BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG ----------------0o0-------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN Ở TRẠNG THÁI RẮN VỚI TÁC NHÂN H2O2 Giảng viên hướng dẫn : ThS. NGUYỄN CÔNG MINH Sinh viên thực hiện : NGUYỄN THỊ HIỀN Mã số sinh viên : 53130517 Khánh Hòa: tháng 6/2015 TRƯỜNG ĐẠI HỌC NHA TRANG VIỆN CÔNG NGHỆ SINH HỌC & MÔI TRƯỜNG BỘ MÔN CÔNG NGHỆ SINH HỌC ----------------0o0-------------- ĐỒ ÁN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGHIÊN CỨU SẢN XUẤT CHITOSAN PHÂN TỬ LƯỢNG THẤP BẰNG PHƯƠNG PHÁP THỦY PHÂN Ở TRẠNG THÁI RẮN VỚI TÁC NHÂN H2O2 GVHD : ThS. NGUYỄN CÔNG MINH SVTH : NGUYỄN THỊ HIỀN MSSV : 53130517 Khánh Hòa, tháng 06/2015 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên cho tôi xin chân thành cảm ơn đến tất cả các thầy cô giáo Trường Đại học Nha Trang đặc biệt là Quý Thầy cô giáo Viên Công nghệ Sinh học và Môi trường đã trực tiếp giảng dạy và truyền đạt những kiến thức quý báu trong suốt khóa học. Để hoàn thành được Đồ án tốt nghiệp, tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc nhất đến giáo viên hướng dẫn Th.S Nguyễn Công Minh đã tận tình hướng dẫn cho tôi trong suốt quá trình nghiên cứu. Tiếp theo cho tôi gửi lời cảm ơn chân thành đến Quý thầy cô giáo phụ trách phòng thí nghiệm - Trung tâm Thí nghiệm Thực hành đã tạo điều kiện cho tôi trong suốt thời gian nghiên cứu tại phòng. Cuối cùng, tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đối với gia đình và bạn bè. Họ là nguồn động viên tinh thần lớn lao và luôn ủng hộ tôi trên từng bước đường học tập. Tôi xin chân thành cảm ơn! Nha Trang - 2015 Nguyễn Thị Hiền ii TÓM TẮT Chitosan phân tử lượng thấp là đối tượng thu hút sự quan tâm của rất nhiều nhà khoa học trên thế giới và tại Việt Nam. Là sản phẩm polymer sinh học, chitosan phân tử lượng thấp được biết đến với nhiều ứng dụng khác nhau như kháng khuẩn, kháng nấm, khả năng phân phối thuốc trong cơ thể, làm chất mang trong công nghệ DNA… Vì vậy sản xuất chitosan phân tử lượng thấp có vai trò rất lớn. Với mục đích nhằm tìm ra một phương pháp sản xuất chitosan phân tử lượng thấp có hiệu quả và đạt chất lượng cao. Phương pháp thủy phân chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 tạo chitosan phân tử lượng thấp đã thu được kết quả cao nhất khi tiến hành quá trình tiền xử lý bằng phương pháp cơ học đến kích thước chitosan 8 mm và ngâm với NaOH 0.1% trong thời gian 150 phút ở 300C, sau đó tiến hành cắt mạch với H2O2 0.2%, tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v) trong thời gian 120 phút ở 30 0C. Sau quá trình cắt mạch, sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp thu được có khối lượng phân tử 152 kDa và độ nhớt biểu kiến 83 cP. iii MỤC LỤC LỜI CẢM ƠN ............................................................................................................................ i TÓM TẮT ................................................................................................................................. ii MỤC LỤC ............................................................................................................................... iii DANH MỤC BẢNG ............................................................................................................... vi DANH MỤC HÌNH ............................................................................................................... vii MỞ ĐẦU................................................................................................................................... 1 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................................................................... 3 1.1. Chitosan ..........................................................................................................................3 1.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitosan ......................................................................... 3 1.1.1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan ......................................................................... 3 1.1.1.2. Tính chất của chitosan: .................................................................................... 4 1.1.2. Ứng dụng của chitosan ........................................................................................... 4 1.1.2.1. Chitosan ứng dụng trong nông nghiệp và thủy sản ........................................ 4 1.1.2.2. Chitosan ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học ................................. 5 1.1.2.3. Chitosan ứng dụng trong công nghiệp ............................................................ 6 1.2. Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp.......................................................8 1.2.1. Vai trò của chitosan phân tử lượng thấp ................................................................ 8 1.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp .............................................. 10 1.2.2.1. Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp trên thế giới .................. 10 1.2.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở Việt Nam ................... 13 1.2.3. Sử dụng H2O2 cho quá trình thủy phân ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp và cơ sở khoa học của phương pháp ........................................................... 14 1.2.3.1. Cơ chế cắt mạch của H2O2 và cơ sở khoa học của phương pháp ................ 14 1.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân chitosan ............................. 15 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ....................................... 17 2.1. Đối tượng nghiên cứu ..................................................................................................17 2.1.1. Chitosan ................................................................................................................. 17 2.1.2. Hóa chất ................................................................................................................. 17 2.1.2.1. Hydroperoxide (H2O2) ................................................................................... 17 iv 2.1.2.2. Một số hóa chất khác...................................................................................... 17 2.1.3. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu .......................................................................... 17 2.2. Phương pháp nghiên cứu ............................................................................................18 2.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát................................................................................... 18 2.2.2. Nghiên cứu quá trình tiền xử lý chitosan ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp với tác nhân H2O2 ......................................................................................... 19 2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan đến quá trình tạo chitosan phân tử lượng thấp ....................................................................................................... 