BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ KHOANG CỔ VÀ HẢI QUỲ TẠI KHÁNH HÒA DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN Giảng viên hướng dẫn : ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh TS. Đặng Thúy Bình Sinh viên thực hiện : Lương Thị Tường Vi Mã số sinh viên : 53132012 Khánh Hòa: 2015 i TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC VÀ MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN SINH HỌC ---------------o0o--------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP PHÂN LOẠI MỘT SỐ LOÀI CÁ KHOANG CỔ VÀ HẢI QUỲ TẠI KHÁNH HÒA DỰA TRÊN ĐẶC ĐIỂM HÌNH THÁI VÀ DI TRUYỀN GVHD: ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh TS. Đặng Thúy Bình SVTH: Lương Thị Tường Vi MSSV: 53132012 Khánh Hòa, tháng 06/2015 ii LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đồ án tốt nghiệp, em xin gửi lời cảm ơn đến Viện Công nghệ sinh học và Môi trường, Trường Đại học Nha Trang đã tạo môi trường thuận lợi về cơ sở vật chất cho em trong suốt quá trình thực hiện đồ án. Đặc biệt em xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc nhất đến ThS. Nguyễn Thị Hải Thanh, ThS. Vũ Đặng Hạ Quyên và TS. Đặng Thúy Bình đã tận tình hướng dẫn, dạy bảo và tạo mọi điều kiện thuận lợi để cho em hoàn thành tốt đồ án này. Em xin chân thành cảm ơn các thầy cô trong Bộ môn Sinh học và Công nghệ sinh học đã giảng dạy và cung cấp kiến thức cho em trong bốn năm học qua. Em xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, anh chị, bạn bè và người thân đã quan tâm, hỗ trợ và động viên em hoàn thành tốt bài đồ án. Trong quá trình thực hiện không thể nào tránh khỏi những thiếu sót, em rất mong nhận được ý kiến đóng góp để đồ án trở nên hoàn thiện hơn. Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, ngày 20 tháng 06 năm 2015 Sinh viên thực hiện Lương Thị Tường Vi iii TÓM TẮT Cá khoang cổ và hải quỳ là hai loài sinh vật đầy màu sắc, có mối quan hệ cộng sinh đặc biệt trong đại dương, chúng có sự đa dạng rất lớn trong thành phần loài, trên thế giới có khoảng 29 loài cá khoang cổ và hơn 1200 loài hải quỳ đã được biết đến. Tuy nhiên hiện nay sự đa dạng sinh học của các loài cá khoang cổ và hải quỳ đã và đang bị ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, trong đó biến đổi khí hậu là yếu tố khó kiểm soát và có sức ảnh hưởng lớn nhất. Trong nghiên cứu này tập trung phân loại một số loài cá khoang cổ và hải quỳ tại khu vực Khánh Hòa – Việt Nam. Dựa vào đặc điểm hình thái, nghiên cứu thu được 6 loài cá khoang cổ thuộc 1 giống Amphiprion và 7 loài hải quỳ thuộc 6 giống, 4 họ và 2 bộ. Nghiên cứu đã sử dụng gen 16S mtDNA để kiểm chứng phân loại hình thái và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của 6 loài cá khoang cổ thu tại Khánh Hòa. Đồng thời nghiên cứu cũng sử dụng đoạn gen ribosome ITS1 – 5.8S – ITS2 để nghiên cứu di truyền của hai loài hải quỳ Stichodactyla tapetum và Macrodactyla doreensis. Dữ liệu trong nghiên cứu này có thể được sử dụng làm nguồn dữ liệu đầu vào để nghiên cứu đa dạng sinh học và mối quan hệ cộng sinh giữa cá khoang cổ và hải quỳ. iv MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ..................................................................................................................ii TÓM TẮT ...................................................................................................................... iii DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT ............................................................................ v DANH MỤC HÌNH .......................................................................................................vi DANH MỤC BẢNG.................................................................................................... viii MỞ ĐẦU .......................................................................................................................... 1 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN .......................................................................................... 4 1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu............................................................................... 4 1.2. Tổng quan về cá khoang cổ và hải quỳ ................................................................. 5 1.2.1 Tổng quan về cá khoang cổ .............................................................................5 1.2.2 Tổng quan về hải quỳ .......................................................................................7 1.3.1 Phân loại bằng hình thái ...................................................................................9 1.3.2 Phân loại bằng di truyền...................................................................................9 1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước .................................................................... 12 1.4.1 Nghiên cứu về cá khoang cổ trong và ngoài nước ........................................12 1.4.2 Nghiên cứu về hải quỳ trong và ngoài nước ..................................................14 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ...................... 16 2.1 Đối tượng nghiên cứu ........................................................................................... 16 2.2 Phương pháp nghiên cứu ...................................................................................... 16 2.2.1 Phân loại hình thái ..........................................................................................16 2.2.2 Phân loại di truyền .........................................................................................20 2.2.3 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại .................23 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ................................ 27 3.1 Phân loại hình thái................................................................................................. 27 3.1.1 Thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa.......................27 3.1.2 Đặc điểm hình thái cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa. .................29 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .............................................................. 68 4.1. Kết luận ................................................................................................................ 68 4.2. Kiến nghị .............................................................................................................. 69 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................................ 70 PHỤ LỤC ....................................................................................................................... 75 v DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT A Số lượng tia và gai vây hậu môn Bp Base pairs BT Độ tin cậy (bootstrap) C Số lượng tia và gai vây đuôi Cm Centimeter Ctv Cộng tác viên D Số lượng tia và gai vây lưng DE Đường kính mắt DNA Deoxyribonucleic acid G Gam GB Genbank H Chiều cao thân cá IUCN International Union for Conservation of Nature L Chiều dài toàn thân LS Chiều dài chuẩn T Chiều dài đầu LM Chiều dài mõm lD Chiều dài vây lưng lA Chiều dài vây hậu môn lP Chiều dài vây ngực lV Chiều dài vây bụng mt DNA Mitochondrial deoxyribonucleic acid Mm Milimeter µL Microliter µM Micromol P Số lượng tia và gai vây ngực PCR Polymerase Chain Reaction rRNA Ribosomal ribonucleic acid tRNA Transfer ribonucleic acid WWF World Wide Fund For Nature V Số lượng tia và gai vây bụng vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 – Bản đồ tỉnh Khánh Hòa – Việt Nam .............................................................. 4 Hình 1.2 – Cấu trúc chung của hải quỳ ............................................................................8 Hình 1.3 – Hai phương pháp dùng để phân loại: .............................................................9 Hình 1.4 – So sánh hệ gen ty thể và hệ gen nhân...........................................................10 Hình 2.1 – Hình thái bên ngoài của cá khoang cổ .........................................................17 Hình 2.2 – Các chỉ số đo trong phân loại cá khoang cổ .................................................18 Hình 2.3 –Các chỉ số đếm trong phân loại cá khoang cổ ...............................................18 Hình 2.4 - Các chỉ tiêu đo của hải quỳ ...........................................................................19 Hình 2.5 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu di truyền cá khoang cổ ............................ 20 Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR............................................................... 21 Hình 3.1a,b – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ hồng chỉ trắng Amphiprion perideraion ......................................................................................................................29 Hình 3.1c – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ hồng chỉ trắng Amphiprion perideraion .........................................................................................................................................30 Hình 3.2a – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ vàng Amphiprion sandaracinos ......32 Hình 3.2b – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ vàng Amphiprion sandaracinos ...........32 Hình 3.3a, b, c, d – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ đen đuôi vàng Amphiprion clarkii ..........................................................................................................34 Hình 3.3e – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ đen đuôi vàng Amphiprion clarkii .......35 Hình 3.4a – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ đỏ Amphiprion frenatus .................37 Hình 3.4b – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ đỏ Amphiprion frenatus ......................38 Hình 3.5 – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ yên ngựa Amphiprion polymnus .........................................................................................................................39 Hình 3.5e – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ yên ngựa Amphiprion polymnus .........40 Hình 3.6a,b – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ nemo Amphiprion ocellaris ...........................................................................................................................42 Hình 3.6c – Đặc điểm hình thái cá nemo Amphiprion ocellaris....................................43 Hình 3.7a, b, c – Hình dáng và màu sắc hải quỳ bong bóng Entacmaea quadricolor .45 Hình 3.7d – Đặc điểm hình thái hải quỳ bong bóng Entacmaea quadricolor..............45 vii Hình 3.8 a, b – Hình dạng và màu sắc của hải quỳ thảm nhỏStichodactyla tapetum....46 Hình 3.8c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thảm nhỏ Stichodactyla tapetum ...................47 Hình 3.9 – Hình dáng và màu sắc hải quỳ thảm Stichodactyla haddoni .......................48 Hình 3.9 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thảm Stichodactyla haddoni .........................49 Hình 3.10 d – Đặc điểm hình thái hải quỳ thân đỏ Macrodactyla doreensis ................51 Hình 3.11a, b– Hình dáng và màu sắc của hải quỳ ống Pachycerianthus magnus .......52 Hình 3.11 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ ống Pachycerianthus magnus....................53 Hình 3.12 – Hình dáng và màu sắc hải quỳ thanh long Cryptodendrum adhaesivum .54 Hình 3.12 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thanh long Cryptodendrum adhaesivum ....55 Hình 3.13 a, b – Hình dáng và màu sắc hải quỳ cúc Heteractis aurora........................56 Hình 3.13 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ cúc Heteractis aurora .................................57 Hình 3.14 – Kết quả điện di DNA tổng số của các loài cá khoang cổ ..........................58 Hình 3.15 – Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA các mẫu cá khoang cổ .....................................................................................................................................58 Hình 3.16 – Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor - Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen 16S mt DNA của các loài cá khoang cổ tại Khánh Hòa – Việt Nam. 62 Hình 3.17 – Kết quả điện di tổng số và sản phẩm PCR đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA hai mẫu hải quỳ ....................................................................................................64 Hình 3.18 – Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor - Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ tại Khánh Hòa – Việt Nam. ................................................................................................................................ 66 viii DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ ..................................24 Bảng 2.2 – Trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ .....................25 Bảng 3.1 – Kết quả thu mẫu cá khoang cổ .....................................................................27 Bảng 3. 2– Danh sách các loài cá Khoang cổ phổ biến ở Khánh Hòa – Việt Nam ......27 Bảng 3.3 – Kết quả thu mẫu hải quỳ ..............................................................................28 Bảng 3.4 – Danh sách các loài hải quỳ thu được ở Khánh Hòa – Việt Nam ................28 Bảng 3.5 – Các chỉ tiêu đo hình thái của hải quỳ...........................................................44 Bảng 3.6 – Độ tương đồng của 7 trình tự 16S mtDNA từ 6 loài cá khoang cổ tại Khánh Hòa – Việt Nam với trình tự Genbank ..........................................................................59 Bảng 3.7 – Sự khác biệt về trình tự 16S mt DNA giữa các loài cá khoang cổ ở Khánh Hòa ..................................................................................................................................60 Bảng 3.8 –Độ tương đồng của trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của 2 loài hải quỳ thu tại Khánh Hòa – Việt Nam với dữ liệu từ Genbank ................................................65 Bảng 3.9 – Sự khác biệt về trình tự ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ ..65 1 MỞ ĐẦU Nằm bên bờ Tây của Biển Đông, Việt Nam là quốc gia có đường bờ biển dài 3260 km với nguồn tài nguyên sinh vật biển đa dạng, phong phú. Vùng biển Việt Nam có khoảng 11000 loài sinh vật cư trú trong hơn 20 kiểu hệ sinh thái điển hình. Trong đó có khoảng 1222 km2 rạn san hô, phân bố rộng rãi từ Bắc tới Nam, tập trung diện tích lớn ở miền Trung và miền Nam – Việt Nam với độ đa dạng sinh học cao (Đỗ Công Thung, 2011). Các rạn san hô được xem là môi trường sống vô cùng quan trọng, ảnh hưởng đến sự tồn tại và phát triển của nhiều loài trong hệ sinh thái biển. Trong đại dương, rạn san hô chỉ chiếm 1% nhưng chúng hỗ trợ khoảng 25% các loài sinh vật biển sinh sống ở nơi này, đây là nơi cư trú, nơi sinh đẻ và là nơi ươm nuôi ấu trùng của nhiều loài cá biển (Johnny, 2014). Mỗi năm san hô chỉ dài ra khoảng 1cm, để hình thành nên một hệ rạn san hô chúng cần phải trải qua thời gian hàng trăm năm. Đây là nơi sinh sản của các loài sinh vật biển, để rồi chúng phát tán ra xung quanh, làm tăng trưởng nguồn lợi thủy sản và đa dạng sinh học (Barnes và ctv, 1999). Tuy nhiên, hiện nay các hệ sinh thái trong rạn san hô trên thế giới đang phải đối diện với nhiều mối đe dọa liên quan đến sự sống còn. Trong đó, mối đe dọa lớn nhất, khó kiểm soát nhất và gây ra nhiều mất mát nhất chính là sự tác động biến đổi khí hậu (Munday và ctv, 2008). Điều này đã và đang tạo ra nhiều biến động lớn trong lòng đại dương, cụ thể là sự suy giảm đa dạng sinh học một số loài sống trong rạn san hô. Những năm gần đây, sự tác động của biến đổi khí hậu ngày càng mạnh mẽ, nhiệt độ và nồng độ acid trong đại dương tăng lên làm tăng nguy cơ xảy ra hiện tượng tẩy trắng san hô (Philip và ctv, 2008). Điều này đồng nghĩa với nơi trú ẩn và nguồn thức ăn của một số sinh vật biển sống ở rạn san hô bị suy giảm. Trong đó cá khoang cổ và hải quỳ là hai loài chịu nhiều ảnh hưởng nhất bởi chúng có mối quan hệ cộng sinh bắt buộc (Fautin và Allen, 1992). Hải quỳ được xem là nơi cư trú, nơi bảo vệ cá khoang cổ trước kẻ thù, nhờ đó mà loài cá này được sống an toàn trong đại dương. Ngược lại, cá khoang cổ ăn những sinh vật nhỏ làm hại tới hải quỳ, ngoài ra cá còn cung cấp dinh dưỡng cho hải quỳ thông qua những chất thải của mình (Fautin và Allen, 1992). Dưới ảnh hưởng của biến đổi khí hậu, đặc biệt là sự gia tăng nhiệt độ và quá trình acid hóa đại dương đã đe dọa nghiêm trọng đến sự sinh trưởng và phát triển của cá khoang cổ và hải quỳ. Khi nồng độ acid trong đại dương tăng lên sẽ ảnh hưởng đến khả năng phát hiện các tín hiệu hóa học cần 2 thiết của cá khoang cổ để tìm đến vật chủ hải quỳ. Vì vậy cá khoang cổ dễ bị đe dọa bởi kẻ thù của mình khi không có hải quỳ bảo vệ, đồng thời cá ít có cơ hội được sinh sản dễ dẫn đến nguy cơ bị tuyệt chủng. Khi nhiệt độ tăng cao, tảo cộng sinh với hải quỳ bị tiêu diệt, nguồn cung cấp dinh dưỡng quan trọng cho hải quỳ bị ảnh hưởng đe dọa đến sự sống còn của chúng. Mặt khác, hải quỳ là loài động vật nhạy cảm, dễ bị ảnh hưởng bởi sự biến động của nhiệt độ và các yếu tố vật lí khác (Munday, 2008). Biến đổi khí hậu càng tác động mạnh mẽ đến đại dương thì cá khoang cổ và hải quỳ càng dễ bị đẩy đến bờ vực tuyệt chủng (Philip và ctv, 2008). Cá khoang cổ và hải quỳ có kích thước nhỏ, màu sắc đẹp nên thường sử dụng trang trí trong các bể cá cảnh nước mặn. Thực tế hiện nay các nghiên cứu về đa dạng sinh học và bảo tồn nguồn lợi thủy sản tại Việt Nam thường chú ý đến những loài thủy sản có giá trị cao về kinh tế như cá tra, cá chạch lấu, cá bống tượng, … mà bỏ ngỏ những loài dùng làm cảnh này (Hà Lê Thị Lộc, 2009). Vì vậy, cần thiết phải có nhiều nghiên cứu hơn về cá khoang cổ và hải quỳ nhằm bảo tồn sự đa dạng và nguồn lợi sinh vật biển này, góp phần tăng trưởng kinh tế cho du lịch và kinh doanh cá cảnh trong và ngoài nước. Các chỉ tiêu hình thái là cơ sở ban đầu rất quan trọng để phân loại sinh vật. Tuy nhiên, những đặc điểm hình thái, dưới sự tác động của môi trường và biến dị cá thể có thể gây nhầm lẫn trong công tác phân loại. Đặc biệt, hải quỳ là loài rất đa dạng về màu sắc, kích cỡ và có rất ít các cấu trúc rõ nét vì thế việc phân loại hải quỳ chỉ dựa vào hình thái là một khó khăn lớn. Do đó, phương pháp này cần được kết hợp với phương pháp phân loại bằng chỉ thị sinh học phân tử để có độ chính xác cao hơn. Nhận thấy sự đa dạng sinh học của cá khoang cổ và hải quỳ ở rạn san hô là tiền đề cho sự phát triển bền vững, đề tài “Phân loại một số loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền” được thực hiện nhằm cung cấp những dẫn liệu về hình thái và di truyền của một số loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa, làm cơ sở cho các nghiên cứu đánh giá đa dạng sinh học bằng việc xây dựng mã vạch DNA (DNA barcoding).  