i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành đợt thực tập tốt nghiệp này ngoài nỗ lực của bản thân em còn nhận được rất nhiều sự giúp đỡ từ cá nhân và tập thể. Em xin trân trọng cảm ơn nhà trường và các thầy cô trong Khoa Công nghệ Thực phẩm nói chung và thầy cô Bộ môn Công nghệ Thực phẩm nói riêng đã trang bị cho em kiến thức bổ ích về chuyên ngành trong những năm học qua giúp em có nền tảng để thực hiện tốt đề tài. Em xin trân trọng cảm ơn các thầy cô quản lý phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm Hóa phân tích, phòng thí nghiệm Công nghệ cao, các anh chị, bạn bè cùng làm đề tài đã tạo điều kiện và giúp đỡ em trong quá trình thực hiện nghiên cứu. Em xin đặc biệt cảm ơn cô Trần Thị Huyền đã giành nhiều thời gian, công sức tận tình hướng dẫn em trong suốt quá trình nghiên cứu và thực hiện đề tài. Cuối cùng em muốn giành lời cảm ơn sâu sắc nhất tới những người thân trong gia đình em luôn giành sự cảm thông chia sẻ và tạo điều kiện giúp đỡ em có đủ nghị lực, kinh phí để hoàn thành tốt đề tài. Em xin chân thành cảm ơn! Nha Trang, tháng 6 năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thị Dung ii DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT TỪ VIẾT TẮT GIẢI THÍCH ĐLC Độ lệch chuẩn NL/DM Nguyên liệu/dung môi OD Optical density (mật độ quang) TB Trung bình TN Thí nghiệm VTM Vitamin PTN Phòng thí nghiệm iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ...........................................................................................................i DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT ................................................................................. ii DANH MỤC BẢNG ................................................................................................ v DANH MỤC HÌNH ................................................................................................vi LỜI MỞ ĐẦU .......................................................................................................... 1 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN ................................................................................... 3 1.1. Tổng quan về cây mã đề .............................................................................. 3 1.1.1. Tên gọi và phân loại ................................................................................ 3 1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản lượng ............................................ 4 1.1.3. Đặc điểm hình thái ................................................................................ 5 1.1.4. Thành phần hoá học ................................................................................ 6 1.1.5 Tác dụng dược học và công dụng của cây mã đề .................................. 12 1.1.6 Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây mã đề...................... 16 1.2. Tìm hiểu về quá trính chống oxy hóa ............................................................ 19 1.2.1. Quá trình oxy hóa và gốc tự do ............................................................. 19 1.2.2. Chất chống oxy hóa ............................................................................. 22 1.3. Phương pháp chiết các chất có hoạt tính sinh học ......................................... 27 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ................. 32 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu ................................................ 32 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu ............................................................................ 32 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu .......................................................... 32 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị ......................................................................... 32 2.2.1. Hóa chất ................................................................................................. 32 2.2.2. Dụng cụ ................................................................................................. 32 2.2.3. Thiết bị................................................................................................... 33 2.3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 33 2.4. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................. 33 2.4.2. Bố trí thí nghiệm. ................................................................................... 36 iv 2.4.3. Các phương pháp phân tích.................................................................... 45 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ............................. 46 3.1 Tỷ lệ khối lượng các bộ phận của cây mã đề.................................................. 46 3.2 Hàm lượng ẩm của nguyên liệu...................................................................... 47 3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của thành phần cây mã đề ........................ 47 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề .............................................................................................................. 50 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề ......................................................................................................................... 52 3.6. Ảnh hưởng của thời gian đến hoạt tính chông oxy hóa của dịch chiết mã đề 53 3.7. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề ................................................................................................... 55 3.8. Đề xuất quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ mã đề ............................ 58 3.8.1. Sơ đồ quy trình ....................................................................................... 58 3.8.2. Thuyết mình quy trình ............................................................................ 59 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ....................................................... 60 4.1. Kết luận ......................................................................................................... 60 4.2. Kiến nghị....................................................................................................... 60 TÀI LIỆU THAM KHẢO..................................................................................... 61 PHỤ LỤC v DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Phân loại học ............................................................................................. 3 Bảng 3.1. Tỷ lệ khối lượng các bộ phận cây mã đề. ................................................ 46 Bảng 3.2. Hàm lượng ẩm của nguyên liệu lá mã đề khô ........................................ 47 vi DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Cây mã đề .................................................................................................. 4 Hình 1.2. Hình thái cây mã đề.................................................................................... 6 Hình 1.3. Acid béo được phân lập trong lá mã đề ....................................................... 8 Hình 1.4. Cấu trúc alkaloids trong mã đề ................................................................... 9 Hình 1.5. Một số dẫn xuất axit caffeic trong mã đề ................................................ 10 Hình 1.6. Một số loại Flavonoid trong mã đề.......................................................... 10 Hình 1.7. Một số Iridoid glycoside trong mã đề ....................................................... 11 Hình 1.8. Cấu tạo của BHA và của BHT .................................................................. 27 Hình 2.1. Sơ đồ bố thí thí nghiệm tổng quát ............................................................. 34 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ các bộ phận cây mã đề........................................................................................... 36 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. ............................................................... 38 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. .......................................................................... 40 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính oxi hóa của dịch chiết mã đề. ....................................................................................... 42 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nguyên liệu/ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề. ....................................................... 44 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các thành phần cây đến khả năng khử gốc tự do DPPH ở dịch chiết mã đề. ............................................................................................. 48 Hình 3.2. Ảnh hưởng của các thành phần cây đến tổng năng lực khử ở dịch chiết mã đề. ................................................................................................................... 48 Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã. .................................................................................................. 50 Hình 3.4 Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến tổng năng lực khử của dịch chiết mã đề.). ........................................................................................................... 50 vii Hình 3.5. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến khả năng khử gốc tự do DPPH ở dịch chiết mã đề............................................................................................................... 52 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nhiệt độ đến tổng năng lực khử ở dịch chiết mã đề.. ....... 52 Hình 3.7 Ảnh hưởng của thời gian đến khả năng khử gốc tự do DPPH ở dịch chiết mã đề............................................................................................................... 54 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian đến tổng năng lực khử ở dịch chiết mã đề. ....... 54 Hình 3.9. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến khả năng khử gốc tự do DPPH ở dịch chiết mã đề.. .............................................................................. 56 Hình 3.10. Ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến tổng năng lực khử ở dịch chiết mã đề. ............................................................................................. 56 Hình 3.11. Sơ đồ quy trình chiết hoạt chất chống oxy hóa từ lá mã đề ..................... 