19 2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình tạo chitosan phân tử lượng thấp ................................................................................................................ 21 2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý đến quá trình tạo chitosan phẩn tử lượng thấp ....................................................................................................... 22 2.2.3. Nghiên cứu quá trình cắt mạch chitosan bằng H2O2 ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp........................................................................................................... 23 2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến quá trình tạo chitosan phân tử lượng thấp ................................................................................................................ 23 2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến quá trình tạo chitosan phẩn tử lượng thấp ....................................................................................................... 24 2.2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến quá trình tạo chitosan phẩn tử lượng thấp ....................................................................................................... 26 2.3. Phương pháp phân tích ................................................................................................27 2.4.Phương pháp xử lý số liệu ............................................................................................27 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN ............................................................................ 28 3.1. Nguồn chitosan ban đầu ..............................................................................................28 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ tiền xử lý đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ........................................................................................30 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ................................................................................. 30 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH trong quá trình tiền xử lý đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ......................................... 33 v 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ................................................................................. 36 3.3. Nghiên cứu các chế độ cắt mạch chitosan tạo chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ..................................................................................................39 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn .................................................................................................................... 39 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ................................................................................. 41 3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ................................................................................. 44 3.4. Đề xuất quy trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ..................................................................................................................................46 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ ............................................................................ 49 4.1. Kết luận ........................................................................................................................49 4.2. Kiến nghị ......................................................................................................................49 TÀI LIỆU THAM KHẢO ..................................................................................................... 50 PHỤ LỤC ................................................................................................................................ 54 vi DANH MỤC BẢNG Bảng 3.1. Các thông số chitosan ban đầu ............................................................................. 29 Bảng 3.2. Thông số chitosan ban đầu và sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp .............. 47 vii DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Công thức phân tử đầy đủ của Chitosan [19]......................................................... 3 Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát ......................................................................... 18 Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitosan thích hợp ........................ 20 Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình tiền xử lý .............................................................................................................................................. 21 Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian tiền xử lý thích hợp ......................... 22 Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ H2O2 thích hợp.................................. 24 Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp ........................ 25 Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ chitosa/H2O2 thích hợp ........................... 26 Hình 3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học ........................... 28 Hình 3.2. Chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học ..................................................... 29 Hình 3.3. Chitosan ban đầu với các kích thước khác nhau .................................................. 30 Hình 3.4. Ảnh hưởng của kích thước chitosan đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch ................................................................................ 31 Hình 3.5. Ảnh hưởng của kích thước chitosan đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch ..................................................................................................................... 32 Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch ...................................................................................... 34 Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch ............................................................................................................................ 35 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch ................................................................................ 37 Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý chitosan đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch..................................................................................................... 38 Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch ...................................................................................... 39 Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch ............................................................................................................................ 