Mục đích của đề tài Nghiên cứu này là một trong những nội dung thuộc mô hình nghiên cứu về ảnh hưởng của biến đổi khí hậu trong rạn san hô, mục đích chủ yếu là xác định thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ để nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh giữa chúng. 3 Nghiên cứu sử dụng phương pháp phân loại dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền, nhằm xây dựng cơ sở dữ liệu về hình thái và di truyền các loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa. Đây là những dẫn liệu đầu vào về đa dạng loài, hệ thống phân loại các loài cá khoang cổ và hải quỳ, làm cơ sở cho công tác bảo tồn và quản lý nguồn lợi.  Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các loài cá khoang cổ và hải quỳ được thu tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa. Các nghiên cứu hình thái và di truyền được sử dụng để phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại của các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa – Việt Nam.  Nội dung nghiên cứu  Thu mẫu và phân loại các loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái.  Phân loại các loài cá khoang cổ và hải quỳ bằng chỉ thị sinh học phân tử.  Xây dựng cây phát sinh loài của các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa.  Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Nghiên cứu góp phần khảo sát sự đa dạng các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa. Dữ liệu này được sử dụng để phục vụ cho các nghiên cứu về đa dạng thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ, làm tiền đề cho việc nghiên cứu mối quan hệ cộng sinh giữa hai loài này, là cơ sở nghiên cứu tác động của biến đổi khí hậu đến đa dạng sinh học ở rạn san hô. Từ đó có những biện pháp để bảo vệ nguồn lợi các cá khoang cổ và hải quỳ trước sự tác động của biến đổi khí hậu. 4 CHƯƠNG I: TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan về vùng nghiên cứu  Vị trí địa lí Khánh Hòa là một tỉnh duyên hải Nam Trung Bộ Việt Nam, có hình dạng thon dài hai đầu và phình ra ở giữa, ba mặt giáp với núi và một mặt giáp với biển. Hướng bắc giáp với tỉnh Phú Yên, hướng tây bắc giáp với tỉnh Đắk Lắk, hướng tây nam giáp với tỉnh Lâm Đồng, hướng nam giáp với tỉnh Ninh Thuận và hướng đông giáp với Biển Đông (Nguyễn Thế Biên và ctv, 2006). Ngoài phần lãnh thổ trên đất liền, tỉnh Khánh Hòa còn có vùng biển, vùng thềm lục địa, các đảo ven bờ và huyện đảo Trường Sa. Tỉnh Khánh Hòa có tổng diện tích là 5197 km2, trong đó diện tích vùng biển rộng gấp nhiều lần so với đất liền, đường bờ biển dài 385 km kéo dài từ xã Đại Lãnh tới cuối vịnh Cam Ranh (Nguyễn Thế Biên và ctv, 2006). Khánh Hòa được bao bởi nhiều hòn đảo lớn nhỏ chạy dọc ven biển, cùng với các đảo san hô tuyệt đẹp ở huyện đảo Trường Sa và các dãy núi từ đất liền lấn ra biển tạo thành những đầm vịnh kín gió, làm nên những nét độc đáo của vùng đất nơi đây. Ninh Vân Hình 1.1 – Bản đồ tỉnh Khánh Hòa – Việt Nam (Nguồn: https://www.google.com/maps)  Sông ngòi Tỉnh Khánh Hòa nằm trong vùng địa lí vừa có vùng biển rộng vừa có các dãy núi bao bọc xung quanh, địa hình không bằng phẳng nên sông ngòi ở đây nhìn chung ngắn, độ dốc dòng chảy lớn, mức độ tập trung lũ cao, dễ gây nên lũ quét đột ngột (Nguyễn Thế Biên và ctv, 2006). Hầu hết, các con sông đều bắt nguồn tại vùng núi phía Tây trong tỉnh và chảy xuống biển phía Đông. 5 Cả tỉnh có khoảng 40 con sông dài từ 10 km trở lên, tạo thành một mạng lưới sông phân bố dày đặc, dọc bờ biển, cứ khoảng 5 - 7 km có một cửa sông (Nguyễn Thế Biên và ctv, 2006). Các con sông lớn ở Khánh Hòa phải kể đến: sông Cái Nha Trang, sông Dinh, sông Tô Hạp; riêng khu trung tâm thành phố Nha Trang nằm giữa hai con sông là sông Cái và sông Bé (Thư viện tỉnh Khánh Hòa, 2010).  Khí hậu Khánh Hòa nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa Đông Nam Á và nằm ở vĩ độ thấp, gần về xích đạo nên nhiệt độ ở đây cao hơn một số tỉnh khu vực phía Bắc. Khánh Hòa có hai mùa mưa nắng rõ rệt, có mùa đông ngắn, ít lạnh (tháng 9 đến tháng 12) và mùa nắng nóng kéo dài hơn (tháng 1 đến tháng 8). Khí hậu quanh năm ôn hòa, nhiệt độ trung bình khoảng 260 C (Nguyễn Thế Biên và ctv, 2006).  Nguồn lợi sinh vật biển Với những lợi thế về vị trí địa lí và khí hậu ôn hòa, tỉnh Khánh Hòa có nguồn tài nguyên đa dạng phong phú, đặc biệt là nguồn tài nguyên biển. Độ đa dạng sinh học các loài sinh vật biển cao, có tới 350 loài san hô đang quần tụ và phát triển, chiếm 45% loài được tìm thấy trên thế giới. Sống cùng với hệ sinh thái này là trên 2000 loài sinh vật đáy và cá cùng nhiều hải sản có giá trị kinh tế cao như tôm hùm, bào ngư, trai ngọc, hải sâm...(Mai Chi, 2013). Khánh Hòa trước đây là nơi chịu ít sự tác động của biến đổi khí hậu hơn các tỉnh khác. Nhưng hiện nay, biến đổi khí hậu đã và đang ảnh hưởng trực tiếp đến Khánh Hòa. Ở Khánh Hoà đã bắt đầu xuất hiện một số dấu hiệu cảnh báo sự thay đổi của khí hậu: giá trị tuyệt đối của nhiệt độ cao đến 39.20 C, mực nước biển cũng có xu thế gia tăng, bước đầu xác định được những vùng nhạy cảm, có nguy cơ bị ảnh hưởng cao do tác động của khí hậu biến đổi (Nguyễn Tác An và Nguyễn Kỳ Phùng, 2014). Chính điều này đã tác động đến hệ sinh thái, đặc biệt là rừng ngập mặn, san hô, cỏ biển… ở các khu vực ven biển, đầm vịnh, hải đảo; đồng thời làm giảm thiểu nguồn lợi thủy sản và ảnh hưởng đến độ đa dạng các loài cá biển nơi đây. 1.2Tổng quan về cá khoang cổ và hải quỳ 1.2.1 Tổng quan về cá khoang cổ  Phân loại và phân bố Cá khoang cổ (còn gọi là cá Hề) thuộc họ cá Thia (Pomacentridae) - họ lớn nhất trong bộ cá Vược (Perciformes).Trên thế giới hiện nay có khoảng 29 loài đã được phân 6 loại, trong đó 28 loài thuộc giống Amphiprion và 1 loài thuộc giống Premnas (Fautin và Allen, 1992). Cá khoang cổ đa số sống ở vùng biển nhiệt đới, trong đó khoảng 70% hiện diện ở khu vực Ấn Độ - Tây Thái Bình Dương (Myers, 1991). Tại Việt Nam xác định có 7 loài cá khoang cổ, toàn bộ cá khoang cổ phân bố tại Việt Nam đều thuộc giống Amphiprion. Cá khoang cổ phân bố nhiều ở vùng biển miền Trung, mà chủ yếu là ở tỉnh Khánh Hòa, chúng cư trú trong một số hòn đảo của Nha Trang như hòn Tằm, hòn Miếu, hòn Mun, hòn Tre… (Hà Lê Thị Lộc, 2009).  Đặc điểm sinh học Cá khoang cổ là loài có kích thước nhỏ, màu sắc đẹp thường sử dụng làm cá cảnh. Tùy thuộc vào từng loài khác nhau mà chúng có màu sắc khác nhau như màu cam, hồng, đỏ, nâu hay màu đen. Đa số chúng có từ một đến ba sọc trắng trên cơ thể (có thể xuất hiện màu xám) với viền xung quanh có màu tối (thường là màu viền đen) (Allen, 1972). Cá khoang cổ là loài lưỡng tính, lúc mới sinh tất cả đều mang giới tính đực. Về sau, khi đạt đến một kích thước nhất định, cá thể đực thành thục sinh dục lớn nhất trong đàn sẽ tự biến đổi giới tính của mình để thành cá thể cái, sau đó kết đôi với một cá thể đực khác. Nếu cá thể cái bị chết hoặc biến mất vì một lí do nào đó, cá thể đực lớn nhất và trội nhất trong đàn sẽ biến đổi giới tính để thay thế cá thể cái, tuy nhiên có những cá thể vẫn giữ mãi giới tính đực cho đến khi chết (Allen, 1972). Cá thể cái thường to hơn cá thể đực và cá thể đực có nhiệm vụ bảo vệ lãnh thổ. Theo Hattori (1991) sự chuyển đổi giới tính của cá khoang cổ diễn ra theo ba chiều hướng sau: (1) Cá thể đực chưa trưởng thành => cá thể cái chưa trưởng thành => cá thể cái trưởng thành. (2) Cá thể đực chưa trưởng thành => cá thể đực trưởng thành => cá thể cái trưởng thành. (3) Cá thể đực chưa trưởng thành => cá thể đực trưởng thành.  Tập tính sống Trong tự nhiên, cá khoang cổ thường sống theo đôi hoặc sống theo đàn, sinh trưởng chậm, thức ăn chính là mùn bã hữu cơ và động vật đáy (Fautin và Allen 1992). Cá khoang cổ sống cộng sinh với hải quỳ và chúng là loài cá duy nhất không bị nhiễm độc bởi hải quỳ. Bên ngoài cơ thể của cá khoang cổ được phủ một chất nhầy có thể trung hòa được độc tố từ những xúc tu của hải quỳ giúp bảo vệ chúng sống trong hải quỳ an toàn (Guiter, 1996). Cá khoang cổ ăn các động vật không xương sống có nguy cơ làm hại đến hải quỳ, phân của cá cung cấp chất dinh dưỡng cho hải quỳ, đồng thời chúng còn làm sạch chất bẩn và các sinh vật bám trên hải quỳ. Ngược lại, hải quỳ được xem là ngôi nhà 7 cho cá khoang cổ sinh sống, chúng bảo vệ cá khoang cổ tránh khỏi những động vật ăn thịt nhờ vào các xúc tu có tiết chất độc của mình, nhờ đó mà cá khoang cổ được bảo vệ an toàn, tránh được sự tấn công của các loài ăn thịt khác (Fautin và Allen, 1992). Kích thước của cá khoang cổ phụ thuộc vào vật chủ hải quỳ mà chúng sống cộng sinh. Cá sống với hải quỳ kích thước lớn sẽ tăng trưởng nhanh hơn cá sống với hải quỳ kích thước nhỏ (Fautin, 1991). Màu sắc của cá thay đổi tùy theo giai đoạn phát triển của cơ thể, vị trí địa lí và phụ thuộc vào vật chủ hải quỳ, cùng một loài cá khoang cổ nhưng sống với các loại hải quỳ có màu sắc khác nhau sẽ khác nhau. Vì vậy, cá khoang cổ có màu sắc vô cùng đa dạng và phong phú (Fautin và Allen, 1992). 1.2.2 Tổng quan về hải quỳ  Phân loại, phân bố Hải quỳ (hải quỳ biển - sea anemone) là một nhóm động vật ruột khoang rất đơn giản, có quan hệ gần gũi với san hô, sứa, thủy tức… chúng thuộc bộ Actiniaria, ngành ruột khoang (Cnidaria), lớp san hô (Anthozoa). Hiện có khoảng 1200 loài hải quỳ được tìm thấy ở những độ sâu khác nhau trên khắp các đại dương của thế giới, trong đó phân bố đa dạng nhất ở ven các bờ biển nhiệt đới (Estefânia và ctv, 2014).  Cấu trúc và đặc điểm sinh học Hải quỳ chủ yếu có dạng hình ống, cơ thể của chúng rất đơn giản, phía dưới là đĩa bám thường dùng để bám vào các giá thể, phía trên là đĩa miệng chứa miệng ở vị trí trung tâm và xung quanh có các xúc tu xếp thành nhiều vòng (Hình 1.2). Xúc tu của hải quỳ rất mềm, có khả năng co giãn mạnh, trên xúc tu có nhiều tiêm mao và các tế bào gai, các xúc tu này thường được hải quỳ sử dụng để bắt mồi, kiếm thức ăn và tự vệ trước kẻ thù (Fautin và Allen, 1994). Trên đĩa miệng của hải quỳ có hai loại xúc tu: endocoelic là các xúc tu nằm bên trong đĩa miệng, sắp xếp tỏa tròn bao gồm hai hoặc nhiều vòng xúc tu kéo dài tới tận rìa đĩa miệng; exocoelic là các xúc tu ở ngoài rìa đĩa miệng, thường dài hơn các xúc tu endocoelic, một loài hải quỳ có thể có một hoặc cả hai loại xúc tu này (Fautin, 2008). Trên thân hải quỳ có thể có các nốt sần (verrucae), sự hiện diện hay vắng mặt của nốt sần là một chỉ tiêu quan trọng để định danh chúng (Fautin, 2008). Phương thức sinh sản chủ yếu của hải quỳ là sinh sản hữu tính tuy nhiên chúng cũng có thể sinh sản sinh dưỡng vô tính (Klinkenberg, 2015), đặc tính này rất hữu ích cho hải quỳ đặc biệt khi chúng bị mắc kẹt vào một tảng đá không có các loài của giới tính khác. Một số loài có thể tách ra một phần nhỏ của thân chúng sau đó phát triển thành một hải 8 quỳ hoàn thiện. Một số loài có thể nhân bản theo hai hướng cùng một lúc, từ từ tách đôi theo chiều dọc, kết quả của cả hai phương pháp đều cho hai cá thể giống hệt nhau về hình thái và di truyền (Klinkenberg, 2015). Hình 1.2 – Cấu trúc chung của hải quỳ Hải quỳ thường dành phần lớn thời gian bám chặt vào đất đá dưới đáy biển hoặc trên các rạn san hô chờ đợi con mồi. Chúng chỉ rời khỏi đó khi bị tấn công hoặc môi trường sống thay đổi và khó kiếm thức ăn bằng cách trượt trên đĩa bám. Thân của hải quỳ thường chôn sâu hoặc ẩn vào cát, bùn, khe nứt trong đá hoặc rạn san hô. Khi thủy triều xuống thấp các khe nứt, mặt dưới của tảng đá…vẫn mát và ẩm ướt giúp hải quỳ duy trì được sự sống (Fautin và Allen, 1994). Hải quỳ là loài có sự thay đổi về hình thái, chúng là một trong những thành viên đa dạng nhất của lớp san hô, có sự đa dạng rất lớn trong giải phẫu, hình thái thân và hình thái các xúc tu. Hình thức bên ngoài của hải quỳ có thể ngắn hay dài, mảnh hay dày, nhọn hay tù, hình cầu hoặc hình cây (Rodriguez và ctv 2014). Khi trong nước chúng xòe các xúc tu ra như một bông hoa, khi ra khỏi nước thường co các xúc tu rụt vào trong cơ thể để tránh bị khô (Klinkenberg, 2015).  Tập tính sống Trong tự nhiên, hải quỳ thường sống cộng sinh với một số loài sinh vật khác như ốc, tôm, tảo…và đặc biệt là cá khoang cổ. Hải quỳ lấy dinh dưỡng hằng ngày từ tảo cộng sinh với chúng (zooxanthellae) và tiêu thụ chất thải từ động vật sống chung như cá khoang cổ. Các mối quan hệ cộng sinh này luôn đem lại lợi ích cho đôi bên, để cùng nhau tồn tại và phát triển trong đại dương (Fautin, 2008; Fautin và Allen, 1992). 9 1.3. Phương pháp phân loại bằng hình thái và di truyền Hình 1.3 – Hai phương pháp dùng để phân loại:(1) Phương pháp phân loại bằng hình thái; (2) Phương pháp phân loại bằng di truyền (Nguồn: http://ibol.org/about-us/what-is-dna-barcoding/) 1.3.1 Phân loại bằng hình thái Phương pháp phân loại dựa trên những đặc điểm hình thái bên ngoài được sử dụng phổ biến, dựa vào những quan sát trực tiếp từ bên ngoài: cấu tạo, hình dạng và màu sắc của cơ thể. Sau đó tiến hành đo và đếm các chỉ tiêu phân loại: kích thước toàn thân và từng bộ phận trên cơ thể … Phương pháp này cần thu thập nhiều dữ liệu có liên quan đến việc phân loại, sau đó so sánh giữa những cá thể để tìm ra những điểm chung và những điểm khác biệt, từ đó có những cơ sở để rút ra kết luận phân loại (Vũ Trung Tạng và Nguyễn Đình Mão, 2005). Phương pháp phân loại dựa vào hình thái có nhiều thuận lợi vì các dấu hiệu dễ dàng nhìn thấy, thao tác đơn giản, dễ thực hiện và nhanh chóng. Tuy nhiên, phương pháp này không giải quyết được triệt để mọi vấn đề của khoa học hiện đại. Phân tích hình thái truyền thống không phải lúc nào cũng cung cấp đầy đủ thông tin chính xác. Hình thái bên ngoài của những loài gần giống nhau có thể gây ra nhầm lẫn, đòi hỏi người thực hiện phải có kinh nghiệm. Nếu mẫu bị hư hỏng hoặc đang trong giai đoạn chưa phát triển sẽ gây khó khăn cho công tác phân loại (Vũ Trung Tạng và Nguyễn Đình Mão, 2005). Do đó cần thiết phải có một số phương pháp khác bổ sung để tăng độ tin cậy của quá trình phân loại, trong đó việc kết hợp với phương pháp di truyền được cho là có độ tin cậy, độ nhạy và tính chính xác cao (Hillis, 1987). 1.3.2 Phân loại bằng di truyền 1.3.2.1 Hệ gen nhân, hệ gen ty thể và các chỉ thị chọn lọc Hệ gen (genome) là toàn bộ các gen trong tế bào của cơ thể sinh vật, chứa toàn bộ thông tin di truyền đặc trưng cho từng loài, cho từng cá thể trong loài. Trong một tế bào của cơ thể, song song tồn tại 2 hệ gen bao gồm hệ gen nhân (nuclear genome) và hệ gen ty thể (mitochondrial genome, đối với động vật) hoặc lạp thể (chloroplast, đối với thực 10 vật). Hai hệ gen này đều có sản phẩm riêng, hoạt động có tính chất vừa độc lập, vừa tương tác. Genome của tế bào đa phần nằm ở trong nhân (khoảng 99%), tuy nhiên nhân không phải là nơi duy nhất chứa vật chất di truyền, trong ty thể, lạp thể… cũng có gen của riêng mình (Chial và Craig, 2008). Hệ gen trong nhân thường có kích thước lớn hơn 3 tỷ base pairs (khoảng 3,3 tỷ base pairs ở người) và phân bố trên các nhiễm sắc thể dạng thẳng. Hệ gen trong ty thể thì nhỏ hơn (16.569 base pairs ở người) và tồn tại độc lập ở dạng vòng khép kín (Chial và Craig, 2008) (Hình 1.4). Hình 1. 4 – So sánh hệ gen ty thể và hệ gen nhân Trong tế bào, DNA ty thể (mtDNA) chiếm 1 đến 5% DNA của tế bào, gồm các gen không có đoạn intron. Ở người, mtDNA chứa 37 gen, tất cả các gen này là rất cần thiết cho các hoạt động bình thường của ty thể (Chial và Craig, 2008). Trong đó 13 gen mã hóa cho các protein là các enzyme tham gia vào quá trình phosphoryl hóa oxy hóa, đây là một quá trình sử dụng oxy và đường đơn để tạo ra các loại đường adenosine triphosphate (ATP), nguồn năng lượng chính của tế bào. Ngoài ra còn có 2 gen RNA ribosome, 22 gen RNA vận chuyển, một vùng không mã hoá (non-coding region) và một số tiểu phần khác chúng góp phần tạo nên những protein hoạt động (Wolstenholme, 1992). Do có kích thước nhỏ, lại chứa gen tối cần thiết cho hoạt động sống của tế bào, nên ty thể được xem là đối tượng lý tưởng để khảo sát sự biến đổi trong hệ gen, phục vụ cho các nghiên cứu về giám định, phân loại và lập phả hệ quần thể. Các gen trong ty thể lại có hệ số biến đổi nhanh hơn hệ gen nhân 10-15 lần, nên rất thuận lợi cho nghiên cứu về tiến hoá. Các gen ty thể trong các loài có quan hệ gần về sinh học có sự bảo tồn rất cao, do vậy, bất cứ sự thay đổi nhỏ nào cũng là dấu hiệu giá trị trong giám định và phân loại. Các chỉ thị (marker) của DNA ty thể thường được sử dụng là các gen mã hóa 12S rRNA, 16S rRNA, cytochrome b, 11 cytochrome oxydase, tRNA và một số vùng không mã hóa như vùng liên gen trnF-cox3, atp6-trnM, cox1-cox2, cox3-trnK, nad1-trnP (Grande và ctv, 2008). Tuy nhiên, việc sử dụng DNA ty thể cũng có một số giới hạn, kích thước của DNA ty thể nhỏ, nên chỉ thể hiện một phần vật chất di truyền. Vì vậy nên sử dụng kết hợp các chỉ thị phân tử khác để có kết quả với độ chính xác cao (Hebert và ctv, 2004). Các marker DNA ty thể được sử dụng kết hợp với marker DNA nhân như 18S, 5.8S, 28S… được sử dụng trong một số trường hợp để cho thấy mối quan hệ tiến hóa rõ hơn (Schander và ctv, 2005). 