58 1 LỜI MỞ ĐẦU Các hợp chất chống oxy hóa, kháng khuẩn hiện nay là đối tượng được nghiên cứu rất nhiều trước tình trạng bệnh tật liên quan đến quá trình oxy hóa đang là một vấn đề cấp thiết. Theo thuyết về gốc tự do xuất phát từ ý kiến của BS. Denham Harman (Trường đại học Nebraska) đưa ra năm 1950 thì các gốc tự do là nguyên nhân chính gây xáo trộn hoạt động của các ty lạp thể (mitochondries), bám vào các DNA là nguyên liệu chính của các mật mã di truyền, gây đột biến bên trong các tế bào… Nói một cách khác các gốc tự do là nguyên nhân của sự tự hủy hoại và sự lão hóa ở cấp tế bào. Con người hiện nay luôn cố gắng tìm kiếm những loại thuốc quý hiếm ngăn ngừa các bệnh mãn tính, có lợi cho sức khỏe, làm đẹp, chống lão hóa… Tuy nhiên chúng ta lại không biết rằng những cây rau cỏ nhỏ bé dễ kiếm trong vườn cũng là những loại thuốc chữa bách bệnh nhưng lại bị lãng quên. Trong đó, mã đề là một loại rau mọc hoang được biết đến với rất nhiều công dụng chữa bệnh như giải nhiệt, lợi tiểu, kháng khuẩn, trừ đờm, sáng mắt, hạ huyết áp,… Mã đề (Plantago major) được sử dụng với nhiều mục đích trong y học cổ truyền trên toàn thế giới như có tác dụng tốt với bệnh lao, ung thư và đặc biệt với các thể nặng của viêm loét dạ dày. Trên thế giới các hoạt tính sinh học của cây mã đề cũng được đánh giá cao. Tuy nhiên ở Việt Nam việc sử dụng loại cây này trong thực phẩm, dược phẩm cũng như các ứng dụng khác còn rất hạn chế. Từ những phân tích đó, kết hợp những kiến thức đã học bước đầu làm quen với công tác nghiên cứu ứng dụng. Được sự hướng dẫn của ThS.TRần Thị Huyền, em đã thực hiện đề tài “Nghiên cứu quá trình chiết và khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề (Plantago major )”. Đây là nghiên cứu cơ bản có thể bổ sung nguồn dữ liệu khoa học về cây mã đề làm cơ cở cho các nghiên cứu khác và thúc đẩy việc ứng dụng nguồn nguyên liệu này. 2 Mục đích và ý nghĩa của đề tài  Mục đích của đề tài - Nghiên cứu các điều kiện (Nồng độ dung môi, tỷ lệ nguyên liệu/dung môi, thời gian, nhiệt độ chiết,…) ảnh hưởng đến khả năng chống oxy hóa từ dịch chiết mã đề. - Đề xuất qui trình thu dịch chiết từ mã đề có hoạt tính chống oxy hóa.  Ý nghĩa khoa học và ý nghĩa thực tiễn - Là cơ sở để áp dụng việc tách chiết chất chống oxy hóa từ các loại dược liệu. - Thành công của đề tài sẽ tạo ra chất chống oxy hóa ứng dụng trong y học. - Nâng cao giá trị của cây mã đề, từ đó mở rộng diện tích gieo trồng, nâng cao giá trị kinh tế của loại cây này. 3 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về cây mã đề 1.1.1. Tên gọi và phân loại [15], [22] 1.1.1.1. Tên gọi Tên tiếng Việt: Mã đề, xa tiền, mã tiền á. Tên tiếng anh: Chinese plantain, obako, arnoglssa. Tên khoa học: Plantago asiatica L. Tên đồng nghĩa: Plantago major, plantago major subsp. major. 1.1.1.2. Phân loại Bảng 1.1. Phân loại học Bộ (order) Hoa môi ( Lamiales) Họ (familia) Mã đề (plantaginaceae) Chi (genus) Mã đề ( plantago) Loài (species) Plantago asiatica Phân loài ( subspecies) Có nhiều phân loài Nói về loài mã đề (Plantago spp…) việc phân chia giữa các loài (species), phân loài (subspecies) và giống (varieties) chưa được thống nhất, còn nhiều tranh cãi. Tuỳ theo quan điểm của các hệ thống phân loại khác mà cây mã đề có hai cách phân loại khác nhau.  Có 2 loài mã đề khác nhau ở Việt Nam Một: Loài Plantago major (mã đề lớn) chủ yếu được dùng làm rau, được trồng phổ biến. Trong loài này có 3 phân loài (subspecies) là: - Plantago major subsp. major. - Plantago major subsp. intermedia (DC.) Arcang. - Plantago major subsp. winteri (wirtg.) W. Ludw. Hai: Loài Plantago asiatica (mã đề, mã đề á hay xa tiền) chủ yếu được dùng làm thuốc. 4 Về công dụng dược liệu của hai loài tương tự nhau nhưng ở loài mã đề lá lớn thì có chất lượng kém hơn.  Chỉ có 1 loài (species) mã đề ở Việt Nam. Đó là loài Plantago asitica với nhiều phân loài (subspecies) khác nhau, phân loài Plantago major subsp. major chính là loài Plantago major (mã đề lớn) nêu trên do quá trình trồng trọt, thuần dưỡng mà thành. Hình 1.1. Cây mã đề 1.1.2. Nguồn gốc, phân bố và tình hình sản lượng 1.1.2.1. Nguồn gốc [14], [15] Hiện nay chưa rõ ràng về nguồn gốc xuất phát của chi mã đề (Plantago). Người ta cho rằng cây mã đề có nguồn gốc từ các nước Bắc Âu. Năm 1983, Jonsson đã tìm thấy hóa thạch của cây mã đề nguyên thủy cách đây gần 4000 năm ở châu Âu. Ông cho rằng con người đã mang loại cây này đến khắp mọi nơi trên thế giới. Người Ấn Độ đặt tên cho nó là “Dấu chân của người da trắng” vì chúng xuất hiện ở khắp mọi nơi có người châu Âu sinh sống. Điều này phù hợp với cái tên “Plantago”, vì theo tiếng latin “Planta” có nghĩa là “ Bàn chân”. 1.1.2.2. Phân bố [15] Các loài mã đề mọc ở nhiều nơi trên thế giới, bao gồm châu Mỹ, châu Á, Úc, New Zealand, châu Phi và châu Âu. Nhiều loài trong chi phân bổ rộng khắp trên thế giới như một dạng cỏ dại. 5 Riêng loài mã đề Plantago asiatica (tên đồng nghĩa là Plantago major subsp. major hay plantago major) có nguồn gốc ở vùng cận nhiệt đới ở Nam Á, được dùng làm thuốc từ lâu đời ở Trung Quốc, Hàn Quốc, Nhật Bản và Việt Nam. Ở Việt Nam cây mã đề lá lớn được trồng phổ biến làm rau ăn và cây mã đề lá nhỏ mọc hoang dại trên khắp cả nước chủ yếu được dùng để làm thuốc. Mã đề thường mọc ở ven đường, ven lạch nuớc, ruộng ẩm ướt, vùng cỏ mọc, ven vườn, ven làng xóm. Mã đề thích ứng rộng với điều kiện sinh thái, cây ưa sáng, chịu bóng, thích ứng được khí hậu và đất đai của hầu khắp các vùng trong cả nước. Mã đề mọc hoang khắp nơi, từ vùng cao Sapa (Lào Cai), Đà Lạt (Lâm Đồng) đến các vùng trung du và đồng bằng… 1.1.2.3. Tình hình sản lượng Hiện nay chưa có con số thống kê về diện tích gieo trồng cũng như sản lượng song cây mã đề đang được áp dụng gieo trồng tại nhiều nơi như Cao Bằng, Lạng Sơn, Điện Biên, Phú Yên, Khánh Hòa,… Vùng đã sản xuất mã đề dược liệu hàng hoá có Nghĩa Trai (Hưng Yên), Thanh Trì (Hà Nội), Tuy Hoà (Phú Yên)… 1.1.3. Đặc điểm hình thái [15] Chi mã đề (Plantago) là một chi chứa khoảng 200 loài thực vật có kích thước nhỏ, được gọi chung là mã đề. Phần lớn là loài cây thân thảo, mặc dù có một số ít loài là dạng cây bụi nhỏ, cao tới 60 cm. Lá của chúng không có cuống, nhưng có một phần hẹp gần thân cây, là dạng cuống lá giả. Chúng có 3 hay 5 gân lá song song và toả ra ở các phần rộng hơn của phiến lá. Các lá hoặc là rộng hoặc là hẹp bản, phụ thuộc vào từng loài. Các cụm hoa sinh ra ở các cuống thường cao 5-40 cm, và có thể là một nón ngắn hay một cành hoa dài. Được thụ phấn nhờ gió. 6 Hình 1.2. Hình thái cây mã đề + Thân: Mã đề là cây thân thảo, sống lâu năm, tái sinh bằng nhánh và hạt, thân cao khoảng 10-15cm. + Lá: Lá có cuống dài, hình trứng dài 5-12 cm, rộng 3,5-8 cm, đầu tù, hơi có mũi nhọn. Mã đề rất dễ nhận ra bởi phiến lá hình thìa, đôi khi hình trứng, có gân hình cung dọc theo sống lá và đồng qui ở ngọn và gốc lá. + Hoa: Hoa mọc thành bông có cán dài 10-15 cm, xuất phát từ kẽ lá, hoa dài lưỡng tính, đài 4, xếp chéo, hơi dính ở gốc, tràng màu nâu tồn tại, gồm 4 thuỳ nằm xen kẽ ở giữa các lá đài. Nhị 4 chỉ nhị mảnh, dài, 2 lá noãn chứa nhiều tiểu noãn. Mùa hoa nở trong tháng 7-8. Hoa thụ phấn nhờ gió và phát tán bằng hạt. + Quả: Quả hộp trong chứa nhiều hạt màu nâu đen bóng. + Hạt: Hạt rất nhỏ nhưng có thể thu hoạch và nghiền nát để trích lấy dung dịch keo bột. Một cây có thể sản sinh hàng ngàn hạt, hạt khuếch tán nhờ gió. 1.1.4. Thành phần hoá học [14] Năm 2009, Beara, I.N. và cộng sự tại Đại học Novi Sad, Novi Sad, Serbia đã kiểm tra các tính chất chống oxy hóa của dịch chiết từ methanol ở một số loài mã đề bằng các phương pháp (DPPH, gốc hydroxyl, anion superoxide, và kiểm tra năng lực oxit nitric…) cho thấy hiệu quả chống oxy hóa của dịch chiết mã đề mạnh hơn so với BHT, một chất chống oxy hóa tổng hợp nổi tiếng. Bên cạnh đó dịch chiết được kiểm 7 tra tổng lượng phenolic (dao động 38,43 ÷ 70,97 mg GAE/g ) và tổng hàm lượng flavonoid từ 5,31 ÷ 13,10 mg QE/g. Theo đánh giá công dụng truyền thống, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở cây mã đề của Anne Berit Samuelsen, bộ phân nghiên cứu nguồn gốc tự nhiên của cây thuốc, đại học Oslo, Na Uy, năm 2002 chỉ ra rằng mã đề có chứa các hợp chất có hoạt tính sinh học như polysaccharides, lipid, dẫn xuất của acid caffeic, flavonoids, glycosid iridoid, terpenoids, alkaloids và một số axit hữu cơ có hoạt động chữa bệnh liên quan đến các vết thương, chống viêm, giảm đau, antiulcerogenic, antileukemic và hạ huyết áp. 1.1.4.1. Cacbonhydrate Theo Ahmed và cộng sự (1965), hạt mã đề chứa glucose monosacarit, fructose, xylose và rhamnose cũng như disaccharide sucrose và trisaccharide planteose. Planteose như một carbohydrate dự trữ trong hạt. Vỏ hạt bên ngoài có chứa polysaccharides trương nở khi tiếp xúc với nước và có dạng chất nhầy, có độ nhớt cao. Polysaccharides chiết xuất từ hạt bằng nước lạnh được chứa 61% xylose, arabinose 13,2% và 24% axit galacturonic, và chiết nước nóng của phần còn lại chứa 78% xylose, arabinose 13,2%, 3% và galactose 6,2% axit galacturonic. Năm 1999, Samuelsen và cộng sự thấy rằng các polysaccharides của dịch chiết từ nước ở nhiệt độ 500C được cấu tạo 39,7% xylose, arabinose 13,1%, 17,2% galacturonic axit, 15,5% acid glucuronic, 2,1% rhamnose, 2,5% galactose và glucose 9,9%. Trong lá có chứa trisaccharit raffinozơ, tetrasccharit stachyozơ, stachyozơ đóng vai trò là cacbonhydrat dự trữ trong thực vật. Năm 1966, Gorin đã phân lập một vài polysaccharide gồm axit galacturonic, galactose, arabinose và rhamnose ngoài ra là một lượng nhỏ glucose và xylose. polysaccharide axit pectic, galactoarabinan galactan đã bị cô lập. Những chất này đôi khi được gọi là 'plantaglucid' và đã được sử dụng để điều trị viêm loét với liều lượng 1,5-3 g/ngày. Trong một liều lượng 1mg/kg, plantaglucid giảm chỉ số loét dạ dày ở chuột xuống 20 lần. Plantaglucid giảm các cơn co thắt trong ruột thỏ và cũng có tác dụng chống co thắt. Nó giúp làm giảm kích ứng phù nề sinh ra bởi formalin và dextran. Theo Obolent-seva và Khadzhai (1966) thì không có tác dụng độc hại đã khi 8 điều trị kéo dài trên đường ruột của chuột và chó. Một số dạng pectin đã este hoá có phân tử lượng lớn (46-48 kDa) có tác dụng hoạt hoá đại thực bào ở người (in vitro) làm tăng sinh TNFα (tumornecrosis α ). 1.1.4.2. Lipit Hầu hết các axit béo thường tìm thấy trong hạt bao gồm axit Myristic, axit Plamitic, axit Stearic, axit Oleic, axit Linoleic, axit Linolenic, axit arachidic, axit Behenic, axit Lignoceric, axit 9-Hydroxy-cis-1octadecenoic. Nhưng chiếm nhiều là axit Oleic 37,4%, axit Linolenic 0,9%, axit 9-Hydroxy-cis-1octadecenoic 1,5%. Lipit trong lá tươi chiếm 0,18%. Năm 1996, Guil và cộng sự đã phân lập được một số loại lipid trong lá được thể hiện ở Hình 1.3. Trong đó phần lớn là các axit béo omega 3, omega 6 và omega 9. Hình 1.3. Acid béo được phân lập trong lá mã đề 1.1.4.3. Alkaloid Theo Rojas (1968) và Smolenski (1974), mã đề được kiểm tra định tính và phát hiện có chứa các alkaloid. Schneider (1990) xác định chúng là indicain và plantagonin. 