40 viii Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch ................................................................................ 42 Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch ........................................................................................................... 43 Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch ................................................................................ 44 Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch ........................................................................................................... 45 Hình 3.16. Đề xuất quy trình tối ưu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 ................................................................................................................... 46 Hình 3.17. Chitosan ban đầu và chitosan phân tử lượng thấp ............................................. 47 1 MỞ ĐẦU Chitosan có khối lượng phân tử khác nhau thì khả năng ứng dụng trong các lĩnh vực khác nhau. Chitosan phân tử lượng cao thường được ứng dụng để tạo màng sinh học, xử lý nước thải… Trong khi đó chitosan phân tử lượng thấp được ứng dụng nhiều trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Cụ thể, khi mạch phân tử chitosan ngắn, chitosan được sử dụng làm phân bón cho cây trồng, cây trồng sẽ dễ dàng hấp thu vào lá và rễ hoặc một số bộ phận khác, kích thích sự phát triển của cây. Đồng thời, chitosan phân tử lượng thấp có khả năng kháng khuẩn nhờ vào đặc tính vốn có của 1 polymer tích điện dương mà không phải bất kỳ polymer sinh học nào cũng có. Trong y học, chitosan phân tử lượng thấp được ứng dụng cho điều trị viêm loét dạ dày do có tác dụng kháng khuẩn đối với vi khuẩn Helicobacter pylori với kết quả rất khả quan [13, 38]. Ngoài ra, chitosan phân tử lượng thấp còn sử dụng làm thuốc kháng viêm, làm lành vết thương, kiểm soát cholesterol, ngăn ngừa sự phát triển của bệnh đái tháo đường…[2]. Trong công nghệ sinh học, chitosan phân tử lượng thấp có tác dụng trong thu hồi, phân riêng các chất có hoạt tính sinh học như phân riêng protein, tinh sạch protein, enzyme… Đồng thời, nó được nghiên cứu trong công nghệ làm chất mang DNA trong lĩnh vực hệ phân phối không dùng virus trong liệu pháp gen [14, 22]. Để sản xuất chitosan phân tử lượng thấp, các nghiên cứu trên thế giới nói chung và tại Việt Nam hiện nay thường sử dụng phương pháp sinh học (enzyme), hóa học (HCl, H2SO4…) và vật lý (chiếu xạ…). Tuy nhiên các phương pháp này gặp phải một số hạn chế như thực hiện trong thời gian dài, phải hòa tan chitosan bằng acid loãng trước khi cắt mạch, tinh sạch sản phẩm khó khăn dẫn đến chi phí sản xuất cao, hiệu suất thu hồi thấp và nguy cơ gây ô nhiễm môi trường cao. Bên cạnh những nhược điểm tồn tại của các phương pháp trên, một số công trình nghiên cứu ngoài nước cho thấy, cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn là phương pháp có hiệu quả, quy trình sản xuất đơn giản, không gây ô nhiễm môi trường, không tốn kém chi phí cho quá trình tinh sạch và ít ảnh hưởng đến chất lượng của chitosan phân tử lượng thấp sau khi cắt. Tuy nhiên, tại Việt Nam chưa có nhiều tài liệu công bố về nghiên cứu này. 2 Xuất phát từ ý nghĩa thực tiễn và khoa học trên, đề tài: “Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp bằng phương pháp thủy phân ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2” được tiến hành. Mục đích của đề tài: nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp tiết kiệm, đơn giản, nhằm tăng hiệu quả về mặt kinh tế đồng thời đảm bảo được chất lượng và hoạt tính sinh học của chitosan. Nội dung của đề tài: - Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý chitosan đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 Tính mới của đề tài: Thủy phân chitosan ở trạng thái rắn là một hướng đi mới với nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp thủy phân chitosan ở trạng thái lỏng như: giảm thiểu ô nhiễm môi trường, quy trình sản xuất đơn giản, giảm chi phí cho quá trình loại bỏ ở công đoạn tinh sạch, tăng hiệu quả thu hồi và chất lượng sản phẩm. Ý nghĩa khoa học của đề tài: Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 là một phương pháp mới có nhiều ưu điểm so với các phương pháp đang được sử dụng hiện nay. Ý nghĩa thực tiễn của đề tài: Sản xuất chitosan phân tử lượng thấp với hiệu suất cao,chi phí sản xuất thấp, không gây ô nhiễm môi trường và hoạt tính sinh học cao là điều mong đợi của các nhà khoa học và các doanh nghiệp sản xuất lớn nhằm ứng dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực như nông nghiệp, y học, thực phẩm và công nghệ sinh học… 3 Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Chitosan 1.1.1. Cấu trúc và tính chất của chitosan 1.1.1.1. Cấu trúc hóa học của chitosan Chitosan là một dẫn xuất của chitin được hình thành khi tách nhóm acetyl (quá trình deacetyl hoá chitin), vì vậy chitosan chứa rất nhiều nhóm amino. Chitosan thường ở dạng vảy hay dạng bột có màu trắng ngà. Công thức phân tử của chitosan gần giống với chitin nhưng chitosan có chứa nhóm amin ở cacbon số 2 [9, 39]. Trong tự nhiên, chitin tồn tại khá phổ biến đặc biệt có nhiều trong vỏ của các loài động vật giáp xác như: tôm, cua, ghẹ, mai mực. Vì vậy, phế liệu từ động vật thủy sản thường được dùng để sản xuất chitin - chitosan và dẫn xuất của chúng. Thực tế cho thấy, mạch phân tử chitosan không đơn thuần chỉ chứa các nhóm amin ở cacbon số 2 mà còn được đan xen bởi các mắt xích chitin (khoảng 10%). Vì vậy, công thức phân tử của chitosan được biểu diễn như Hình 1.1. Hình 1.1. Công thức phân tử đầy đủ của Chitosan [19] (trong đó tỷ lệ m/n phụ thuộc vào mức độ deacetyl hóa) Chitosan được gọi là: Poly-β-(1-4)-D-glucosamin hay còn gọi: Poly-β-(1-4)-2amino-2-deoxy-D-glucose. Công thức hóa học chitosan: (C6H11O4N)n Khối lượng phân tử của chitosan: MChitosan = (161.07)n 4 1.1.1.2. Tính chất của chitosan: Chitosan là một chất rắn, xốp, nhẹ, có màu trắng ngà và thường ở dạng vảy hoặc dạng bột. Thông thường, chitosan thương mại có độ deacetyl (DD) >70% và trọng lượng phân tử (100.000 - 1.200.000) Dalton. Phân tử lượng của chitosan thường rất khó kiểm soát và phụ thuộc nhiều vào nguồn chitin cùng với điều kiện deacetyl. Phân tử lượng của chitosan quyết định đến tính chất của chitosan như khả năng kết dính, tạo màng, tạo gel, khả năng hấp phụ chất màu đặc biệt là khả năng ức chế vi sinh vật. Chitosan có phân tử lượng càng lớn thì độ nhớt càng cao, khả năng tạo màng tốt và màng có sức căng tốt. Tuy nhiên, chitosan có phân tử lượng thấp thường có hoạt tính sinh học cao hơn và có nhiều ứng dụng trong nông nghiệp, y học và công nghệ sinh học. Chitosan có tính kiềm nhẹ, không hòa tan trong nước, trong dung dịch kiềm mà tan tốt trong các acid hữu cơ thông thường như acid acetic, acid fomic, acid propionic, acid lactic, acid citric. Khi hòa tan trong dung dịch acid loãng, chitosan tạo thành keo dương. Đây là điểm đặc biệt của chitosan vì đa số keo polysaccharide tự nhiên đều tích điện âm. Khi hòa tan chitosan trong dung dịch acid loãng, Chitosan sẽ mang điện tích dương. Chính