1.3.2.2 Ứng dụng kĩ thuật di truyền trong phân loại Phương pháp phân loại dựa vào di truyền là một phương pháp hiện đại, tiếp cận nhanh chóng và chính xác. Khác với việc phân tích DNA hỗn hợp, việc phân tích một gen xác định có lợi thế và tiện dụng hơn. Kỹ thuật di truyền mã vạch DNA - barcoding (Hebert và ctv, 2003) tập trung phân tích trên một đoạn ngắn của hệ gen, sử dụng một cặp mồi chung để khuếch đại đoạn DNA mục tiêu, rồi dựa trên dữ liệu di truyền thu được để xác định các loài một cách nhanh chóng và chính xác. Những tiến bộ mới trong lĩnh vực sinh học phân tử cho phép so sánh một số lượng lớn các loài có quan hệ gần gũi có thể sử dụng trong phân tích phát sinh loài (Chial và Craig, 2008). Phương pháp di truyền hiện đại có thể cung cấp cơ sở khoa học cho việc bảo tồn các hệ sinh thái, cùng với quần thể các loài phân bố trong khu hệ sinh thái và tính đa dạng di truyền của chúng (Ovenden và ctv, 2013; Willette và ctv, 2014). Các chỉ thị sinh học phân tử đã được nghiên cứu và ứng dụng như là một công cụ hỗ trợ đắc lực cho công tác định danh loài. Các chỉ thị sinh học phân tử dùng trong định danh và nghiên cứu di truyền thường là những trình tự có tính bảo tồn cao và biến dị khác biệt giữa các loài nên các DNA ty thể được xem là những đoạn gen có vai trò quan trọng, được sử dụng nhiều trong chỉ thị sinh học phân tử. Theo Teletchea (2009), sử dụng DNA ty thể là công cụ hữu hiệu trong phân loại các loài cá, ngoài ra chúng còn được áp dụng cho nhiều loài động vật khác như giáp xác, động vật lưỡng cư… Các nghiên cứu về di truyền cá khoang cổ cũng chứng minh sự hữu ích của DNA ty thể, Litsios và ctv (2014) đã sử dụng gen 16S mtDNA nghiên cứu thành công sự phát sinh loài của các loài cá khoang cổ. Một số nghiên cứu khác áp dụng các chỉ thị gen ty thể nghiên cứu di truyền các loài cá khoang cổ cũng chỉ ra rằng sử dụng gen ty thể rất hiệu 12 quả để định danh và nghiên cứu mối quan hệ tiến hóa của cá khoang cổ (Santini và ctv, 2006; Li và ctv, 2015). Tuy nhiên, trên thực tế, sử dụng một cặp mồi chung khuếch đại đoạn gen trong DNA ty thể có thể định danh được đến loài ở hầu hết các ngành thuộc hệ thống phân loại động vật ngoại trừ ngành ruột khoang Cnidaria (Herbert và ctv, 2004). Do đó việc sử dụng các gen ty thể để định danh các loài hải quỳ là không hiệu quả. Trong hệ gen nhân có một tổ hợp gen quan trọng gọi là tổ hợp ADN ribosome (rDNA), bao gồm các khung gen do 18S - ITS1 – 5.8S - ITS2 - 28S hợp thành. Mỗi một hệ gen có nhiều khung gen nối tiếp nhau. Bất kỳ sự thay đổi nào của các gen quan trọng cũng dẫn đến sự biến đổi hệ gen có tính chất đặc trưng của loài vì vậy bất kì gen ribosome nào (18S, 5.8S, 28S) hay vùng giao gen (ITS1, ITS2) đều được sử dụng trong phân tích phân loại (Wilmer, 2008). Các nghiên cứu di truyền cũng phát hiện ra rằng DNA ty thể phát triển chậm trong hải quỳ và các loài khác trong ngành ruột khoang (Hebert và ctv, 2003), sự tiến hóa của DNA ty thể chậm hơn so với những động vật biển khác 100 lần hoặc hơn (Hellberg, 2007). Nghiên cứu của Shearer và ctv (2002) cho thấy, không giống như tất cả các loài sinh vật đa bào khác, mức độ đột biến trong gen nhân ở lớp anthozoan (lớp san hô) cao hơn nhiều so với ở các gen ty thể. Vì vậy phức hợp các gen ribosome trong nhân 18S ITS1 - 5.8S - ITS2 - 28S được xem là lý tưởng để xác định tới mức loài trong ngành ruột khoang Cnidaria (Commas 1991; Odorico và Miller 1997). Sergiovà ctv (2014) đã sử dụng các chỉ thị gen 16S mtDNA và 18S rDNA, 28S rDNA nghiên cứu di truyền các loài hải quỳ. Kết quả cho thấy chỉ thị gen 16S mtDNA không thể hiện rõ sự phân tách di truyền của hải quỳ ngoại trừ bộ Ceriantharia; các chỉ thị gen ribosome còn lại hỗ tợ tốt cho nghiên cứu di truyền hải quỳ hơn gen ty thể. 1.4 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 1.4.1 Nghiên cứu về cá khoang cổ trong và ngoài nước  Nước ngoài Cá khoang cổ và vật chủ của chúng (hải quỳ) đã được chú ý và nuôi làm cảnh từ cuối thế kỉ XIX, tuy nhiên những hiểu biết về đặc điểm sinh học của chúng mãi tới gần giữa thế kỉ XX mới được nghiên cứu. Allen (1972) đã nghiên cứu và phân loại cá khoang cổ dựa trên đặc điểm hình thái như tỉ lệ cơ thể, số lượng tia gai ở các vây, hình dạng vẩy ở đầu… Trong đó, chỉ tiêu hình thái quan trọng để phân loại những loài cá này là dựa vào màu sắc của chúng. Cũng vào năm đó, Allen phát hành cuốn sách “The Anemonefishs”, 13 mô tả đặc điểm sinh học của 21 loài cá khoang cổ. Năm 1975, Allen tái bản lần thứ hai cuốn sách này và bổ sung 5 loài cá Khoang cổ mới. Nghiên cứu hoàn thiện nhất về phân loại cá khoang cổ dựa vào đặc điểm hình thái được ghi nhận là của Fautin và Allen (1992). Hai tác giả đã phân loại được tổng cộng 28 loài cá khoang cổ thuộc giống Amphiprion, cung cấp đầy đủ thông tin về đặc điểm hình thái, tập tính sống, sinh sản và phân bố của chúng. Trên thế giới đã có nhiều công trình nghiên cứu phân loại cá khoang cổ dựa vào chỉ thị di truyền. Trong đó, Elliott và ctv đã sử dụng gen cytochrome b và gen 16S rRNA phân loại 6 loài cá khoang cổ đại diện cho 4 phân giống (Subgenus) cơ bản là Actinicola, Paramphiprion, Phalerebus và Amphiprion (trong đó 5 loài thuộc giống Amphiprion, 1 loài giống Premnas). Ông đã xây dựng cây phân loại và cung cấp mối quan hệ di truyền giữa các loài cá khoang cổ nằm trong 4 phân giống đại diện cho 28 loài cá khoang cổ đã được biết trên thế giới (Elliott và ctv, 1999). Năm 2006, Santini và ctv đã nghiên cứu sự tiến hóa của 23 loài cá khoang cổ tại Ý, trong đó ông đã xây dựng cây phân loại dựa trên gen 16S mtDNA và phân tích sự tiến hóa của các loài cá khoang cổ. Boonphakdee và Sawangwong cũng sử dụng hai đoạn gen cytochrome b và 16S rRNA để phân loại cá khoang cổ ở Thái Lan bằng PCR – RELP (Restriction Endonuclease Length Polymorphism). Nghiên cứu này đã phân loại được 7 loài cá khoang cổ, trong đó, 6 cá thể thuộc giống Amphiprion và 1 cá thể thuộc giống Premnas (Boonphakdee và Sawangwong, 2008). Trong khi đó Steinke và ctv (2009) đã sử dụng gen cytochrome c oxidase tiểu đơn vị I (COI) phân loại được 3 loài Amphiprion akallopsisos, A. perideraion và A. sandarcinos. Litsios đã nghiên cứu di truyền, xây dựng cây phát sinh loài của 28 loài cá khoang cổ từ đảo Galapagos dựa trên gen ty thể. Nghiên cứu đã cung cấp những dữ liệu về mối quan hệ phát sinh loài của các loài cá khoang cổ đồng thời nghiên cứu được mối quan hệ hỗ trợ cộng sinh giữa hải quỳ và cá khoang cổ (Litsios và ctv, 2012). Gần đây nhất, Li và ctv nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài dựa trên gen ty thể của 7 loài cá khoang cổ thuộc giống Amphiprion và 1 loài thuộc giống Premnas đại diện cho 4 phân giống trong hệ thống phân loại của cá khoang cổ. Kết quả nghiên cứu của Li giống với nghiên cứu của Elliott (1999), ông đã cung cấp những dữ liệu về sự tiến hóa phát sinh loài của các loài cá khoang cổ nằm trong 4 phân giống cơ bản (Li và ctv, 2015). 14  Trong nước Ở Việt Nam, năm 1993, báo cáo của WWF (Quỹ quốc tế bảo vệ thiên nhiên) về “Nghiên cứu tính đa dạng sinh học, sử dụng nguồn lợi ở Hòn Mun - Nha Trang” cho thấy sự hiện diện của 4 loài cá khoang cổ là Amphiprion clarkii, A. frenatus, A. perideraion và A. polymnus. Đào Tấn Hổ và ctv, sau 8 chuyến điều tra đã bổ sung một loài cá khoang cổ ở vùng biển Nha Trang là loài Amphiprion sandaracinos (Đào Tấn Hổ và ctv, 2000). Từ năm 2000, các nhà khoa học thuộc Phòng Công nghệ sinh học nuôi trồng, Viện Hải dương học Nha Trang đã tiến hành nghiên cứu các đặc điểm sinh học và cho sinh sản nhân tạo thành công loài cá khoang cổ cam (Amphiprion ocellaris), cung cấp được 2.000 con giống có kích cỡ khoảng 3 - 4cm. Năm 2005, Hà Lê Thị Lộc đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu cơ sở sinh học phục vụ cho sinh sản cá khoang cổ (Amphiprion sp.) vùng biển Khánh Hòa” trong Luận án Tiến Sĩ Ngư Loại Học của mình. Hà Lê Thị Lộc đã nghiên cứu và phân loại hai loài Amphiprion clarkii và Amphiprion frenatus dựa trên các đặc điểm hình thái. Astakhov đã khảo sát thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Việt Nam, ông đã xác định sự hiện diện 5 loài cá khoang cổ ở vùng biển Khánh Hòa gồm Amphiprion clarkii, A. frenatus, A. polymnus, A. perideraion và A. sandaracinos. Tại đảo Côn Sơn có 4 loài cá khoang cổ: A. frenatus, A. polymnus, A. perideraion và A. sandaracinos và đảo Bạch Long Vĩ có 4 loài cá khoang cổ: Amphiprion clarkii, A. polymnus, A. perideraion và A. sandaracinos (Astakhov, 2001; Astakhov và ctv, 2008; Astakhov, 2012). Hiện nay trong nước vẫn chưa có công bố nào về nghiên cứu phân loại cá khoang cổ dựa vào chỉ thị sinh học phân tử. 1.4.2 Nghiên cứu về hải quỳ trong và ngoài nước  Nước ngoài Về mặt hình thái, Fautin (2008) đã phân loại 19 loài hải quỳ ở vịnh Moreton phía đông Australia dựa trên phân tích mô học và các đặc điểm bên ngoài như màu sắc, hình thái thân, sự hiện diện hay vắng mặt của các nốt sần trên thân, hình dạng và sự sắp xếp các xúc tu trên đĩa miệng, số lượng xúc tu… Một năm sau đó, Fautin (2009) đã phân loại 16 loài hải quỳ thuộc 7 họ ở Singapore. Năm 2012, Kostina đã nghiên cứu 6 loài hải quỳ thuộc 5 họ: Edwardsiidae, Andvakiidae, Condylanthidae, Actiniidae, Metridiidae dựa trên 56 mẫu có ở vịnh Amursky (Nhật Bản) được thực hiện bởi 15 Zhirmunsky từ năm 1981 đến 2007. Ông đã cung cấp những dữ liệu về hình thái, phân bố địa lí và nơi sống phổ biến của các loài này. Nghiên cứu hoàn thiện nhất về hình thái hải quỳ được ghi nhận là của Fautin và Allen (1994), hai tác giả đã phát hành cuốn sách “Anemone Fishes and Their Host Sea Anemones” cung cấp những dữ liệu về đặc điểm hình thái, nơi sống, tập tính sống của 37 loài hải quỳ và 24 loài cá khoang cổ. Về di truyền, Wilmer và ctv sử dụng đoạn gen ribosome khuếch đại thành công 6 loài hải quỳ đại diện từ vịnh Moreton: Anemonea sp., Heteractis malu, Stichodactyla haddoni, Entacmaea quadricolor, Macrodactyla doreensis, Oulactis muscosa (Wilmer và ctv, 2008). Cũng vào năm này, các nhà khoa học Mỹ do Daly (2008) đứng đầu đã nghiên cứu các mối quan hệ phát sinh loài trong hải quỳ. Nghiên cứu này đã phân tích 48 loài hải quỳ từ hai gen ty thể (12S, 16S) và hai gen nhân (18S, 28S). Kết quả chỉ ra rằng sự tiến hóa phân tử trong DNA ty thể hải quỳ phát triển chậm bất thường, tuy nhiên gen 12S hỗ trợ xác định các mối quan hệ trong hải quỳ tốt hơn gen 16S và dữ liệu từ cả hai gen 18S và 28S hỗ trợ rất tốt cho việc nghiên cứu mối quan hệ phát sinh loài trong hải quỳ.  Trong nước Tại Việt Nam, Astakhov (2001) nghiên cứu khảo sát thành phần các loài hải quỳ và xác định vùng biển Khánh Hòa có sự hiện diện của 9 loài hải quỳ gồm Cryptodendrum adhaesivum, Entacmaea quadricolor, Macrodactyla doreensis, Heteractis aurora, H. crispa, H. magnifica, H. malu, Stichodactyla haddoni, và S. mertensii. Hải quỳ còn được sử dụng trong một số các nghiên cứu cộng sinh với cá khoang cổ của Hà Lê Thị Lộc. Ngoài các nghiên cứu trên thì chưa có công bố nào đáng kể về hình thái và di truyền của hải quỳ. 16 CHƯƠNG II: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng nghiên cứu Cá khoang cổ và hải quỳ được thu mua tại các tiệm bán cá cảnh ở tỉnh Khánh Hòa từ 10/11/2014 đến 30/4/2015. Mẫu sau khi thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm và tiến hành phân loại bằng hình thái ngay khi mẫu còn tươi. Tiến hành cắt mô cơ cá và hải quỳ, cố định trong cồn 960 và bảo quản lạnh ở -200 C để phục vụ cho các nghiên cứu về di truyền. Thay cồn cho các mẫu cá và hải quỳ trong ba ngày liên tiếp để loại bỏ các tạp chất và sắc tố để bảo quản mẫu được lâu hơn. 2.2 Phương pháp nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu chung: Thu mẫu cá khoang cổ và hải quỳ Phân loại cá khoang cổ và hải quỳ bằng hình thái  Đo các chỉ tiêu hình thái.  Đếm các chỉ tiêu phân loại.  Quan sát các chỉ tiêu hình thái đặc trưng. Phân loại cá khoang cổ và hải quỳ bằng di truyền  Tách chiết DNA tổng số.  PCR.  Điện di kiểm tra kết quả.  Gửi mẫu giải trình tự.  Xử lí số liệu di truyền và xây dựng cây phát sinh 2.2.1 Phân loại hình thái 2.2.1.1 Phân loại cá khoang cổ bằng hình thái Cá sau khi thu về phòng thí nghiệm được quan sát tổng thể bên ngoài cơ thể cá, sau đó tiến hành đo các chỉ tiêu hình thái (mm), cân trọng lượng (g) cơ thể, đếm các chỉ tiêu phân loại. Cá khoang cổ được phân loại theo khóa phân loại và mô tả của Allen (Allen,1975; Allen và ctv, 2005). 17 Hình 2.1 – Hình thái bên ngoài của cá khoang cổ (Allen, 1975)  Đo các chỉ tiêu hình thái Dùng tay hoặc kẹp để kéo căng các vây cá lên, sau đó dùng thước kẹp kĩ thuật có độ chính xác 0,02mm đo các chỉ tiêu hình thái của cá khoang cổ. Cách đo Dùng thước kẹp đo các chỉ tiêu hình thái sau: - Chiều dài toàn thân cá (L): đo từ mõm trên của cá đến điểm cuối của vây đuôi. - Chiều dài chuẩn (LS): đo từ mõm trên của cá đến cuống đuôi. - Chiều cao thân cá (H): đo phần cao nhất của thân cá, là khoảng cách ở điểm cao nhất giữa lưng và bụng. - Chiều dài đầu (T): đo từ mõm trên của cá đến điểm mút của xương nắp mang. - Chiều dài gốc vây lưng (lD): đo từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc gốc vây lưng (từ tia vây đầu tiên đến tia vây cuối cùng của gốc vây lưng) . - Chiều dài gốc vây hậu môn (lA): đo từ điểm khởi đầu đến điểm kết thúc vây hậu môn (từ tia vây thứ nhất đến tia vây hậu môn cuối cùng). - Chiều dài gốc vây ngực (lP): đo từ điểm khởi đầu gốc vây ngực đến cuối vây ngực. - Chiều dài gốc vây bụng (lV): đo từ điểm khởi đầu gốc vây bụng đến cuối vây bụng. Dùng kích hiển vi soi nổi có thang đo để đo các chỉ tiêu sau: - Chiều dài mõm (LM): đo từ mõm trên của cá đến viền trước của mắt. 18 Hình 2.2 – Các chỉ số đo trong phân loại cá khoang cổ (Allen 1975) - Đường kính mắt (DE): đo ở phần chính giữa mắt (đường kính ngang hoặc dọc của vành mắt).  Đếm các chỉ tiêu phân loại Dùng tay hoặc kẹp để kéo căng các vây cá lên đếm các tia vây cứng và tia vây mềm có trên các vây của cá khoang cổ. Các chữ đầu của tên tiếng Anh được dùng để kí hiệu cho vây. D (Dorsal): số lượng tia và gai vây lưng. V (Ventral): số lượng tia và gai vây bụng. A (Anal) : số lượng tia và gai vây hậu môn. P (Pelvic): số lượng tia và gai vây ngực. C (Caudal): số lượng tia và gai vây đuôi. Số tia gai cứng được kí hiệu bằng chữ số La Mã, còn số lượng tia vây mềm được kí hiệu bằng chữ số thường cách nhau bằng dấu phẩy, dao động giữa các mẫu ghi cách nhau bằng dấu gạch nối. Đếm số vẩy đường bên, số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn và số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng. Hình 2.3 –Các chỉ số đếm trong phân loại cá khoang cổ (theo Allen 1975) 19 2.2.1.2 Phân loại hải quỳ bằng hình thái Hải quỳ là loài động vật có sự thay đổi hình dáng bên ngoài khi rời khỏi nước, vì vậy cần phân loại hình thái sơ bộ ngay tại nơi thu mẫu, sau đó vận chuyển hải quỳ chứa trong nước biển về phòng thí nghiệm. Cho hải quỳ cùng nước biển vào chậu hoặc lọ có kích thước phù hợp với hải quỳ, đợi vài tiếng đồng hồ, khi hải quỳ trở về hình dạng ban đầu, lộ rõ những đặc điểm hình thái thì tiến hành quan sát cẩn thận hơn các đặc điểm riêng của từng loài hải quỳ, tiến hành đo các đặc điểm hình thái (mm), cân trọng lượng (g). Hải quỳ được phân loại theo khóa phân loại và mô tả của Fautin và Allen (1994), Fautin (2008) và Stampar và ctv (2014).  Quan sát các chỉ tiêu phân loại Quan sát những đặc điểm đặc trưng trên đĩa miệng và trên thân. - Đĩa miệng: quan sát màu sắc, họa tiết đặc trưng có trên đĩa miệng. - Xúc tu: quan sát hình dạng, kích cỡ, màu sắc của xúc tu. Sự sắp xếp của xúc tu trên đĩa miệng: các xúc tu sắp xếp dày đặc hay thưa thớt, sắp xếp xa hay gần miệng, sắp xếp theo hàng hay không. - Thân: quan sát trên thân có các nốt sần (verrucae) hay không, sự sắp xếp và hình dạng của chúng.  Đo các đặc điểm hình thái - Đường kính đĩa miệng: đo từ đầu bên này đến đầu bên kia của đĩa miệng (phần rộng nhất trên đĩa miệng). - Đường kính đĩa bám: đo khoảng cách lớn nhất giữa hai đầu của đĩa bám. - Chiều dài thân: đo từ phía dưới đĩa miệng đến chân đĩa bám (phần cao nhất của thân). - Chiều dài xúc tu: đo từ gốc đến đỉnh của xúc tu; chiều dài trung bình các xúc tu được tính bằng công thức: chiều dài của n xúc tu/n Hình 2.4 - Các chỉ tiêu đo của hải quỳ (Fautin và Allen, 1994) 20 2.2.2 Phân loại di truyền Sơ đồ tiến hành Tách chiết DNA tổng số PCR Điện di kiểm tra kết quả Đọc kết quả Gửi giải trình tự Xử lí số liệu, xây dựng cây phát sinh loài Hình 2.5 – Sơ đồ khối nội dung nghiên cứu di truyền cá khoang cổ 2.2.2.1 Phân loại cá khoang cổ bằng di truyền  Tách chiết DNA tổng số DNA tổng số của cá khoang cổ được tách chiết từ 20mg mẫu cơ từng cá thể bằng bộ kit Thermo Scientific Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific), quy trình thực hiện hai bộ kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (phụ lục 1a). Bảo quản DNA của cá khoang cổ trong tủ đông -400 C.  PCR Đoạn gen 16S mt DNA cá khoang cổ được khuếch đại với cặp mồi: 16Sar: 5’- CGCCTGTTTATCAAAAACAT- 3’ 21 16Sbr: 5’- CCGGTCTGAACTCAGATCACGT- 3’ (Palumbi và ctv, 1991). Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µL bao gồm: Buffer (1X) 2,5 µL dNTP (10µM) 0,5 µL 16Sar (10µM) 1 µL 16Sbr (10µM) 1 µL Taq Polymerase (5U/ µL) 0,125 µL Mẫu DNA 5 µL H2 O 14,875 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Biến tính ban đầu tại 940C trong 3 phút; sau đó là 38 chu kì của 940C trong 30 giây, nhiệt độ lai 480C trong 30 giây, 720C trong 1 phút cuối cùng là bước kéo dài tại 720C trong 7 phút. Hình 2.6 – Chu trình nhiệt của phản ứng PCR  Điện di kiểm tra kết quả Sản phẩm được điện di trên gel agarose 1.5% nhuộm Ethidium bromide để kiểm tra kết quả. Cách chuẩn bị gel agarose 1.5%  Cân 0,6g agarose cho vào 40ml đệm TBE 1X chứa trong bình tam giác 100ml.  Đun sôi trong lò vi sóng cho đến khi agarose tan hoàn toàn.  Để nguội đến 60-700C rồi chuyển sang bình tam giác 100ml thứ 2 (bình này có sẵn trong tủ riêng dùng để pha gel chạy điện di). 22  Thêm 1,5 µL Ethidium bromide (EtBr), lắc nhẹ tránh tạo bọt và trộn đều Ethidium bromide vào gel agarose.  Đổ gel ra khuôn đã lắp sẵn lược (lược 8 giếng hoặc lược 15 giếng).  Khi gel nguội và đông cứng lại rút nhẹ nhàng các bản lược ra theo phương thẳng đứng, tránh làm rách các giếng. Chạy điện di Cho gel đã chuẩn bị vào bể điện di và thêm đệm TBE 1X cho đến khi ngập bản gel, dùng micropipette trộn đều 3 µL mẫu với 1 µL loading dye 6X rồi cho vào các giếng của gel. Hút 3 µL DNA Ladder (thang marker DNA) vào một giếng sau đó tiến hành chạy điện di với nguồn điện 90V, 400mA trong 20 phút. Đọc kết quả Bản gel điện di được soi trên thiết bị UV Transilluminator. Sản phẩm của quá trình khuếch đại đối với cá khoang cổ là các band DNA có kích thước khoảng 650bp.  Giải trình tự DNA Sản phẩm PCR được gửi đến công ty THNHH Nam Khoa – thành phố Hồ Chí Minh giải trình tự. Phản ứng giải trình tự được tiến hành theo nguyên tắc Dey – labelles dideoxy terminator với các đoạn mồi tương tự như phản ứng PCR theo chương trình luân nhiệt sau: 960C trong 20 giây, 500C trong 20 giây, cuối cùng là 600C trong 4 phút. Sản phẩm sau đó được phân tích bằng thiết bị ABI Prism 3.700 DNA Analyser (Applied Biosystems). 2.2.2.2 Phân loại hải quỳ bằng di truyền  Tách chiết DNA tổng số Hải quỳ được tách chiết DNA tổng số từ 25mg mẫu cơ ở đĩa bám hoặc từ xúc tu bằng bộ kit Qiagen, quy trình thực hiện bộ kit theo hướng dẫn của nhà sản xuất (phụ lục 1b). Bảo quản DNA của hải quỳ trong tủ đông -400 C.  PCR Đoạn gen ribosome ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của hải quỳ được khuếch đại với cặp mồi: 18S seaanemone: 5’- GGCGACCCGCTGAATTCAAGCATAT - 3’ 28S seaanemone: 5’- GCTTTGGGCTGCAGTCCCAAGCAACCCACTC - 3’ (Wilmer và ctv, 2008) Phản ứng PCR được tiến hành với tổng thể tích 25µL bao gồm: Buffer (1X) 2,5 µL dNTP (10µM) 0,5 µL 18S seaanemone (10µM) 1 µL 23 28S seaanemone (10µM) 1 µL Taq Polymerase (5U/ µL) 0,125 µL Mẫu DNA 5 µL H2 O 14,875 Chu trình nhiệt của phản ứng PCR Biến tính ban đầu tại 940C trong 2 phút; sau đó là 35 chu kì của 940C trong 20 giây, nhiệt độ lai 550C trong 20 giây, 650C trong 45 giây cuối cùng là bước kéo dài tại 650C trong 5 phút.  Điện di kiểm tra kết quả Cách chuẩn bị gel agarose 1.5% và chạy điện di giống phần phân loại cá khoang cổ bằng di truyền. Đọc kết quả: Bản gel điện di được soi trên thiết bị UV Transilluminator. Sản phẩm của quá trình khuếch đại đối với hải quỳ là các band DNA có kích thước khoảng 800bp (Wilmer và ctv, 2008).  Giải trình tự DNA Tương tự trong phần phân loại cá khoang cổ bằng di truyền. 