9 Hình 1.4. Cấu trúc alkaloids trong mã đề (Trong đó R=CHO là Indicain, R=COOH là Plantagonin) 1.1.4.4. Dẫn xuất Caffeic acid Năm 1969, Pailer và Haschke Hofmeister đã phân lập được các ethyl và methyl este của axit caffeic trong mã đề từ dịch chiết methanol. Năm 1971, Maksyutina đã phân lập được chlorogenic và acid neochlorogenic từ dịch chiết dung môi nước. Theo Noro và cộng sự (1991), plantamajoside là axit caffeic chính trong cây mã đề. Plantamajoside cũng là một chất có hoạt tính sinh học được biết đến. Nó có tác dụng ức chế acid arachidonic gây ra phù nề tai ở chuột tức hay nói cách khác nó có khả năng kháng viêm. Nó còn có khả năng chống oxy hóa. Skari và cộng sự (1999) thấy rằng plantamajoside là một chất khử gốc tự do DPPH (diphenylpicrylhydrazyl). Plantamajoside cũng được biết là có một số hoạt tính kháng khuẩn (theo Rxcavn và Brimer, 1988). Acteoside được tìm thấy với một lượng nhỏ trong mã đề, nó cũng có hoạt tính chống oxy hóa, có khả năng khử gốc tự do DPPH, superoxide anion, và chống lipid peroxy (Theo Xiong, 1996; Miyase, 1991; Zhou và Zheng, 1991; Skariet, 1999). Nó còn có tính kháng khuẩn (Theo Shoyama và cộng sự, 1987) và các hoạt động giảm đau (Theo Andary và cộng sự, 1982). Acteoside có tác dụng hạ huyết áp, với liều 10 mg/kg đối với chuột (Theo Ahmad, 1995). 10 Hình 1.5. Một số dẫn xuất axit caffeic trong mã đề (Trong đó (A) Cafeic acid, (B) Chlorogenic acid, (C) Plantamajoside R=Glc, Acteoside R=Rha.) 1.1.4.5. Flavonoid Một số flavonoid đã được phân lập từ mã đề (Hình 1.6). Ta thấy những chất flavonid này đều có nhóm OH- trong cấu tạo do đó chúng sẽ tan tốt trong các dung môi có gốc ancol. Hình 1.6. Một số loại Flavonoid trong mã đề Nhiều flavonoids là chất chống oxy hóa ( Rice-Evans và cộng sự, 1996; Bohm và cộng sự, 1998). Ví dụ như các hợp chất chính trong mã đề như Baicalein, Hispidulin và Plantaginin ( Theo Yuting, 1990; Yokozawa, 1997; Skari, 1999 vàcộng sự của họ). 11 Một số flavonoids cũng được biết là có hoạt tính khử gốc tự do (Theo Kandaswami và Middleton, 1994). Baicalein, hispidulin, scutallarein và plantaginin khử gốc tự do và chống lipid peroxy (Theo Sanz, 1994; Yoshino, 1997; Gao, 1999; Skari, 1999 và cộng sự của họ). Cả Baicalein và Hispidulin có hoạt động chống viêm, Baicalein ức chế carrageenan gây ra phù chân ở chuột (Theo Lin và Shieh, 1996), trong khi Hispidulin đã được chứng minh là một chất ức chế 5-lipoxygenase ( Theo Moongkarndi và cộng sự, 1991). Baicalein có tác dụng bảo vệ gan chống lại tổn thương gan CCl4 gây ra ở chuột (Theo Lin và Shieh, 1996). Baicalein có thể gây chết tế bào ung thư biểu mô tế bào (Theo Matsuzaki và cộng sự, 1996), Scutallarein và Baicalein có các hoạt động chống dị ứng (Theo Kawasaki, 1994 và Toyoda , 1997). Ngoài ra, chúng là những chất ức chế enzyme sao chéo ngược HIV trong ống nghiệm tương ứng với giá trị IC50 (2,5mM và 5,6 mM). Theo Nishibe, 1997, các Glucosides Plantaginin, Luteolin 7glucoside và Homoplantaginin cũng là các chất ức chế enzyme sao chép ngược HIV mạnh (IC50 9,8, 40,2 và 43,3 mM, tương ứng). 1.1.4.6. Iridoid glycosides Các glycosid iridoid phân lập từ mã đề được liệt kê trong Hình 1.7. Hình 1.7. Một số Iridoid glycoside trong mã đề 12 Glycoside iridoid chính được tìm thấy là aucubin, nhưng hàm lượng của nó thay đổi qua các mùa. Mức aucubin cao nhất (1,3% trong lá khô) là vào tháng sáu. Aucubin có đặc tính kháng viêm, khi bôi tại chỗ aucubin có tác dụng ức chế TPA (12-O tetradecanoylphorbol acetate) ở chuột làm giảm phù nề tai với liều tối đa 1 mg/ tai (Theo Recio và cộng sự, 1994). Aucubin cũng có đặc tính chống co thắt do acetylcholine gây ra co thắt tử cung và ống dẫn tinh ở chuột (Theo Oritz de Urbina, 1994). Aucubin có hoạt tính giải độc cho nấm Amanita gây độc ở chuột bằng cách bảo vệ chống lại các tổn thương gan gây ra bởi amanitin. Cơ chế được cho là do hiệu ứng cạnh tranh của aucubin trên amanitin ức chế tổng hợp RNA gan (Theo Chang và cộng sự, 1984). Nó cũng có hoạt tính bào vệ gan chống lại CCl4 gây ra tổn thương về gan ở chuột (Chang, 1998), thêm vào đó là hoạt động kháng virus, chống lại virus viêm gan B (Chang, 1997). 1.1.4.7. Vitamin Mã đề lớn đã được sử dụng như một nguồn cung cấp thực phẩm, đặc biệt trong mùa xuân khi thu hoạch. Mã đề chứa các loại vitamin. Đã được báo cáo có chứa 6 mg b-carotene (Tiền vitamin A) và acid ascorbic 19 mg trong 100g (Theo Zennie và Ogzewalla, 1977). Như vậy, mã đề có thể được coi như là một nguồn thực phẩm tốt giàu vitamin C và carotenoids. 1.1.5. Tác dụng dược học và công dụng của cây mã đề [ 14], [15 ], [19] 1.1.5.1. Chống viêm loét Mã đề đã được sử dụng ở Thổ Nhĩ Kỳ trong điều trị viêm loét. Bột lá khô được trộn cùng với mật ong vào bữa ăn sáng hàng ngày. Năm 1993, Yesilada và cộng sự đã tiến hành một thử nghiệm trên chuột để kiểm tra khả năng để ức chế viêm loét của dịch chiết mã đề. Sau 7 giờ nhúng trong nước, những con chuột đã thiệt mạng và dạ dày đã được đưa ra để kiểm tra. Dịch chiết từ methanol pha với nước (1,2 g/kg) ức chế hình thành loét chiếm 40% so với nhóm kiểm soát. Dịch chiết từ nước (1 g/kg) ức chế sự hình thành vết loét bằng 37% và dịch chiết methanol ức chế nó bằng 29%. 13 1.1.5.2. Chống ung thư Năm 1976, Bhakuni và cộng sự tiến hành một cuộc kiểm tra hoạt tính chống ung thư của cây mã đề ở vùng Chile. Chiết xuất từ lá, thân và hạt của mã đề bằng dung môi ethanol 50% không có hoạt động chống lại bệnh bạch cầu lymphocytic ở chuột. Tuy nhiên năm 1990, báo cáo của Yaremenko cho rằng dịch chiết mã đề có hiệu quả trong hệ thống kiểm soát ung thư học dự phòng. Các hiệu ứng bao gồm các hoạt động chống di căn trong khối u ở chuột. Nhưng chi tiết trong nghiên cứu này không được mô tả. Trong một nghiên cứu khác, một chiết xuất dung dịch nước đã được chứng minh là có tác dụng dự phòng trên ung thư vú ở chuột (Lithander, 1992). Lá mã đề được trích ly với đệm phosphat pH 7 có chứa 0,9% NaCl và được dùng cho nhưng con chuột của chủng khỏe mạnh bị tiêm subcutaneously. Trong số những con chuột bị nhiễm virus. Sau 60 tuần, 93,3% của không được điều trị và 18,2% số chuột được điều trị phát hiện có khối u. Lithander kết luận rằng hiệu quả quan sát được cho có lẽ là do dịch chiết có tác dụng kích thích hệ thống miễn dịch hơn là ảnh hưởng trực tiếp đến virus. Do đó, dịch chiết mã đề chủ yếu có tác dụng tốt đối với con người chứ không có tác dụng trực tiếp lên vi rút herpes trong vitro. 1.1.5.3. Hoạt động Antigiardiasic Mã đề được sử dụng tại Mexico chống lại tiêu chảy và ký sinh trùng. Dung dịch mã đề nấu với nước muối được ủ với dưỡng thể của vi khuẩn Giardia duedenalis. Tỷ lệ tử vong là 76 ± 1,2 trong khi đó thuốc kháng sinh Tinidazol là (79 ± 1,9) (Theo Ponce-Ma-cotela và cộng sự, 1994). 1.1.5.4. Chống sốt rét Mã đề lớn đã được sử dụng trong điều trị bệnh sốt rét ở Tanzania. Trong vitro hoạt động chống lại trùng sốt rét Plasmodium falciparum chủng K1 được thực hiện bằng cách đo khả năng của các chất chiết xuất để ức chế sự kết hợp của [ 3H]hypoxantine vào ký sinh trùng sốt rét. Các chiết xuất dichloromethane của mã đề đã có một số tác dụng (IC50 10-49 mg/ ml), dịch chiết ether dầu hỏa và dịch chiết 14 methanol có ít tác dụng hơn (IC50 100-499 mg/ ml và 499 mg/ ml), (Theo Weenen và cộng sự, 1990). 1.1.5.5. Kháng viêm và giảm đau Các chiết xuất từ dung dịch nước (720C, 30 phút) của lá mã đề khô khi uống đã thể hiện sự chống viêm và các hoạt động liên quan đến thuốc giảm đau ức chế tổng hợp prostaglandin ở chuột. Hoạt tính kháng viêm ở chuột đã được chứng minh bởi sự ức chế phù nề chân gây ra bởi carrageenan. (Guille'n và cộng sự, 1997). 1.1.5.6. Chống oxi hóa Khả năng chống oxy hóa bằng cách làm mất màu của độ hấp thụ của 2,2% azinobis (acid 3-ethylben-zthiazolinesulfonic). Nước trà mã đề gồm một lượng nhỏ chất có khả năng quét gốc tự do so với trà đen. Khả năng chống oxy hóa của lá mã đề còn xanh thì cao hơn của trà mã đề, điều này cho thấy rằng quá trình chế biến làm giảm hoạt tính chống oxy hóa của mã đề (Campos và Lissi, 1995). 1.1.5.7. Tác dụng lợi tiểu Ở Guatemala, lá được sử dụng có công dụng lợi tiểu. Trong một nghiên cứu với của 67 cây thuốc trong đó chiếm 10% là lá mã đề khô đã được thử nghiệm trên chuột với liều 1 g/kg. Nó đã có tác dụng lợi tiểu trung gian, lượng nước tiểu tăng 108.944% sau 6 giờ. Hydrochlorothiazide tăng lượng nước tiểu bằng 286.938% (Ca'ceres, 1987). Ở Việt Nam, các dịch chiết hạt mã đề uống được cho là có tác dụng lợi tiểu. Một hoạt động lợi tiểu có thể được thử nghiệm trên người tình nguyện khỏe mạnh trong thử nghiệm “double-blind”. Tuy nhiên, không có sự khác biệt giữa thuốc và giả dược (Theo Doan và cộng sự, 1992). 1.1.5.8. Tác dụng hạ huyết áp Ở Miến Ðiện, dịch chiết mã đề được dùng để uống nhằm giảm huyết áp. Trong một nghiên cứu khác, chuột huyết áp bình thường được tiêm dịch chiết mã đề vào tĩnh mạch. Các chiết xuất 70% ethanol đã được đông khô hòa tan trong dung dịch sinh lý. Hiệu quả tối đa là quan sát 0,2 phút sau khi tiêm và kéo dài trong 0,5 phút. Các mức giảm huyết áp động mạch là không trọng đáng kể (Schmeda Hirschmann, 1992). 15 1.1.5.9. Hoạt động hạ đường huyết Rodriguez và cộng sự (1994) đã thử nghiệm dịch chiết từ ethanol 70% cho hoạt động của hạ đường huyết ở chuột normoglycaemic mà không tìm thấy bất kỳ ảnh hưởng đáng kể. Dịch chiết được cho uống với liều 500 mg/kg. Nền tảng của thử nghiệm này là người da đỏ Mapuche ở Chile đã sử dụng nước sắc từ mã đề trong việc điều trị bệnh tiểu đường (Theo Houghton và Manby, 1985). 1.1.5.10. Công dụng của cây mã đề  Cây mã đề dùng để làm rau ăn Ở Việt Nam: Lá cây mã đề non được dùng làm rau như các loại rau cải khác. Lá mã đề non còn được dùng để ăn sống với khác loại rau ghém khác nhất là ăn chung với các loại rau rừng. Lá mã đề non cũng được dùng để xào, nấu các món canh rau mặn và chay rất ngon và có tác dụng giải nhiệt, tiểu tiện dễ dàng. Ở nước ngoài: Nhiều nước Châu Á và vùng Đông Nam Á đều dùng lá non để làm rau, ở Nhật Bản dùng để ăn sống với các món súp hải sản truyền thống, ở Bắc Mỹ và Nam Mỹ dùng để làm salad hoặc hầm, nấu với thịt.  Cây mã đề dùng để làm thuốc Theo y học cổ truyền  Lá mã đề có vị nhạt, tính mát, hạt có vị ngọt, nhạt, nhớt. Quy vào 4 kinh can, phế, thận, tiểu trường. Có tác dụng thanh nhiệt lợi phế, tiêu thũng, thông tiểu tiện.  Mã đề được dùng chữa ho lâu ngày, viêm khí quản, viêm thận và bàng quang, bí tiểu tiện, tiểu tiện ra máu hoặc ra sỏi, phù thũng, đau mắt sưng đỏ, tiêu chảy, lỵ, chảy máu cam, ra nhiều mồ hôi.  Dùng ngoài, lá mã đề tươi đắp làm mụn nhọt chóng vỡ, mau lành.  Hạt mã đề dùng điều trị đái tháo đường, khó tiêu, ho, bệnh vô sinh, chữa một số bệnh về mắt.  Trong y học cổ truyền Ấn Độ, mã đề có tác dụng cầm máu, trị vết thương, viêm các mô; các bệnh về biểu bì, mụn nhọt mưng mủ, ngứa da, chốc lở loét. Lá mã đề là thuốc mát có tác dụng lợi tiểu, làm săn, chữa sốt, ho, nhức đầu, đau tai và răng, trị trĩ và tiêu chảy. 16  Ở Nhật Bản và Trung Quốc, mã đề được dùng trị ho, hen, viêm phế quản mãn, viêm màng phổi, bệnh tiết niệu, tiêu thũng, tiêu viêm và bệnh thận mãn tính. Theo y học hiện đại  Nước ép cây mã đề có tác dụng tăng tiết dịch vị. Có tác dụng tốt với bệnh lao, ung thư và thể loét dạ dày nặng trên thực nghiệm.  