vì vậy, chitosan có khả năng bám dính lên bề mặt các ion tích điện âm và có khả năng tạo phức với các kim loại và tương tác tốt với các polymer tích điện âm. Chitosan là một trong những polymer sinh học có khả năng kháng nấm và kháng khuẩn tốt [4, 9, 21]. Chitosan là một chất không độc, dễ tạo màng, có thể tự phân hủy sinh học và có tính hòa hợp, tương thích cao với cơ thể [1, 9]. Nhờ những đặc tính trên mà chitosan tăng được khả năng ứng dụng của nó trong một số lĩnh vực như: nông nghiệp, thực phẩm, y học, công nghệ sinh học… 1.1.2. Ứng dụng của chitosan 1.1.2.1. Chitosan ứng dụng trong nông nghiệp và thủy sản  Trong nông nghiệp Chitsosan thường được ứng dụng trong nông nghiệp giúp tăng cường sự hoạt động của các vi sinh vật có lợi trong đất, bọc các hạt giống ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất. Đồng thời, chitosan còn có tác dụng cố định phân bón, thuốc trừ sâu, tăng khả 5 năng nảy mầm của hạt, giảm stress cho cây, kích thích sinh trưởng và tăng năng suất thu hoạch. Đặc biệt, chitosan đóng vai trò là chất kích thích hệ miễn dịch của cây [12, 16, 29]. Theo Lê Thị Thu Hiền và Lê Thị Lan Oanh năm 2007, khi sử dụng hàm lượng vi lượng chitosan sẽ có khả năng tăng hàm lượng diệp lục tổng số, hàm lượng nitơ, amylase, catalase và peroxydase lên đáng kể đối với giống lúa CR-205 và CR-230. Cây mạ được xử lý chitosan sinh trưởng rất tốt, có khả năng chịu rét và cho năng suất từ 21 - 24% so với giống đối chứng. Năm 1987, Betech đã được cấp bằng sang chế nhờ nghiên cứu ứng dụng chitosan trong việc bọc hạt giống để ngăn ngừa sự tấn công của nấm trong đất. Trong những vùng cây trồng bị nấm tấn công vào hệ rễ, nếu hạt giống được bọc bởi chitosan sẽ nâng cao hiệu quả thu hoạch lên 80% so với không sử dụng chitosan. Ngoài ra, chitosan còn có tác dụng kích thích sự nảy mầm của hạt. Ngày nay, chitosan còn được dùng làm nguyên liệu để bổ sung vào thức ăn cho gia cầm, gia súc để kích thích sinh trưởng và tăng khả năng kháng bệnh.  Trong thủy sản Trong lĩnh vực thủy sản, chitin và chitosan đã được nghiên cứu nhiều đặc biệt là nuôi trồng thủy sản. Chitosan được nghiên cứu bổ sung vào thức ăn cho tôm, cá để kích thích sự sinh trưởng, tăng hệ miễn dịch và cải thiện môi trường ao nuôi. Ngoài ra chitosan còn được ứng dụng làm màng bao, làm chất kết dính để tăng độ ổn định cho thức ăn của tôm [7, 8]. 1.1.2.2. Chitosan ứng dụng trong y học và công nghệ sinh học  Trong y học Chitosan có ứng dụng quan trọng và hiệu quả kinh tế cao trong lĩnh vực y học mà hiện nay được rất nhiều các nhà nghiên cứu quan tâm. Nhờ khả năng kháng khuẩn và tạo màng mà chitosan được phối hợp ứng dụng với một số thành phần khác để tạo ra các sản phẩm trong y học: màng sinh học, da nhân tạo, chất nền cho da nhân tạo, chỉ khâu phẫu thuật, mô cấy ghép chống nhiễm khuẩn và cầm máu… Nhờ tính chất tương thích và phân hủy sinh học cao của chitosan nên chitosan được ứng dụng làm chất mang trong việc kiểm soát quá trình giải phóng thuốc và vận 6 chuyển thuốc. Các dạng ứng dụng chính của chitosan là vi hạt, hạt nano, nhũ dịch. Đã có rất nhiều loại thuốc được thử nghiệm với chitosan như: Insulin, 5-fluorouracil, thuốc chống ung thư, kháng viêm… Chitosan còn được dùng làm hoạt chất chính để chữa các bệnh như: thuốc điều trị liền vết thương, vết bỏng, vết mổ vô trùng. Đồng thời, chitosan giúp hạ đường huyết và cholesterol trong máu, chữa đau dạ dày, chống đông tụ máu, điều trị suy giảm miễn dịch… Ngoài ra, trong lĩnh vực kiểm soát cân nặng cơ thể, chitosan còn được xem là một chất giảm béo rất tốt [33]. Chitosan có khả năng ngăn cản sự hấp thu mỡ của cơ thể.  Trong công nghệ sinh học Chitosan được ứng dụng làm vật liệu cố định enzyme và tế bào, thông qua cầu nối glutaraldehyte hoặc được nhốt trong gel. Chitosan còn được ứng dụng trong việc chế tạo màng bao, màng vi bảo, chất mang sinh học và nuôi cấy mô. Trong việc ứng dụng chitosan để bảo vệ và duy trì hoạt tính của các chất có giá trị cao, chitosan đã được nghiên cứu để bảo vệ, tăng cường độ ổn định của các chất có hoạt tính sinh học như: thuốc, chất màu, vitamin, DNA… Trong công nghệ di truyền, chitosan được nghiên cứu làm chất mang DNA trong hệ phân phối không dùng virus vào liệu pháp gen. Với các nghiên cứu này, DNA được cố định trong các hạt nano chitosan. Đối với lĩnh vực nuôi cấy mô, chitosan được ứng dụng làm giá thể vi chitosan có cấu trúc xốp, có tính chất tạo gel, dễ dàng thực hiện cảm biến, có ái lực cao đối với các đại phân tử (Kim và cộng sự, 2008). Có rất nhiều nghiên cứu ứng dụng chitosan trong lĩnh kỹ thuật mô xương chủ yếu tập trung vào hợp chất chitosan - Phosphat Canxi. Đồng thời, chitosan cũng được nghiên cứu trong việc làm chất kích thích trong nuôi cấy mô thực vật. 1.1.2.3. Chitosan ứng dụng trong công nghiệp Chitosan được ứng dụng khá phổ biến trong các ngành công nghiệp.  Trong công nghiệp thực phẩm Chitosan là hợp chất polymer tự nhiên an toàn với những tính chất đặc trưng như khả năng kháng nấm, kháng khuẩn, chống oxy hóa, tạo màng, tạo gel, hấp phụ màu, làm 7 trong… Vì vậy, chitosan được ứng dụng rất nhiều trong lĩnh vực chế biến và bảo quản thực phẩm. Ứng dụng chitosan trong tạo màng, chống biến nâu, mất nước, kháng nấm bảo quan rau quả. Nhờ hàng hào bảo vệ, hạn chế sự cung cấp oxy trên bề mặt rau quả và hàm lượng CO2 bên trong màng tăng lên nên quá trình hô hấp của rau quả bị ức chế và hạn chế quá trình biến nâu của quả. Hơn nữa, màng chitosan có lại có tính khàng khuẩn, kháng nấm nên sự hư hỏng do vi sinh vật sẽ giảm đi nhiều. Năm 2001 và 2005, Jiang đã thực hiện bảo quản vải, nhãn nhờ chitosan và kết quả cho thấy sự biến nâu được giảm rõ rệt và kéo dài được thời gian bảo quản khi sử dụng chitosan ở nồng độ 2% [24, 25]. Ngoài ra có nhiều loại hoa quả khác cũng được ứng dụng như: xoài, táo, chuối, đào, kiwi, nho, cà rốt, dâu tây, cà chua… Chitosan được ứng dụng trong kháng khuẩn, kháng nấm, chống oxy hóa, chống hao hụt trọng lượng trong bảo quản và chế biến thịt, các, chả giò, xúc xích, đậu phụ, bánh mì… Chitosan được sử dụng làm chất trợ keo tụ, tạo bông trong công nghệ sản xuất nước hoa quả nhằm mục đích tạo độ trong, sáng, màu sắc đẹp và tăng tính cảm quan cho sản phẩm.  Trong xử lý môi trường Chitosan có khả năng hấp phụ nhiều ion kim loại nặng như đồng, chì, crom, thủy ngân… Nhờ các nhóm amin của chitosan có ái lực mạnh và có thể hình thành phức hợp với các ion kim loại nặng [20, 27, 28, 35]. Tuy nhiên, chitosan có hạn chế là bị hòa tan trong môi trường pH thấp. Với pH của dịch nước thải từ 5 - 5,5 thì khả năng hấp phụ Pb2+ và Cu2+ của chitosan là tốt nhất. Chitosan được ứng dụng để thu hồi protein trong nước thải của ngành Công nghệ Thực phẩm [9, 32]. Nhiều công trình nghiên cứu đã tiến hành thực nghiệm sử dụng chitosan để thu hồi protein từ nước rửa surimi, dịch thải máu cá, nước thải trong quá trình chế biến cá, chế biến sữa… Phân tử chitosan có khả năng hấp phụ, tạo cầu nối để liên kết các hạt keo protein đã keo tụ thành các phân tử có kích thước lớn hơn và lắng xuống. Chitosan được ứng dụng trong xử lý chất màu của nước thải từ nhà máy dệt nhuộm. Ngành công nghiệp dệt - nhuộm là ngành tạo ra một lượng lớn nước thải chứa 8 nhiều chất màu gây ô nhiễm môi trường. Tuy nhiên, các phương pháp xử lý nước thải hiện nay chỉ có thể làm giảm BOD và các chất thải rắn mà hiệu quả xử lý chất màu chưa cao. Và chitosan đã nâng cao được hiệu quả đó nhờ khả năng hấp phụ chất màu thông qua phản ứng trao đổi ion tại giá trị pH thích hợp và cơ chế hấp phụ vật lý. Chính vì vậy, hiện nay chitosan được ứng dụng khá phổ biến và được xem như là một trong các nhóm tác nhân chính để xử lý nước thải [22].  