2.2.3 Phân tích dữ liệu và xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại  Kết nối trình tự và phân tích dữ liệu Các trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ và gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của hải quỳ được kết nối bằng chương trình Sequencher 4.1.4 (www.genecodes.com) và kiểm chứng với dữ liệu Genbank bằng chương trình BLAST (www.blast.ncbi.nlm.nih.gov/). Các trình tự được dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (Hall, 1999), sau đó trình tự được kiểm tra, chỉnh sửa bằng mắt thường, xác định mức độ tương đồng và sự khác biệt di truyền của các loài cá khoang cổ và hải quỳ. Sự khác biệt di truyền của các cặp trình tự các loài cần so sánh được tính theo công thức sau: Số nucleotide khác biệt Sự khác biệt di truyền = x 100% Tổng số nucleotide dóng hàng  Xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của cá khoang cổ 24 Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen 16S của DNA ty thể các mẫu cá khoang cổ, bao gồm 7 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở Khánh Hòa, Việt Nam và 12 trình tự từ Genbank. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6 (Tamura và ctv, 2013) dựa trên thuật toán Neighbor – Joining với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) 1000 lần, độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng để xác định tính chính xác của thuật toán. LoàiChrysiptera cyanea và Chrysiptera rollandi được sử dụng làm nhóm ngoại, thông tin về loài, khu vực nghiên cứu, nguồn tham khảo và mã số Genbank được trình bày ở Bảng 2.1. Bảng 2.1 – Trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ STT Loài Địa điểm thu Mã số mẫu Genbank Tác giả Nghiên cứu hiện tại 1 A. perideraion Khánh Hòa 2 A. rubrocinctus Thụy Sĩ 3 A. clarkii (black) Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại 4 A. clarkii Khánh Hòa Nghiên cứu hiện tại KJ833753.1 Litsios và ctv, 2014 (orange) 5 A. clarkii Thụy Sĩ 6 A. sandaracinos Khánh Hòa 7 A. allardi Thụy Sĩ KF264152.1 Litsios và ctv, 2014 8 A. pacificus Thụy Sĩ KF264174.1 Litsios và ctv, 2014 9 A. frenatus Khánh Hòa 10 A. akindynos Thụy Sĩ 11 A. polymnus Khánh Hòa 12 A. chagosensis Thụy Sĩ 13 A. ocelaris Khánh Hòa 14 A. nigripes Thụy Sĩ KF264170.1 Litsios và ctv, 2014 15 A. sebae Ấn độ HQ020377.1 John và ctv, 2010 16 A. tricinctus Thụy Sĩ KF264186.1 Litsios và ctv, 2014 17 A. percula Thụy Sĩ KF264176.1 Litsios và ctv, 2014 18 A. mccullochi Thụy Sĩ KF264168.1 Litsios và ctv, 2014 KF264159.1 Litsios và ctv, 2014 Nghiên cứu hiện tại Nghiên cứu hiện tại KF264151.1 Litsios và ctv, 2014 Nghiên cứu hiện tại KF819364.1 Litsios và ctv, 2014 Nghiên cứu hiện tại 25 19 A. latifasciatus Pháp JF457235.1 Hubert và ctv, 2012 20 Premnas Thụy Sĩ KF264189.1 Litsios và ctv, 2014 Mỹ AF114838.1 Elliott và ctv, 1999 Mỹ AY098629.1 Tang và ctv, 2004 biaculeatus 21 Chrysiptera cyanea * 22 Chrysiptera rollandi* (*) Loài có trình tự gen làm nhóm ngoại.  Xây dựng mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài hải quỳ Phân tích di truyền được tiến hành với trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của DNA ribosome các mẫu hải quỳ, bao gồm 2 trình tự của nghiên cứu hiện tại ở Khánh Hòa, Việt Nam và 5 trình tự từ Genbank. Cây phát sinh loài được xây dựng bằng phần mềm MEGA 6 (Tamura và ctv, 2013) dựa trên thuật toán Neighbor – Joining với giá trị bootstrap (độ tin cậy) (BT) 1000 lần, độ lặp lại ngẫu nhiên được áp dụng để xác định tính chính xác của thuật toán. Loài Leptogorgia virgulata được sử dụng làm nhóm ngoại, thông tin về loài, khu vực nghiên cứu, nguồn tham khảo và mã số Genbank được trình bày ở Bảng 2.2. Bảng 2.2 – Trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ STT 1 Loài Stichodactyla Địa điểm thu Mã số mẫu Genbank Tác giả Nghiên cứu hiện tại Khánh Hòa tapetum 2 Heteractis Singapore AF050209.1 Nelson và cttv (1999) magnifica 3 Macrodactyla Nghiên cứu hiện tại Khánh Hòa doreensis 4 Urticina Nga JQ844117.1 Bocharova (2012) Brazil JN118562.1 Gomes và ctv (2012) crassicornis 5 Actinia bermudensis 26 6 Aulactinia Mỹ EF026602.1 Acuna và ctv (2008) Brazil JN118561.1 Gomes và ctv (2012) Mỹ AY268464.1 LePard và ctv, 2003 marplatensis 7 Bunodosoma cangicum 8 Leptogorgia virgulata* (*) Loài có trình tự gen làm nhóm ngoại. 27 CHƯƠNG III: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 Phân loại hình thái 3.1.1 Thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa  Cá khoang cổ Qua 4 đợt thu mẫu liên tục trong 5 tháng (10/11/2014 – 30/4/2014), nghiên cứu đã thu 66 cá thể cá khoang cổ và đã xác định được vùng biển Khánh Hòa hiện diện 6 loài cá khoang cổ đều thuộc giống Amphiprion. Số lượng cá thể của mỗi loài trong các đợt được thể hiện ở Bảng 3.1. Bảng 3.1 – Kết quả thu mẫu cá khoang cổ Ngày thu mẫu Số lượng cá thể của mỗi loài A. clarkii A. frenatus A. sandaracinos A. polymnus A. perideraion A. ocellaris 14/11 19 1 4 0 8 0 2/12 0 0 2 13 9 0 2/4 0 0 0 0 0 10 Tổng 19 1 6 13 17 10 % cá thể 28.8% 1.5% 9.1% 19.7% 25.8 % 15.1% Danh sách các loài được trình bày ở Bảng 3.2. Bảng 3. 2– Danh sách các loài cá khoang cổ phổ biến ở Khánh Hòa – Việt Nam Bộ Họ Giống Phân giống Loài Perciformes Pomacentridae Amphiprion Phalerebus Amphiprion perideraion Amphiprion sandaracinos Amphiprion clarkii Amphiprion Amphiprion frenatus Paramphiprion Amphiprion polymnus Actinicola Amphiprion ocellaris Tên thường gọi Khoang cổ hồng Khoang cổ vàng Khoang cổ đen đuôi vàng Khoang cổ đỏ Khoang cổ yên ngựa Cá nemo 28  Hải quỳ Qua 7 đợt thu mẫu liên tục trong 3 tháng (1/2/2015 – 30/4/2014), bước đầu nghiên cứu xác định vùng biển Khánh Hòa hiện diện 7 loài hải quỳ thuộc 6 giống, 4 họ, 2 bộ. Số lượng cá thể của mỗi loài trong các đợt được thể hiện ở Bảng 3.3. Bảng 3.3 – Kết quả thu mẫu hải quỳ Ngày thu Số lượng cá thể của mỗi loài mẫu S. tapetum S. haddoni E. quadricolor 6/2 11/2 M. doreensis H. aurora P. magnus C. adhaesivum 1 1 1 4/3 1 18/3 1 1 16/4 1 Danh sách các loài hải quỳ ở Khánh Hòa được trình bày ở Bảng 3.4 Bảng 3.4 – Danh sách các loài hải quỳ thu được ở Khánh Hòa – Việt Nam Bộ Họ Giống Loài Tên thường gọi Actiniaria Actiniidae Entacmaea Entacmaea Hải quỳ bong bóng quadricolor Macrodactyla Macrodactyla Hải quỳ chân đỏ doreensis Thalassianthidae Cryptodendrum Cryptodendrum Hải quỳ thanh long adhaesivum Stichodactylidae Stichodactyla Stichodactyla Hải quỳ tím tapetum Stichodactyla Hải quỳ thảm haddoni Heteractis Heteractis Hải quỳ cúc aurora Ceriantharia Cerianthidae Pachycerianthus Pachycerianthus Hải quỳ ống magnus 29 3.1.2 Đặc điểm hình thái cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa  Cá khoang cổ 1. Amphiprion perideraion (Bleeker, 1855) Tên tiếng Anh: Pink anemonefish, Salmon clownfish. Tên tiếng Việt: Cá khoang cổ hồng chỉ trắng, cá khoang cổ tím. Theo FishBase http://www.fishbase.org (cập nhật tháng 12/2014) A. perideraion có hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Pomacentridae Giống: Amphiprion (Bloch và Schneider, 1801) Loài: Amphiprion perideraion (Bleeker, 1855) a b Hình 3.1a, b – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ hồng chỉ trắng Amphiprion perideraion (hình a: cá thể đực, cân nặng 1.81g; hình b: cá thể cái, cân nặng 4.15g)  Đặc điểm hình thái A. perideraion có thân hình bầu dục dài, chiều dài chuẩn (LS) gấp 2.2 – 2.4 lần chiều cao và gấp 2.1 – 3.7 lần chiều dài đầu; đường kính mắt từ 2.1 – 5.1 mm; chiều dài mõm từ 1.8 – 4.7 mm. Tất cả các vây có màu hồng nhạt đến trong suốt, số lượng các tia vây như sau: D (vây lưng): IX – X, 16 – 17; A (vây hậu môn): II, 11 –15; P (vây ngực) 13 –18; V (vây bụng): I, 5. Số vẩy đường bên từ 34 – 42 vẩy. Số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 4 – 6 vẩy, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 15 – 19 vẩy (phụ lục 2 – Bảng 1a, b) 30 A. perideraion có thân màu hồng đến hồng nhạt, đầu màu hồng sẫm, nhạt dần khi về sau đuôi và từ lưng xuống bụng. Toàn cơ thể phủ vẩy, ngoại trừ mõm và phần dưới ổ mắt. Trên thân có hai đường sọc trắng: một sọc trắng bắt đầu từ điểm giữa hai mắt, chạy dọc theo sống lưng kéo dài tới cuống đuôi; một sọc trắng nhỏ đặc trưng nằm phía sau hai mắt. Theo Allen (1975), cá thể A. perideraion khi đạt đủ kích thước (khoảng trên 35mm)sẽ có sự khác biệt về màu sắc giữa cá thể đực và cá thể cái. Cá thể đực có một viền hẹp màu cam sáng trên phần rìa tia mềm vây lưng và hai viền ở rìa trên, rìa dưới vây đuôi. Còn ở cá thể cái, phần rìa có màu hơi hồng hay trong suốt. Cá thể cái thường có kích thước lớn hơn cá thể đực. A. perideraion là loài duy nhất mà Allen có thể tìm thấy được sự khác biệt về màu sắc giữa cá thể đực và cá thể cái. Theo quan sát của chúng tôi, loài A. perideraion thu tại Nha Trang có sự khác biệt về màu sắc và trọng lượng giữa cá thể đực (Hình 3.2a) và cái (Hình 3.2b) giống với mô tả của Allen (1975). Hình 3.1 c – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ hồng chỉ trắng Amphiprion perideraion 1 – Thân có màu hồng đến hồng nhạt. 2 – Một sọc trắng ở phần đầu, nằm sau mắt. 3 – Mõm và phần dưới ổ mắt không có vẩy, sọc trắng bắt đầu từ điểm giữa hai mắt; 4 – Có một sọc hẹp, màu trắng nhạt dọc trên lưng.  Nhận xét Loài A. perideraion nghiên cứu hiện tại thu được có những đặc điểm hình thái đặc trưng cho loài A. perideraion cơ bản giống với mô tả của Allen (1975), Allen và ctv (2005). Theo Allen (1975), loài A. perideraion có đặc điểm hình thái như sau: D: IX – X, 16 – 17; A: II, 13 – 14; P: 16 – 18; V: I, 5. Chiều dài chuẩn gấp 2.1 – 2.7 chiều cao thân, gấp 3.0 – 3.4 chiều dài đầu. Chiều dài mõm 3.2 – 4 mm, đường kính mắt 31 3 – 4 mm. Số vẩy đường bên 32 – 43 vẩy; số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 3 – 4 vẩy, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 19 – 20 vẩy. Loài A. perideraion ở vùng biển Nha Trang có đặc điểm hình thái giống với mô tả của Allen (1975), nhưng có sự khác nhau ở một số điểm: số lượng tia mềm vây hậu môn, chiều dài mõm và đường kính mắt. Đa số các chỉ tiêu này trong nghiên cứu hiện tại nằm trong khoảng rộng hơn so với mô tả của Allen (1975). Có lẽ để giải thích sự khác biệt đó là do các loài cá thu được trong nghiên cứu hiện tại ở các giai đoạn phát triển khác nhau vì vậy các kích thước đo hình thái có sự chênh lệch. Về màu sắc: loài A. perideraion thu ở vùng biển Khánh Hòa hoàn toàn giống với mô tả của Allen (1975) và Allen và ctv (2005). Kích thước lớn nhất được ghi nhận của loài A. perideraion là 100 mm (Lieske và Myers, 1994). Kích thước lớn nhất nghiên cứu hiện tại thu được là 72.9 mm và nhỏ nhất là 38.82 mm.  Phân biệt với một số loài tương tự (Allen, 1975) A. nigripes có hình thái tương tự loài A. perideraion tuy nhiên A. perideraion có 9 – 10 vây lưng có tia cứng còn A. nigripes có 11 tia cứng. Ngoài ra A. perideraion dễ bị nhầm với A. akallopisos và A. sandaracinos nhưng cả hai loài này đều không có sọc trắng ngay sau mắt như A. perideraion. 2. Amphiprion sandaracinos(Allen, 1972) Tên tiếng Anh: Orange anemonefish, Yellow clownfish. Tên tiếng Việt: Cá khoang cổ vàng. Theo FishBase http://www.fishbase.org (cập nhật tháng 12/2014) A. sandaracinos có hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Pomacentridae Giống: Loài: Amphiprion (Bloch và Schneider, 1801) Amphiprion sandaracinos (Allen, 1972) 32 Hình 3.2 a – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ vàng Amphiprion sandaracinos  Đặc điểm hình thái A. sandaracinos có thân hình bầu dục, chiều dài chuẩn gấp 2.3 – 2.5 lần chiều cao và gấp 3.2 – 3.6 lần chiều dài đầu; đường kính mắt từ 2.9 – 4.1 mm; chiều dài mõm 1.3 – 3.1 mm. Số lượng tia vây: D: IX, 17 – 18; A: II, 12 – 14; P: 14 – 17; V: I, 5. Số vẩy đường bên có 34 – 38 vẩy, số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 4 – 6 vẩy, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 15 –17 vẩy (phụ lục 2 – Bảng 2a, b). A. sandaracinos toàn thân có màu vàng cam tươi sáng, với một sọc trắng bắt đầu từ môi trên đi qua giữa hai mắt, kéo dài trên lưng và kết thúc ở cuống đuôi. Khoảng sọc trắng rộng nhất từ vị trí tia mềm số 1 đến số 10 của vây lưng nằm sát đường bên, đây là đặc điểm khác biệt giữa A. sandaracinos với các loài cá khoang cổ khác. Đầu cá có màu vàng cam đậm, trở nên nhạt và sáng dần khi về phía đuôi; phía dưới sọc trắng lưng có màu cam đậm, trở nên nhạt và sáng dần khi về phía bụng. Đuôi có màu vàng cam tươi, nhạt dần từ phần cuống đuôi đến cuối vây đuôi. Tất cả các vây có màu màu cam tươi sáng, trừ vây lưng có một phần trắng ở gốc vây, phần còn lại màu vàng cam nhạt hoặc màu trắng. Hình 3.2 b – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ vàng Amphiprion sandaracinos 33 1 – Thân có màu vàng cam, sọc rộng màu trắng sáng dọc trên lưng; 2 – Mõm và phần dưới ổ mắt không có vẩy, sọc trắng bắt đầu từ môi trên của cá; 3 – Khoảng sọc trắng rộng nhất từ vị trí tia mềm số 1 đến số 10 của vây lưng nằm sát đường bên; 4 – Cuống đuôi màu cam đậm và nhạt dần khi về cuối vây đuôi, rìa xung quanh vây đuôi có màu vàng rất nhạt.  Nhận xét Loài Amphiprion sandaracinos có đặc điểm hình thái cơ bản giống với mô tả của Allen (1975) và Allen và ctv (2005). Theo Allen (1975), A. sandaracinos có đặc điểm hình thái như sau: D: VIII – X, 16 –18; A: II, 12 – 13; P: 16 – 18; V: I, 5. Chiều dài chuẩn gấp 2.2 – 2.4 chiều cao thân và gấp 3.3 – 3.4 chiều dài đầu. Chiều dài mõm 3.7 – 4.5 mm, đường kính mắt 3.5 – 4.2 mm. Số vẩy đường bên 33 – 37 vẩy; số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 17 – 18 vẩy, từ đường bên đến gốc vây lưng là 3 – 5 vẩy. Một số đặc điểm hình thái đặc trưng cho loài A. sandaracinos ở Khánh Hòa giống với mô tả của Allen (1975). Tuy nhiên có sự khác nhau rõ ở chiều dài mõm: chiều dài mõm của loài A. sandaracinos ở vùng biển Khánh Hòa (1.3 – 3.1 mm) ngắn hơn so với mô tả của Allen (3.7 – 4.5 mm). Số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn trong nghiên cứu có sự khác biệt với Allen (chêch lệch nhau 1 vẩy). Về màu sắc: loài A. sandaracinos thu ở vùng biển Khánh Hòa hoàn toàn giống với mô tả của Allen (1975) và Allen và ctv (2005). Kích thước lớn nhất được Allen (1975) ghi nhận là 140 mm. Trong nghiên cứu hiện tại loài A. sandaracinos có kích thước lớn nhất là 71.3 mm và nhỏ nhất là 37 mm.  Phân biệt với một số loài tương tự (Allen, 1975) A. sandaracinos dễ nhầm với A. akallopisos, A. akallopisos cũng có một sọc trắng trên lưng nhưng không bắt đầu từ môi trên. Cơ thể A. sandaracinos có màu cam sáng, trong khi đó A. akallopisos có xu hướng màu hồng hơn là cam. Ngoài ra, A. perideraion cũng có hình thái tương tự như A. sandaracinos tuy nhiên A. sandaracinos không có sọc trắng nằm sau mắt như A. perideraion. 3. Amphiprion clarkii (Bennett, 1830) Tên tiếng Anh: Clark’s anemonefish, Yellowtail clownfish. Tên tiếng Việt: Cá khoang cổ đen đuôi vàng, cá khoang cổ sọc trắng. 34 Theo FishBase http://www.fishbase.org (cập nhật tháng 12/ 2014) A. clarkii có hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Pomacentridae Giống: Loài: Amphiprion(Bloch và Schneider, 1801) Amphiprion clarkii (Bennett, 1830) a b c d Hình 3.3a, b, c, d – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ đen đuôi vàng Amphiprion clarkii  Đặc điểm hình thái A. clarkii có thân hình bầu dục dài, hơi dẹp; chiều dài chuẩn gấp 2.8 – 3.7 lần chiều dài đầu và gấp 1.8 – 2.7 lần chiều cao thân. Mắt to và ở vị trí cao gần đỉnh đầu, đường kính mắt từ 3.5 – 6.2 mm. Mõm nhỏ, ngắn và tròn; chiều dài mõm từ 1.5 – 5.8 mm. 35 Số lượng các tia vây: D: IX – X, 13 – 18; A: II, 12 – 16; P: 16 – 19; V: I, 5. Số vẩy đường bên có 37 – 42 vẩy, số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng thường là 5 – 6 vẩy, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 12 – 20 vẩy (phụ lục 2 – Bảng 3a, b). Màu sắc của loài A. clarkii có nhiều biến đổi và phụ thuộc nhiều vào khu vực sống của chúng. Thông thường đầu cá có màu cam, bụng màu vàng cam và lưng màu đen (Hình 3.4c). Cơ thể của những cá thể trưởng thành có nhiều màu đen hơn (Hình 3.4a), trong khi cơ thể ở cá thể còn non lại nhiều màu vàng cam hơn (Hình 3.4 d). A. clarkii có ba sọc trắng viền đen trên cơ thể: sọc thứ nhất từ đỉnh đầu chạy qua rìa sau mắt đến dưới nắp mang, sọc thứ hai bắt đầu ở khoảng giữa vây lưng kéo dài xuống hậu môn và sọc thứ ba ở ngay vị trí cuống đuôi. Sọc trắng thứ ba này là ranh giới phân chia giữa màu sáng và màu tối của cơ thể. Vây lưng thường màu đen, nâu hoặc vàng nâu; vây ngực có màu vàng hoặc trắng; vây bụng và vây hậu môn có màu đen hoặc màu cam với viền màu đen; vây đuôi có màu vàng chanh, đôi khi là màu trắng. Hình 3.3 e – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ đen đuôi vàng Amphiprion clarkii 1 – Vẩy nhô về phía trước và sau sọc trắng thứ nhất; 2 – Ba sọc trắng viền đen đặc trưng trên cơ thể: ngay sau mắt (2a), giữa cơ thể (2b) và ở cuống đuôi (2c); 3 – Đuôi có màu vàng.  Nhận xét Theo Allen (1975), A. clarkii có đặc điểm hình thái như sau: D: IX – X, 14 – 17; A: II, 12 – 15; P: 18 – 21; V: I, 5. Chiều dài chuẩn gấp 1.7 – 2 lần chiều cao thân và gấp 3 – 3.5 lần chiều dài đầu. Chiều dài mõm 3 – 3.6 mm, đường kính mắt 2.8 – 3.8 mm. Số vẩy đường bên 34 – 45 vẩy, số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn 15 – 20 vẩy và từ đường bên đến gốc vây lưng 5 – 6 vẩy. 36 Một số đặc điểm hình thái đặc trưng cho loài A. clarkii ở vùng biển Khánh Hòa cơ bản giống với mô tả của Allen (1975), nhưng có một số điểm khác biệt như chiều dài mõm, đường kính mắt. Cả hai chỉ tiêu này của loài A. clarkii trong nghiên cứu hiện tại nằm trong khoảng lớn hơn nhiều so với mô tả của Allen (1975). Về màu sắc: loài A. clarkii thu ở vùng biển Khánh Hòa hoàn toàn giống với mô tả của Allen (1975) và Allen và ctv (2005). A. clarkii là loài có vùng phân bố rộng và sống cộng sinh với nhiều loài hải quỳ, nên màu sắc của chúng có sự biến đổi phong phú nhất trong những loài cá khoang cổ (Fautin và Allen, 1992). Điều này gây ra một số khó khăn trong công tác phân loại bằng hình thái. Nghiên cứu hiện tại ở vùng biển Nha Trang chưa nhận biết được sự khác biệt rõ rệt giữa cá thể đực và cá thể cái. Theo Anderson và Hafiz (1987), A. clarkii có kích thước lớn nhất được ghi nhận là 150 mm. Nghiên cứu hiện tại thu được loài A. clarkii có kích thước lớn nhất là 101.5 mm và nhỏ nhất là 35.82 mm.  