Qua thực nghiệm và lâm sàng thấy mã đề có một số tác dụng sau: lợi tiểu do làm tăng lượng nước tiểu, ure, axit uric và muối trong nước tiểu; trừ đờm, chữa ho; làm tăng niêm dịch phế quản, ống tiêu hoá; ức chế trung khu hô hấp, làm thở sâu và chậm, kháng khuẩn với một số chủng vi khuẩn gây bệnh ngoài da.  Cao cồn mã đề có tác dụng bảo vệ gan rõ rệt với tổn thương gan gây bằng carbon tetrachlorid ở động vật thí nghiệm. Hoạt chất aucubin phân lập được có tác dụng bảo vệ gan và chống độc tố của nấm amanita.  Trên lâm sàng đã sử dụng dạng viên phối hợp terpin và mã đề cho thấy tác dụng điều trị ho rất hiệu quả và các bệnh viêm đường hô hấp trên do siêu vi khuẩn.  Hạt mã đề được dùng điều trị bệnh sỏi đường tiết niệu.  Các polysacharid trong hạt mã đề có tác dụng nhuận tràng tốt và hạ đường máu, cholesterol máu.  Hoạt chất plantamajosid phân lập được, có tác dụng ức chế tụ cầu vàng, trực khuẩn E.coli … 1.1.6. Tình hình nghiên cứu trong và ngoài nước về cây mã đề 1.1.6.1. Tình hình nghiên cứu trong nước Ở nước ta các công bố nghiên cứu khoa học về cây mã đề vẫn còn rất hạn chế. Có một vài nghiên cứu như: Năm 1999, Đoàn Dự Đạt và cộng sự công bố nghiên cứu tác dụng lợi tiểu khi sử dụng riêng lẻ và khi kết hợp giữa bốn loại dược liệu truyền thống Việt Nam (râu ngô, mã đề, rễ cỏ tranh, cỏ râu mèo). Năm 2010, Lê Thị Lan Phương và cộng sự đã công bố xây dựng quy trình định lượng polysacharid trong cao mã đề bằng phương pháp đo quang năm trên tạp chí y học thành phố Hồ Chí Minh. 17 Một số công trình nghiên cứu khoa học của viên dược liệu như: Nghiên cứu tác dụng bảo vệ gan của chế phẩm chiết xuất từ mã đề (2004). Phân tích xác định aucubin trong dược liệu mã đề (Plantago major L.) bằng phương pháp sắc ký lỏng kết hợp đo mật độ( 9TLC-scaning) phục vụ nghiên cứu tiêu chuẩn hóa, (2009). [21] Ngoài ra còn một số bài luận văn của sinh viên như “ Nghiên cứu thành phần hóa học cây mã đề” của Trần Thanh Hà (2014) sinh viên trường đại học Cần Thơ, đã phân tích và phân tách một số hợp chất của cây mã đề. Các nghiên cứu về cây mã đề ở nước ta chưa nhiều hơn nữa mới chỉ nghiên cứu tách chiết một số hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong dược liệu, chưa nghiên cứu nhiều về khả năng chống oxy hóa của loài cây này. 1.1.6.2. Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trong những năm gần đây, xu hướng của các nghiên cứu là tìm ra các hoạt chất trong tự nhiên có khả năng kháng khuẩn, kháng virus, chống oxi hóa ngày càng mở rộng. Các bệnh liên quan tới vi khuẩn, vi rút như tiêu chảy, cúm, nhiễm trùng, uốn ván, sốt xuất huyết, ebolla, HIV…, các bệnh liên quan tới sự lão hóa, béo phì, tiểu đường, huyết áp cao và nhất là ung thư đang là vấn đề nan giải và là mối đe dọa không chỉ đối với các nước phát triển mà còn cả các nước đang phát triển và chậm phát triển. Trong số đó, cây mã đề cũng là một đối tượng được các nhà nghiên cứu quan tâm rất nhiều. Từ lâu trên thế giới đã có nhiều công bố khoa học về thành phần hóa học cũng như hoạt tính sinh học của loại cây này. Mã đề được biết đến với hoạt tính nổi trội là khả năng kháng khuẩn, kháng virus. Năm 1988, Helle Ravn và Leon Brimer, khi nghiên cứu cấu trúc và hoạt tính kháng khuẩn của Plantamajoside từ mã đề cho thấy trong môi trường thạch, khả năng ức chế vi khuẩn của Plantamajoside là lớn nhất khi so sánh với forsythtaside và axit chlorogenic. Năm 2001, Chiang và cộng sự tiến hành kiểm tra khả năng kháng vi rút của dịch chiết dung môi nước và một số chất phân lập từ mã đề trên vi rút herpesviruses (HSV-1, HSV-2). Kết quả cho thấy dịch chiết nước mã đề có khả năng kháng yếu, trong khi đó các chất phân lập được từ mã đề có khả năng kháng mạnh hơn, Chiang 18 kết luận thành phần hóa học trong mã đề có khả năng kháng vi rút chủ yếu là do các hợp chất phenolic, đặc biệt là caffeic. Một hoạt tính sinh học nữa của mã đề đáng chú ý là khả năng chống oxy hóa. Năm 1999, Ren và cộng sự khi nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của mã đề mọc ở những độ cao khác nhau. Mẫu được thu thập từ các độ cao khác nhau trên núi Mahan, Trung Quốc. Kết quả cho thấy có sự tương quan giữa độ cao và khả năng chống oxy hóa của lá và hạt của mã đề. Hoạt tính chống oxy hóa của hạt thì tăng theo sự tăng độ cao nhưng lá thì ngược lại. Điều này cho ta thấy địa hình và điều kiên khí hậu có ảnh hưởng tới hoạt tính chống oxy hóa của mã đề. Khả năng khử gốc tự do DPPH và superoxide (SO) của polysaccharides là 81,4% và 79,7% ở nồng độ polysaccharides 0,75 mg/ml, trong khi đó khả năng khử gốc tự do của 0,75 mg/mL axit ascorbic tương ứng là 83,5% và 85,1%. Điều nay cho thấy tiềm năng chống oxy hóa của của polysaccharide trong mã đề. Theo Jamilah, 2012 khi phân tích dịch chiết từ lá mã đề theo phương pháp GCMS. Kết quả phân tích các thành phần hóa học của mã đề trong dịch chiết từ các dung môi (ether dầu khí, methanol, ethyl acetate, n-butanol và nước) đều cho thấy cả năm dịch chiết trên đều có nhóm phenol, các đồng phân khác nhau của axit hữu cơ, flavonoid và terpenoid, đây là những chất được biết đến với khả năng chống oxy hóa cao. Cũng năm 2012, Harput và cộng sự tiến hành kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào và chống oxi hóa của mã đề để xác minh về những công bố về dụng truyền thống của nó. Kết quả cho thấy, dịch chiết mã đề có khả năng quét gốc tự do DPPH, oxit nitrit (NO), superoxide (SO) mạnh khi được so sánh với BHA và Quersetin. Ngoài ra dịch chiết từ dung môi nước thể hiện khả năng gây độc tế bào tùy theo liều lượng sử dụng. Từ dịch chiết mã đề với dung môi methanol 50%, đã phân lập được hai chất từ mã đề là verbascoside và calceorioside, trong đó verbascoside trước đó chưa được phân lập từ loài mã đề. Hai hợp chất này cũng được kiểm tra tương tư như đối với dịch chiết, kết quả cho thấy nó cũng có hoạt tính chống oxy hóa mạnh khi so sánh với BHA và Quersetin. Hai hợp chất này cũng thể hiện được khả năng gây độc mạnh đối với tế bào ung thư HEP-2, RD và MCF-7 (tế bào ung thư tuyến vú ở người). Tóm lại, những 19 hợp chất được phát hiện verbascoside và calceorioside có thể được sử dụng trong phòng chống ung thư. 1.2. Tìn hiểu về quá trính chống oxy hóa [3], [16], [17] 1.2.1. Quá trình oxy hóa và gốc tự do 1.2.1.1. Quá trình oxy hóa Quá trình oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa. 1.2.1.2. Gốc tự do Theo định nghĩa, gốc tự do (Free radical) là bất cứ chất nào chỉ có một điện tử duy nhất (electron mang điện âm) hay một số lẻ điện tử. Đôi khi, trong diễn tiến hóa học, một điện tử bị tách rời khỏi nhóm và phân tử đó trở thành một gốc tự do, với số lẻ điện tử. Do đó, nó không cân bằng, đầy đủ nên rất bất ổn, dễ tạo ra phản ứng. Nó luôn luôn tìm cách chiếm đoạt điện tử mà nó thiếu từ các phân tử khác, và lần lượt tạo ra một chuỗi những gốc tự do mới, gây rối loạn cho sinh hoạt bình thường của tế bào Chính do chứa điện tử độc thân mà gốc tự do có hoạt tính rất mạnh, nó luôn mang tính "huỷ hoại", sẵn sàng thực hiện tính oxy hoá, cướp điện tử của chất mà nó tiếp xúc để ghép đôi với điện tử độc thân của nó và làm chất bị nó oxy hoá bị huỷ hoại nặng nề. Phản ứng oxy hoá thường thấy hàng ngày là phản ứng đốt cháy, còn trong cơ thể phản ứng của chất oxy hoá của gốc tự do êm ái hơn nhưng lại gây huỷ hoại tế bào đặc biệt ở màng tế bào hoặc cấu trúc di truyền trong nhân tế bào, nó phá huỷ các mô gây nên quá trình lão hoá. Năm 1954, bác sĩ Denham Harman thuộc Đại học Berkeley, California, là khoa học gia đầu tiên nhận ra sự hiện hữu của gốc tự do trong cơ thể với nguy cơ gây ra những tổn thương cho tế bào. Trước đó, người ta cho rằng gốc tự do này chỉ có ở ngoài cơ thể. 1.2.1.3. Nguồn gốc hình thành các gốc tự do Nguồn gốc hình thành các gốc tự do như tia UV, bức xạ ion hóa, ô nhiễm không khí, hút thuốc, trao đổi chất, sự cháy, căng thẳng,… Các gốc tự do là nguyên nhân gây tổn thương tế bào, protein, axit nucleic, DNA,… và dẫn tới các căn bệnh 20 nguy hiểm như ung thư, lão hóa, tiểu đường, tim mạch… Do đó, để tránh sự gây hại của các gốc tự do thì cần thiết phải loại bỏ chúng bằng cách sử dụng các chất chống oxy hóa bổ sung như VTM A, VTM C, VTM E, polyphenol,… 1.2.1.4. Ảnh hưởng của gốc tự do đối với cơ thể Gốc tự do có tác dụng không tốt cho cơ thể liên tục ngay từ lúc con người mới sinh ra và mỗi tế bào chịu sự tấn công của cả chục ngàn gốc tự do mỗi ngày. Ở tuổi trung niên, cơ thể khỏe mạnh, trấn áp được chúng, nhưng tới tuổi cao, sức yếu, gốc tự do lấn át, gây thiệt hại nhiều gấp mười lần ở người trẻ. Nếu không bị kiểm soát, kiềm chế, gốc tự do gây ra các bệnh thoái hóa như ung thư, xơ cứng động mạch, làm suy yếu hệ thống miễn dịch gây dễ bị nhiễm trùng, làm giảm trí tuệ, teo cơ quan bộ phận người cao niên. Nó phá rách màng tế bào khiến chất dinh dường thất thoát, tế bào không tăng trưởng, tu bổ, rồi chết. Nó tạo ra chất lipofuscin tích tụ dưới da khiến ta có những vết đồi mồi trên mặt, trên mu bàn tay. Nó tiêu hủy hoặc ngăn cản sự tổng hợp các phân tử chất đạm, đường bột, mỡ, enzyme trong tế bào. Nó gây đột biến ở gene, ở nhiễm thể, ở DNA, RNA. Nó làm chất collagen, elastin mất đàn tính, dẻo dai khiến da nhăn nheo, cơ khớp cứng nhắc. Theo các nhà nghiên cứu, gốc tự do hủy hoại tế bào theo diễn tiến sau đây: Trước hết, gốc tự do oxy hóa màng tế bào, gây trở ngại trong việc thải chất bã và tiếp nhận thực phẩm, dưỡng khí; rồi gốc tự do tấn công các ty lập thể, phá vỡ nguồn cung cấp năng lượng. Sau cùng, bằng cách oxy hóa, gốc tự do làm suy yếu kích thích tố, enzym khiến cơ thể không tăng trưởng được. Trong tiến trình hóa già, gốc tự do cũng dự phần và có thể là nguy cơ gây tử vong. Hóa già được coi như một tích tụ những đổi thay trong mô và tế bào. Theo bác sĩ Denham Harman, các gốc tự do là một trong nhiều nguyên nhân gây ra sự hoá già và sự chết cuả các sinh vật. Ông ta cho là gốc tự do phản ứng lên ty lạp thể, gây tổn thương các phân tử bằng cách làm thay đổi hình dạng, cấu trúc, khiến chúng trở nên bất khiển dụng, mất khả năng sản xuất năng lượng. Do quan sát, người ta thấy gốc tự do có ít ở các sinh vật chết non, có nhiều hơn ở sinh vật sống lâu. Người cao tuổi có nhiều gốc tự hơn là khi người đó còn trẻ. 21 Theo các nhà khoa học thì gốc tự do có thể là thủ phạm gây ra tới trên 60 bệnh, đáng kể nhất gồm có: bệnh vữa xơ động mạch, ung thư, Alzheimer, Parkinson, đục thuỷ tinh thể, bệnh tiểu đường, cao huyết áp không nguyên nhân, xơ gan. Tuy nhiên, không phải là gốc tự do nào cũng phá hoại. Đôi khi chúng cũng có một vài hành động hữu ích. Nếu được kiềm chế, nó là nguồn cung cấp năng lượng cho cơ thể; tạo ra chất màu melanine cần cho thị giác; góp phần sản xuất prostaglandins có công dụng ngừa nhiễm trùng; tăng cường tính miễn dịch; làm dễ dàng cho sự truyền đạt tín hiệu thần kinh, co bóp cơ thịt. 1.2.2. Chất chống oxy hóa 1.2.2.1. Khái niệm chất chống oxy hóa là gì Chất chống oxi hóa là một loại hóa chất giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxi hóa chất khác. Sự oxi hóa là loại phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxi hóa, có khả năng tạo các gốc tự do sinh ra phản ứng dây chuyền phá hủy tế bào sinh vật. Chất chống oxi hóa ngăn quá trình phá hủy này bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxi hóa bằng cách oxi hóa chính chúng. 