Trong công nghiệp giấy: Nhờ cấu trúc tương tự cellulose nên chitosan được nghiên cứu bổ sung vào làm nguyên liệu sản xuất giấy giúp tăng độ bền dai của giấy, đồng thời giúp cho việc in trên giấy được tốt hơn.  Trong công nghiệp dệt: Dung dịch chitosan có thể thay thế cho hồ tinh bột để hồ vải, nó có tác dụng làm sợi tơ bền, mịn, bóng đẹp, cố định hình in, chịu được acid và kiềm nhẹ. Đồng thời, chitosan có thể kết hợp với một số thành phần khác để sản xuất vải chịu nhiệt, vải chống thấm, vải cold…  Trong nghành hóa mỹ phẩm: Chitosan có thể cố định dễ dàng trên biểu bì của da nhờ các nhóm NH3+. Các nhóm này liên kết với tế bào sừng hóa của da. Dựa vào đặc tính này, người ta sử dụng chitosan làm các loại kem dưỡng da: giữ ẩm, chống khô, làm mềm da, ngăn ngừa tia cực tím… 1.2. Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp Chitosan phân tử lượng thấp là chitosan có khối lượng phân tử có sự dao động từ 20 - 200 (kDa), độ nhớt biểu kiến dao động từ 20 - 200 (cP) [36] và mang đầy đủ tính chất vật lý, hóa học, sinh học của chitosan. 1.2.1. Vai trò của chitosan phân tử lượng thấp Chitosan phân tử lượng thấp có thể nhận biết khi so sánh với chitosan phân tử lượng cao thông qua độ nhớt của chitosan khi được hòa tan trong dung dịch acid loãng. Như vậy, độ nhớt là nhân tố quan trọng để xác định trọng lượng phân tử của chitosan [42]. Ta có thể thấy rằng, chitosan phân tử lượng thấp sẽ có độ nhớt thấp bởi mạch phân tử chitosan ngắn sẽ làm giảm sự tương tác giữa các phân tử với nhau. Ngược lại, nếu mạch phân tử chitosan cao, các phân tử trong môi trường có sự ràng buộc lẫn nhau tạo 9 thành trạng thái rối làm cho chitosan có độ nhớt cao hơn. Vì lý do đó mà ta có thể xác định tương đối chitosan phân tử lượng thấp thông qua độ nhớt của nó. Theo một số nghiên cứu cho biết, chitosan phân tử lượng thấp sẽ có độ nhớt nằm trong khoảng từ 20 - 200 (cP). Trong khi đó, chitosan phân tử lượng trung bình có độ nhớt từ 200 - 800 (cP) và chitosan phân tử lượng cao có độ nhớt từ 800 - 2000 (cP) [36]. Ngoài việc vẫn đảm bảo được tính chất như một chitosan phân tử lượng cao và trung bình thì chitosan phân tử lượng thấp còn có nhiều đặc tính ưu việt khác. Theo một nghiên cứu ngoài nước [15] cho thấy, chitosan phân tử lượng thấp là một chất có khả năng kháng khuẩn, kháng nấm và virus rất tốt. Trên thực tế, đa số bề mặt tế bào vi khuẩn thường là Gram âm, nhờ lực tương tác tĩnh điện xảy ra giữa nhóm NH3+ của chitosan và bề mặt tế bào vi khuẩn dẫn đến sự phá vỡ màng tế bào vi khuẩn, đồng thời màng bao bọc của chitosan lên tế bào vi sinh vật là rào cản của các quá trình trao đổi chất và gián tiếp tham gia vào quá trình ly giải tế bào. Hơn nữa, chitosan là một tác nhân tạo phức, nó có thể loại bỏ các kim loại vi lượng cần thiết cho quá trình phát triển của vi sinh vật. Khi quan sát dưới kính hiển vi điện tử, các nhà Khoa học chỉ ra rằng, chitosan có phân tử lượng thấp có khả năng ức chế vi sinh vật tốt hơn chitosan phân tử lượng cao. Nhờ khả năng tương tác và tiếp xúc với toàn bộ bề mặt vi sinh vật làm ngăn cản các quá trình sinh hóa và hoạt động bình thường mà chitosan phân tử lượng thấp có khả năng kháng khuẩn tốt hơn chitosan phân tử lượng cao. Ngoài cơ chế kháng khuẩn, chitosan còn được xem là một chất an toàn và có khả năng tự phân hủy sinh học mà các nhà nghiên cứu muốn ứng dụng rộng rãi trong lĩnh vực công nghiệp thực phẩm. Một số nghiên cứu khác cho thấy rằng, với khả năng tác động về mặt lý hóa và đặc tính sinh học mà chitosan phân tử lượng thấp được sử dụng như một chất tăng cường hấp thu cho các đại phân tử và còn là phương tiện chuyển gen hữu hiệu. Đồng thời, chitosan phân tử lượng thấp hữu ích cho việc thiết kế hệ thống phân phối thuốc do các tính chất hòa tan được cải thiện [34]. 10 Từ các cơ sở khoa học và vai trò trên, đề tài được tiến hành nghiên cứu nhằm đưa ra một quy trình tối ưu cho quá trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp với độ nhớt mục tiêu từ 50 - 100 (cP). 1.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp Chitosan đã được biết đến về dạng tồn tại, cấu trúc, tính chất và ứng dụng bởi các nhà nghiên cứu trên thế giới công bố từ những năm 30 của thế kỷ XX. Trên thế giới và tại Việt Nam đã có nhiều nghiên cứu thành công trong lĩnh vực này. 1.2.2.1. Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp trên thế giới Nhật Bản, Hoa Kỳ, Trung Quốc, Ấn Độ, Pháp được xem là những nước có rất nhiều thành công trong lĩnh vực nghiên cứu sản xuất chitosan. Với công nghệ sản xuất chitosan hàng đầu, Nhật Bản là nước đầu tiên trên thế giới sản xuất 20 tấn/năm. Cho đến nay, mỗi năm Nhật Bản sản xuất được 700 tấn, trong khi Hoa Kỳ chỉ đạt trên 300 tấn. Người ta ước tính rằng, sản lượng chitosan trên thế giời sẽ đạt tới 118.000 tấn/năm, trong đó Nhật Bản và Hoa Kỳ là hai nước sản xuất chính. Cho đến nay có rất nhiều các phương pháp sản xuất chitosan và chitosan phân tử lượng thấp, tuy nhiên, trong pham vi Đề tài, chúng tôi quan tâm đến các phương pháp thủy phân chitosan tạo chitosan phân tử lượng thấp với mục đích giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm môi trường và quy trình sản xuất đơn giản. Trên thế giới, có rất nhiều phương pháp sản xuất chitosan có phân tử lượng thấp và chủ yếu được phân thành các dạng như sau: Phương pháp sinh học, hóa học và vật lý. Bởi một số ưu điểm vươt trội mà phương pháp hóa học và sinh học được ứng dụng nhiều trong cuộc sống.  Thủy phân chitosan bằng tác nhân sinh học Ước tính có hơn 30 loại enzyme có thể sử dụng để cắt mạch chitosan: chitosanase, cellulase thu từ các vi sinh vật (vi khuẩn, nấm mốc), papain tách chiết từ đu đủ… [6]. Theo nghiên cứu của Jin Li và cộng sự, 2004, chitosan sau khi được cắt mạch bằng enzyme protease có nguồn gốc từ vi khuẩn Bacillus subtilis đã tạo ra được sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp có khối lượng phân tử là 5 -10 (kDa). 11 Nhờ tính đặc hiệu của enzyme mà phương pháp thủy phân bằng enzyme có hiệu quả cao và giảm thiểu được khả năng biến đổi hóa học không có lợi, đồng thời tăng hoạt tính sinh học của sản phẩm thủy phân và không gây ô nhiễm môi trường. Tuy phương pháp thủy phân chitosan bằng enzyme có nhiều ưu điểm, nhưng phương pháp này vẫn còn khá nhiều hạn chế. Do công đoạn tinh sạch cho sản phẩm khó khăn nên chi phí cho sản xuất rất lớn, quy trình sản xuất phức tạp. Tính đặc hiệu của enzyme cao vì vậy có những enzyme chỉ cắt liên kết giữa các đơn vị có chứa nhóm acetyl hoặc chỉ cắt liên kết giữa các đơn vị đã bị khử nhóm acetyl nên hiệu quả thủy phân chưa cao.  