schmidt H., Turk, V. and Helm K.V.D. (1988), "Human immunodeficiency virus has an aspartic-type protease that can be inhibited by pepstatin A", Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 85, pp. 6612-6616. 46. Taylor A., Brown P.D., Kadam S., Maus M., Kohlbrenner E.W., Weigl D., Turon C.M. and Katz L. (1992), “High-level expression and purification of mature HIV-I protease in Escherichia coli under control of the araBAD promoter”, Appl. Microbiol. Biotechnol. 37, pp. 205-210. 47. Tie Y. (2006), Crystallographic analysis and kinetic studies of HIV-1 protease and drug-resistant mutants, Chemistry Dissertations, Department of Chemistry, Georgia State University, pp. 2. 48. Tie Y., Wang YF, Boross PI, Chiu TY, Ghosh AK, Tozser J, Louis J. M., Harrison RW, Weber IT, (2012), Critical differences in HIV-1 and HIV-2 protease specificity for clinical inhibitors, Protein Sci. Epub 2012 Jan 24. 58 49. UNAIDS in Vietnam from www.unaids.org.vn. 50. Yanchunas J., Langley D.R., Tao L., Rose R.E., Friborg J., Colonno R.J., Doyle M.L. (2005), "Molecular basis for increased susceptibility of isolates with atazanavir resistance-conferring substitution I50L to other protease inhibitors", Antimicrob Agents Chemother, 49, pp. 3825-3832. 51. Zhang W., Bevins M.A., Plantz B.A., Smith L.A., Meagher M.M. (2000), "Modelling Pichia pastoris growth on methanol and optimising the production of a recombinant protein, the heavy-chain fragment C of botulinum neurotoxin, serotype A". Biotechnol Bioeng 70: 1–8. 52. Zhang W., Inan M., Meagher M. M. (2005), Fermentation strategies for recombinant protein expression in the methylotrophic yeast P. pastoris, Biotechnol. Bioprocess Eng, 5, pp. 275 – 28 53. http://www.hiv.lanl.gov/content/sequence/HIV/CRFs/CRFs.html. 54. http://www.anninhthudo.vn/506855.antd 55. http://www.diabetes.co.uk/diabetes-types.html 56. http://vietbao.vn/Bao-dong-ty-le-nhiem-HIV-AIDS-tren-the-gioi 59 [...]... Kiểu gen Y -11 430 Kiểu dại GS 115 HIS4 GS190 ARG4 GS200 HIS4ARG4 SMD 116 8 ∆PEP4:URA HIS4 ura3 SMD 116 5 HIS4 PRB1 SMD 116 3 PEP4 HIS4 PRB1 20 Chủng nấm men P pastoris SMD 116 8 đã đƣợc chúng tôi lựa chọn và sử dụng trong biểu hiện gen mã hóa protease HIV- 1 Ngoài gen HIS4-, P pastoris SMD 116 8 còn có gen PEP4 đã bị đột biến ở dạng PEP4-, PEP4 là gen mã hóa cho carboxypeptidase A cần thiết cho sự kích hoạt các protease. .. các nghiên cứu về protease HIV- 1 chủ yếu đƣợc biểu hiện ở vi khuẩn E coli Trong khi, protease HIV- 1 là protease của virus HIV- 1 chỉ tạo ra ở tế bào sinh vật nhân chuẩn, cần có quá trình biến đổi sau dịch mã mà E coli lại không thể đáp ứng đƣợc điều kiện này Tuy đã có một số nghiên cứu trên thế giới đã biểu hiện thành công protease HIV- 1 trên nấm men S cerevisiae Hiện tại chƣa có công bố nào về biểu hiện. .. tính độc này, một số nhóm nghiên cứu đã nhân dòng và biểu hiện protease HIV- 1 bằng cách sử dụng các hệ thống và quy trình biểu hiện khác nhau nhƣ sử dụng các promoter trp, λPL, ara BAD và tac [19 ; 46] Một số nghiên cứu đã tiến hành biểu hiện protease HIV- 1 ở nấm men S cerevisiae [39] Pichuantes và tập thể (19 89) đã biểu hiện thành công protease HIV- 1 tái tổ hợp ở nấm men [39] Protease tạo ra cũng có... về protease HIV- 1 vẫn đƣợc các nhà khoa học trên thế giới cũng nhƣ các trung tâm nghiên cứu rất quan tâm Tuy nhiên, hƣớng nghiên cứu chủ yếu về sự khác biệt trong tính đặc