1.2.2.2. Sự chống oxy hóa Sự khử gốc tự do của chất chống ôxi hóa, trong đó các electron không ghép đôi của gốc tự do sẽ được nhận electron của chất chống oxy hóa để tạo thành các electron ghép đôi bền vững. 1.2.2.3. Tác dụng của chất chống oxy hóa Để chống lại sự bội tăng các gốc tự do sinh ra quá nhiều mà hệ thống "chất oxy hoá nội sinh" không đủ sức cân bằng để vô hiệu hoá, các nhà khoa học đặt vấn đề dùng các "chất chống oxy hóa ngoại sinh" (tức là từ bên ngoài đưa vào cơ thể) với mục đích phòng bệnh, nâng cao sức khoẻ, chống lão hoá. Các chất chống oxy hoá ngoại sinh đó đã được xác định, đó là beta-caroten, chất khoáng selen, các hợp chất flavonoid, polyphenol... Các chất oxy hoá ngoại sinh đó thật không xa lạ, chúng có từ các nguồn thiên nhiên là thực phẩm như rau cải, trái cây tươi và một số loại dược thảo. Ngoài ra trong thực phẩm, các loại phụ gia vừa tạo mùi vị cho sản phẩm còn đóng vai trò là chất chống oxy hóa giúp ngăn chặn hoặc làm chậm quá trình oxy hóa của các chất khác có trong thực phẩm. 22 Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng. 1.2.2.4. Các chất chống oxy hóa có trong tự nhiên a) Nhóm polyphenol Polyphenols là một trong những nhóm nhiều và phổ biến nhất của các chất chuyển hóa thực vật. Chúng là một phần tích hợp của cả hai chế độ ăn của con người và động vật trong đó có một phổ cao của các hoạt tính sinh học, bao gồm tính chống oxy hóa, chức năng kháng viêm, kháng khuẩn, và kháng virus. Nhiều công trình lớn nghiên cứu tiền lâm sàng và xây dựng dữ liệu dịch tễ học cho thấy polyphenol thực vật có thể làm chậm sự lan triển của ung thư, giảm nguy cơ bệnh tim mạch, bệnh thoái hóa thần kinh, tiểu đường, hoặc loãng xương. Các thông tin cũng cho thấy polyphenol thực vật có hoạt động như tiền chất ngăn ngừa và chống ung thư ở người. b) Nhóm carotene Carotenoid là một dạng sắc tố hữu cơ có tự nhiên trong thực vật và các loài sinh vật quang hợp khác như là tảo, một vài loài nấm và một vài loài vi khuẩn. Hiện nay người ta đã tìm được 600 loại carotenoid, sắp xếp theo hai nhóm, xanthophylls và carotene. Khác với cây cỏ, con người không thể tự tổng hợp ra carotenoid mà sử dụng carotenoid từ việc ăn thực vật nhằm bảo vệ bản thân mình. Carotenoid giúp chống lại các tác nhân oxy hóa từ bên ngoài. Thiên nhiên có đến khoảng 600 loại carotenoid khác nhau, trong đó có 50 loại carotenoid hiện diện trong thực phẩm. Thế nhưng trong máu của người có khoảng 15 loại được tìm thấy và chúng đang được chứng minh là đóng vai trò quan trọng đối với đời sống con người. Carotenoid không phải là tên riêng của một chất nào mà là tên của một nhóm các hợp chất có công thức cấu tạo tương tự nhau và tác dụng bảo vệ cơ thể cũng tương tự nhau. Carotenoid khá quen thuộc với chúng ta là beta-caroten hay còn gọi là tiền chất của vitamin A. Trong mấy năm gần đây người ta còn nói nhiều đến các carotenoid khác như lycopen, lutein và zeaxanthin,… Beta carotene là một tenpen. Nó là một trong hơn 600 loại caorenoid tồn tại nhiều trong tự nhiên. Carotenoid là những chất có màu vàng, cam và hơi pha đỏ. Nó có nhiều trong thực vật mà không hề xuất hiện trong động vật cũng như các thực 23 phẩm có nguồn gốc từ động vật, tính số miligam trong 100g thức ăn được thì cao nhất là gấc với kỷ lục 91,6mg%, tiếp đó là cà rốt 5mg%, beta-carotene là tiền chất của vitamin A khi hấp thụ vào cơ thể nó được chuyển hóa thành vitamin A với tỷ lệ 1mcg betacarotene thì được 0,167 mcg vitamin A. Ngoài những tác dụng như vitamin A nó không hề gây độc tính quá nhiều như vitamin A và điều đặc biệt là beta-carotene khử các gốc tự do tốt hơn vitamin A. Trên 50 công trình dịch tễ học tiền cứu và hậu cứu được thực hiện trong mấy thập niên gần đây đã chứng minh tỷ lệ beta caroten trong thức ăn gắn liền với việc giảm nguy cơ của nhiều căn bệnh ung thư. Ngoài ra nó còn giúp làm trẻ hóa làn da, giảm tử vong do bệnh tim mạch... c) Nhóm vitamin Vitamin E là chất chống oxy hóa chiến lược nhất hiện nay. Có rất nhiều công trình nghiên cứu tập trung vào vitamin E. Các thực phẩm nguồn gốc thực vật giàu vitamin E như: đậu xanh (4-6mg%), xà lách (3mg%), lạc, lúa mì, ngô hạt, cà rốt... Đặc biệt có rất nhiều ở mầm của các loại hạt: giá đỗ xanh, giá đỗ tương, mầm hạt ngô (15-25mg%), mầm lúa mì (25mg%)... Vitamin E cũng có trong một số thực phẩm nguồn gốc động vật: trứng gà, thịt bò, cá mè... Vitamin E có vai trò chính là chống oxy hóa thông qua. Việc loại trừ sự oxy hóa các lipid và sự xuất hiện các gốc tự do làm phân hủy các acid béo chưa bão hòa. Ngoài ra, vitamin E còn có tác dụng rất rõ trong việc phòng ngừa bệnh tim mạch, giảm sự mệt mỏi, suy nhược. Vitamin C xuất hiện khá phổ biến trong thực phẩm có nguồn gốc thực vật: rau ngót (185mg%), cần tây (150mg%), rau đay (77mg%), súp lơ, cà chua, su hào, mồng tơi, rau muống... Nó cũng có nhiều trong một số loại quả chín như: bưởi (95mg%), xoài (60mg%), nhãn (58mg%), đu đủ (54mg%), cam, chanh, quất, quýt... Vitamin C tham gia vào nhiều quá trình chuyển hóa quan trọng trong cơ thể. Chuyển hóa vitamin C có liên quan với nhiều vitamin khác, nó cũng bảo vệ vitamin C tránh sự oxy hóa. Vitamin C giữ vai trò quan trọng trong việc duy trì sức đề kháng của cơ thể. Khi thiếu nó, nhiều phản ứng miễn dịch sinh học của cơ thể giảm xuống. Vitamin C rất hiệu quả trong việc khử gốc tự do trong môi trường nước, máu, bào tương… 24 d) Peptide Peptide là một chuỗi các axít amino tương tự như protein nhưng ngắn mạch hơn hơn. Peptide không kèm theo các hóa chất khác và hình thành từ các amino axit có nguồn gốc tự nhiên. Chúng cũng kích thích sản xuất collagen và làm tăng tác dụng của chất chống oxy hóa. Trong cơ thể động vật và thực vật peptide làm nhiệm vụ bảo vệ cho cơ thể. Loại peptide đầu tiên phải kể đến ở động vật có xương sống là các peptide kháng thể trong máu, chúng là những yếu tố nhận biết đắc lực các tác nhân vi khuẩn, virus và các vật thể lạ xâm nhập vào cơ thể và để loại trừ chúng ra khỏi cơ thể. Ngoài ra trong máu của động vật trên còn có các interferon với nồng độ nhỏ có khả năng chống lại sự xâm nhiễm của virus. Trong máu của động vật còn có các peptide chống chảy máu như fibrin… Ở thực vật có nhiều loại tạo ra những peptide độc tố, chỉ với liều lượng nhỏ cũng có khả năng giết chết người và động vật. Ngoài ra trong cơ thể động vật, thực vật và các sinh vật khác nói chung đều tồn tại một hợp chất có bản chất peptide làm nhiệm vụ bảo về đó là lectin. Vì có khả năng liên kết đường ruột một cách đặc hiệu và chọn lọc nên lectin có thể kết tủa các tác nhân hay tế bào lạ có cấu trúc đường xâm nhập vào cơ thể để bảo vệ cơ thể. e) Selen Selen (Tên Latinh selenium) là nguyên tố hóa học thuộc nhóm VI trong hệ thống tuần hoàn các nguyên tố Mendeleyev. Selen có nhiều trong cá biển và sau đó là các thực phẩm: lòng đỏ trứng, dầu ô liu, gan động vật, các hạt ngũ cốc nguyên hạt (có nhiều ở lớp vỏ lụa), và nấm ăn... Trước đây, trong dinh dưỡng người ta ít quan tâm tới selen. Nó chỉ mới được biết tường tận vào những năm gần cuối thế kỷ 20. Có nhiều công trình nghiên cứu về selen mà đặc biệt nhất là vai trò khử các gốc tự do. Giáo sư G. Simonoff, người Pháp (giảng dạy môn vật lý hạt nhân thuộc Viện đại học Bordeauc) đã ví von: “Selen chính là “tay điệp báo” săn lùng những “trái bom” các gốc tự do để “tháo ngòi nổ” hữu hiệu nhất”. Selen ngoài tác dụng hoạt hóa vitamin E (giúp vitamin E “bẫy” các gốc tự do một cách rất hiệu quả), còn có mặt trong một số enzym dọn sạch lipo - peroxide ngăn cản sự sản sinh các gốc tự do thứ cấp. 25 f) Các alkaloid Polonopski định nghĩa Alkaloid là những hợp chất hữu cơ có chứa nitơ, thường có dược tính mạnh và cho những phản ứng hóa học với một số thuốc thử chung của alkaloid. Alkaloid có phổ biến trong thực vật, tập trung ở một số họ: Apocynaceae (họ Trúc đào) có gần 800 alkaloid, Papaveraceae (họ Thuốc phiện) gần 400 alkaloid, Fabaceae (họ Đậu) 350 alkaloid, Solanaceae (họ Cà) gần 200 alkaloid. Ở nấm có alkaloid trong nấm cựa khỏa mạch (Claviceps purpurea), nấm Amanita phalloides. Ở động vật, cũng đã tìm thấy alkaloid ngày càng tăng, alkaloid samandarin, samandaridin, samanin có trong tuyến da của loài kỳ nhông. Bufotenin, bufotenidin, dehydrobufotenin lấy từ nhựa cóc. Trong cây, alkaloid thường tập trung ở một số bộ phận nhất định. Rất ít trường hợp trong cây chỉ có một alkaloid duy nhất mà thường có hỗn hợp nhiều alkaloid, trong đó alkaloid có hàm lượng cao được gọi là alkaloid chính. Các alkaloid ở trong những cây cùng một họ thực vật cũng thường có cấu tạo rất gần nhau. Hàm lượng alkaloid trong cây thường rất thấp, Một số dược liệu chứa 1-3% alkaloid đã được coi là hàm lượng khá cao. Trong cây, alkaloid ít khi ở trạng thái tự do (alkaloid base),mà thường ở dạng muối của các acid hữu cơ như citrat, tactrat, oxalat, acetat… Có một số ít trường hợp alkaloid kết hợp với đường tạo ra dạng glycoalkaloid như solasonin và solamacgin trong cây Cà lá xẻ (Solanum laciniatum). Công dụng của alkaloid rất đa dạng và phong phú, tùy theo từng loại alkaloid. Tác dụng lên hệ thần kinh. Kích thích thần kinh trung ương: strychnine, caffeine; ức chế thần kinh trung ương: morphin, codeine; kích thích thần kinh giao cảm: ephedrine; liệt giao cảm: yohimbin; kích thích phó giao cảm: pilocarpin; liệt phó giao cảm: atropine; gây tê: cocaine; tác dụng hạ huyết áp: reserpine, serpentin; tác dụng chống ung thư: taxol, vinblastine, vincristine; tác dụng diệt ký sinh trùng, diệt khuẩn: quinine, berberine, arecoline, emetine… ngoài ra một vài alkaloid có khả năng chống oxy hóa rất cao. Các gốc tự do ngoài nguyên nhân gây nên sự lão hóa cơ thể, còn là đồng phạm gây ra nhiều bệnh khác (tim mạch, xương khớp, đái tháo đường, đục thủy tinh thể, ung thư...) bởi vậy rất cần ăn nhiều thực phẩm chống oxy hóa. 26 Tuy người ta còn nói tới những chất chống lão hóa khác nhưng trong ăn uống thì 4 chất chống oxy hóa: beta- carotene, vitamin E, vitaminC, selen là quan trọng hơn cả. Cùng với hoạt tính riêng của từng chất nên trong ăn uống nếu có được hỗn hợp cả 4 thứ này chúng sẽ có tác dụng tương hỗ bảo vệ nhau chống sự phá hủy, giúp tái tạo, khiến cho khả năng chống oxy hóa càng đạt hiệu quả cao. 1.2.2.5. Các chất chống oxy hóa tổng hợp. Các chất chống oxy hóa tổng hợp phải thỏa mãn các yêu cầu sau: - Không độc. - Có hoạt tính chống