Thủy phân chitosan bằng tác nhân vật lý Sử dụng tác nhân vật lý cho thủy phân chitosan cũng đã được các nhà khoa học nghiên cứu khá nhiều. Khi thủy phân bằng tác nhân vật lý, người ta thường sử dụng các tia chiếu xạ cho quá trình thủy phân. Có thể kể đến như: - Chiếu xạ ở trạng thái khô: dùng tia gamma phát ra từ nguồn 60 Co với liều lượng là 0.56 Gy s -. - Chiếu xạ trong dung dịch: dùng tia gamma phát ra từ nguồn 60 Co với liều lượng là 0.023 Gy s-. - Siêu âm trong dung dịch: phương pháp này dễ dàng thu được chitosan phân tử lượng thấp phụ thuộc vào tần số của sóng siêu âm sử dụng. Năm 2005, Czechowska-Biskup và cộng sự đã thử nghiệm thủy phân chitosan bằng phương pháp vật lý tạo oligochitosan và thử nghiệm kết hợp oligochitosan với chất béo nhằm mục đích ứng dụng oligochitosan trong dược phẩm hoặc thực phẩm chức năng để làm giảm khả năng hấp thụ chất béo của con người. Năm 2004, Wasikiewicz và cộng sự đã sử dụng tia gamma, tia UV và sóng siêu âm để thủy phân chitosan, kết quả thu được oligo chitosan có phân tử lượng khá thấp (>25 kDa). Năm 2011, Nguyễn Ngọc Duy đã kết hợp phương pháp vật lý và phương pháp hóa học để thủy phân chitosan bằng tia gamma trong môi trường có bổ sung H2O2 và thu được olygochitosan có khối lượng phân tử thấp (5 – 10 kDa) [30]. 12 Phương pháp này có ưu điểm là phản ứng thủy phân diễn ra nhanh nhờ tác động mạnh của các tia chiếu xạ. Tuy nhiên, Thủy phân bằng phương pháp vật lý phải hòa tan chitosan trong môi trường acid với nồng độ (0.1 - 1)%, đồng thời phản ứng thủy phân dễ xảy ra quá trình phá vỡ các cấu trúc bên ngoài của chitosan.  Thủy phân chitosan bằng phương pháp hóa học Trên thực tế có rất nhiều tác nhân hóa học đã được nghiên cứu và ứng dụng để thủy phân chitosan thu chitosan phân tử lượng thấp hoặc oligochitosan như: acid nitrous, acid sulfuric, acid phosphosunfuric và acid hydrofluoric [17, 26, 31, 37]. Tuy nhiên, phương pháp này đòi hỏi thời gian dài, dễ bị phá vỡ các cấu trúc mạch vòng của chitosan, quá trình tinh sạch sản phẩm khó khăn, ô nhiễm môi trường và phải sử dụng các thiết bị hiên đại ở quy mô công nghiệp. Bên cạnh đó, một số các nghiên cứu đã sản xuất thành công chitosan phân tử lượng thấp bằng việc thủy phân chitosan ở trạng thái lỏng (sau khi pha loãng trong môi trường acid) bởi các tác nhân oxy hóa như: ozone, natri nitrite và hydroperoxid [10, 13]. Tuy nhiên, phương pháp này vẫn chưa khắc phục được nhược điểm lớn nhất của phương pháp hóa học là quá trình tinh chế sản phẩm gặp nhiều khó khăn và nguy cơ ô nhiễm môi trường cao. Một phương pháp mới đã được đưa ra nhằm giảm thiểu chi phí và đơn giản hóa quy trình sản xuất khi thủy phân chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân HCl. Nghiên cứu này đã thành công với 80% chitosan được chuyển thành glucosamine. Tuy vây, phưng pháp này khó thương mại hóa sản phẩm vì sản phẩn tạo thành chủ yếu không phải chitosan - oligosaccharide và việc xử lý nước thải gặp rất nhiều khó khăn [17]. Phương pháp thủy phân với tác nhân hóa học thường cho hiệu quả cao, sản phẩm tạo thành có sự đồng nhất bởi chitosan được hòa tan ở dạng dung dịch. Tuy nhiên, khi thủy phân chitosan bằng phương pháp hóa học ở dạng dung dịch, các nhà khoa học còn lo ngại về hoạt tính sinh học của sản phẩm và có nguy cơ gây ô nhiễm môi trường. Vì vậy, cần tìm ra một phương pháp hóa học hoàn hảo hơn để có thể khắc phục được các nhược điểm trên. 13 1.2.2.2. Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở Việt Nam Ở Việt Nam hiện nay có rất nhiều cơ sở khoa học đã và đang nghiên cứu sản xuất chitosan như: Trường Đại học Nha Trang, Trung tâm nghiên cứu polymer – Viện khoa học Việt Nam, Viện Hóa thuộc Viện khoa học Việt Nam tại Thành phố Hồ Chí Minh, Trung tâm Công nghệ và Sinh học Thủy sản - Viện Nghiên cứu Môi trường Thủy sản 2, Đại học Nông Lâm Thành phố Hồ Chí Minh… Gần đây, Trường Đại học Nha Trang đã công bố nhiều quy trình sản xuất theo hướng giảm thiểu sử dụng hóa chất trong xử lý và những nghiên cứu ứng dụng công nghệ enzyme [3, 5]. Đặc biệt có công trình của GS. Trần Thị Luyến và cộng sự, 2006 đã nghiên cứu sản xuất oligochitosan bằng HCl, sản phẩm thu được có màu sắc trắng, đẹp, và chất lượng tốt. Đồng thời, cùng năm 2006, GS. Trần Thị Luyến đã nghiên cứu sản xuất oligochitosan từ chitin, chitosan bằng enzyme papain, enzyme hemicellulose, enzyme cellulase từ xạ khuẩn [5]. Theo GS.Trần Thị Luyến khi sử dụng enzyme papain từ đu đủ xanh đã thu được 95% oligochitosan từ chitosan. Còn sử dụng enzyme papain thương phẩm thì thu được 97%. Đối với khi sử dụng enzyme hemicellulose thương phẩm, sản phẩm thu được là 88,9% oligochitosan từ chitosan và 86,7% từ chitin. Khi sử dụng enzyme cellulase từ xạ khuẩn [5] sẽ thu được 52,6% oligochitosan từ chitosan và 45,6% từ chitin. Năm 2008, Đỗ Thị Liền đã nghiên cứu cắt mạch chitosan trong dung dịch acid acetic bằng H2O2 [3], kết quả cho thấy 9 sản phẩm chitosan mạch ngắn đã được sản xuất thử nghiệm thành công. Đây là một bước tiến mới so với các phương pháp sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở Việt Nam trước năm 2008. Tuy nhiên, độ nhớt của chitosan mà tác giả Đỗ Thị Liền đã nghiên cứu sau khi cắt mạch chỉ có thể chấp nhận về mặt định tính bởi độ nhớt của chitosan thấp có thể biểu thị phân tử lượng thấp một cách tương đối mà chưa xác định đầy đủ về mặt định lượng. Đồng thời, phương pháp cắt mạch của nghiên cứu trên phải thông qua bước hòa tan và pha loãng chitosan trong môi trường acid, điều này ảnh hưởng rất lớn đến môi trường, gây khó khăn và tốn kém chi phí trong công đoạn tách và tinh sạch sản phẩm. 14 Như vậy, để phát triển ưu điểm của các phương pháp trên và hạn chế các nhược điểm còn tồn tại, nghiên cứu mong muốn có thể giảm thiểu được những tồn tại của các phương pháp trước đây. 1.2.3. Sử dụng H2O2 cho quá trình thủy phân ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp và cơ sở khoa học của phương pháp 1.2.3.1. Cơ chế cắt mạch của H2O2 và cơ sở khoa học của phương pháp Quá trình cắt mạch chitosan của H2O2 là một quá trình thủy phân liên tục, vì vậy để hiểu thêm về cơ chế cắt mạch của H2O2 khi tác động vào mạch phân tử chitosan, chúng ta cần biết rõ về cấu trúc của chitosan. Mạch phân tử chitosan là polysaccharide được cấu tạo bởi các monosaccharide liên kết với nhau bằng cầu nối 1,4 glucoside và có sự hình thành của các nhóm amin ở cacbon số 2 khi deacetyl hóa chitin. Trong quá trình thủy phân chitosan bằng hydroperoxide, các phản ứng được diễn ra lần lượt như sau: Trước hết là sự phân ly của H2O2: H2O2 = H+ + HOO- (1) Ion H+ của phương trình (1) sẽ liên kết với nhóm NH2 ở cacbon số 2 của chitosan (hình 1.3) để tạo thành NH3+: R – NH2 + H+ = R – NH3+ (2) Từ (1), (2) và hình 1.3, ta có phương trình tổng quát: H2O2 + R – NH2 = R – NH3+ + HOO- (3) Gốc HOO- được tạo ra khá linh động, nó dễ dàng bị thủy phân tạo ra gốc tự do HO*, O* và nhóm -OH-. Như vậy, có thể hiểu là H2O2 liên tục bị thủy phân. HOOH2O2 + HOO- OH- + O* HO* + O*2- + H2O (4) (5) Gốc hydroxyl là một gốc oxy hóa rất mạnh, nó phản ứng với Cacbohydrates rất nhanh, HO* lấy một hydro nguyên tử của mạch phân tử chitosan, nước được hình thành 