Phân biệt với một số loài có hình thái tương tự (Allen, 1975) A. latifasciatus có đặc điểm hình thái gần giống như loài A. clarkii nhưng thiếu một sọc trắng ở gốc vây đuôi và đuôi của nó phân thùy. A. allardi, A. akindynos, A. chagosensis có 3 sọc trắng như A. clarkii nhưng sọc thứ hai ở cả 3 loài này hẹp hơn loài A. clarkii. Trên thân 3 loài A. chrysogaster, A. fuscocaudatus, A. tricinctus cũng có ba sọc màu trắng, nhưng vây đuôi của chúng màu tối, thường là màu đen. 4. Amphiprion frenatus (Brevoort, 1856) Tên tiếng Anh: Tomato anemonefish, Red Clownfish, Bridled Clownfish. Tên tiếng Việt: Cá hề cà chua, cá khoang cổ đỏ. Theo FishBase http://www.fishbase.org (cập nhật tháng 12/ 2014) A. frenatus có hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Pomacentridae Giống: Loài: Amphiprion (Bloch và Schneidder, 1801) Amphiprion frenatus (Brevoort, 1856) 37 Hình 3.4 a – Hình dáng và màu sắc cá khoang cổ đỏ Amphiprion frenatus  Đặc điểm hình thái A. frenatus có thân màu đỏ cà chua, cơ thể tròn hình trứng. Chiều dài chuẩn gấp 2 lần chiều cao và gấp 3,5 lần chiều dài đầu; chiều dài mõm 3,4 mm; đường kính mắt 4,1 mm. Số lượng các tia vây: D: X, 17; A: II, 16; P: 17; V: I, 5. Số vẩy đường bên là 34; số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 6, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 19 vẩy (Phụ lục 2 – Bảng 5 a, b). Đuôi và các vây có màu đỏ cam (nhạt hơn màu đỏ thân), có viền đen trên rìa vây bụng, vây hậu môn và rìa trên, dưới của vây đuôi. A. frenatus có đặc điểm là khi chưa trưởng thành cơ thể sẽ có màu đỏ sẫm, có ba sọc trắng và các vây ngực màu đen. Khi trưởng thành còn hai sọc trắng trên cơ thể và khi lớn hơn chỉ còn lại một sọc trắng nằm sau vùng mắt (Allen, 1975). Loài A. frenatus thu được trong nghiên cứu hiện tại có một sọc trắng viền đen ở sau mắt và một sọc đen mờ trên thân cá, điều này cho thấy cá chuẩn bị mất dần đi sọc thứ hai ở trên thân chỉ còn một sọc trắng duy nhất, có thể cho rằng loài đang được nghiên cứu này đang ở giai đoạn chuyển tiếp giữa giai đoạn trưởng thành đến giai đoạn cá lớn hơn. Cá thể cái thường có kích thước lơn hơn cá thể đực. Cá thể đực toàn thân có màu đỏ tươi sáng hơn. Trong khi cá thể cái có màu đen ở hai bên thân với các phần bụng, miệng, ngực và các vây có màu đỏ (Allen, 1975). Cá thể thu được trong nghiên cứu hiện tại có màu đỏ toàn thân, không có màu đen ở hai bên thân nên có thể kết luận giới tính cá khoang cổ đỏ A. frenatus thu được là cá thể đực. 38 Hình 3.4 b – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ đỏ Amphiprion frenatus 1 – Hình dáng đầu, vẩy cá nhô về phía trước mõm; 2 – Trên đầu một sọc trắng viền đen, nằm ngay sau mắt; 3 – Thân có màu đỏ cà chua.  Nhận xét Theo Allen (1975), A. frenatus có đặc điểm hình thái như sau: D: IX – X, 16 – 18; A: II, 13 – 17; P: 18 – 20; V: I, 5. Chiều dài chuẩn gấp 1.7 – 2 lần chiều cao thân và gấp 2.8 – 3.5 lần chiều dài đầu. Đường kính mắt 3 – 4.8 mm; chiều dài mõm 3 – 3.9 mm. Số vẩy đường bên 31 – 44 vẩy; số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 17 – 21 vẩy, từ đường bên đến gốc vây lưng là 5 – 6 vẩy. Loài A. frenatus nghiên cứu hiện tại thu được có đặc điểm hình thái và màu sắc giống hoàn toàn với mô tả của Allen (1975); Allen và ctv (2005). Kích thước lớn nhất loài này có thể đạt được là 140 mm (Lieske và Myers, 1994). Nghiên cứu hiện tại thu được loài A. frenatus có kích thước 54,3 mm. Trong số 5 loài cá khoang cổ thì loài A. frenatus có giá trị kinh tế nhất (Hà Lê Thị Lộc, 2009) nhưng qua những lần thu mẫu cho thấy số loài cá khoang cổ này ở Nha Trang chiếm tỉ lệ ít nhất trong 5 loài thu được. Nghiên cứu chỉ thu được một cá thể A. frenatus nên việc so sánh, phân biệt hai giới tính đực và cái chưa rõ ràng.  Phân biệt với một số loài tương tự (Allen, 1975) Loài A. frenatus có đặc điểm hình thái giống với loài Amphiprion rubrocinctus (tây bắc Australia). Màu sắc của chúng rất giống nhau nhưng sọc trắng trên cơ thể Amphiprion rubrocinctus không có viền đen như A. frenatus. Cá chưa trưởng thành của loài A. frenatus 39 và A. rubrocinctus rất khó để phân biệt bởi vì chúng có hình thái bên ngoài rất giống nhau, để phân biệt chúng chỉ có thể dựa vào phân bố địa lí của chúng. 5. Amphiprion polymnus(Linnaeus, 1758) Tên tiếng anh: Saddleback anemonefish, Saddle brown clownfish. Tên tiếng việt: Cá khoang cổ yên ngựa. Theo FishBase http://www.fishbase.org (cập nhật tháng 12/2014) A. polymnus có hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Pomacentridae Giống: Loài: Amphiprion (Bloch và Schneider, 1801) Amphiprion polymnus (Linnaeus, 1758) a b c d Hình 3.5 – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ yên ngựa Amphiprion polymnus; a, b, c: A. polymnus trưởng thành; d: A. polymnus chưa trưởng thành 40  Đặc điểm hình thái A. polymnus là loài có kích thước lớn nhất trong giống Amphiprion, chúng có dáng hơi thon dài về phía sau, cơ thể có thể là màu đen hoặc màu nâu sáng. Chiều dài chuẩn gấp 2.1 – 2.5 lần chiều cao và gấp 3 – 4 lần chiều dài đầu. Mắt to có đường kính từ 3.9 – 8.7 mm; mõm có chiều dài từ 1.6 – 7.7 mm. Số lượng các tia vây: D: X – XI, 12 –16; A: II, 12 – 14; P: 15 – 18; V: I, 5. Số vẩy đường bên từ 31– 45 vẩy; số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 4 – 6 vẩy; số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 15 – 19 vẩy (phụ lục 2 – Bảng 4a, b). A. polymnus có hai sọc trắng: một sọc trắng rộng ở trên đầu, nằm sát với mắt. Một sọc trắng ngắn hình yên ngựa ở giữa lưng và kéo dài đến giữa bụng. Sọc trắng này bắt đầu từ những tia gai cứng cuối cùng của vây lưng (thường 1 đến 2 tia cứng) đến phần xa nhất của tia mềm vây lưng. A. polymnus có mõm màu cam, phần bụng ở phía dưới mang cá có màu nâu sẫm hoặc vàng cam. Vây lưng có màu tối (đen hoặc nâu); ngoại trừ một phần ở tia mềm có màu trắng. Vây ngực có khoảng biến màu, có thể là màu cam, nâu hoặc vàng; vây bụng có màu đen đến nâu. Vây đuôi tròn, màu đen hoặc nâu với một khoảng màu trắng rộng bao xung quanh, phần đuôi có màu tối và hơi thuôn nhọn về phía sau. Đa số những loài cá khoang cổ khác thường cá thể cái sẽ có kích thước lớn hơn cá thể đực tuy nhiên cá thể đực và cái loài A. polymnus có kích thước như nhau. Cá thể cái thường có phần đầu màu vàng cam, trong khi ở cá thể đực thì có phần đầu màu nâu. Hình 3.5 e – Đặc điểm hình thái cá khoang cổ yên ngựa Amphiprion polymnus 1 – Trên phần đầu, giữa các ổ mắt không có vẩy cá; 2 – Sọc trắng rộng nằm sau mắt; 3 – Tia gai cứng của vây lưng ngắn; 4 – Sọc trắng hình yên ngựa ở giữa lưng và kéo 41 dài đến giữa bụng; 5 – Vây đuôi thường tròn, có màu tối và có một khoảng trắng rộng bao xung quanh đuôi, màu tối của đuôi thuôn nhọn về phía sau.  Nhận xét Theo Allen (1975), A. polymnus có những đặc điểm hình thái đặc trưng như sau: D: X – XI, 13 – 16; A: II, 12 – 14; P: 18 – 19; V: I, 5. Chiều dài chuẩn gấp 2.1 – 2.4 chiều cao thân và gấp 3 – 3. 5 chiều dài đầu. Chiều dài mõm 3.7 – 4.4 mm, đường kính mắt 2.8 – 3.8 mm. Số vẩy đường bên 32 – 41 vẩy; số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn 17 – 21 vẩy, từ đường bên đến gốc vây lưng 4 – 5 vẩy. Loài A. polymnus trong nghiên cứu hiện tại có đặc điểm hình thái cơ bản giống với mô tả của Allen (1975). Tuy nhiên có những điểm khác biệt sau: chiều dài mõm và đường kính mắt của A. polymnus trong nghiên cứu có khoảng dao động rộng hơn theo mô tả của Allen. Điều này có thể là do các loài thu được ở vùng biển Nha Trang đang ở trong nhiều giai đoạn phát triển khác nhau nên các chỉ tiêu đo hình thái biến động trong khoảng rộng hơn so với Allen. Số lượng vẩy cá cũng có sự sai khác, số lượng vẩy đường bên trong nghiên cứu hiện tại nhiều hơn trong mô tả của Allen là 4 vẩy, số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng nhiều hơn Allen là 1 vẩy. Kích thước lớn nhất của loàiA. polymnus ghi nhận được là 130 mm (Lieske và Myers, 1994). Kích thước lớn nhất của loài A. polymnus được ghi nhận trong nghiên cứu này là 138.33 mm và kích thước nhỏ nhất là 34.71 mm. Như vậy, về mặt hình thái tạm thời ghi nhận loài thu được là A. polymnus, sự phân loại chính thức loài này sẽ cần đến các dữ liệu sinh học phân tử khi phân tích các chỉ tiêu di truyền. Màu sắc của cá phụ thuộc vào giai đoạn phát triển, khi còn non cá có màu nâu, khi cá lớn hơn thì sẽ có màu đen (hoặc màu vàng nâu). Ngoài ra màu sắc còn phụ thuộc vào loài hải quỳ mà nó cộng sinh, những con sống với loài hải quỳ Heteractis crispa sẽ có màu tối hơn là những con sống với loài hải quỳ Stichodactyla haddoni (Allen, 1991). Nghiên cứu chưa phân biệt rõ ràng giới tính của loài A. polymnus thông qua hình dáng bên ngoài.  Phân biệt với loài tương tự (Allen, 1975) Loài cá khoang cổ này có đặc điểm hình thái giống với loài Amphiprion sebae (Ấn Độ Dương) nhưng đuôi của A. sebae có màu vàng. 6. Amphiprion ocellaris (Cuvier, 1830) Tên tiếng Việt: Cá nemo, cá khoang cổ cam. 42 Tên tiếng Anh: Ocellaris clownfish. Theo FishBase http://www.fishbase.org (cập nhật tháng 5/2014) A. ocellaris có hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Chordata Lớp: Actinopterygii Bộ: Perciformes Họ: Pomacentridae Giống: Loài: Amphiprion (Bloch và Schneider, 1801) A. ocellaris (Cuvier, 1830) a b Hình 3.6 a, b – Hình dáng và màu sắc của một số loài cá khoang cổ nemo Amphiprion ocellaris  Đặc điểm hình thái A. ocellaris có thân hình bầu dục dài, chiều dài chuẩn (LS) gấp 1.9 – 2.5 lần chiều cao và gấp 3 – 3,9 lần chiều dài đầu; đường kính mắt từ 2.2 – 3.9 mm; chiều dài mõm từ 1.3 – 2.9 mm. Tất cả các vây có màu vàng cam, số lượng các tia vây: D: XI, 13 –16; A: II, 11 – 13; P: 13 –18, V: I, 5. Số vẩy đường bên từ 32 – 44 vẩy. Số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 4 – 5 vẩy, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 19 – 21 vẩy (phụ lục 2 – Bảng 6a, b). A. ocellaris thân có màu vàng cam với ba sọc trắng trên cơ thể. Một sọc trắng nằm ngay sau mắt, sọc thứ hai ở giữa lưng kéo dài tới bụng (bắt đầu từ vài tia gai cứng cuối cùng của vây lưng kéo dài xuống khu vực phía trước của hậu môn). Ranh giới của sọc thứ hai này mở rộng về phía trước (mức độ mở rộng tăng lên cùng với sự phát triển của cá khoang cổ). Sọc trắng thứ ba ở vị trí cuống đuôi và mở rộng vào xung quanh viền 43 ngoài của vây đuôi. Xung quanh các vây (ở gần viền ngoài) có thể có các đường màu đen mỏng. Hình 3.6 c – Đặc điểm hình thái cá nemo Amphiprion ocellaris 1 – Hình dáng đầu, giữa các ổ mắt không có vẩy cá; 2 – Sọc trắng thứ nhất nằm ngay sau mắt; 3 – Sọc trắng thứ hai ở giữa thân, lồi mạnh về phía trước đầu; 4 – Sọc trắng thứ ba nằm ở cuống đuôi và mở rộng vào xung quanh viền ngoài của vây đuôi; 5 – Vây lưng có 11 tia cứng.  Nhận xét Theo Allen (1975), A. ocellaris có đặc điểm hình thái như sau: D: XI, 13 – 16; A: II, 11 – 13; P: 17; V: I, 5. Chiều dài chuẩn gấp 2.1 – 2.4 chiều cao thân, gấp 3.0 – 3.3 chiều dài đầu. Chiều dài mõm 3.2 – 3.9 mm, đường kính mắt 3.9 – 4.8 mm. Số vẩy đường bên 34 – 48 vẩy; số vẩy từ đường bên đến gốc vây lưng là 4 – 5 vẩy, từ đường bên đến gốc vây hậu môn là 22 – 25 vẩy. Loài A. ocellaris ở vùng biển Khánh Hòa có đặc điểm hình thái giống với mô tả của Allen (1975), nhưng có sự khác nhau ở một số điểm sau: chiều dài mõm và số vẩy từ đường bên đến gốc vây hậu môn. Sự sai khác này là vì các cá thể trong nghiên cứu hiện tại đang ở giai đoạn còn nhỏ nên các chỉ tiêu hình thái này nhỏ so với mô tả của Allen. Về màu sắc: loài A. ocellaris thu ở vùng biển Khánh Hòa hoàn toàn giống với mô tả của Allen (1975) và Allen và ctv (2005). Về giới tính, nghiên cứu hiện tại chỉ thu được cá thể trong giai đoạn chưa phát triển nên cá chưa phân hóa thành giới tính cái.  Phân biệt với một số loài có hình thái tương tự (Allen, 1975) 44 A. ocellaris có đặc điểm hình thái rất giống với loài Amphiprion percula nhưng A. ocellaris vây lưng đa số có 11 tia cứng còn A. percula là 10 tia cứng và phần tia gai của vây lưng loài A. ocellaris cao hơn A. percula.  Hải quỳ Kết quả phân tích các chỉ tiêu hình thái của 7 loài hải quỳ được tìm thấy ở vùng biển Khánh Hòa được trình bày trong Bảng 3.5. Bảng 3.5 – Các chỉ tiêu đo hình thái của hải quỳ Chiều xúc tu xúc tu endocoelic exocoelic (mm) (mm) bám miệng (mm) (mm) 10 35 63 17 10.3 17 36 115 rất ngắn 83 84 80 168 1–2 45 22 75 15 thân (mm) Entacmaea Chiều dài ĐK đĩa cao Loài Chiều dài ĐK đĩa Cân nặng (g) quadricolor Stichodactyla tapetum Stichodactyla 5 228.6 haddoni Macrodactyla 38.87 doreensis Pachycerianthus 120 30 125 75.62 rất ngắn 139.07 magnus Cryptodendrum 47 56 135 3 55 75 160 28 adhaesivum Heteractis 227.5 aurora 1. Entacmaea quadricolor (Rüppell và Leuckart, 1828) Tên tiếng Anh: Bubble – tip anemone Tên tiếng Việt: Hải quỳ vú, hải quỳ bong bóng Theo http://animaldiversity.org/ (cập nhật tháng 5/2015) E. quadricolor có hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Lớp: Cnidaria Anthozoa 45 Bộ: Actiniaria Họ: Actiniidae Giống: Entacmaea (Ehrenberg 1834) Loài: E. quadricolor (Rüppell và Leuckart, 1828) Hình 3.7a, b, c– Hình dáng và màu sắc hải quỳ bong bóng Entacmaea quadricolor (Thanh tỉ lệ = 2.1 cm) a, b: E. quadricolor xúc tu nâu đậm; c: E. quadricolor xúc tu nâu nhạt  Đặc điểm hình thái E. quadricolor có đĩa miệng màu nâu với đường kính 63mm, miệng màu kem. Các xúc tu dài khoảng 17 mm, có màu nâu như đĩa miệng với những đốm hoặc sọc trắng ở gần đỉnh. Điểm đặc trưng của E. quadricolor phân biệt với các loài khác là xúc tu có hình củ hành (phồng ra ở gần đỉnh); đây là đặc điểm duy nhất có ở loài hải quỳ này nên chúng ít khi bị nhầm lẫn với loài khác. E. quadricolor có thân màu đỏ, chiều dài 10mm, không có các nốt sần trên trên thân. Loài này thường giấu thân vào bên trong nên chỉ thấy các xúc tu nhô ra bên ngoài, chỉ để lộ ra một phần thân, đường kính đĩa bám 35 mm. 1 2 3 4 Hình 3.7 – Đặc điểm hình thái hải quỳ bong bóng Entacmaea quadricolor 1 – Các xúc tu màu nâu, có hình củ hành đặc trưng;2 – Trên mỗi xúc tu có các đốm và sọc màu trắng; 3 – Thân có màu đỏ, ngắn; 4 – Thân không có các nốt sần. 46  Nhận xét Theo Fautin (2008) loài E. quadricolor ở vịnh Moreton – Australia là loài hải quỳ có kích thước lớn; xúc tu có màu nâu, một số hoặc tất cả có búp tận cùng màu đỏ; màu của đĩa miệng giống như xúc tu, đĩa miệng mở rộng hơn so với đĩa bám, đường kính 80 mm. Thân mịn, không có các nốt sần thường màu nâu, một số cá thể có màu xanh hoặc màu đỏ. Loài E. quadricolor thu ở Khánh Hòa trong nghiên cứu hiện tại có một số đặc điểm đặc trưng giống với mô tả của Fautin. Tuy nhiên có thể do điều kiện địa lí khác nhau nên E. quadricolor ở Khánh Hòacó một số điểm khác biệt về màu sắc của thân; kích thước nhỏ hơn. 2. Stichodactyla tapetum (Hemprich và Ehrenberg, 1834) Tên tiếng Anh: Mini Carpet Anemone Tên tiếng Việt: Hải quỳ thảm nhỏ Theo http://animaldiversity.org/ (cập nhật tháng 5/ 2015) S. tapetumcó hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Cnidaria Lớp: Anthozoa Bộ: Actinaria Họ: Stichodactylidae Giống: Stichodactyla (Brandt, 1835) Loài: Stichodactyla tapetum (Hemprich và Ehrenberg, 1834) Hình 3.8 a, b– Hình dạng và màu sắc của hải quỳ thảm nhỏ Stichodactyla tapetum; a: Đĩa miệng (Thanh tỉ lệ = 4.5 cm; b: Thân (Thanh tỉ lệ = 1.8 cm) 47  Đặc điểm hình thái Stichodactyla tapetum có đĩa miệng bằng phẳng, đường kính 115 mm, màu nâu tím. Các xúc tu rất ngắn và trông giống như những u thịt lồi lên trên, chóp xúc tu tù. Đĩa miệng không có xúc tu exocoelic, chúng chỉ có một loại xúc tu endocoelic, kích thước đồng đều, không dính vào nhau đặc biệt là gần trung tâm đĩa miệng được sắp xếp gọn gàng thành hình chữ V, vào sâu bên trong các xúc tu sắp xếp tỏa tròn xung quanh miệng. Số lượng các xúc tu phân bố giảm dần từ viền ngoài đĩa miệng đến khu vực trung tâm. Thân thấp (17mm), màu trắng và có ít nốt sần màu xanh tím phân bố ở phía dưới của đĩa miệng, đường kính đĩa bám 36mm. 1 2 3 4 Hình 3.8c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thảm nhỏ Stichodactyla tapetum 1 – Các xúc tu ngắn phân bố dày tại rìa đĩa miệng; 2 – Vào trong đĩa miệng các xúc tu phân bố thưa thớt hơn và sắp xếp thành hình chữ V; 3 – Tại trung tâm đĩa miệng các xúc tu phân bố tỏa tròn xung quanh miệng; 4 – Bên dưới đĩa miệng có ít nốt sần màu xanh nâu phân bố theo hàng dọc.  Nhận xét Theo Fautin (2008) S. tapetum thu ở vịnh Moreton – Australia có đường kính đĩa bám 30mm, đường kính đĩa miệng 100mm. Chiều dài thân thường bằng một nửa đường kính đĩa bám nhưng có thể cao hơn, xúc tu rất ngắn phân bố trên toàn bộ đĩa miệng. Loài S. tapetum thu ở Khánh Hòa trong nghiên cứu hiện tại có đặc điểm hình thái giống với mô tả của Fautin nhưng kích thước lớn hơn: đường kính đĩa bám lớn hơn 6mm, đường kính đĩa miệng lớn hơn 5mm. 48 S. tapetum có thể bị nhầm lẫn với loài S. haddoni (Kent, 1893). Tuy nhiên các xúc tu của loài S. tapetum trên đĩa miệng phân bố thưa thớt hơn S. haddoni và S. tapetum không có các xúc tu exocoelic ở rìa ngoài đĩa miệng như S. haddoni . 3. Stichodactyla haddoni (Saville Kent, 1893) Tên tiếng Anh: Haddon's Carpet Anemone. Tên tiếng Việt: Hải quỳ thảm. Theo http://animaldiversity.org/ (cập nhật tháng 5/2015) S. haddonicó hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Cnidaria Lớp: Anthozoa Bộ: Actinaria Họ: Stichodactylidae Giống: Stichodactyla (Brandt, 1835) Loài: Stichodactyla haddoni (Saville Kent, 1893) Hình 3.9 – Hình dáng và màu sắc hải quỳ thảm Stichodactyla haddoni (Thanh tỉ lệ = 4.2 cm); a: Đĩa miệng; b: Thân  Đặc điểm hình thái S. haddoni có đĩa miệng rộng, đường kính 168mm, màu nâu tím, thường nhấp nhô uốn lượn; có nhiều xúc tu ngắn (1 – 2 mm) phân bố dày như một tấm thảm trên đĩa miệng (tentacles endocoelic). Ngoài ra có các xúc tu dài hơn xúc tu endocoelic có chiều dài khoảng 5 mm, chúng thường nằm ở ngoài rìa đĩa miệng (tentacles exocoelic). Các xúc tu rất dính, màu nâu tím, đỉnh của xúc tu tròn, màu trắng, xung quanh miệng thường trống, không có xúc tu phân bố. S. haddoni có thân to trắng với chiều dài 84mm, phần 49 thân trên (dưới đĩa miệng) có màu nâu tím và nhạt dần khi xuống dưới đĩa bám, có 1 vài các nốt sần màu tím nhạt nằm ở rìa phía dưới của đĩa miệng, đĩa bám chắc và rộng, bám rất chặt vào giá thể. 1 4 2 3 Hình 3.9 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thảm Stichodactyla haddoni 1 – Nhiều xúc tu ngắn phân bố dày trên đĩa miệng (tentacles endocoelic); 2 – Ngoài rìa đĩa miệng có các xúc tu dài (tentacles exocoelic); 3 – Thân to dày, màu trắng; 4– Phía dưới đĩa miệng có các nốt sần màu tím nhạt.  Nhận xét Theo Fautin (2008) S. haddoni ở vịnh Moreton – Australia đường kính đĩa miệng lớn (500 mm), uốn lượn, có màu xanh lá cây hoặc màu nâu. Có nhiều xúc tu ngắn (dài vài mm, đường kính 1mm) bao phủ toàn bộ đĩa miệng. Thân màu trắng, vàng hoặc màu xanh lá cây mở rộng dần từ đĩa bám lên trên đĩa miệng, rìa phía dưới của đĩa miệng có ít nốt sần nhỏ. S. haddoni thu ở Khánh Hòa – Việt Nam trong nghiên cứu hiện tại có đặc điểm giống với mô tả của Fautin. Tuy nhiên có thể do sự cách biệt về địa lí nên loài thu tại Khánh Hòa có màu sắc sáng hơn, kích thước nhỏ hơn so với mô tả của Fautin. S. haddoni thường bị nhầm lẫn với các loài khác thuộc giống Stichodactyla như Stichodactyla gigantean, S. mertensii tuy nhiên S. haddoni có các xúc tu exocoelic ở ngoài rìa đĩa miệng các loài còn lại thì không có (Fautin và Allen, 1994) . 4. Macrodactyla doreensis (Quoy và Gaimard, 1833) Tên tiếng Anh: Long tentacle anemone Tên tiếng Việt: Hải quỳ chân đỏ Theo http://animaldiversity.org/ (cập nhật tháng 5/2015) M. doreensiscó hệ thống phân loại như sau: 50 Giới: Animalia Ngành: Cnidaria Lớp: Anthozoa Bộ: Actiniaria Họ: Actiniidae Giống: Loài: Macrodactyla (Haddon, 1898) M. doreensis (Quoy và Gaimard, 1833) Hình 3.10a, b, c, d – Hình dáng và màu sắc một số loài hải quỳ chân đỏ Macrodactyla doreensis (Thanh tỉ lệ = 1.5 cm)  Đặc điểm hình thái M. doreensis có xúc tu ít, kích thước các xúc tu đồng đều với chiều dài 15 mm, chủ đa số tập trung nhiều ở xung quanh viền ngoài của đĩa miệng và càng gần vào trung tâm xúc tu phân bố càng thưa thớt hơn, xúc tu có màu kem, trắng… Đĩa miệng có đường kính 75 mm, màu giống như màu của xúc tu và có thể có các họa tiết màu trắng hoặc nâu xám xuyên vào tâm của đĩa miệng, đôi khi các họa tiết này kéo dài lên trên các xúc tu. M. doreensis có thân mỏng, chiều dài 45 mm, màu đỏ cam, phần thân trên màu kem; phía dưới đĩa miệng có các nốt sần hình trứng, màu trắng sắp xếp theo hàng dọc, đường kính đĩa bám 22 mm. 51 1 4 2 3 Hình 3.10 d – Đặc điểm hình thái hải quỳ thân đỏ Macrodactyla doreensis 1– Các xúc tu phân bố dày ở ngoài đĩa miệng; 2 – Các xúc tu ở bên trong đĩa miệng phân bố thưa thớt; 3 – Thân có màu đỏ cam với màu kem ở phía trên; 4 – Phía dưới đĩa miệng có các nốt sần màu trắng.  