oxy hóa ở nồng độ thấp. - Có thể tập trung được trên bề mặt pha dầu. - Bền trong điều kiện kỹ thuật của quá trình chế biến thực phẩm. Các chất chống oxy hóa tổng hợp thường sử dụng là: BHT (Butylated hydroxxytoluen), BHA ( Butylate hydroxyanisole), tocopherol tổng hợp, TBHQ (Tertbutyl hydroquinone), doecyl gallate, propyl gallate, ascorbyl palmitate,… a) BHT (Butylated hydroxxytoluen) Còn được goi là 3,5-di-tert-butyl-4-hydroxytoluene;methyl-di-tertbutylphenol; - 2,6-di-tert-butyl-para-cresol. BHT được tạo thành ohanr ứng của p-cresol (4methylphenol) với isobutylene (2-methylpropene) xúc tác bởi acid sulfuric. - Công thức phân tử C15H24O - Bột màu trắng BHT ngăn ngừa oxy hóa chất béo. Nó được sử dụng để bảo quản thực phẩm có mùi, màu sắc và hương vị. Nhiều vật liệu đóng gói kết hợp BHT. Nó cũng được bổ sung trực tiếp để bảo quản ngũ cốc và các loại thực phẩm chứa chất béo và dầu. b) BHA (Butyllated hydroxytoluen) - BHA là một hỗn hợp của các đồng phân 3-tert-butyl-4-hydroxyanisole và 2-tertbutyl-4-hydroxyanisole. - Công thức phân tử C11H16O2 - Màu trắng hoặc hơi vàng - Mùi thơm đặc trưng - BHA thường được sử dụng để giữ chất béo khỏi bị ôi 27 - BHA được tìm thấy trong bơ, thịt, ngũ cốc, kẹo cao su, đồ nướng, thực phẩm snack, khoai tây khử nước và bia. Nó cũng được tìm thấy trong thức ăn động vật, bao bì thực phẩm, mỹ phẩm, sản phẩm cao su và các sản phẩm dầu khí. Hình 1.8. Cấu tạo của BHA (A) và của BHT (B) c) TBHQ (Terbutyl hydroquinone) - TBHQ là một chất chống oxy hóa được dùng rộng rãi trong thực phẩm, mỹ phẩm, cao su, đặc biệt là trong bảo quản các loại dầu và chất béo. Nó còn được sử dụng như một chất ổn định để hạn chế sự trùng hợp tự động của các peroxit hữu cơ. - TBHQ là một tinh thể màu trắng có mùi đặc trưng, không tan trong nước nhưng hòa tan trong rượu và ete. 1.3. Phương pháp chiết các chất có hoạt tính sinh học [18] Chiết xuất là phương pháp sử dụng dung môi để lấy các chất tan ra khỏi các mô thực vật. Sản phẩm thu được của quá trình chiết xuất là một dung dịch của các chất hòa tan trong dung môi. Dung dịch này được gọi là dịch chiết. Có ba quá trình quan trọng đồng thời xảy ra trong chiết xuất là: - Sự hòa tan của chất tan vào dung môi. - Sự khuyếch tán của chất tan trong dung môi. - Sự dịch chuyển của các phân tử chất tan qua vách tế bào thực vật. Các yếu tố ảnh hưởng lên ba quá trình này (bản chất của chất tan, dung môi, nhiệt độ, áp suất, cấu tạo của vách tế bào, kích thước tiểu phân bột dược liệu...) sẽ quyết định chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết xuất. 28 Nguyên liệu trước khi chiết xuất cần kiểm tra về mặt thực vật xem có đúng loài, đôi khi còn đúng thứ hay chủng mà ta cần hay không. Cần ghi rõ nơi thu hái, thời gian thu hái. Tùy theo trường hợp mà đặt vấn đề về thời vụ thu hái, để đảm bảo hoạt chất mong muốn có hàm lượng cao nhất. Dược liệu sau đó có thể làm khô hoặc để tươi mà chiết. Nhiều hoạt chất rắn rất dễ bị biến đổi trong quá trình làm khô hoặc ngay khi còn tươi nếu không xử lý để diệt enzym. Kích thước của bột dược liệu cũng là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng tới chất lượng và hiệu quả của quá trình chiết. Có rất nhiều kỹ thuật và thiết bị chiết khác nhau được áp dụng cho hai phương pháp chiết trên như: chiết ở nhiệt độ thường (ngâm lạnh, ngấm kiệt ở nhiệt độ thường) hay nhiệt độ cao (chiết nóng, hãm, sắc, ngấm kiệt nóng); chiết với các thiết bị như soxhlet, kumagawa... tùy yêu cầu, điều kiện mà lực chọn kỹ thuật chiết thích hợp. Các phương pháp chiết gồm có ngâm và chiết kiệt. Trong phương pháp ngâm dược liệu được ngâm trong 1 lượng thừa dung môi trong một thời gian nhất định để các chất tan trong dược liệu hòa tan vào dung môi. Dịch chiết sau đó được rút hết ra và dung môi mới được thêm vào và quá trình ngâm - chiết được lập lại cho tới khi lấy hết các chất khỏi dược liệu. Trong phương pháp ngấm kiệt, dung mội được dịch chuyển trong khối dược liệu theo một chiều xác định với 1 tốc độ nhất định. Trong quá trình dịch chuyển, các chất tan trong dược liệu tan vào dung môi và nồng độ dung dịch tăng dần cho tới khi bão hòa ở đầu kia của khối dược liệu. Như vậy, ngấm kiệt là 1 quá trình chiết ngược dòng với nồng độ dịch chiết tăng dần từ đầu tới cuối khối dược liệu. Dung môi mới tiếp xúc với dược liệu có lượng hoạt chất thấp nhất do vậy quá trình chiết được thực hiện hoàn toàn hơn. Dung môi chiết cũng tùy theo từng loại họat chất mà chọn cho thích hợp. Về nguyên tắc, để chiết các chất phân cực (các glycosic, các muối của alcaloid, các hợp chất polyphenol...) thì phải sử dụng các dung môi phân cực. Để chiết các chất kém phân cực (chất béo, tinh dầu, carotenoid, các triterpen và steroid tự do...) thì phải sử dụng các dung môi kém phân cực. Trên thực tế, cồn với các độ cồn khác nhau là dung môi hay được dùng. Cồn có thể hòa tan được nhiều nhóm hoạt chất, không độc, rẻ 29 tiền và dễ kiếm. Trong một vài trường hợp, dược liệu tươi được thả từ từ trong cồn sôi vừa để diệt enzym vừa để hòa tan hoạt chất. Ngoài các kỹ thuật chiết cổ điển như trên, các kỹ thuật chiết mới như chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm, vi sóng, chiết chất lỏng quá tới hạn, chiết dưới áp suất cao v.v... đã được phát triển để nâng cao hiệu quả cũng như chất lượng chiết xuất.  Chiết với sự hỗ trợ của siêu âm Trong quá trình chiết xuất, đôi khi sóng siêu âm cũng được áp dụng để tăng hiệu quả chiết. Sóng siêu âm với tần số trên 20 KHz thường được sử dụng. Sóng siêu âm có tác dụng làm tăng sự hòa tan của chất tan vào dung môi và tăng quá trình khuyếch tán chất tan. Sóng siêu âm cường độ cao cũng có thể phá vỡ cấu trúc tế bào, thúc đẩy quá trình chiết. Chiết với sự hỗ trợ của sóng siêu âm thường được sử dụng tng chuẩn bị mẫu phân tích thay cho phương pháp ngâm lạnh hay chiết Soxhlet cổ điển. Khi đó, người ta nhúng bình chiết vào một bể siêu âm có chứa nước, sóng siêu âm phát ra từ các đầu phát sẽ truyền qua môi trường nước và đi vào hỗn hợp chiết. Trong chiết siêu âm, hỗn hợp chiết với dung môi phân cực sẽ nóng lên. Tuy nhiên, người ta cũng có thể gia nhiệt để quá trình chiết được nhanh hơn. Trong chiết xuất ở quy mô lớn hơn, đầu phát siêu âm thường được nhúng trực tiếp vào bình chiết chứa dược liệu. Do khả năng xuyên sâu kém nên việc sử dụng thường ở quy mô phòng thí nghiệm.  Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng Khi chiếu bức xạ điện từ ở tần số 2450 MHz (bức xạ trong vòng vi sóng của dải sóng điện từ) vào môi trường các chất phân cực, các phân tử sẽ chịu đồng thời 2 tác động đó là sự dẫn truyền ion và sự quay lưỡng cực dưới tác dụng của điện trường. Cả hai tác động này làm sinh ra nhiệt trong lòng khối vật chất làm cho việc gia nhiệt nhanh và hiệu quả hơn rất nhiều so với phương pháp dẫn nhiệt truyền thống. Trong chiết xuất, trong chiếu xạ vi sóng vào môi trường có chứa các tiểu phân dược liệu và dung môi phân cực, các phân tử dung môi và các chất phân cực sẽ dao động và nóng lên nhanh chóng làm tăng khả năng hòa tan các chất vào dung môi. Thêm vào đó, vi sóng cũng làm phá hủy cấu trúc vách tế bào thực vật làm các chất tan giải phóng trực tiếp vào dung môi chiết làm cho quá trình chiết chuyển thành hòa 30 tan đơn giản. Điều này làm cho việc chiết xuất nhanh hơn nhưng cũng làm dịch chiết nhiều tạp chất hơn. Việc sử dụng vi sóng hỗ trợ việc chiết xuất dược liệu ở quy mô phòng thí nghiệm được áp dụng thay thế cho chiết xuất truyền thống (như chiết bằng Soxhlet) do rút ngắn thời gian chiết xuống còn từ vài chục giây tới 15-20 phút. Cũng đã có những thiết bị chiết vi sóng ở quy mô lớn. Chiết với sự hỗ trợ của vi sóng cũng có nhược điểm đó là các tạp chất trong dịch chiết nhiều hơn, cần có quy trình loại tạp tiếp theo. Thiết bị chiết hỗ trợ bằng vi sóng đặc biệt thích hợp cho tinh cất tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn theo hơi nước. Thời gian chưng cất rút ngắn đáng kể, hàm lượng tinh dầu thu được thường cao hơn và chất lượng tốt hơn do thời gian tiếp xúc với nhiệt ngắn. Cũng có báo cáo về chiết xuất các nhóm hoạt chất khác bằng phương pháp này như chiết saponin, anthraquinon, alkaloid...  Chiết bằng chất lỏng quá tới hạn Những năm gần đây phương pháp chiết xuất bằng chất lỏng quá tới hạn (super-critical fluid extraction,SFC) cũng được áp dụng để chiết xuất trong định tính cũng như công nghiệp các hợp chất tự nhiên. Nguyên tắc của phương pháp này như sau: trong điều kiện áp suất bình thường, khi nâng nhiệt độ một chất lỏng tới điểm sôi của nó, chất lỏng sẽ hóa hơi. Tuy nhiên, nếu tiếp tục tăng nhiệt độ và đồng thời tăng áp suất của hệ lên quá một nhiệt độ và một áp suất nhất định nào đó, người ta sẽ thu được một “chất lỏng” đặc biệt gọi là chất lỏng quá tới hạn. Chất lỏng này không giống với trạng thái lỏng thông thường mà mang cả đặc tính của cả chất khí và chất lỏng. Do mang cả đặc tính của chất khí và chất lỏng nên chất lỏng quá tới hạn có khả năng hòa tan các chất đồng thời có độ nhớt thấp và khả năng khuếch tán cao có thể dùng để hòa tan các chất và ứng dụng vào chiết xuất các chất trong dược liệu. Các đặc tính của chất lỏng quá tới hạn (khả năng hòa tan các chất, độ nhớt...) phụ thuộc vào nhiệt độ và áp suất. Thay đổi các điều kiện này sẽ làm thay đổi đặc tính (độ phân cực, khả năng hòa tan) của chất lỏng quá tới hạn. Trong thực tế, người ta thực hiện chiết trong điều kiện cao hơn điểm tới hạn một ít. 31 Chất lỏng thông dụng nhất hiện nay là CO2 lỏng quá tới hạn. Chiết chất lỏng quá tới hạn hiện nay được ứng dụng trong nhiều ngành ở quy mô công nghiệp (từ những năm 1978), trong nghiên cứu và phân tích kiểm nghiệm. Trong phạm vi nghiên cứu cây thuốc, tác giả đầu tiên ứng dụng nghiên cứu này là Stahl và cộng sự. Các nhóm hợp chất thích hợp nhất để chiết bằng chất lỏng quá tới hạn là tinh dầu, chất béo, carotenoid và các chất kém phân cực khác.  Chiết dưới áp suất cao Một kỹ thuật chiết hiện cũng được sử dụng trong chiết suất hiện đại là chiết dưới áp suất cao (pressurized liquid extraction-PLE). Khả năng hòa than của các chất trong dung môi phụ thuộc nhiều vào nhiệt độ. Khi nhiệt độ tăng, khả năng hòa tan các chất tăng. Vì thế, trong chiết xuất, người ta có xu hướng tăng nhiệt độ để giảm lượng dung môi sử dụng và giả thời gian chiết. Tuy nhiên, trong điều kiện bình thường, việc tăng nhiệt độ để chiết có giới hạn của nó là nhiệt độ sôi của dung môi. Khi hóa hơi, dung môi không còn khả năng hòa tan các chất nữa. Để khắc phục điều này, người ta tiến hành chiết các chất dưới áp suất cao dựa vào nguyên tắc: nhiệt độ sôi của chất lỏng tăng khi áp suất tăng. Khi đó ta có phương pháp chiết chất lỏng dưới áp suất. Khi nhiệt độ tăng lên 100C, khả năng hòa tan của dung môi tăng lên gấp rưỡi. Trong chiết dưới áp suất, dung môi chiết được đưa tới nhiệt độ và áp suất gần với vùng tới hạn. Nhiệt độ và áp suất cao làm tăng khả năng hòa tan và khuếch tán của dung môi để cho việc chiết xuất hiệu quả hơn. Nhiệt độ có thể thay đổi từ 80-2000C và áp suất có thể tới 150 bar tùy theo loại dung môi và chất cần chiết. 