15 tạo điều kiện thuận lợi cho quá trình thủy phân. Dựa vào cấu trúc chitosan Hình 1.3, ta có phương trình: (GlcN)m − (GlcN)n + HO*→ (GlcN*)m − (GlcN)n + H2O (6) (GlcN.)m− (GlcN)n + H2O→ (GlcN)m + (GlcN)n (7) Sau quá trình thủy phân, cấu trúc của chitosan sẽ không thay đổi, mạch chitosan ngắn lại do các liên kết 1,4 glucoside bị cắt đứt [19]. Ở trạng thái rắn, sự trương nở cấu trúc của chitosan là một yếu tố quan trọng nhằm hỗ trợ cho sự xâm nhập và cắt đúng vị trí của tác nhân H2O2. Nếu khả năng xâm nhập vào các liên kết bị giảm thì tác nhân oxy hóa chỉ phản ứng ở bề mặt ngoài của chitosan, vì vậy, sản phẩm tạo thành sẽ có hiên tượng ngả sang màu vàng. Như vậy, tiền xử lý chitosan cho phản ứng cắt mạch là quá trình quan trọng ảnh hưởng rất lớn đến tính chất của chitosan sản phẩm. Từ cơ chế đã được phân tích ở trên cho thấy, chitosan hoàn toàn có thể được cắt mạch bằng tác nhân H2O2 ở trạng thái rắn mà không cần hòa tan trong dung dịch acid. 1.2.3.2. Các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng thủy phân chitosan Phản ứng thủy phân chitosan bằng H2O2 ảnh hưởng bởi nhiều yếu tố, có thể kể đến một số yếu tố ảnh hưởng lớn như: kích thước chitosan, nồng độ - tỷ lệ H2O2 được bổ sung, nhiệt độ và thời gian thủy phân.  Ảnh hưởng của kích thước chitosan: Chitosan có kích thước khác nhau sẽ có phản ứng thủy phân khác nhau phụ thuộc vào khả năng tiếp xúc giữa H2O2 và chitosan.  Ảnh hưởng của nồng độ và tỷ lệ H2O2 được bổ sung: Theo nghiên cứu của Tian, 2004 [6] cho thấy trọng lượng phân tử của chitosan sau khi thủy phân sẽ giảm dần khi nồng độ H2O2 tăng, một lượng nhỏ H2O2 cũng có thể làm giảm trọng lượng của phân tử chitosan. Như vậy, khi điều kiện phản ứng không đổi thì nồng độ H2O2 càng cao, lượng H2O2 được bổ sung vào càng nhiều thì trọng lượng phân tử càng giảm. 16  Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian xử lý: Trong phản ứng thủy phân, khi nhiệt độ thủy phân cao thì phản ứng xảy ra mạnh mẽ hơn làm cho trọng lượng phân tử chitosan giảm nhanh hơn. Đồng thời, khi phản ứng xảy ra trong thời gian dài cũng có thể làm kéo dài khả năng cắt mạch chitosan. Ngoài các yếu tố trên, tốc độ và hiệu quả của phản ứng cắt mạch chitosan còn phụ thuộc vào môi trường phản ứng. trong môi trường H+ hoặc OH-, H2O2 có tác động mạnh với chitosan hơn khi đứng một mình. Hydroperoxide là một tác nhân, mà dựa vào sự hình thành các gốc tự do, chúng có khả năng tấn công vào liên kết β-D-1,4-glucoside của chitosan. Việc oxi hóa chitosan bằng H2O2 thông thường được xảy ra trong pha đồng nhất (khi chitosan được hòa tan trong môi trường acid). Tuy nhiên, quá trình này cũng có thể được thực hiên khi chitosan ở trạng thái không đồng nhất [17]. Điều này giảm thiểu được quá trình chuyển chitosan từ trang thái rắn sang lỏng nhờ acid, đồng thời, hydroperoxide được sử dụng để thủy phân chitosan còn vì dễ dàng thao tác, rẻ tiền và thân thiện với môi trường [3]. 17 Chương 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tượng nghiên cứu 2.1.1. Chitosan Chitosan được tác giả sản xuất bằng phương pháp hóa học tại Trường Đại học Nha Trang cải tiến dựa trên quy trình sản xuất chitosan của PGS. Ts Trang Sỹ Trung năm 2003 [9]. 2.1.2. Hóa chất 2.1.2.1. Hydroperoxide (H2O2) - Hydroperoxide có nồng độ 30% (w/v) được bảo quản trong chai nhựa để nơi thoáng mát - Là chất lỏng có màu trong suốt, có tính oxi hóa mạnh - Công thức phân tử: H2O2 - H2O2 được mua tại cửa hàng hóa chất Hoàng Trang, Số 42, đường Hoàng Hoa Thám - Tp. Nha Trang - Xuất xứ: Trung Quốc 2.1.2.2. Một số hóa chất khác - Acid acetic (CH3COOH) 99% - xuất xứ: Đức - Sodium hydroxide (NaOH) dạng viên tròn – xuất xứ: Đức 2.1.3. Thiết bị sử dụng cho nghiên cứu - Thiết bị đo khối lượng phân tử - Máy đo độ nhớt - Máy đo quang phổ - Máy đo độ đục - Tủ nung - Tủ sấy - Máy nghiền mẫu - Máy lắc - Bể ổn nhiệt - Máy ly tâm 18 2.2. Phương pháp nghiên cứu 2.2.1. Bố trí thí nghiệm tổng quát Để nghiên cứu khả năng thủy phân của H2O2 đến chitosan ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp, thí nghiệm được tiến hành dựa trên quy trình sau: Chitosan Kiểm tra các thông số ban đầu Nghiên cứu quá trình tiền xử lý chitosan Nghiên cứu quá trình cắt mạch chitosan bằng Nồng độ H2O2 Thời gian phản ứng Lọc Tỷ lệ phản ứng Bỏ dịch Thu rắn Rửa đến trung tính Sấy Sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp Xác định hiệu suất, độ nhớt và khối lượng phân tử của sản phẩm Kết quả, thảo luận và kết luận Hình 2.1. Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát Nguồn chitosan ban đầu được kiểm tra các thông số: Khối lượng phân tử, độ nhớt, độ đục, độ tan, độ deacetyl, hàm lượng protein, hàm lượng ẩm, hàm lượng tro. Quá trình tiền xử lý chitosan được nghiên cứu thông qua các yếu tố: kích thước chitosan ban đầu cùng với sự tương tác với NaOH. 19 Chitosan được xay đến các kích thước nghiên cứu bằng máy nghiền mẫu khô, sau đó cân lượng chitosan cần thiết cho vào các bình thí nghiệm. Bổ sung chất tiền xử lý NaOH theo các thông số nghiên cứu. Mỗi mẫu nghiên cứu được lặp lại 3 lần. Quá trình này nhằm xác định kích thước và chế độ tiền xử lý chitosan thích hợp nhất cho các thí nghiệm tiếp theo. Quá trình cắt mạch chitosan bằng H2O2 được nghiên cứu dựa trên 3 yếu tố: nồng độ H2O2, thời gian thủy phân và tỷ lệ chitosan/H2O2 cho quá trình thủy phân. Cả 2 quá trình được tiến hành theo các thông số nghiên cứu đã được đưa ra, mẫu thí nghiệm được đặt trên máy lắc và ở điều kiện nhiệt độ quy định. Sau khi hết thời gian cho quá trình cắt mạch, các mẫu chitosan được rửa và lọc bằng nước cất đến trung tính, thu phần rắn và sấy khô ở nhiệt độ 50oC ta thu được chitosan phân tử lượng thấp. Sản phẩm chitosan sau quá trình cắt được đánh giá hiệu suất thu hồi, độ nhớt biểu kiến và khối lượng phân tử của chitosan. 2.2.2. Nghiên cứu quá trình tiền xử lý chitosan ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp với tác nhân H2O2 Quá trình tiền xử lý chitosan có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng cắt mạch. Quá trình này nhằm giúp cho chitsan ban đầu có khả năng tiếp xúc và dễ dàng bị cắt bởi tác nhân H2O2. Vì vậy, nghiên cứu được tiến hành với các kích thước chitosan khác nhau, quá trình tiền xử lý sử dụng NaOH và nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH, thời gian tiền xử lý thích hợp để đảm bảo quá trình này diễn ra hỗ trợ cho phản ứng cắt xảy ra dễ dàng và tốt nhất nhằm tạo chitosan phân tử lượng thấp có độ nhớt mục tiêu. 2.2.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan đến quá trình tạo chitosan phân tử lượng thấp  Bố trí thí nghiệm: Chitosan Xay ở các kích thước khác nhau Vảy 8 mm 4 mm 2 mm 1 mm 20 NaOH 0.1%, tỷ lệ 1:15, 30oC, 3 giờ Bổ sung H2O2 0.2%, tỷ lệ 1:3, 30oC, 2 giờ Rửa, lọc, sấy Xác định hiệu suất, độ nhớt và khối lượng phân tử của sản phẩm Chọn kích thước chitosan thích hợp Hình 2.2. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định kích thước chitosan thích hợp  Mục đích: Xác định kích thước chitosan thích hợp để thủy phân chitosan ở trạng thái rắn nhằm thu hồi chitosan phân tử lượng thấp.  