Nhận xét Theo Fautin (2008) M. doreensis ở vịnh Moreton – Australia có thân dài 150mm, thường màu xám với những đốm màu cam hoặc toàn bộ thân màu cam đỏ với màu vàng kem đầu gần, đĩa miệng loe rộng. Xúc tu có màu xám, kem, tím với đầu nhọn. Những loài M. doreensis thu tại Khánh Hòa – Việt Nam có đặc điểm hình thái tương tự như mô tả của Fautin tuy nhiên loài ở Khánh Hòa có chiều dài của thân ngắn hơn, thân có màu đỏ cam như mô tả của Fautin nhưng các màu còn lại của thân chưa được tìm thấy. M. doreensis có thể bị nhầm lẫn với một số loài hải quỳ thuộc giống Heteractis như Heteractis aurora, H. crispa hoặc H. malu, chúng đều có màu đỏ hoặc sắc tố vàng trên thân. Tuy nhiên có thể được phân biệt nhờ vào các chi tiết về hình dạng, màu sắc của xúc tu, số lượng và kích thước của chúng. M. doreensis xúc tu không có những nốt phồng như H. aurora, số lượng xúc tu ít hơn so với loài H. crispa và xúc tu dài hơn so với loài H. malu. Thân của M. doreensis mỏng và có nốt sần khác biệt so với những loài hải quỳ còn lại (Fautin và Allen, 1994) 5. Pachycerianthus magnus (Nakamoto, 1919) Tên tiếng Anh: Tube anemone. Tên tiếng Việt: Hải quỳ ống, hải quỳ dừa. Theo http://animaldiversity.org/ (cập nhật tháng 5/2015) Pachycerianthus magnuscó hệ thống phân loại như sau: 52 Giới: Animalia Ngành: Cnidaria Lớp: Anthozoa Bộ: Ceriantharia Họ: Cerianthidae Giống: Pachycerianthus (Roule, 1904) Loài: Pachycerianthus magnus (Nakamoto, 1919) Hình 3.11a, b– Hình dáng và màu sắc của hải quỳ ống Pachycerianthus magnus (Thanh tỉ lệ = 3 cm)  Đặc điểm hình thái Hải quỳ ống có đĩa miệng bao gồm hai vòng xoắn của hai loại xúc tu có kích thước khác nhau rõ rệt. Vòng xoắn bên ngoài gồm các xúc tu mảnh, dài 125mm, màu kem và thường hướng ra ngoài. Vòng xoắn bên trong gồm các xúc tu ngắn hơn xúc tu ngoài (dài 30mm), màu kem trắng nhạt, thường dựng thẳng đứng. Thân hải quỳ có dạng hình ống dài (140 mm), màu xám, nhớt, có màng bọc mỏng bao xung quanh thân. Trên thân thường dính những hạt cát, mảnh vụn có trong môi trường sống của hải quỳ ống, chúng không có đĩa bám như các loài hải quỳ khác. 53 1 2 3 4 Hình 3.11 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ ống Pachycerianthus magnus 1 – Vòng ngoài đĩa miệng là các xúc tu dài và mảnh, nhạt màu; 2 – Vòng trong đĩa miệng là các xúc tu trắng, ngắn hơn xúc tu vòng ngoài; 3 – Thân hình ống dài, có lớp màng mỏng bao bên ngoài; 4 –Phía dưới không có đĩa bám như những loài hải quỳ khác.  Nhận xét Theo Stampar và ctv (2014) loài P. magnus thu ở Brazilcó dạng hình ống dài, một đầu được bao phủ bởi 2 vòng xúc tu có hình dạng và màu sắc khác nhau, đầu còn lại không phải là đĩa bám như những loài hải quỳ khác. Các xúc tu bên ngoài có màu kem hoặc màu cam rất nhạt màu, các xúc tu bên trong ngắn hơn nhiều và có màu trắng. Loài P. magnus thu tại Khánh Hòa có đặc điểm hình thái hoàn toàn giống với mô tả của Stampar (2014). P. magnus thường bị nhầm lẫn với một số loài hải quỳ cùng nằm trong Họ Cerianthidae. Để phân biệt chúng thường dựa vào chiều dài của hai vòng xoắn xúc tu, màu sắc và các họa tiết trên xúc tu. Trên xúc tu ngoài của loài P. magnus không có sọc, vệt hay các họa tiết khác là đặc điểm riêng của P. magnus. 6. Cryptodendrum adhaesivum (Klunzinger, 1877) Tên tiếng Anh: Pizza anemone Tên tiếng Việt: Hải quỳ thanh long Theo http://animaldiversity.org/ (cập nhật tháng 5/2015) Cryptodendrum adhaesivumcó hệ thống phân loại như sau: Giới: Ngành: Animalia Cnidaria 54 Lớp: Anthozoa Bộ: Actiniaria Họ: Thalassianthidae Giống: Loài: Cryptodendrum (Klunzinger, 1877) C. adhaesivum (Klunzinger, 1877) Hình 3.12 – Hình dáng và màu sắc hải quỳ thanh long Cryptodendrum adhaesivum (Thanh tỉ lệ = 3 cm); a: Đĩa miệng; b: Thân  Đặc điểm hình thái C. adhaesivum có đĩa miệng rộng (135 mm) và có hai màu khác biệt: màu xám ở viền ngoài và màu nâu ở bên trong. Các xúc tu cực kì dính, ngắn, phủ kín đĩa miệng. C. adhaesivum có hai loại xúc tu hình dạng không giống nhau: tại khu vực xung quanh trung tâm đĩa miệng là các xúc tu có nhiều nhánh; ở viền ngoài là các xúc tu đơn, có hình cầu; tại mép rìa ngoài cùng có các xúc tu giống vùng trung tâm, nhưng ít phân nhánh hơn. C. adhaesivum có thân màu tím, cao 47 mm, màu sắc đậm dần khi lên phía thân trên (phía dưới đĩa miệng) và nhạt dần khi xuống dưới đĩa bám. Các nốt sần màu tím đậm sắp xếp dọc theo thân, nhỏ dần khi xuống phía dưới thân. Xung quanh thân dưới là các chấm nhỏ li ti, đường kính đĩa bám 56 mm. 55 4 3 2 1 5 Hình 3.12 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ thanh long Cryptodendrum adhaesivum 1 – Các xúc tu nhiều nhánh phân bố bên trong đĩa miệng; 2 – Các xúc tu đơn, có dạng hình cầu ở viền ngoài đĩa miệng; 3 – Mép rìa ngoài cùng của đĩa miệng có các xúc tu phân nhánh giống như trong đĩa miệng nhưng ít nhánh hơn; 4 –Dưới đĩa miệng có các nốt sần màu tím đậm; 5 – Nhiều chấm nhỏ li ti phân bố xung quanh phần thân dưới, kéo dài xuống tới đĩa bám.  Nhận xét Theo Fautin và Allen (1994) loài C. adhaesivum thu tại Australia có xúc tu ngắn (5 mm), phân bố dày đặc và tồn tại trong hai hình thức: các xúc tu ở trung tâm có cuống hẹp với 5 nhánh ngắn, các xúc tu đơn phân bố gần lề có đường kính 1 mm và tại lề ngoài đĩa miệng là các xúc tu phân nhánh như ở trung tâm nhưng số lượng nhánh ít hơn (3 nhánh). Xúc tu trong hai hình thức trên thường có màu sắc khác nhau, thường có sự kết hợn của màu vàng và màu hồng, màu xanh và màu xám, màu nâu và màu xám. C. adhaesivum thu tại Khánh Hòa – Việt Nam có đặc điểm hình thái giống với mô tả của Fautin và Allen. Các loài hải quỳ trong giống Stichodactyla có hình thái bên ngoài tương tự Cryptodendrum adhaesivum bởi nhiều xúc tu ngắn tuy nhiên sự phân bố của hai loại xúc tu phân nhánh và không phân nhánh của C. adhaesivum là đặc điểm độc đáo giúp phân biệt chúng. 7. Heteractic aurora (Quoy và Gaimard, 1833) Tên tiếng Anh: Beaded sea anemone Tên tiếng Việt: Hải quỳ cúc 56 Theo http://animaldiversity.org/ (cập nhật tháng 5/2015) Heteractis auroracó hệ thống phân loại như sau: Giới: Animalia Ngành: Cnidaria Lớp: Anthozoa Bộ: Actiniaria Họ: Stichodactylidae Giống: Heteractis (Milne Edwards, 1857) Loài: H. aurora (Quoy và Gaimard, 1833) Hình 3.13 a, b – Hình dáng và màu sắc hải quỳ cúc Heteractis aurora (Thanh tỉ lệ = 4 cm)  Đặc điểm hình thái Heteractis aurora có đĩa miệng phẳng rộng với đường kính 160 mm, xúc tu dài 28 mm, màu nâu xám với gốc xúc tu màu đỏ tía. Mỗi xúc tu của H. aurora chứa nhiều nốt phồng giống như một chuỗi hạt đính vào nhau (7 - 11 nốt phồng). Ở trung tâm miệng có những mảng trắng hoặc nâu đỏ tỏa ra xung quanh đĩa miệng, các xúc tu ở gần trung tâm phân bố thưa thớt, xung quanh miệng không có xúc tu. Thân to, dài 55mm, màu vàng cam nhạt với các vệt màu cam phân bố xung quanh. Mặt dưới đĩa miệng màu trắng với phần rìa màu tím xen kẽ các nốt sần trắng, càng gần mép rìa các nốt sần càng nhỏ dần. Đường kính đĩa bám 75mm. 57 4 1 2 3 Hình 3.13 c – Đặc điểm hình thái hải quỳ cúc Heteractis aurora 1 – Tại trung tâm có những mảng trắng và nâu đỏ tỏa ra xung quanh đĩa miệng; 2 – Các xúc tu có dạng nốt phồng ; 3 – Thân màu vàng cam nhạt với những đốm màu cam phân bố xung quanh; 4 –Dưới đĩa miệng có các nốt sần màu trắng, càng gần mép rìa dưới đĩa miệng các nốt sần càng nhỏ dần .  Nhận xét Theo Fautin và Allen (1994) loài H. aurora thu tại vịnh Moreton – Australia có xúc tu dài 50 mm, màu nâu hay đỏ tía với những nốt phồng (nhiều nhất là 20 nốt phồng). Đĩa miệng rộng, nhìn thấy được vì các xúc tu thưa thớt, đường kính lớn nhất là 250 mm. Thân thường có những đốm màu cam hoặc đỏ, trên thân dính các nốt sần có màu nhạt hơn màu của thân. H. aurora thu tại Khánh Hòa – Việt Nam có đặc điểm tương tự với mô tả của Fautin và Allen, tuy nhiên có thể do vị trí địa lí khác nhau nên loài ở Khánh Hòa kích thước nhỏ hơn loài tìm thấy ở Australia, số lượng nốt phồng trên xúc tu ít hơn. H. aurora có thể bị nhầm lẫn với Macrodactyla doreensis, Heteractis malu và H. crispa. Tuy nhiên xúc tu có những nốt phồng là đặc điểm đặc trưng duy nhất ở loài H. aurora (Fautin và Allen, 1994). 3.2. Nghiên cứu di truyền các loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa – Việt Nam 3.2.1 Nghiên cứu di truyền cá khoang cổ  Tách chiết DNA tổng số Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ các mẫu cá thu được trong nghiên cứu (hình 3.14) là một băng đậm nét. Sản phẩm DNA cho dải sáng rõ, đảm bảo yêu cầu cho quá trình khuếch đại gen 16S mtDNA sau này. 58 Hình 3.14 – Kết quả điện di DNA tổng số của các loài cá khoang cổ Giếng M: Marker 1 kb; giếng 1 – 7: DNA tổng số lần lượt của: A. perideraion, A. sandaracinos, A. frenatus, A. polymnus, A. ocellaris, A. clarkii (orange), A. clarkii (black).  Khuếch đại, giải trình tự DNA cá khoang cổ ở Khánh Hòa Sử dụng DNA tổng số đã tách chiết làm khuôn, cặp mồi 16Sar - br (Palumbi và ctv, 1991) cùng với chu trình nhiệt đã trình bày ở Hình 2.6. Sản phẩm PCR thu được là một băng DNA duy nhất, có kích thước khoảng 650 bp đối với đoạn gen 16S mt DNA (Hình 3.15). Điều này cho thấy cặp mồi có tính đặc hiệu, khuếch đại tốt đoạn gen mong muốn và chu trình nhiệt đã được tối ưu hóa. Hình 3.15 – Kết quả điện di sản phẩm PCR đoạn gen 16S mtDNA các mẫu cá khoang cổ Giếng M: Marker 1kb , giếng 1 – 7: sản phẩm PCR khuếch đại gen 16S mtDNA lần lượt của: A. perideraion, A. sandaracinos, A. frenatus, A. polymnus, A. ocellaris, A. clarkii(orange), A. clarkii (black); giếng số 8: mẫu đối chứng âm 59  Sự tương đồng di truyền của trình tự 16S mtDNA của cá khoang cổ ở Khánh Hòa với các trình tự Genbank Sản phẩm PCR của gen 16S mtDNA được khuếch đại thành công với kích thước khoảng 650bp. Kết nối các trình tự gen 16S mtDNA thu được bằng chương trình Sequencher 4.1.4 (www.genecodes.com) và so sánh với dữ liệu từ Genbank bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast), kết quả được thể hiện ở Bảng 3.6. Bảng 3.6 – Độ tương đồng của 7 trình tự 16S mtDNA từ 6 loài cá khoang cổ tại Khánh Hòa – Việt Nam với trình tự Genbank S Loài mô tả T hình thái Loài tương đồng Độ tương Mã số Số Genbank nu đồng T khác biệt 1 A. perideraion 2 A. clarkii (black) Amphiprion perideraion GB 100% KJ833753.1 0 Amphiprion frenatus GB 99% KJ833752.1 5 Amphiprion polymnus GB 99% KJ101554.1 7 Amphiprion sebae GB 99% HQ020377.1 7 Amphiprion clarkii GB 100% KF264161.1 0 Amphiprion tricinctus GB 99% KF264186.1 4 Amphiprion perideraion GB 97% KJ833753.1 17 Amphiprion frenatus GB 97% KJ833752.1 17 99% KF264161.1 1 Amphiprion tricinctus GB 99% KF264186.1 3 Amphiprion perideraion GB 97% KJ833753.1 13 Amphiprion sandaracinos GB 100% KF264183.1 0 Amphiprion pacificus GB 100% KF264174.1 0 Amphiprion chagosensis GB 99% KF819364.1 6 Amphiprion frenatus GB 99% KJ833752.1 7 Amphiprion perideraion GB 99% KJ833753.1 3 Amphiprion frenatus GB 100% KJ833752.1 0 Amphiprion perideraion GB 99% KJ833753.1 5 Amphiprion polymnus GB 98% KJ101554.1 10 3 A. clarkii (orange) Amphiprion clarkii GB 4 A. sandaracinos 5 A. frenatus 60 6 A. polymnus 7 A. ocelaris Amphiprion sebae GB 98% HQ020377.1 10 Amphiprion polymnus GB 100% KJ101554.1 0 Amphiprion sebae GB 99% HQ020377.1 2 Amphiprion perideraion GB 99% KJ833753.1 4 Amphiprion frenatus GB 98% KJ833752.1 10 Amphiprion ocelaris GB 100% KF264171.1 0 Amphiprion percula GB 99% AF285946.1 2 Premnas biaculeatus GB 95% KJ833754.1 19 Amphiprion perideraion GB 95% KJ833753.1 19 GB: Ký hiệu chỉ trình tự các loài từ Genbank Kết quả của Bảng 3.6 cho thấy sự tương đồng có giá trị cao giữa các loài cá khoang cổ thu được ở Khánh Hòa với trình tự tương tự trên Genbank. Dữ liệu này cho thấy việc xác định tên loài qua các đặc điểm hình thái trùng khớp với các nghiên cứu di truyền trên gen 16S mtDNA. Sự sai khác nhỏ trong các đặc điểm hình thái so với khóa phân loại của Allen có thể do sự khác biệt địa lí, sinh thái. Loài A. sandaracinos có độ tương đồng với hai loài A. sandaracinos GB và A. pacificus GB đều là 100%, cần kết hợp các chỉ thị di truyền khác để phân loại rõ hai loài này. Các loài cá khoang cổ còn lại vì cùng chung một giống nên mức độ tương đồng giữa các loài khác nhau cũng khá cao 95 – 99%.  Sự khác biệt trình tự giữa các loài cá khoang cổ thu tại Khánh Hòa Bảng 3.7 – Sự khác biệt về trình tự 16S mt DNA giữa các loài cá khoang cổ ở Khánh Hòa Đơn vị % 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 6 7 ID 2.8 2.9 0. 6 0.9 1.2 5.5 ID 0.2 2.6 3.3 3.6 6.5 ID 2.8 3.4 3.8 6.6 ID 1.4 1.7 5.5 ID 1.7 5.6 ID 5.6 6 7 ID Chú thích: 1 – A. perideraion; 2 – A. clarkii (orange); 3 – A. clarkii (black) 4 – A. sandaracinos; 5 – A. frenatus; 6 – A. polymnus; 7 – A. ocellaris. 61 Các trình tự gen 16S mtDNA của các loài cá khoang cổ sau khi được kết nối bằng chương trình Sequencher 4.1.4 (www.genecodes.com) và dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (Hall, 1997) sẽ được so sánh sự khác biệt di truyền. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.7.  Nhận xét Qua Bảng 3.7 cho thấy sự khác biệt di truyền của các loài cá khoang cổ nằm trong khoảng 0.2% (1/590 bp) đến 6.6% (39/590 bp). Các loài cá khoang cổ này đều nằm trong cùng một giống nên sự khác biệt di truyền giữa các loài không quá cao. Sự khác biệt lớn nhất là giữa loài A. ocellaris với loài A. clarkii (black) (6.6%), sự khác biệt nhỏ nhất là giữa 2 loài A. clarkii (black) và A. clarkii (orange) (0.2%), tiếp đến là giữa A. sandaracinos với loài A. perideraion (0.6%). Loài A. ocellaris có sự khác biệt di truyền trung bình lớn hơn so với các loài còn lại trong nghiên cứu (5.9%).  Xây dựng và phân tích mối quan hệ phát sinh loài các loài cá khoang cổ thu ở Khánh Hòa Tất cả 6 trình tự của cá khoang cổ trong nghiên cứu hiện tại với 13 trình tự từ GB đã được sử dụng để phân tích mối quan hệ phát sinh loài. Sau khi so sánh và dóng hàng, 560bp của các trình tự được sử dụng cho việc phân tích mối quan hệ tiến hóa. Kết quả được trình bày ở Hình 3.16 với cây phát sinh loài cùng các giá trị BT được thể hiện trên các nhánh. Qua Hình 3.16 ta thấy cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA chia làm 2 nhóm chính: Nhóm I phân thành 2 nhóm: nhóm I.1 phân thành 2 phân nhóm: nhóm I.1.1 gồm Amphiprion frenatus, A. polymnus, A. perideraion, A. sandaracinos và 9 loài cá khoang cổ trên Genbank: A.rubrocinctus, A. akindynos, A. mccullochi, A. sebae, A. chagosensis, A. nigripes, A. allardi và A. latifasciatus, nhóm I.1.2 gồm A. clarkii (orange), A. clarkii (black) và A. tricinctus GB; nhóm I.2 gồm loài Premnas biaculeatus GB. Nhóm II gồm có A. ocellaris và A. percula GB. Ở nhóm I.1.1, loài A. frenatus trong nghiên cứu hiện tại thể hiện mối quan hệ gần gũi với A. rubrocinctus với giá trị BT 70%. Về hình thái hai loài này rất giống nhau: đều có màu đỏ và một sọc trắng ngay sau mắt, tuy nhiên ở A. rubrocinctus sọc trắng không có viền màu đen như A. frenatus. Kết quả nghiên cứu của Litsios và ctv (2014) trên gen 16S của các loài cá khoang cổ cũng cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa hai loài này với 62 giá trị BT 53%. Giống như A. frenatus, loài A. polymnus trong nghiên cứu hiện tại cũng thể hiện mối quan hệ họ hàng với loài A. sebae GB với giá trị BT là 95%. Hình 3.16 – Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor - Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen 16S mt DNA của các loài cá khoang cổ tại Khánh Hòa – Việt Nam. Loài có kí hiệu GB được lấy từ Genbank, loài Chrysiptera cyanea và Chrysiptera rollandi được sử dụng làm nhóm ngoại Cũng ở nhóm I.1.1, vị trí của A. perideraion trên cây phát sinh loài thể hiện mối quan hệ gần gũi với A. sandaracinos (sự khác biệt trình tự là 0.6%). Về hình thái, hai loài đều có thân nhạt màu, các vây lưng, vây đuôi và vây hậu môn đều có màu trắng trong suốt. Tuy nhiên, A. perideraion có hai sọc trắng: trên lưng và sau mắt còn A. sandaracinos chỉ có một sọc trắng trên lưng (Allen, 1975). Nghiên cứu hiện tại ghi nhận kết quả này phù hợp với kết quả của Li và ctv (1999) và Litsios và ctv (2014). Trình tự của A. sandaracinos trong nghiên cứu hiện tại thể hiện độ tương đồng chính xác 100% với A. sandaracinos GB và A. pacificus GB. Nghiên cứu của Allen và ctv (2010) cũng cho thấy mối quan hệ tương đồng giữa A. sandaracinos và A. pacificus, chúng là hai loài khác nhau nhưng lại có sự giống nhau về trình tự 16S. Sự phân tách di truyền giữa A. sandaracinos và A. pacificus chưa rõ ràng, cần có thêm nghiên cứu di truyền bằng những chỉ thị khác để để kiểm chứng phân loại giữa hai loài này. 63 Ở nhóm I.1.2, trình tự loài A. clarkii thân màu đen (A. clarkii (black)) của nghiên cứu hiện tại có độ tương đồng chính xác 100% với với A. clarkii GB, tuy nhiên loài A. clarkii thân màu vàng A. clarkii (orange) lại có sự khác biệt với A. clarkii GB và A. clarkii (black). Sự khác biệt di truyền giữa A. clarkii (orange) và A. clarkii (black) là 0.2% (1/590bp). Nghiên cứu thu được tổng cộng 19 cá thể loài A. clarkii trong đó có 8 cá thể A. clarkii màu đen và 11 cá thể A. clarkii màu vàng, ngoài sự khác nhau về màu sắc, các đặc điểm hình thái khác đa phần đều giống nhau. Theo Allen (1975), A. clarkii là loài có sự đa dạng rất lớn về hình thái đồng thời là loài cá khoang cổ sống cộng sinh với nhiều loài vật chủ hải quỳ nhất (10 loài). Do môi trường sống khác nhau và cộng sinh với nhiều hải quỳ đòi hỏi A. clarkii phải thích ứng với từng vật chủ khác nhau nên có thể dẫn đến sự sai khác di truyền giữa hai màu sắc của loài A. clarkii. Nghiên cứu của Santini và ctv (2006) dựa vào trình tự gen 16S của các loài cá khoang cổ cũng cho thấy sự khác biệt của loài A. clarkii giữa màu đen và màu vàng giống với nghiên cứu hiện tại. Cũng trong nhóm I.1.2 này loài A. clarkii cũng thể hiện mối quan hệ gần gũi với loài A. tricinctus GB với giá trị BT cao (100%). Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Litsios và ctv (2014). Nhóm I. 2 là một loài cá khoang cổ thuộc giống khác với tất cả các loài cá khoang cổ còn lại Premnas biaculeatus GB, tách thành một nhánh riêng biệt nhưng lại nằm giữa giống Amphiprion. Vị trí của Premnas biaculeatus trên cây phát sinh loài gần với 2 loài A. ocellaris và A. percula hơn những loài cá khoang cổ khác. Về hình thái, theo Allen (1975), Premnas biaculeatus có vây đuôi tròn, một số cá thể màu cam có hình dạng cơ thể tương tự như A. ocellaris và A. percula. Elliott và ctv (1999) dựa trên trình tự gen 16S mtDNA và cytochrome b đã cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa Premnas biaculeatus và A. ocellaris. Cây phát sinh loài dựa vào trình tự gen 16S mtDNA của Santini và ctv (2006) cũng cho thấy mối quan hệ giữa ba loài này giống trong nghiên cứu hiện tại. Ở nhóm II, loài A. ocellaris trong nghiên cứu hiện tại thể hiện mối quan hệ gần gũi với loài A. percula với giá trị BT 99%; sự khác biệt di truyền giữa hai loài này là 0.4%. Theo Allen (1975), A. ocellaris vây lưng thường có 11 tia cứng còn A. percula có 10 tia cứng; các đặc điểm hình thái khác đều tương tự nhau, chúng rất khó nhận biết đặc biệt là trong giai đoạn chưa trưởng thành. Về hình thái, các loài ở nhóm I có sọc trắng thẳng còn hai loài ở nhóm II này có sọc ở giữa thân lồi về phía đầu, sự khác nhau về hình thái dẫn đến sự phân tách về mặt di truyền của hai nhóm này. Vị trí của hai loài A. ocellaris 64 và A. perculla trong cây phát sinh loài cho thấy chúng là tổ tiên của các loài cá khoang cổ. Cây phát sinh loài dựa trên gen 16S mtDNA trong kết quả nghiên cứu của Santini và ctv (2006); Litsios và ctv (2014) và Li (2015) cũng thể hiện mối quan hệ gần gũi giữa A. ocellaris và A. percula. 3.1.2 Nghiên cứu di truyền hải quỳ  Tách chiết DNA tổng số và khuếch đại trình tự DNA của hải quỳ Trong nghiên cứu này, vì thời gian hạn hẹp và thiếu kinh phí nên nghiên cứu chỉ làm di truyền 2 loài hải quỳ trên tổng số 7 loài thu được tại Khánh Hòa. Kết quả điện di DNA tổng số tách chiết từ các mẫu hải quỳ thu được trong nghiên cứu (Hình 3.17, giếng 1, 2) là một băng đậm nét đảm bảo yêu cầu cho quá trình khuếch đại gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA sau này. Sử dụng DNA tổng số đã tách chiết làm khuôn, cặp mồi 18S seaanemone – 28S seaanemone (Wilmer và ctv, 2008) cùng với chu trình nhiệt đã trình bày ở Mục 2.2.2.2. Sản phẩm PCR thu được là một băng DNA duy nhất, có kích thước khoảng 800 bp đối với đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 mt DNA (Hình 3.17, giếng 3, 4). Điều này cho thấy cặp mồi có tính đặc hiệu, khuếch đại tốt đoạn gen mong muốn và chu trình nhiệt đã được tối ưu hóa. Hình 3.17 – Kết quả điện di tổng số và sản phẩm PCR đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA hai mẫu hải quỳ; Giếng M: Marker 1kb, giếng 1, 2: DNA tổng số và giếng 3, 4: sản phẩm PCR khuếch đại gen ITS1– 5.8S – ITS2 rDNA lần lượt của Stichodactyla tapetum và Mcrodactyla doreensis; giếng số 5: mẫu đối chứng âm 65  Sự tương đồng di truyền của trình tự ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của hải quỳ với các trình tự Genbank Các trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của hải quỳ được khuếch đại thành công với kích thước khoảng 800bp. Kết nối các trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA thu được bằng chương trình Sequencher 4.1.4 (www.genecodes.com) và so sánh với dữ liệu từ Genbank bằng chương trình BLAST (ncbi.nlm.nih.gov/Blast), kết quả được thể hiện ở Bảng3.8 Bảng 3.8 –Độ tương đồng của trình tự đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của 2 loài hải quỳ thu tại Khánh Hòa – Việt Nam với dữ liệu từ Genbank Loài tương đồng STT Loài 1 Stichodactyla Độ tương đồng Heteractis magnifica GB 95% AF050209.1 Actinia bermudensis GB 81% JN118562.1 Bunodosoma cangicum GB 80% JN118561.1 Macrodactyla Aulactinia marplatensis 93% EF026602.1 doreensis GB 86% JQ844117.1 tapetum 2 Urticina crassicornis GB GB: Ký hiệu chỉ trình tự các loài từ Genbank Kết quả ở Bảng 3.8 cho thấy hai trình tự của hải quỳ trong nghiên cứu hiện tại chưa tìm thấy trình tự tương đồng 100% với trình tự trên Genbank. Độ tương đồng của các loài này được thể hiện qua mối quan hệ với các loài cùng họ. Hải quỳ chỉ mới được phân loại bằng hình thái mà chưa được kiểm chứng bằng phân loại di truyền.  So sánh khác biệt trình tự giữa các loài hải quỳ Bảng 3.9 – Sự khác biệt về trình tự ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ 1 2 3 4 5 6 7 1 2 3 4 5 6 7 ID 31.8 29.8 30.2 30.3 35.9 45.4 ID 5.4 30.3 31.4 37.8 46.4 ID 29.3 30.7 36.9 45.2 ID 15.7 40.5 45.5 ID 39.7 43.3 ID 42.1 ID 66 Chú thích: 1 – Urticina crassicornis GB; 2 – Stichodactyla tapetum; 3 – Heteratis magnifica GB; 4 – Actinia bermudensis GB; 5 – Bunodosoma cangicum GB; 6 – Mcrodactyla doreensis; 7 – Aulactinia marplatensis GB. Các trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của 2 loài hải quỳ sau khi được kết nối bằng chương trình Sequencher 4.1.4 (www.genecodes.com) và dóng hàng bằng phần mềm BioEdit 7.2.5 (Hall, 1997) sẽ được so sánh sự khác biệt di truyền cùng với 5 trình tự hải quỳ khác trên Genbank. Kết quả được thể hiện ở Bảng 3.9 Qua Bảng3.9 cho thấy sự khác biệt di truyền của các loài hải quỳ nằm trong khoảng biến động tương đối lớn, từ 5.4% (34/630 bp) đến 46.4% (292/630 bp). Sự khác biệt nhỏ nhất giữa loài Heteratis magnifica GB và Stichodactyla tapetum (5.4%), sự khác biệt lớn nhất giữa loài Mcrodactyla doreensis và Actinia bermudensis GB (40.5%).  Xây dựng cây phát sinh loài hải quỳ Hai trình tự của hai loài hải quỳ thu ở Khánh Hòa với 5 trình tự trên Genbank được sử dụng phân tích mối quan hệ phát sinh loài. Sau khi so sánh và dóng hàng, 630 bp của các trình tự được sử dụng phân tích mối quan hệ tiến hóa. Kết quả được trình bày ở Hình 3.18 với cây đa dạng loài cùng các giá trị BT tin cậy được thể hiện trên các nhánh. Hình 3.18 – Cây phát sinh loài từ phương pháp Neighbor - Joining với độ lặp lại 1000 lần dựa trên gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ tại Khánh Hòa – Việt Nam. Loài có kí hiệu GB được lấy từ Genbank, loài Leptogorgia virgulata được sử dụng làm nhóm ngoại Qua Hình 3.18 ta thấy cây phát sinh loài hải quỳ dựa vào trình tự gen ITS1 – 5.8S – ITS2 thiếu phân tách về mặt di truyền nhưng vẫn cho thấy mối quan hệ gần gũi giữa các loài hải quỳ, cây phát sinh loài được chia thành 2 nhóm chính: 67 Nhóm I.1 gồm 3 loài thuộc họ Actiniidae: Actinia bermudensis GB, Bunodosoma cangicum GB, Unticina crassicornis GB và 2 loài thuộc họ Stichodactylidae: Stichodactyla tapetum và Heteractis magnifica GB. Nhóm I.2 gồm 2 loài thuộc họ Actiniidae là Macrodactyla doreensis và Aulactinia marplatensis GB. Ở nhóm I.1, vị trí của Stichodactyla tapetum thể hiện mối quan hệ gần gũi với Heteractis magnifica với giá trị BT 100%. Các báo cáo về di truyền hải quỳ còn rất ít, hiện tại chưa có công bố nào dựa trên đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 của các loài hải quỳ này. Tuy nhiên cây phát sinh loài dựa trên gen 12S, 18S và 28S rDNA trong kết quả nghiên cứu của Rodriguez (2010) cũng đều thể hiện mối quan hệ gần gũi giữa hai giống Heteractis và Stichodactyla. Ở nhóm I.2 loài Macrodactyla doreensis trong nghiên cứu hiện tại tách thành một nhánh khác cùng với loài Aulactinia marplatensis GB với giá trị BT 74%. Về hình thái cả hai loài này đều có xúc tu phân bố thưa thớt khi vào trung tâm đĩa miệng, khu vực xung quanh miệng không có xúc tu phân bố, tuy nhiên Macrodactyla doreensis chỉ có nốt sần dưới đĩa miệng còn Aulactinia marplatensis có nhiều nốt sần ở xung quanh thân. Các nghiên cứu về hải quỳ vẫn còn rời rạc, hiện vẫn chưa có nghiên cứu cho thấy mối quan hệ giữa Macrodactyla doreensis và Aulactinia marplatensis. Tuy nhiên, nghiên cứu của Rodriguez (2010) dựa trên gen 18S rDNA cũng cho thấy loài Macrodactyla doreensis thuộc họ Actiniidae nhưng tách thành một nhánh khác so với các loài hải quỳ trong họ Actiniidae giống trong nghiên cứu hiện tại. Vị trí của loài Stichodactyla tapetum và Macrodactyla doreensis thu tại Khánh Hòa trong cây phát sinh loài nằm cách xa nhau, về đặc điểm hình thái cả hai loài không có sự tương đồng với nhau. Stichodactyla tapetum có xúc tu và thân ngắn, thân ngắn còn Macrodactyla doreensis có xúc tu dài, thân dài mảnh hơn. Để có mối quan hệ họ hàng rõ ràng hơn giữa các loài hải quỳ cần có các nghiên cứu về trình tự các gen ribosome khác. 68 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Từ những nghiên cứu trên chúng tôi đưa ra những kết luận sau đây: 1. Nghiên cứu đã thu thập và phân loại được 6 loài cá khoang cổ thuộc 1 giống Amphiprion tại Khánh Hòa bao gồm A. perideraion, A. sandaracinos, A. clarkii, A. frenatus, A. polymnus và A. ocellaris dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền (gen 16S mtDNA). Trong đó loài A. clarkii ở vùng biển Khánh Hòa có sự xuất hiện chiếm ưu thế nhất trong 6 loài thu được. Xây dựng dữ liệu về đặc điểm sinh học của các loài cá khoang cổ ở Khánh Hòa. 2. Nghiên cứu đã thu thập và phân loại 7 loài hải quỳ thuộc 6 giống, 4 họ, 2 bộ bao gồm: Stichodactyla tapetum, Stichodactyla haddoni, Entacmaea quadricolor, Macrodactyla doreensis, Heteractic aurora, Pachycerianthus magnus và Cryptodendrum adhaesivum dựa trên các đặc điểm hình thái. Xây dựng dữ liệu về đặc điểm sinh học của những loài hải quỳ ở Khánh Hòa. 3. Khuếch đại thành công đoạn gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của 2 loài hải quỳ Stchodactyla tapetum và Macrodactyla doreensis, đồng thời xây dựng dữ liệu di truyền mã vạch dựa trên chỉ thị ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của hai loài hải quỳ này. 4. Xây dựng cây phát sinh loài cá khoang cổ ở Khánh Hòa dựa trên chỉ thị gen 16S mtDNA. Cây phát sinh loài dựa trên chỉ thị 16S mtDNA cho thấy các loài cá khoang cổ trong nghiên cứu chia thành 2 nhóm lớn. Nhóm I phân thành 2 nhóm: nhóm I.1 chia thành 2 phân nhóm: nhóm I.1.1 gồm 4 loài cá khoang cổ thu tại Khánh Hòa: Amphiprion frenatus, A. polymnus, A. perideraion, A. sandaracinos nhóm I.1.2 gồm 2 loài A. clarkii (orange), A. clarkii (black); nhóm I.2 gồm loài Premnas biaculeatus GB. Nhóm II gồm có A. ocellaris và A. percula GB. 5. Xây dựng cây phát sinh loài hải quỳ dựa vào chỉ thị ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA. Cây phát sinh loài dựa trên gen ITS1 – 5.8S – ITS2 rDNA của các loài hải quỳ chia thành 2 nhóm lớn: nhóm I.1gồm 3 loài thuộc họ Actiniidae và 2 loài thuộc họ Stichodactylidae, nhóm I.2 gồm 2 loài thuộc họ Actiniidae. Cây phát sinh loài cho thấy sự thiếu phân tách về mặt di truyền nhưng vẫn thể hiện mối quan hệ gần gũi giữa các loài hải quỳ. 69 4.2. Kiến nghị 1. Cần có thêm các nghiên cứu tiếp theo nhằm khảo sát, nghiên cứu đầy đủ hơn sự đa dạng các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa. 2. Mở rộng hướng khảo sát sự đa dạng cá khoang cổ và hải quỳ dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền (DNA barcoding), đồng thời xây dựng thêm mối quan hệ phát sinh chủng loại của các loài hải quỳ. 3. Cần có nhiều nghiên cứu hơn dựa trên các chỉ thị di truyền khác nhau để định danh chính xác và thống nhất các loài hải quỳ dựa vào đặc điểm hình thái và di truyền. 70 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt 1. Nguyễn Tác An , Nguyễn Kỳ Phùng (2014). Biến đổi khí hậu đối với dải ven bờ tỉnh Khánh Hoà, những tiếp cận thích ứng và ứng phó. Hội thảo khoa học Quốc gia về khí tượng thủy văn, môi trường và biến đổi khí hậu, Khánh Hòa. 2. Nguyễn Thế Biên, Nguyễn Đức Vượng, Hồ Lương Tụy, Đỗ Hoài Nam, Trương Thị Nhàn, Hoàng Đức Cường, Nguyễn Văn Điển (2006). Đánh giá cân bằng nước và định hướng sử dụng bền vững, bảo vệ tài nguyên môi trường nước ở Khánh Hòa. Thành phố Hồ Chí Minh. 3. Mai Chi (2013). Bảo tồn và phát triển của các rạn san hô ở Nha Trang (Khánh Hòa). Bộ Tài Nguyên và Môi Trường. 4. Thái Thanh Dương, Chu Tiến Vĩnh, Trần Mạn Tuấn, Nguyễn Quang Đăng (2001). Một số loài cá thường gặp ở biển Việt Nam. 5. Nguyễn Kim Hòa (2011). Vị trí địa lí Khánh Hòa. Cổng Thông tin điện tử tỉnh Khánh Hòa, Khánh Hòa. 6. Hà Lê Thị Lộc, Nguyễn Thị Thanh Thủy, Trương Sĩ Kì, Nguyễn Thị Kim Bích, Nguyễn Trung Kiên, Hồ Thị Hoa (2009). Hoàn thiện quy trình sản xuất giống và nuôi thương mại cá khoang cổ đỏ. Báo cáo tổng kết khoa học và kĩ thuật, Viện Hải Dương Học, Nha Trang. 7. Ngọc Lan (2003). Cá cảnh biển, nhà xuất bản Mũi Cà Mau. Cà Mau. Nguyễn Thị Quỳnh Ngọc (2013). Nghiên cứu một số đặc điểm sinh học của cá khoang cổ tím (Amphiprion perideraion Bleeker) vùng biển Khánh Hòa. Luận văn thạc sĩ khoa học – Trường ĐH Bách Khoa Tp.HCM. 8. Đỗ Công Thung (2011). Điều tra đánh giá nguồn lợi sinh vật biển Việt Nam. Viện Hàn lâm khoa học và Công nghệ Việt Nam. 9. Vũ Trung Tạng, Nguyễn Đình Mão (2005). Giáo trình ngư loại học. Nhà xuất bản Nông nghiệp, Hà Nội. 10. Quỹ Môi trường Toàn cầu (2005). San hô Việt Nam đa dạng hàng đầu thế giới. 11. Thư viện tỉnh Khánh Hòa (2010). Tổng quan về Khánh Hòa. Khánh Hòa. 71 Tiếng Anh 1. Allen, G. R. (1972). The Anemonefishes. Their classification and biology. T. F. H. Publications, Neptune City, NJ, pp 1 - 288. 2. Allen, G.R, (1991). Damselfishes of the world. Mergus Publishers, Melle, Germany, pp 1 - 271. 3. Allen, G.R, (1975). The Anemone fishes. Their classification and biology. Segona edició. T.F.H. Publications, Inc., Neptune City, Nova Jersey, pp. 1-272, i-xii, 285-352. 4. Allen, G.R. Steene RG, Humann P, Deloach N (2005). Reef fish identification tropical pacific, v2, pp. 64-67. 5. Allen, G.R., Drew, J., Fenner, D. (2010). Amphiprion pacificus, a new species of anemonefish (Pomacentridae) from Fiji, Tonga, Samoa, and Wallis Island. International Journal of Ichthyology, 16, pp. 129 –138. 6. Astakhov, D.A. (2001). Species Composition of Anemonefishes (Perciformes, Pomacentridae) and Their Host Sea Anemones (Cnidaria, Actiniaria) in the Khanhhoa Province (South Vietnam). Russian Academy of Sciences, 36. 7. Astakhov, D.A. (2012). Fauna of Anemonefishes (Perciformes, Pomacentridae, Amphiprioninae) and Host Sea Anemones (Cnidaria, Actiniaria) of the Bach Long Vi Island (South China Sea, Gulf of Tonkin, Northern Vietnam). published in Voprosy Ikhtiologii, Vol. 52, No. 6, pp. 723–725. 8. Astakhov, D.A., Ponomarev, S. A., Dao Duy Thu, Lai Duy Phuong. (2008). Materials on Fauna of Anemonefishes (Perciformes, Pomacentridae, Amphiprioninae) and Host Sea Anemones (Cnidaria, Actiniaria) From Con Son Islands (South China Sea, Southern Vietnam). published in Voprosy Ikhtiologii, Vol. 48, No. 6, pp. 739–744. 9. Barnes, R.D. and Hughes. (1999). An Introduction to Marine Ecology; Third edition. Oxford, UK: Blackwell Science Ltd, pp. 117-141. 10. Bennett, J. W. (1830). A selection from the most remarkable and interesting fishes found on the coast of Ceylon. London. First Edition: i--viii + pp. 30 11. Bos, A.R. (2011). Clownfishes Amphiprion clarkii and A. sandaracinos (Pomacentridae) coexist in the sea anemone Stichodactyla mertensii. Coral Reefs 30(2), pp 1- 369. 12. Bos, R., Girley, S. Gumanao, Marieke, M., Benjamin, M., Marjho Saceda, M. , Rosie, P.(2011). Ontogenetic habitat shift, population growth, and burrowing behavior 72 of the Indo-Pacific beach star, Archaster typicus (Echinodermata; Asteroidea). 158 (3), pp 639- 648. 13. Chial, H. and Craig, J. (2008). MtDNA and mitochondrial diseases. Nature Education, 1(1), pp. 217 14. Chuta, B.P and Pichan, S.W (2008). Discrimination of Anemonefish Species by PCR-RFLP Analysis of Mitochondrial Gene Fragments. Nature Education, 1, 51 – 54. 15. Daly, M., Chaudhuri, A., Gusmão, L., Rodríguez, E. (2008). Phylogenetic relationships among sea anemones (Cnidaria: Anthozoa: Actiniaria). Molecular Phylogenetics and Evolution, 48, pp 292 – 301. 16. Elliott, J.K, Lougheed, S.C, Bateman B, McPhee, L.K, Boag P.T (1999). Molecular phylogenetic evidence for the evolution of specialization in anemonefishes. Nature Education, 266(1420), 677–685. 17. Fautin, D. G., Allen, G. R. (1994). Anemone Fishes and Their Host Sea Anemones. amazon, 2, pp 1 – 8. 18. Fautin, D.G (1991). The anemonefish symbiosis: What is known and what is not. Symbiosis. Mergus Publishers, 10(1): 23-46. . 19. Fautin, D.G and Allen, G.R. (1992). Field guide to anemonefishes and their host sea anemones. Western Australian Museum, pp 160. 20. Gohar, H. A. F. (1934). Partnership between Fish and Anemone. Nature, 134, pp. 291 21. Grande, C., Templado, J. and Zardoya, R. (2008). Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements. BMC Evolutionary Biology, 8, pp. 61-76. 22. Grande, C., Templado, J. and Zardoya, R. (2008). Evolution of gastropod mitochondrial genome arrangements. BMC Evolutionary Biology, 8, pp. 61-76. 23. Guiter, S. (1996). Relations between sea anemones and marine organisms: the example of the symbiosis with the clown fish. Publisher Ecole Nationale Veterinaire, Alfort (France), pp 205. 24. Hattori A. (1991). Socially controlled growth and size – dependent sex change in the anemonefish Amphprion frenatus in Okinawa. Japan, 38 (2), pp. 165-178 25. Hebert, P. D. N., Penton, E. H., Burns, J. M., Janzen, D. H. and Hallwachs, W. (2004). Ten species in one: DNA barcodingreveals cryptic species in the neotropical 73 skipper butterfly Astrapes fulgerator. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of American, 101(41), pp. 14812–14817. 26. Hebert, P. D. N., Ratsingham, S., Dewaard, J. R., (2003). Barcoding animal life: cytochrome c oxidase sub – unit 1 divergences among closely related species. Proceedings of the Royal Society of London, Series B, Biology Letters Supplement, 1(270), pp 96 – 99. 27. Hebert, P.D.N, Cywinska A, Ball S.L and Waard, J.R. (2003). Biological identifications through DNA barcodes. Proceedings of the Royal Society B: Biological Sciences, 270(1512), pp. 313–321. 28. ellberg, M. E. (2007). Footprints on water: the genetic wake of dispersal among reefs. Coral Reefs, 26, pp. 463-73. 29. Hillis, D. M., 1987. Molecular versus morphological approaches to systematic, A. Rev. Ecol. Syst. 18, pp 23 – 42. 30. Johnny L. (2014). Coral Triangle could be last bastion for planet's beleaguered reefs. 1 (1), pp 320. 31. Kenneth W. (2011). Aquarium Fish: An Overview of Clownfish of the Skunk Complex. Nature Education, v10. 32. Klinkenberg, Brian (2015). Electronic Atlas of the Fauna of British Columbia. Lab for Advanced Spatial Analysis, Department of Geography, University of British Columbia, Vancouver. 33. Li, J., Chen, X., Kang, B., Liu, M. (2015). Mitochondrial DNA genomes organization and phylogenetic relationships analysis of eight anemonefishes (pomacentridae: amphiprioninae) Journal List, 10 (4). 34. Lieske, E. and Myers R. (1994). Collins Pocket Guide. Coral reef fishes. IndoPacific and Caribbean including the Red Sea. Haper Collins Publishers, pp 400. 35. Linnaeus (1758). Systema naturae per regna tria naturae, secundum classes, ordines, genera, species, cum characteribus, differentiis, synonymis, locis. Tomus I. Editio decima, reformata. Systema Nat. ed., pp 10. 36. Litsios, G., Pearman, P. B., Lanterbecq, D., Tolou, N. and Salamin, N. (2014). The radiation of the clownfishes has two geographical replicates, Journal of Biogeography, 41 (11), pp. 2140 - 2149. 74 37. McCommas, S. A. (1991). Relationships within the family Actiinidae (Cnidaria, Actiniaria) based on molecular characters. Hydrobiologyca, 216/217, pp 509 – 512. Munday, P. L., Jones, G. P., Pratchett, M. S., Williams, A. J. (2008). Climate change and the future for coral reef fishes. fish and fisheries,9, pp 261–285. 