32 CHƯƠNG 2: ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng, địa điểm và thời gian nghiên cứu 2.1.1. Đối tượng nghiên cứu Nguyên liệu sử dụng cho nghiên cứu là cây mã đề đang độ tuổi thu hoạch trong tháng 3/2015, đảm bảo chất lượng, được thu mua tại chợ Xóm Mới, thành phố Nha Trang, tỉnh Khánh Hòa. 2.1.2. Địa điểm và thời gian nghiên cứu Nghiên cứu được tiến hành tại phòng thí nghiệm công nghệ sinh học, phòng thí nghiệm công nghệ cao, phòng thí nghiệm hóa phân tích thuộc Trung tâm thí nghiệm thực hành, trường Đại Học Nha Trang. Thời gian thực hiện: 15/3/2015 – 7/6/2015. 2.2. Hóa chất, dụng cụ và thiết bị 2.2.1. Hóa chất - Dung môi ethanol sử dụng trong nghiên cứu này có độ tinh khiết 99.5% ( Nhiệt độ sôi 78.9oC) - Hóa chất Na2HPO4, NaH2PO4, K3Fe(CN)6, CCL3COOH 10%, FeCl3 0.1% sản xuất tại Guanghua Chemical Factory Co. Ltd. - Các hóa chất trên được mua từ cửa hàng hóa chất Hoàng Trang số 42- Hoàng Hoa Thám- TP Nha Trang, đạt tiêu chuẩn dùng trong phòng thí nghiệm. - 1,1-diphenyl-2-pycrylhydrazyl (DPPH) được mua từ công ty Sigma – Aldrich INC, PO.Box 14508,st. Louis, MO63178 USA + 1-314-771-5750. 2.2.2. Dụng cụ - Cốc sấy - Ống nghiệm - Cốc thủy tinh 50 ml, 100ml, 250 ml - Bình tam giác 100ml, 250ml - Phễu thủy tinh - Bóp cao su - Pipet 10 ml 33 - Ống đong 50ml, 100ml, 250 ml - Giấy lọc 2.2.3. Thiết bị  Tủ lạnh LG 595 lít, 5951,model GR-S592 QTC/BSIPCTT,  Cân phân tích điện tử Shimadzu AY 120, Nhật.  Bể ổn nhiệt Memmert Model WB29, Đức.  Cân phân tích AY220.  Cân kỹ thuật BL3200.  Máy đo quang phổ kế UV-Vis Carry 50.  Tủ sấy vuông, Trung Quốc.  Micropipet 100-1000 μl, NPX-1000, Nhật Bản. 2.3. Nội dung nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây mã đề từ các bộ phận cây. - Nghiên cứu ảnh hưởng của dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây mã đề. - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết từ cây mã đề. 2.4. Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thực nghiệm yếu tố từng phần cổ điển (thay đổi một yếu tố trong khi cố định các yếu tố còn lại). 34 2.4.1. Quy trình nghiên cứu tổng quát CÂY MÃ ĐỀ TƯƠI XỬ LÝ TÁCH RIÊNG RỄ, LÁ, HOA PHƠI KHÔ XAY CHIẾT Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng: Bộ phân cây, nồng độ dung môi, nhiệt độ, thời gian, tỷ lệ NL/DM. LỌC DỊCH CHIẾT Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. - Tổng năng lực khử.  Kết luận Hình 2.1. Sơ đồ bố thí thí nghiệm tổng quát 35  Thuyết minh quy trình Xử lý: Nguyên liệu tươi đảm bảo độ đồng đều, chất lượng tốt, được loại bỏ các phần bị già úa, hư thối sau đó rửa sạch loại bỏ đất cát rồi tách riêng phần lá, hoa, rễ. Phơi khô: Nguyên liệu tươi sẽ rất khó khăn trong việc bảo quản, vận chuyển nguyên liệu tươi có hàm lượng nước cao, dưới tác dụng của enzyme và vi sinh vật nguyên liệu nhanh chóng bị hư hỏng và thất thoát các chất có hoạt tính. Do đó đem phơi khô làm giảm hàm ẩm đồng thời diệt enzyme giúp bảo quản được lâu hơn. Xay: Nguyên liệu khô được xay nhỏ với mục đích làm tăng diện tích tiếp xúc giữa dung môi và nguyên liệu, tăng khả năng khuếch tán và thẩm thấu của các chất vào dung môi, làm tăng khả năng trích ly. Sử dụng máy xay sinh tố, cối xay khô. Sau khi xay xong chia thành nhiều phần nhỏ đựng trong túi PE, tất cả các túi nhỏ đựng trong túi PA lớn. Nguyên liệu này được sử dụng cho hết quá trình nghiên cứu. Chiết: Là công đoạn quan trọng sử dụng dung môi dựa trên sự thẩm thấu của dung môi vào tế bào, các chất hòa tan vào dung môi và khuếch tán ra ngoài tế bào. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình chiết: Phương pháp, loại dung môi, nồng độ dung môi, nhiệt độ chiết, thời gian chiết, tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi, số lần chiết. Phương pháp chiết: Sử dụng phương pháp chiết tĩnh trong nghiên cứu này, phương pháp chiết tĩnh đơn giản, không cần máy móc phức tạp, có thể tiến hành được ở mọi phòng thí nghiệm. Việc lắc chiết có thể thực hiện bằng tay. Nhiệt độ chiết: Nhiệt độ càng cao làm tăng vận tốc và hiệu quả của quá trình, tuy nhiên cần lưu ý để lựa chọn nhiệt độ phù hợp tránh làm mất hoạt tính của các chất cần trích ly. Thời gian trích ly: Thời gian càng tăng thì hiệu suất trích ly càng tăng. Tuy nhiên nếu thời gian quá dài thì khả năng trích ly lại giảm. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi: Tỉ lệ này càng nhỏ thì hiệu suất trích ly của quá trình càng cao. Tuy nhiên sử dụng nhiều dung môi sẽ làm giảm hiệu suất trích ly. Loại dung môi: Sử dụng dung môi ethanol cho nghiên cứu này, dung môi ethanol rẻ, dễ kiếm và ít độc hại, có hiệu quả cao trong việc tách chiết các chất chống oxi hóa trong các nghiên cứu trước đây. Lọc: Mẫu sau khi chiết xong được lọc qua giấy lọc loại bỏ bã và thu được dịch chiết. Dịch chiết sau đó được đem đi kiểm tra khả năng chống oxy hóa bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH và tổng năng lực khử. 36 2.4.2. Bố trí thí nghiệm. 2.4.2.1. Thí nghiệm 1: khảo sát hoạt tính chống oxi hóa của của dịch chiết mã đề từ các bộ phận cây. CÂY MÃ ĐỀ TƯƠI TÁCH RIÊNG BỘ PHẬN CÂY PHƠI KHÔ XAY CHIẾT (Ethanol) RỄ Nồng độ dung môi: 40% Nhiệt độ: 500C Thời gian: 30 phút Tỷ lệ NL/DM: 1/20 (g/ml) LÁ LỌC DỊCH CHIẾT HOA Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. - Tổng năng lực khử.  Kết luận Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm khảo hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết từ các bộ phận cây mã đề. 37 Cách tiến hành Nguyên liệu sau khi tách riêng các bộ phận, phơi khô và đem xay được tiến hành sử dụng cho thí nghiệm 1. Dùng 3 cốc thủy tinh 100ml, mỗi cốc cân chính xác 2g lần lượt là nguyên liệu rễ, lá, hoa. Mỗi cốc cho vào dung môi ethanol nồng độ 40% khi bắt đầu chiết. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20 (g/ml), tức (40ml ethanol), đậy miệng cốc bằng giấy bạc, dùng dây su cột chặt, đưa cốc vào bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt đến nhiệt độ 500C trong thời gian 30 phút. Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi về đúng thể tích ban đầu là 40ml. Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa để xác định được bộ phận nào của cây cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Thí nghiệm 3 lần lặp lại. 38 2.4.2.2. Thí nghiệm 2: khảo sát ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. MÃ ĐỀ KHÔ XAY Bộ phận cây: TN1 Nhiệt độ: 500C Thời gian: 30 phút Tỷ lệ NL/DM: 1/20 (g/ml) CHIẾT Nồng độ ethanol 30% 40% 50% LỌC DỊCH CHIẾT 60% 70% Phân tích hoạt tính chống ox y hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. - Tổng năng lực khử.  Kết luận Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. 39 Cách tiến hành Dùng 5 cốc thủy tinh 100ml, mỗi cốc cân chính xác 2g nguyên liệu khô, đã xay. Mỗi cốc cho vào dung môi ethanol ở các nồng độ khác nhau lần lượt là 30%, 40%, 50%, 60%, 70%. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20 g/ml (40ml ethanol), đậy miệng cốc bằng giấy bạc, dùng dây su cột chặt, đưa tất cả các cốc vào bể ổn nhiệt đã nâng đến 500C, trong thời gian 30 phút. Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi về đúng thể tích ban đầu là 40ml. Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa để lựa chọn được dung môi thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Thí nghiệm 3 lần lặp lại. 40 2.4.2.3. Thí nghiệm 3: khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. LÁ MÃ ĐỀ KHÔ XAY Bộ phận cây: TN1 Nồng độ ethanol: TN2 Thời gian: 30phút Tỷ lệ NL/DM: 1/20 (g/ml) CHIẾT NHIỆT ĐỘ CHIẾT T0thường 400C 500C 600C 700C 800C LỌC DỊCH CHIẾT Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. - Tổng năng lực khử.  Kết luận Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nhiệt độ chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. 41 Cách tiến hành Dùng 6 cốc thủy tinh 100ml, mỗi cốc cân chính xác 2g nguyên liệu khô, xay. Mỗi cốc cho vào dung môi ethanol nồng độ đã được xác định ở thí nghiệm 2 khi bắt đầu chiết. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20 g/ml, tức 40ml ethanol. Đậy miệng cốc bằng giấy bạc, dùng dây su cột chặt, đưa cốc vào bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt đến những nhiệt độ khảo sát lần lượt là 400C, 500C, 600C, 700C, 800C và nhiệt độ thường trong thời gian 30 phút. Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi về đúng thể tích ban đầu là 40ml. Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa để lựa chọn nhiệt độ chiết thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Thí nghiệm 3 lần lặp lại. 42 2.4.2.4. Thí nghiệm 4: khảo sát ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. MÃ ĐỀ KHÔ XAY Bộ phận cây: TN1 Nồng độ dung môi: TN2 Nhiệt độ: TN3 Tỷ lệ NL/DM: 1/20 (g/ml) CHIẾT THỜI GIAN CHIẾT 0,5 giờ 1,5 giờ 2,5 giờ 3,5 giờ 4,5 giờ LỌC DỊCH CHIẾT Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. - Tổng năng lực khử.  Kết luận Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của thời gian chiết đến hoạt tính oxi hóa của dịch chiết mã đề. 43 Cách tiến hành Dùng 5 cốc thủy tinh 100ml, mỗi cốc cân chính xác 2g nguyên liệu khô, đã xay. Mỗi cốc cho vào dung môi ethanol nồng độ xác định ở thí nghiệm 2. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi là 1/20( g/ml), tức 40ml ethanol Đậy miệng cốc bằng giấy bạc, dùng đây su cột chặt, đưa tất cả cốc vào bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt đến nhiệt độ xác định ở thí nghiệm 3. Cứ sau khoảng thời gian tính từ lúc bắt đầu chiết lần lượt là 0,5giờ, 1,5 giờ, 2,5 giờ, 3,5 giờ, 4,5 giờ thì lấy một cốc ra. Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi về đúng thể tích ban đầu là 40ml. Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa, lựa chọn được thời gian chiết thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Thí nghiệm 3 lần lặp lại. 44 2.4.2.5. Thí nghiệm 5: khảo sát ảnh hưởng của tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi đến hoạt tính chống oxi hóa của dịch chiết mã đề. MÃ ĐỀ KHÔ XAY Bộ phận cây:TN1 Nồng độ dung môi: TN2 Nhiệt độ: TN3 Thời gian: TN4 CHIẾT TỶ LỆ NL/DM (g/ml) 1/20 1/40 1/30 1/50 LỌC DỊCH CHIẾT Phân tích hoạt tính chống oxy hóa: - Khả năng khử gốc tự do DPPH. - Tổng năng lực khử.  Kết luận Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm ảnh hưởng của nguyên liệu/ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề. 45 Cách tiến hành Dùng 4 bình tam giác 250ml, mỗi bình cân chính xác 2g nguyên liệu khô, xay. Mỗi bình cho vào dung môi ethanol nồng độ xác định ở thí nghiệm 2. Tỷ lệ nguyên liệu/ dung môi (g/ml) lần lượt là 1/20, 1/30, 1/40, 1/50, đậy miệng bình bằng giấy bạc, dùng dây su cột chặt, đưa tất cả mẫu vào bể ổn nhiệt đã nâng nhiệt đến nhiệt độ xác định ở thí nghiệm 3 trong thời gian xác định ở thí nghiệm 4. Sau khi chiết xong thì lấy mẫu ra làm nguội nhanh bằng cách ngâm trong nước mát rồi đem lọc mẫu qua giấy lọc. Dịch lọc được thêm dung môi vào tất cả các mẫu cho cùng thể tích 100ml. Sau đó đem đi tiến hành kiểm tra hoạt tính chống oxy hóa, lựa chọn được tỷ lệ nguyên liệu/dung môi thích hợp cho dịch chiết có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Thí nghiệm 3 lần lặp lại. 2.4.3. Các phương pháp phân tích 2.4.3.1 Xác định tỷ lệ khối lương các bộ phận cây. Các bộ phận cây mã đề được tiến hành xác định tỷ lệ khối lượng ở cả tươi và khô được trình bày ở phụ lục 1. 