hiệu của protease HIV- 1 và protease HIV- 2 [48] Ngoài ra, một số nghiên cứu nhằm tìm hiểu các đột biến của gen mã hóa protease HIV- 1 khiến HIV- 1 có thể kháng đƣợc thuốc ức chế, từ đó tìm ra loại thuốc ức chế mới hiệu quả hơn [14 ]... PROTEASE HIV- 1 1.2 .1 Protease HIV- 1 Protease HIV- 1 là enzym có vai trò phân cắt các polyprotein tiền thân gag và gag-pol thành những protein cấu trúc và chức năng trong quá trình trƣởng thành của virus Protease HIV- 1 đƣợc mã hóa bởi gen pol trong hệ gen của HIV- 1 và là một protease aspartyl (chứa aspartyl trong trung tâm hoạt động), họ retropepsin A2, đƣợc tạo ra khi HIV- 1 nhiễm vào tế bào vật chủ Protease. .. cerevisiae Hiện tại chƣa có công bố nào về biểu hiện protease HIV- 1 trên nấm men P pastoris ở Việt Nam 1. 2.4 Thực trạng sản xuất protease HIV- 1 ở Việt Nam Những nghiên cứu về các enzym của HIV- 1 ở Việt Nam có thể kể đến các công trình nhƣ: Phan Trọng Hoàng và tập thể (2007) đã nhân dòng và biểu hiện đƣợc gen mã hóa tiểu đơn vị P66 của reverse transcriptase của HIV- 1 ở E coli để dùng cho các phản ứng tổng hợp... vào nghiên cứu đề tài Nghiên cứu protease virus gây suy giảm miễn dịch ở ngƣời (HIV) phân lập tại Việt Nam”, nhằm mở ra khả năng tự sản xuất PI chống HIV ở Việt Nam Đây là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu có tính hệ thống, bài bản về phân lập, nhân dòng và biểu hiện gen mã hóa protease HIV- 1 tái tổ hợp từ chủng CRF 01- AE của Việt Nam trong E coli [54] Trong nghiên cứu này, gen mã hóa protease. .. bệnh nhân nhiễm HIV- 1 chỉ 13 còn cách dùng thuốc để duy trì sự sống Các nghiên cứu tập trung vào việc tìm ra các chất ức chế sự xâm nhiễm, lây lan của HIV- 1 Protease HIV- 1 là một trong các đích quan trọng nhất của liệu pháp điều chế thuốc ức chế HIV- 1 vì protease HIV- 1 có vai trò không thể thiếu trong chu trình sống của HIV- 1 Do vậy, cần một lƣợng lớn protease HIV- 1 trong quá trình nghiên cứu tìm ra và... trong nhiều nghiên cứu đầu tiên Sau đó một số loại nấm men đã đƣợc chọn bởi một số ƣu thế so với vi khuẩn E coli trong biểu hiện protease HIV- 1 Năm 19 89, một số nhà nghiên đã biểu hiện protease HIV- 1 bằng việc sử dụng các vector pPRT và pHIVexpo15 có promoter trp trong vi khuẩn E coli [18 ; 19 ] Protease thu đƣợc sau khi tinh sạch đƣợc xác định khối lƣợng phân tử (KLPT) của một monomer khoảng 11 kDa, bao... cao nấm men, 1% trypton, 1% NaCl, 1. 5% agar + Thành phần môi trƣờng BMGY: 1% cao nấm men, 2% peptone, 1. 34% yeast nitrogen base, 4x10-5 biotin, 1% glycerol, pH 6.0 + Môi trƣờng MM: 10 %YNB; 1% methanol; 1. 10-5% biotin + Môi trƣờng MD: 1, 34 % YNB; 4 .10 -5% biotin; 2% glucose Các hóa chất trên và một số hóa chất khác đều có độ tinh khiết cần thiết cho nghiên cứu sinh học phân tử - Dụng cụ: + Bộ pipetman 10 , ... VỀ PROTEASE HIV- 1 12 1. 2 .1 Protease HIV- 1 12 1. 2.2 Chức protease HIV – 13 1. 2.3 Sơ lƣợc nghiên cứu biểu protease HIV- 1 giới 13 1. 2.4 Thực trạng sản xuất protease HIV- 1. .. dung: - Nhân gen mã hóa protease HIV- 1 vào vector biểu - Nghiên cứu biểu gen mã hóa protease HIV- 1 nấm men P pastoris CHƢƠNG - TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1. 1 TỔNG QUAN VỀ AIDS VÀ HIV 1. 1 .1 Nguyên nhân... GS190 ARG4 GS200 HIS4ARG4 SMD 116 8 ∆PEP4:URA HIS4 ura3 SMD 116 5 HIS4 PRB1 SMD 116 3 PEP4 HIS4 PRB1 20 Chủng nấm men P pastoris SMD 116 8 đƣợc lựa chọn sử dụng biểu gen mã hóa protease HIV- 1 Ngoài gen