38. Myers, R. F. (1991). Micronesian reef fishes. A practical guide to the identification of the coral reef fisfef of the Tropical Central and Western Paticific. A Coral Graphics GUAM, USA, pp 298. 39. Odorico, D. M., Miller, D. J. (1997). Variation in the ribosomal internal transcribed spacers and 5.8S rDNA among five species of Acropola (Cnidaria, Scleractinia): Patterns of variation consistent with reticulate evolution. Molecular Biology and Evolution, 14 (5), pp 165 – 473. 40. Ovenden, J., Berry, O., Welch, D. J., Buckworth, R. C., Dichmont, C. M. (2013). Ocean’s eleven: a critical evaluation of the tole of population, evolutionary and molecular genetics in the management of wild fisheries. Fish and Fisheries, ISI Journal Citation Reports 41. Palumbi, S., Martin, A., Romano, S., Mcmillan, W. O., Stice, L. and Grabowski, G. (1991), “The Simple Fool's Guide to PCR”, version 2, University of Hawaii Press Honolulu. 42. Philip L.M, Geoffrey P.J, Morgan S.P, Ashley J.W (2008). Climate change and the future for coral reef fishes. Nature Education, v9, pp 261 – 285. 43. Rodriguez, E., Barbeitos, M.S., Brugler, M.R., Crowley, L.M., Grajales, A., Gusma˜o, L., Ha¨ussermann, V., Reft, A., Daly, M. (2014). Hidden among Sea Anemones: The First Comprehensive Phylogenetic Reconstruction of the Order Actiniaria (Cnidaria, Anthozoa, Hexacorallia) Reveals a Novel Group of Hexacorals. PLOS ONE, 9(5), pp e96998. 44. Rodriguez, E., Daly, M. (2010). Phylogenetic Relationships among Deep-Sea and Chemosynthetic Sea Anemones: Actinoscyphiidae and Actinostolidae (Actiniaria: Mesomyaria). Journal List. PLoS One, 9(5). 45. Saccone, C., De Giorgi, C., Gissi, C., Pesole, G. and Reyes, A. (1999). Evolutionary genomics in the Metazoa : the mitochondrial DNA as a model system. Gene, 238(1), pp. 195 – 210. 75 46. Santini, S., Polacco, G. (2006). Finding Nemo: Molecular phylogeny and evolution of the unusual life style of anemonefish, Science Direct, 385, pp. 19 – 27. 47. Schander, C. and Willassen, E. (2005). What can biological barcoding do for marine biology. Marine Biology Research, 1, pp. 79-83. 48. Shearer, T. L., Rodríguez, C. G., Coffroth, M. A., (2005). Generating molecular markers from zoothanthellate cnidarians. Coral reffs, 24, pp 57 – 66. 49. Stampar, S. N., Morandini, A. C, Silveira, F. L. D. (2014). A new species of Pachycerianthus (Cnidaria, Anthozoa, Ceriantharia) from Tropical Southwestern Atlantic,Zootaxa (3), pp. 343–354. 50. Steinke, D.R, Zemlak, T.S and Hebert, P.D (2009). Barcoding Nemo: DNA-Based Identifications for the Ornamental Fish Trade. Nature Education, 4(7), 6300. 51. Vilcinskas, A. (2002). La vie sous-marine des tropiques [Marine life of the tropic]. in French, Paris. 52. Wilmer, W. J., Mitchell, M. L. (2008). A preliminary investigation of the utility of ribosomal gens for species identification of sea anemones (Cnidaria, Actinidria). In, Davie, P. J. F., Philips, J. A. (2008). Proceedings of the thirteenth International Marine Biologycal Worshop, The Marine Fauna and Flora of Moretion Bay, Queesland. Memoirs of the Queesland Museum – Nature, 54 (1). Pp 65 – 73. 53. Wolstenholme, D. R. (1992). Animal mitochondrial genome: structure and evolution. International Review of Cytology, 141, pp. 172-216. Tài liệu Internet 1. http://animaldiversity.org/ 2. http://www.fishbase.org 3. http://www.sealifebase.org/ PHỤ LỤC Phụ lục 1a 76 Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng bộ kit Thermo Scientific Dream Taq DNA Polymerase (Thermo Scientific):  Cắt 20 mg mô cơ cá, cho vào tube 1,5mL và nghiền nhỏ.  Thêm 180µL Digestion Solution, mix đều  Thêm 20 µL Proteinase K Solution, mix đều .  Ủ ở 560C cho tới khi mô tan hoàn toàn.  Thêm 20 µL Rnase A Solution, vortex rồi ủ 10 phút ở nhiệt độ phòng.  Thêm 200 µL Lysis Solution, vortex 15s cho đồng nhất.  Thêm 400 µL ethanol 50%, mix đều.  Chuyển toàn bộ thể tích trong tube 1,5mL sang cột GeneJET Genomic DNA Purification Column, rồi tiến hành:  Ly tâm 1 phút tại 8000 vòng/phút  Loại bỏ dịch  Đặt GeneJET vào tube 2 mL mới  Thêm 500 µL Wash Buffer I vào GeneJET, ly tâm 1 phút tại 10.000 vòng/phút, tiếp tục loại bỏ dịch và đặt cột trở lại.  Thêm 500 µL Wash Buffer II vào GeneJET, ly tâm 4 phút tại 13.000 vòng/phút, tiếp tục loại bỏ dịch và chuyển cột GeneJET sang tube 1,5mL.  Thêm 100 µL Elution Buffer, đặt ở nhiệt độ phòng trong 2 phút, sau đó ly tâm 1 phút tại 8000 vòng/phút.  Loại bỏ cột GeneJET  Thu được DNA tổng số trong tube 1,5mL  Bảo quản DNA tổng số ở -200C đến -400C 77 Phụ lục 1b Quy trình tách chiết DNA tổng số bằng bộ kit Qiagen  Lấy 25mg mẫu mô hải quỳ cho vào trong tube 1,5ml  Thêm 180µl đệm ATL  Thêm 20µl proteinase K, mix đều  Ủ 56 0C cho đến khi mẫu tan hoàn toàn, mix 15s  Thêm 200µl Buffer AL, mix  Thêm 200µl ethanol (96 – 100 0C), mix  Dùng pipet hút toàn bộ dịch chuyển sang tube có cột lọc 2ml (có sẵn)  Ly tâm tại 6.000g (8.000 vòng/phút) trong 1phút  Loại bỏ dịch và thu cột lọc ở trên  Đặt cột lọc sang tube 2ml mới (có sẵn)  Thêm 500µl đệm AW1, ly tâm trong 1 phút tại 6.000g  Loại bỏ dịch và thu cột lọc ở trên  Đặt cột lọc sang tube 2ml mới (có sẵn)  Thêm 500µl buffer AW2, ly tâm 4 phút tại 13.000 vòng/phút  Loại bỏ dịch và chuyển cột lọc ở trênsang tube 1,5ml mới (không có sẵn)  Thêm 50µl đệm AE, ủ 3-5 phút tại nhiệt độ phòng, ly tâm 1 phút tại 6.000g thu được 100µl bảo quản DNA ở -20 0C. 78 Phụ lục 2: Các bảng số liệu đo và đếm các chỉ tiêu hình thái của cá khoang cổ Bảng PL.1 a – Kết quả đo các chỉ tiêu hình thái của loài Amphiprion perideraion. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 L (mm) 38.82 43.42 44.32 46.02 51.1 51.4 51.74 52.23 53.32 56.64 58.42 59.41 61.7 61.8 67.4 68.22 72.9 LS (mm) 32.33 39.1 35.94 38 40.9 41.4 40 40.7 42.1 44.61 48.7 47.73 50.3 54.04 53.32 55.3 59.1 LM (mm) 1.8 2.8 2.1 2.7 3.0 2.8 3.1 2.6 3 2.5 4.0 2.4 4.2 4.2 2.7 4.3 4.7 T (mm) 9 12.73 16.8 10.2 11.44 12.73 12.53 11.82 12.7 13.84 13.83 14.49 13.8 15.6 15.3 16 17.53 DE (mm) 3.1 3.9 3.1 3.3 3.4 3.4 3.5 3.3 4.1 3.8 3.9 4.1 4.4 4.7 4.1 4.7 5.1 H (mm) 14 17.53 15.8 16.44 18.2 17.6 18.1 17.43 19.2 19.4 21.3 21.1 21.3 23.5 23.1 24.2 26.9 lD (mm) 18.6 21.4 18.52 19.3 20.2 22.43 23.32 21.9 20.8 24.9 24.91 27.1 27.1 29.2 27.2 29.6 29.82 lA (mm) 9.9 10.5 10.12 10.34 11.6 10.3 10.72 11 11.5 9 11.13 11.8 14.4 14 13.22 15.6 16.2 lP (mm) 9.3 10.8 9.7 8.2 9.53 9.52 10.5 9.4 10.7 11.74 11.2 12 11.83 12.3 12.6 14.2 15.3 lV (mm) 6 8.2 10.8 7.6 8.6 7.7 9.2 8.22 7.9 9 8.8 9.6 10.8 10.3 10.4 11.04 10.93 Cân nặng (g) 1.16 2.29 1.4 1.81 2.21 2.52 2.33 2.35 2.92 3.08 4.02 4.15 4.1 5.51 5.07 6.09 8.88 79 Bảng PL.1 b – Kết quả đếm các chỉ tiêu phân loại của loài Amphiprion perideraion. STT D C P V A Số vẩy đường bên Số hàng vẩy Từ đường bên đến gốc vây lưng Từ đường bên đến gốc vây hậu môn 1 X, 17 22 17 I, 5 II, 13 38 5 15 2 X, 16 22 17 I, 5 II, 13 41 5 19 3 X, 18 20 16 I, 5 II, 14 43 4 18 4 X, 16 21 17 I, 5 II, 14 42 4 17 5 X, 17 22 17 I, 5 II, 12 39 4 16 6 X, 17 17 16 I, 5 II, 13 35 5 17 7 X, 17 20 15 I, 5 II, 13 41 5 16 8 X, 17 20 17 I, 5 II, 13 40 5 17 9 X, 17 19 13 I, 5 II, 11 34 - 35 5 16 10 X, 17 16 16 I, 5 II, 13 42 5 18 11 X, 16 22 18 I, 5 II, 13 41 6 18 12 X, 16 16 17 I, 5 II, 12 36 5 18 13 X, 17 21 15 I, 5 II, 15 37 5 15 14 X, 18 24 15 I, 5 II, 14 34 4 16 15 X, 16 17 16 I, 5 II, 12 38 5 19 16 X, 17 22 17 I, 5 II, 14 41 6 19 17 IX.16 19 17 I, 5 II, 14 42 6 16 80 Bảng PL. 2 a – Kết quả đo các chỉ tiêu hình thái loài Amphiprion sandaracinos. Cân nặng L LS LM T DE H (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) 1 37 30.8 2.1 9.22 2.9 12.6 15.2 9.8 7.81 6.5 1.04 2 42.3 37.03 2 10.53 2.9 15.52 21.23 9.3 8.34 5.1 1.9 3 44.11 35.1 1.3 10.9 2.9 14.71 20.4 8.1 10.3 9 1.51 4 61.18 49 2.8 13.5 3.4 19.9 21.4 12.2 14.23 7.6 4.18 5 61.43 49.7 2.9 14.22 3.5 21.4 27.83 12.11 12.11 10.14 4.62 6 71.3 57.2 3.1 16.42 4.1 22.63 28.2 14 13.6 10.5 6.7 STT lD lA lP lV (g) Bảng PL. 2 b – Kết quả đếm các chỉ tiêu phân loại loài Amphiprion sandaracinos. Số hàng vẩy Số vẩy STT D C P V A đường Từ đường bên đến Từ đường bên đến bên. gốc vây lưng gốc vây hậu môn 1 IX, 17 20 14 I, 5 II, 12 34 6 15 2 IX, 18 19 17 I, 5 II, 13 37 5 17 3 IX, 18 22 16 I, 5 II, 14 37 5 15 4 IX, 18 21 16 I, 5 II, 13 38 5 16 5 IX, 18 19 15 I, 5 II, 13 36 4 16 6 IX, 18 17 16 I, 5 II, 12 36 5 17 81 Bảng PL. 3 a – Kết quả đo các chỉ tiêu hình thái loài Amphiprion clarkii. Kí hiệu: O: A. clarkii – orange; B: A. clarkii – black STT L (mm) 1(O) 35.82 2(O) 37.83 3(O) 39.01 4(O) 39.8 5(O) 44.9 6(O) 45.4 7(O) 47.43 8(O) 49.4 9(B) 51.6 10(O) 52.53 11((B) 54.01 12(B) 56.34 13(O) 57.43 14(B) 57.73 15(O) 63.32 16(B) 73.5 17(B) 73.8 18(B) 86.2 19(B) 101.5 LS (mm) 27.71 28.66 35.1 31.1 36 34.5 36.9 36.84 40.3 41.78 41.54 45.8 44.8 43.9 48.62 57.23 53.9 67.73 77.9 LM (mm) 1.6 1.8 1.7 1.6 1.8 1.8 1.5 2.6 2.4 2.7 2.1 3.8 3.5 2.9 3.4 3.7 3.4 5.8 2.7 T (mm) 9.3 9.7 11.44 9.8 11 12.33 11.7 11.5 11.5 14 12.53 14.8 12 14.02 14.31 16.84 16.2 19.3 23.31 DE (mm) 3.5 3.9 4.6 4.1 4.6 4.2 4.6 4.6 5 4.8 4.8 5.2 5.1 5.5 5.2 6.2 6.1 6.2 5.3 H (mm) 13.7 13.32 13.2 14.3 15.9 16.5 17.81 17.93 16.44 20 19.7 22.9 19.41 21.1 23.32 27.3 27.7 34.52 42.6 lD (mm) 14.9 15 15.7 16.31 19.1 19 18.52 19.8 20.63 22.4 23.6 23.3 22 24.61 25.6 30.7 27.3 37 47.43 lA (mm) 7.43 8 7.5 7.4 8.81 7.7 10.12 9.3 8.54 11.54 11.3 8.5 11.13 14.23 12.24 15.6 11.9 17 22.03 lP (mm) 8.9 7.54 8.14 8.1 8.4 10.51 9.7 10.73 11.04 11.1 9.3 9.7 11.5 11.9 13.8 13.3 15.7 21.9 22.03 lV (mm) 7.61 7.8 8.7 8.42 9.5 11.34 10.8 14 14.2 13.22 12.34 13.62 11.84 13.12 14.91 15.4 16 21.7 26.3 Cân nặng 0.98 1.06 1.16 1.33 1.71 1.92 2.17 2.25 2.78 2.82 2.86 5.24 3.53 3.66 4.81 7.68 5.84 14.63 26 82 Bảng PL. 3 b– Kết quả đếm các chỉ tiêu phân loại loài Amphiprion clarkii. STT 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 D X, 16 X, 13 X, 16 X, 16 IX, 13 X, 18 X, 16 X, 18 X, 17 X, 18 X, 17 X, 15 X, 17 X, 17 X, 18 X, 16 X, 16 X, 16 X, 16 C 19 19 18 -19 18 17 19 19 19 18 22 18 17 18 20 20 19 18 21 15 -16 P V A 19 16 17 18 17 17 17 17 18 18 18 17 18 17 17 16 17 17 18 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 I, 5 II, 15 II, 12 II, 13 II, 12 II, 13 II, 15 II, 14 II,15 II, 14 II, 16 II, 14 II, 15 II, 14 II, 15 II, 15 II, 14 II, 14 II, 13 II, 13 Số vẩy đường bên. 40 37 42 40 42 39 41 41 40 40 41 40 38 41 38 41 37 40 41 Số hàng vẩy Từ đường bên Từ đường bên đến đến gốc vây lưng gốc vây hậu môn 6 19 5 16 5 13 5 13 5 18 5 17 6 18 5 19 6 13 6 19 6 18 6 19 5 12 5 16 5 19 6 20 5 18 7 20 6 18 83 Bảng PL. 4 a – Kết quả đo các chỉ tiêu hình thái loài Amphiprion polymnus. ST L LS LM T DE H lD lA lP lV Cân nặng T (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (mm) (g) 1 34.71 30.04 1.6 9.7 3.9 12.5 15.94 7.3 6.9 6.44 0.92 2 36 30.7 2 10.3 3.9 12.53 15.5 9.04 8.1 6.1 1.16 3 48.5 39.9 2,4 11.9 4.6 17.1 20.4 11.24 10.92 9.21 2.46 4 49.5 42.2 2.3 12.13 4.7 18 20.7 11 12.3 9.83 2.56 5 51.34 41.89 2.6 12.6 4.2 18 22.8 11.6 11.1 11.1 3.00 6 55.2 43.9 2.7 13.14 4.8 19.61 21.44 11.94 11.93 11.4 3.31 7 55.3 44.84 2.5 14.5 5.2 18.82 23.63 12.1 11.6 11.1 3.31 8 65.4 52.3 2.9 15.7 5.4 23.2 26.72 14.52 13.9 13.13 5.31 9 68 56.24 3.4 16.64 5.1 22.93 26.6 13.5 14.23 12.7 5.64 10 118.82 90.4 6.2 22.43 8.1 42.5 51.3 23.9 24.8 25.7 36.10 11 124.01 97.23 6.6 28.5 7.2 43 54.1 26.6 27.2 26.44 37 12 135.62 116.01 7.7 31 8.7 47.51 58.7 30.22 29.5 26.4 56.93 13 138.33 113.62 7.3 32 8.7 49.4 59.51 31 30 29.4 60.02 84 Bảng PL. 4 b – Kết quả đếm các chỉ tiêu phân loại loài Amphiprion polymnus. Số hàng vẩy Số vẩy STT D C P V A đường Từ đường bên Từ đường bên đến bên đến gốc vây lưng gốc vây hậu môn 1 X, 12 15 16 I, 5 II, 12 34 5 17 2 X, 12 15 15 I, 5 II, 12 33 4 15 3 X, 14 15 17 I, 5 II, 12 32 4 17 4 X, 12 16 16 I, 5 II, 13 34 5 18 5 X, 14 16 17 I, 5 II, 13 40 4 16 6 X, 14 15 16 I, 5 II, 13 35 5 18 7 X, 16 17 18 I, 5 II, 12 41 5 18 8 X, 14 18 17 I, 5 II, 13 45 5 17 9 X, 13 16 17 I, 5 II, 12 32 5 18 10 X, 15 16 17 I, 5 II, 14 37 5 18 11 X, 16 15 16 I, 5 II, 12 31 5 19 12 X, 14 17 18 I, 5 II, 13 39 6 18 13 XI, 14 16 16 I, 5 II, 12 37 5 18 85 Bảng PL 5 a – Kết quả đo các chỉ tiêu hình thái loài Amphiprion frenatus. STT L (mm) 1 54.3 LS LM (mm) (mm) 43.22 3.4 T DE (mm) (mm) 12.33 4.1 H (mm) 21.3 lD lA lP 25.73 12.3 14.54 lV Cân nặng (g) 12.8 2.92 Bảng PL. 5 b – Kết quả đếm các chỉ tiêu phân loại loài Amphiprion frenatus. STT 1 D X, 17 C 17 P 17 V I, 5 A II, 16 Số vẩy đường bên 34 Từ đường bên đến gốc vây lưng 6 Số hàng vẩy Từ đường bên đến gốc vây hậu môn 19 Bảng PL. 6 a – Kết quả đo các chỉ tiêu hình thái loài Amphiprion ocellaris STT L (mm) 1 35 2 35 3 36 4 36 5 37 6 37 7 39 8 40 9 45 10 46 LS (mm) 25 27 27 29 30 30 31 32 36 35 LM (mm) 1.7 1.6 1.5 2.3 1.4 2 1.9 2.1 2.9 1.3 T (mm) 10 8 9 7 7 7 8 8 9 9 DE (mm) 2.3 2.4 2.2 2.5 2.2 2.4 3.5 3.6 2.8 3.9 H (mm) 12 19 11 18 19 16 14 12 16 16 lD lA lP lV 16 17 16 16 16 17 16 16 20 21 6 9 7 7 8 8 8 8 9 10 8 8 6 8 5 7 6 7 8 9 4 6 6 6 5 5 5 6 7 7 Cân nặng (g) 2.23 0.7 0.79 1.53 0.81 0.7 0.75 0.67 2.23 1.55 86 Bảng PL.6 b –Kết quả đếm các chỉ tiêu phân loại loài Amphiprion ocellaris. STT D C P V A Số vẩy đường bên Số hàng vẩy Từ đường bên đến Từ đường bên đến gốc vây lưng gốc vây hậu môn 1 XI, 15 19 17 I, 5 II, 13 35 5 20 2 XI, 13 19 17 I, 5 II, 12 34 4 20 3 XI, 16 19 17 I, 5 II, 11 40 5 19 4 XI, 15 21 17 I, 5 II, 11 42 4 20 5 XI, 15 19 17 I, 5 II, 13 32 4 19 6 XI, 14 19 17 I, 5 II, 11 35 4 21 7 XI, 16 18 16 I, 5 II, 1 43 5 22 8 XI, 16 19 17 I, 5 II, 13 44 5 21 9 XI, 15 19 17 I, 5 II, 13 35 5 20 10 XI, 16 19 16 I, 5 II, 13 42 5 21 87 Chú thích các kí hiệu: D – Số lượng tia và gai vây lưng L – Chiều dài toàn thân V – Số lượng tia và gai vây bụng LS – Chiều dài chuẩn A – Số lượng tia và gai vây hậu môn H – Chiều cao thân cá P – Số lượng tia và gai vây ngực T – Chiều dài đầu C – Số lượng tia và gai vây đuôi LM – Chiều dài mõm lD – Chiều dài vây lưng Số tia gai cứng được ký hiệu bằng chữ số La Mã, lA – Chiều dài vây hậu môn còn số lượng tia vây mềm ký hiệu bằng chữ số lP – Chiều dài vây ngực thường, cách nhau bằng dấu phẩy (vd: 2 tia gai lV – Chiều dài vây bụng cứng, 8 tia mềm thì ký hiệu: II,8) DE – Đường kính mắt [...]... phát sinh chủng loại của các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa – Việt Nam  Nội dung nghiên cứu  Thu mẫu và phân loại các loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái  Phân loại các loài cá khoang cổ và hải quỳ bằng chỉ thị sinh học phân tử  Xây dựng cây phát sinh loài của các loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa  Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của đề tài Nghiên... học phân tử để có độ chính xác cao hơn Nhận thấy sự đa dạng sinh học của cá khoang cổ và hải quỳ ở rạn san hô là tiền đề cho sự phát triển bền vững, đề tài Phân loại một số loài cá khoang cổ và hải quỳ tại Khánh Hòa dựa trên đặc điểm hình thái và di truyền được thực hiện nhằm cung cấp những dẫn liệu về hình thái và di truyền của một số loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa, làm cơ sở cho các nghiên... truyền các loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Khánh Hòa Đây là những dẫn liệu đầu vào về đa dạng loài, hệ thống phân loại các loài cá khoang cổ và hải quỳ, làm cơ sở cho công tác bảo tồn và quản lý nguồn lợi  Đối tượng và phạm vi nghiên cứu Các loài cá khoang cổ và hải quỳ được thu tại địa bàn tỉnh Khánh Hòa Các nghiên cứu hình thái và di truyền được sử dụng để phân loại và xây dựng cây phát sinh chủng loại. .. cơ cá và hải quỳ, cố định trong cồn 960 và bảo quản lạnh ở -200 C để phục vụ cho các nghiên cứu về di truyền Thay cồn cho các mẫu cá và hải quỳ trong ba ngày liên tiếp để loại bỏ các tạp chất và sắc tố để bảo quản mẫu được lâu hơn 2.2 Phương pháp nghiên cứu Sơ đồ nghiên cứu chung: Thu mẫu cá khoang cổ và hải quỳ Phân loại cá khoang cổ và hải quỳ bằng hình thái  Đo các chỉ tiêu hình thái  Đếm các... chỉ tiêu phân loại  Quan sát các chỉ tiêu hình thái đặc trưng Phân loại cá khoang cổ và hải quỳ bằng di truyền  Tách chiết DNA tổng số  PCR  Điện di kiểm tra kết quả  Gửi mẫu giải trình tự  Xử lí số liệu di truyền và xây dựng cây phát sinh 2.2.1 Phân loại hình thái 2.2.1.1 Phân loại cá khoang cổ bằng hình thái Cá sau khi thu về phòng thí nghiệm được quan sát tổng thể bên ngoài cơ thể cá, sau đó... 2008; Fautin và Allen, 1992) 9 1.3 Phương pháp phân loại bằng hình thái và di truyền Hình 1.3 – Hai phương pháp dùng để phân loại: (1) Phương pháp phân loại bằng hình thái; (2) Phương pháp phân loại bằng di truyền (Nguồn: http://ibol.org/about-us/what-is-dna-barcoding/) 1.3.1 Phân loại bằng hình thái Phương pháp phân loại dựa trên những đặc điểm hình thái bên ngoài được sử dụng phổ biến, dựa vào những... 3.1 Phân loại hình thái 3.1.1 Thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ thu tại Khánh Hòa  Cá khoang cổ Qua 4 đợt thu mẫu liên tục trong 5 tháng (10/11/2014 – 30/4/2014), nghiên cứu đã thu 66 cá thể cá khoang cổ và đã xác định được vùng biển Khánh Hòa hiện di n 6 loài cá khoang cổ đều thuộc giống Amphiprion Số lượng cá thể của mỗi loài trong các đợt được thể hiện ở Bảng 3.1 Bảng 3.1 – Kết quả thu mẫu cá. .. cứu và phân loại hai loài Amphiprion clarkii và Amphiprion frenatus dựa trên các đặc điểm hình thái Astakhov đã khảo sát thành phần loài cá khoang cổ và hải quỳ ở Việt Nam, ông đã xác định sự hiện di n 5 loài cá khoang cổ ở vùng biển Khánh Hòa gồm Amphiprion clarkii, A frenatus, A polymnus, A perideraion và A sandaracinos Tại đảo Côn Sơn có 4 loài cá khoang cổ: A frenatus, A polymnus, A perideraion và. .. 1 loài giống Premnas) Ông đã xây dựng cây phân loại và cung cấp mối quan hệ di truyền giữa các loài cá khoang cổ nằm trong 4 phân giống đại di n cho 28 loài cá khoang cổ đã được biết trên thế giới (Elliott và ctv, 1999) Năm 2006, Santini và ctv đã nghiên cứu sự tiến hóa của 23 loài cá khoang cổ tại Ý, trong đó ông đã xây dựng cây phân loại dựa trên gen 16S mtDNA và phân tích sự tiến hóa của các loài. .. thí nghiệm Cho hải quỳ cùng nước biển vào chậu hoặc lọ có kích thước phù hợp với hải quỳ, đợi vài tiếng đồng hồ, khi hải quỳ trở về hình dạng ban đầu, lộ rõ những đặc điểm hình thái thì tiến hành quan sát cẩn thận hơn các đặc điểm riêng của từng loài hải quỳ, tiến hành đo các đặc điểm hình thái (mm), cân trọng lượng (g) Hải quỳ được phân loại theo khóa phân loại và mô tả của Fautin và Allen (1994), ... mẫu phân loại loài cá khoang cổ hải quỳ Khánh Hòa dựa đặc điểm hình thái  Phân loại loài cá khoang cổ hải quỳ thị sinh học phân tử  Xây dựng phát sinh loài loài cá khoang cổ hải quỳ Khánh Hòa. .. chung: Thu mẫu cá khoang cổ hải quỳ Phân loại cá khoang cổ hải quỳ hình thái  Đo tiêu hình thái  Đếm tiêu phân loại  Quan sát tiêu hình thái đặc trưng Phân loại cá khoang cổ hải quỳ di truyền ... 10 Hình 2.1 – Hình thái bên cá khoang cổ 17 Hình 2.2 – Các số đo phân loại cá khoang cổ 18 Hình 2.3 –Các số đếm phân loại cá khoang cổ .18 Hình 2.4 - Các tiêu đo hải quỳ