2.4.3.2. Xác định độ ẩm của nguyên liệu Độ ẩm của nguyên liệu được phân tích theo phương pháp sấy ở nhiệt độ 1050C đến khối lượng không đổi theo tiêu chuẩn Việt Nam TCVN 3700-79 được trình bày chi tiết ở phụ lục 1. 2.4.3.3. Phân tích khả năng khử gốc tự do 1,1-diphenyl-2pycrylhydrazyl (DPPH) Khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã đề được phân tích theo phương pháp của Fu và cộng sự (2002) được trình bày chi tiết ở phụ lục 1. 2.4.3.4. Phân tích tổng năng lực khử Tổng năng lực khử của dịch chiết từ mã đề được phân tích theo phương pháp Oyaizu (1986) được trình bày chi tiết ở phụ lục 1. 2.4.3.5. Phương pháp xử lí số liệu Tất cả các thí nghiệm được bố trí lặp lại 3 lần để đảm bảo tiến hành phân tích ANOVA.Số liệu được phân tích ANOVA bằng phần mềm xử lý số liệu thống kê chuyên dụng SPSS 16.0. Kiểm định (Tukey HSD, Tamhane, Dunnett t3, Dunett C) được thực hiện để đánh giá mức độ khác biệt có ý nghĩa giữa các giá trị với mức ý nghĩa P < 0,05. Vẽ đồ thị được thực hiện với sự hỗ trợ của phần mềm Microsoft office Excel 2007. 46 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Tỷ lệ khối lượng các bộ phận của cây mã đề Kết quả tỷ lệ khối lượng các bộ phận cây mã đề được thể hiện trong Bảng 3.1 Bảng 3.1. Tỷ lệ khối lượng các bộ phận cây mã đề. (Kết quả trong bảng là giá trị trung bình của 3 lần lặp lại thí nghiêm) TƯƠI BỘ PHẬN CÂY KHÔ KHỐI LƯỢNG (g) TỶ LỆ (%) KHỐI LƯỢNG (g) TỶ LỆ (%) RỄ 58,25 ± 1,78 15,16 ± 0,7 13,52 ± 0,81 21,63 ± 1,47 LÁ 281,65 ± 13,9 73,22 ± 1,99 38,66 ± 0,72 61,84 ± 3,09 HOA 45,59 ± 4,53 11,62 ± 1,43 10,47 ± 2,97 16,57 ± 3,86 TB TỔNG 384,36 100 62,63 100 Kết quả ở Bảng 3.1 cho biết lá là thành phần chiếm tỷ lệ cao nhất 73,22% theo khối lượng tươi và 61,84% theo khối lượng khô. Tiếp đến là rễ chiếm 15,16% theo khối lượng tươi, 21,63% theo khối lượng khô. Hoa chiếm 11,62% theo khối lượng tươi, 16,57 theo khối lượng khô. Trong thực tế, lá là bộ phận có nhiều công dụng và được ứng dụng nhiều nhất. Rễ và hoa là các bộ phận có tỷ lệ thấp hơn, nhưng cả hai thành phần này lại chiếm đến 26,78% theo khối lương tươi và 38,2% theo khối lượng khô. Tỷ lệ này cos ựu thay đổi tùy theo độ tuổi, mùa vụ. Rễ và hoa tuy chiếm tỷ lệ thấp nhưng có nhiều công dụng khác nên vẫn được tận dụng. Tuy nhiên, do khó khăn cho việc đồng nhất mẫu giữa các bộ phận do đó cần nghiên cứu thêm về hoạt tính chống oxi hóa của rễ, lá, hoa để chọn ra thành phần có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất phục vụ cho các thí nghiệm sau. 47 3.2. Hàm lượng ẩm của nguyên liệu Bảng 3.2. Hàm lượng ẩm của nguyên liệu lá mã đề khô Thành phần Hàm lượng Hàm lượng ẩm (%) 13,84 ± 1,46 Kết quả ở bảng 3.2 cho thấy hàm lượng ẩm của lá mã đề khô là 13,84%. Kết quả này cho thấy rằng nguyên liệu sau khi được phơi khô có độ ẩm thấp, do đó thuận tiện trong quá trình bảo quản, tránh được các yếu tố gây hư hỏng như vi sinh vật, enzyme… Khi phơi khô thì dung môi dễ dàng thấm vào trong nguyên liệu hơn sự chênh lệch nồng độ chất tan giữa bên trong và bên ngoài. Tuy nhiên theo thời gian, nguyên liệu dễ bị hút ẩm trở lại dẫn đến có thể bị nấm mốc, hư hỏng ảnh hưởng đến chất lượng cũng như sai số kết quả của các thí nghiệm khác, do đó cần chia nhỏ lượng nguyên liệu vừa đủ đựng trong các bao bì PE sau đó cho vào bao bì PA, buộc chặt để tránh hiện tượng hút ẩm trở lại. 3.3. Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa của bộ phận cây mã đề Kết quả thí nghiệm khảo sát khả năng chống oxy hóa của các bộ phận cây mã đề được trình bày ở đồ thị Hình 3.1 và 3.2. 48 Hình 3.1. Ảnh hưởng của các bộ phận cây đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã đề. Chữ cái trong cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (P hoa với giá trị tương ứng (49,08> 38,89> 19,4). Điều này chứng tỏ khả năng chống oxy hóa của lá là tốt nhất. Giải thích cho điều này có lẽ bởi vì trong lá chứa các thành phần hóa học có hoạt tính chống oxy hóa cao như flavonoid, iridoid glucoside, và các dẫn xuất của cafeic acid… nhiều hơn ở các bộ phận khác. Các bộ phận khác như rễ, hoa và hạt chứa phần lớn là cacbonhydrate và chất béo. So sánh với kết quả nghiên cứu của Mohamed và cộng sự trong nghiên cứu hóa sinh của mã đề (lá, hạt) và đậu guar, 2010. Trong nghiên cứu của Mohamed, các thành phần có hoạt tính sinh học của lá mã đề cao hơn của hạt mã đề và đậu guar. Cụ thể như tổng số phenol (mg gallic/g) của lá> rễ> đậu guar với giá trị tương ứng là (13,05mg/g, 7,43mg/g, 3,76 mg/g). Tổng số Plavonoid (mg Quercetin/g) của lá> rễ> đậu guar ( 6,41mg/g>3,03mg/g > 0,83mg/g), Tannin (mg Catechine /g) của lá 5,63mg/g>rễ 2,43 mg/g > đậu guar 0,76mg/g. Cũng trong nghiên cứu của Mohamed, khả năng chống oxy hóa được xác định bằng phương pháp khử gốc tự do DPPH cũng chỉ ra lá mã đề là thành phần có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất. Những kết quả trên cho thấy phần lá không chỉ chiếm tỷ lệ khối lượng cao nhất mà còn có hoạt tính chống oxy hóa cao nhất, kết quả này góp phần lý giải vì sao trong thực tế người ta thường ứng dụng phần lá nhiều hơn (trà mã đề, sản xuất dược liệu từ lá mã đề). Từ kết quả này kết hợp với tỷ lê khối lượng cao mà chọn lá để thí nghiệm tiếp theo. 50 3.4. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa của dịch chiết mã đề Kết quả ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng chống oxy hóa của dịch chiết mã đề được thể hiện qua đồ thị Hình 3.3 và hình 3.4. Hình 3.3. Ảnh hưởng của nồng độ dung môi đến khả năng khử gốc tự do DPPH của dịch chiết mã. Chữ cái khác nhau trên cột chỉ ra sự khác nhau có ý nghĩa thống kê (P[...]... biệt là caffeic Một hoạt tính sinh học nữa của mã đề đáng chú ý là khả năng chống oxy hóa Năm 1999, Ren và cộng sự khi nghiên cứu về khả năng chống oxy hóa của mã đề mọc ở những độ cao khác nhau Mẫu được thu thập từ các độ cao khác nhau trên núi Mahan, Trung Quốc Kết quả cho thấy có sự tương quan giữa độ cao và khả năng chống oxy hóa của lá và hạt của mã đề Hoạt tính chống oxy hóa của hạt thì tăng theo... (Guille'n và cộng sự, 1997) 1.1.5.6 Chống oxi hóa Khả năng chống oxy hóa bằng cách làm mất màu của độ hấp thụ của 2,2% azinobis (acid 3-ethylben-zthiazolinesulfonic) Nước trà mã đề gồm một lượng nhỏ chất có khả năng quét gốc tự do so với trà đen Khả năng chống oxy hóa của lá mã đề còn xanh thì cao hơn của trà mã đề, điều này cho thấy rằng quá trình chế biến làm giảm hoạt tính chống oxy hóa của mã đề (Campos... Thơ, đã phân tích và phân tách một số hợp chất của cây mã đề Các nghiên cứu về cây mã đề ở nước ta chưa nhiều hơn nữa mới chỉ nghiên cứu tách chiết một số hợp chất có hoạt tính sinh học ứng dụng trong dược liệu, chưa nghiên cứu nhiều về khả năng chống oxy hóa của loài cây này 1.1.6.2 Tình hình nghiên cứu ngoài nước Trong những năm gần đây, xu hướng của các nghiên cứu là tìm ra các hoạt chất trong tự... quả chống oxy hóa của dịch chiết mã đề mạnh hơn so với BHT, một chất chống oxy hóa tổng hợp nổi tiếng Bên cạnh đó dịch chiết được kiểm 7 tra tổng lượng phenolic (dao động 38,43 ÷ 70,97 mg GAE/g ) và tổng hàm lượng flavonoid từ 5,31 ÷ 13,10 mg QE/g Theo đánh giá công dụng truyền thống, thành phần hóa học và hoạt tính sinh học ở cây mã đề của Anne Berit Samuelsen, bộ phân nghiên cứu nguồn gốc tự nhiên của. .. người) Tóm lại, những 19 hợp chất được phát hiện verbascoside và calceorioside có thể được sử dụng trong phòng chống ung thư 1.2 Tìn hiểu về quá trính chống oxy hóa [3], [16], [17] 1.2.1 Quá trình oxy hóa và gốc tự do 1.2.1.1 Quá trình oxy hóa Quá trình oxy hóa là quá trình xảy ra phản ứng hóa học trong đó electron được chuyển sang chất oxy hóa 1.2.1.2 Gốc tự do Theo định nghĩa, gốc tự do (Free radical)... hình và điều kiên khí hậu có ảnh hưởng tới hoạt tính chống oxy hóa của mã đề Khả năng khử gốc tự do DPPH và superoxide (SO) của polysaccharides là 81,4% và 79,7% ở nồng độ polysaccharides 0,75 mg/ml, trong khi đó khả năng khử gốc tự do của 0,75 mg/mL axit ascorbic tương ứng là 83,5% và 85,1% Điều nay cho thấy tiềm năng chống oxy hóa của của polysaccharide trong mã đề Theo Jamilah, 2012 khi phân tích dịch. .. chậm quá trình oxy hóa của các chất khác có trong thực phẩm 22 Chất chống oxy hóa ngăn quá trình phá hủy bằng cách khử đi các gốc tự do, kìm hãm sự oxy hóa bằng cách oxy hóa chính chúng 1.2.2.4 Các chất chống oxy hóa có trong tự nhiên a) Nhóm polyphenol Polyphenols là một trong những nhóm nhiều và phổ biến nhất của các chất chuyển hóa thực vật Chúng là một phần tích hợp của cả hai chế độ ăn của con... tra hoạt tính chống ung thư của cây mã đề ở vùng Chile Chiết xuất từ lá, thân và hạt của mã đề bằng dung môi ethanol 50% không có hoạt động chống lại bệnh bạch cầu lymphocytic ở chuột Tuy nhiên năm 1990, báo cáo của Yaremenko cho rằng dịch chiết mã đề có hiệu quả trong hệ thống kiểm soát ung thư học dự phòng Các hiệu ứng bao gồm các hoạt động chống di căn trong khối u ở chuột Nhưng chi tiết trong nghiên. .. dịch chiết từ lá mã đề theo phương pháp GCMS Kết quả phân tích các thành phần hóa học của mã đề trong dịch chiết từ các dung môi (ether dầu khí, methanol, ethyl acetate, n-butanol và nước) đều cho thấy cả năm dịch chiết trên đều có nhóm phenol, các đồng phân khác nhau của axit hữu cơ, flavonoid và terpenoid, đây là những chất được biết đến với khả năng chống oxy hóa cao Cũng năm 2012, Harput và cộng... tiến hành kiểm tra hoạt tính gây độc tế bào và chống oxi hóa của mã đề để xác minh về những công bố về dụng truyền thống của nó Kết quả cho thấy, dịch chiết mã đề có khả năng quét gốc tự do DPPH, oxit nitrit (NO), superoxide (SO) mạnh khi được so sánh với BHA và Quersetin Ngoài ra dịch chiết từ dung môi nước thể hiện khả năng gây độc tế bào tùy theo liều lượng sử dụng Từ dịch chiết mã đề với dung môi ... 2.3 Nội dung nghiên cứu - Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ mã đề từ phận - Nghiên cứu ảnh hưởng dung môi chiết đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết từ mã đề - Nghiên cứu ảnh hưởng... công tác nghiên cứu ứng dụng Được hướng dẫn ThS.TRần Thị Huyền, em thực đề tài Nghiên cứu trình chiết khảo sát hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết mã đề (Plantago major )” Đây nghiên cứu bổ sung... 3.3 Khảo sát hoạt tính chống oxy hóa thành phần mã đề 47 3.4 Ảnh hưởng nồng độ dung môi đến hoạt tính chống oxy hóa dịch chiết mã đề 50 3.5 Ảnh hưởng nhiệt độ chiết đến hoạt tính