Thuyết minh quy trình: Chitosan được thí nghiệm ở 5 kích thước khác nhau: dạng vảy (dạng ban đầu), 8 (mm), 4 (mm), 2 (mm) và 1 (mm). Trừ kích thước dạng vảy thì các kích thước khác được tạo ra bằng máy nghiền mẫu khô với các màng rây có kích thước lỗ khác nhau. Cân khối lượng các mẫu, mỗi mẫu 2.5g được cho vào các bình thí nghiệm. Mỗi kích thước được lặp lại 3 lần, bổ sung tác nhân tiền xử lý NaOH 0.1% với tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v), nhiệt độ 30oC trong thời gian 3 giờ. Kết thúc giai đoạn tiền xử lý, các bình thí nghiệm được bổ sung H2O2 0.2%, tỷ lệ chitosan/H2O2 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC và thời gian trong 2 giờ. Các bình thí nghiệm được đặt trên máy lắc trong khoảng thời gian xác định. Sau khi thủy phân xong, mẫu được rửa và lọc thu rắn bằng nước cất đến trung tính rồi đem sấy ở nhiệt độ 50oC đến trạng thái khô ta thu được chitosan sản phẩm. Sản phẩm được xác định độ ẩm nhằm đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định độ nhớt biểu kiến bằng máy đo độ nhớt và khối lượng phân tử bằng thiết bị đo độ nhớt nội. Căn cứ vào các kết quả thu được và mục tiêu đề ra, lựa chọn kích thước chitosan thích hợp nhất cho quá trình cắt mạch tạo chitosan phân tử lượng thấp. 21 2.2.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến quá trình tạo chitosan phân tử lượng thấp  Bố trí thí nghiệm: Chitosan kích thước xác định NaOH tỷ lệ 1:15, 30oC, 3giờ với các nồng độ 0.05% 0.1% 0.2% 0.3% 0.4% 0.5% 0.6% Bổ sung H2O2 0.2%, tỷ lệ 1:3, 30 oC, 2 giờ Rửa, lọc, sấy Xác định hiệu suất, độ nhớt và khối lượng phân tử của sản phẩm Chọn nồng độ NaOH thích hợp Hình 2.3. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình tiền xử lý  Mục đích: Xác định nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình tiền xử lý để thủy phân chitosan ở trạng thái rắn nhằm thu hồi chitosan phân tử lượng thấp.  Thuyết minh quy trình: Cân 2.5 (g) các mẫu chitosan có kích thước được xác định theo quy trình bố trí ở Hình 2.2 rồi cho vào các bình thí nghiệm đã được chuẩn bị sẵn. Tiến hành quá trình tiền xử lý với tác nhân NaOH tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC, thời gian xử lý trong 3 giờ với các nồng độ khác nhau (0.05%, 0.1%, 0.2%, 0.3%, 0.4%, 0.5%, 0.6%). Mỗi nồng độ thí nghiệm được lặp lại 3 lần. Sau đó, các bình thí nghiệm được bổ sung H2O2 0.2%, tỷ lệ chitosan/H2O2 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC và 22 thời gian trong 2 giờ. Các bình thí nghiệm được đặt trên máy lắc trong khoảng thời gian xác định. Sau khi thủy phân xong, mẫu được rửa và lọc thu rắn bằng nước cất đến trung tính rồi đem sấy ở nhiệt độ 50oC đến trạng thái khô, ta thu được chitosan sản phẩm. Sản phẩm được xác định độ ẩm nhằm đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định độ nhớt biểu kiến bằng máy đo độ nhớt có bể ổn nhiệt và khối lượng phân tử bằng thiết bị đo độ nhớt nội. Căn cứ vào các kết quả thu được và mục tiêu đề ra, xác định nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình tiền xử lý nhằm tạo chitosan phẩn tử lượng thấp. 2.2.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý đến quá trình tạo chitosan phẩn tử lượng thấp  Bố trí thí nghiệm: Chitosan kích thước xác định Nồng độ NaOH xác định, tỷ lệ 1:15, 30 oC với các thời gian 30 phút 60 phút 90 phút 120 phút 150 phút 180 phút 240 phút Bổ sung H2O2 0.2%, tỷ lệ 1:3, 30oC, 2 giờ Rửa, lọc, sấy Xác định hiệu suất, độ nhớt và khối lượng phân tử của sản phẩm Chọn thời gian tiền xử lý thích hợp Hình 2.4. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian tiền xử lý thích hợp  Mục đích: Xác định thời gian thích hợp cho quá trình tiền xử lý để thủy phân chitosan ở trạng thái rắn nhằm thu hồi chitosan phân tử lượng thấp. 23  Thuyết minh quy trình: Sau khi lựa chọn được kích thước chitosan và nồng độ NaOH thích hợp bằng thí nghiệm được bố trí ở Hình 2.2 và 2.3, tiến hành cân các mẫu có khối lượng 2.5 (g) cho vào các bình thí nghiệm đã được chuẩn bị sẵn. Tiến hành quá trình tiền xử lý, sử dụng NaOH nồng độ xác đinh, tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v), nhiệt độ 30oC với các thời gian khác nhau (30, 60, 90, 120, 150, 180, 240 phút). Mỗi mốc thời gian được lặp lại thí nghiệm 3 lần. Các bình thí nghiệm được đặt trên máy lắc trong khoảng thời gian xác định. Kết thúc giai đoạn tiền xử lý, các bình thí nghiệm được bổ sung H2O2 0.2%, tỷ lệ chitosan/H2O2 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC và thời gian trong 2 giờ. Sau khi thủy phân xong, mẫu được rửa và lọc thu rắn bằng nước cất đến trung tính rồi đem sấy ở nhiệt độ 50oC đến trạng thái khô ta thu được chitosan sản phẩm. Sản phẩm được xác định độ ẩm nhằm đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định độ nhớt biểu kiến bằng máy đo độ nhớt có bể ổn nhiệt và khối lượng phân tử bằng thiết bị đo độ nhớt nội. Căn cứ vào các kết quả thu được và mục tiêu đề ra, lựa chọn thời gian tiền xử lý thích hợp nhất cho quá trình cắt mạch tạo chitosan phân tử lượng thấp. 2.2.3. Nghiên cứu quá trình cắt mạch chitosan bằng H2O2 ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp 2.2.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến quá trình tạo chitosan phân tử lượng thấp  Bố trí thí nghiệm: Chitosan kích thước xác định Nồng độ NaOH xác định, tỷ lệ 1:15, 30oC với thời gian xác định Bổ sung H2O2 tỷ lệ 1:3, 30oC, 2 giờ với các nồng độ 0.05% 0.1% 0.2% 0.3% 0.4% 0.5% 0.6% 24 Rửa, lọc, sấy Xác định hiệu suất, độ nhớt và khối lượng phân tử của sản phẩm Chọn nồng độ H2O2 thích hợp Hình 2.5. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định nồng độ H2O2 thích hợp  Mục đích: Xác định nồng độ H2O2 thích hợp để thủy phân chitosan ở trạng thái rắn nhằm thu hồi chitosan phân tử lượng thấp. Thuyết minh quy trình: Cân 2.5 (g) chitosan có kích thước đã được xác định cho vào các bình thí nghiệm. Tiến hành quá trình tiền xử lý, sử dụng nồng độ NaOH xác định với tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v), nhiệt độ 30oC và thời gian xác định. Kết thúc giai đoạn tiền xử lý, các bình thí nghiệm được bổ sung H2O2: tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC, thời gian trong 2 giờ với các nồng độ khác nhau (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6%). Mỗi nồng độ được lặp lại thí nghiệm 3 lần. Sau khi thủy phân xong, mẫu được rửa và lọc thu rắn bằng nước cất đến trung tính rồi đem sấy ở nhiệt độ 50oC đến trạng thái khô ta thu được chitosan sản phẩm. Sản phẩm được xác định độ ẩm nhằm đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định độ nhớt biểu kiến bằng máy đo độ nhớt có bể ổn nhiệt và khối lượng phân tử bằng thiết bị đo độ nhớt nội. Căn cứ vào các kết quả thu được và mục tiêu đề ra, lựa chọn nồng độ H2O2 thích hợp nhất cho quá trình cắt mạch tạo chitosan phân tử lượng thấp. 2.2.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến quá trình tạo chitosan phẩn tử lượng thấp  Bố trí thí nghiệm: Chitosan kích thước xác định Nồng độ NaOH xác định, tỷ lệ 1:15, 30oC với thời gian xác định 25 Bổ sung H2O2 tỷ lệ 1:3, 30oC, nồng độ xác định với các mốc thời gian 30 phút 60 phút 90 phút 120 phút 150 phút 180 phút Rửa, lọc, sấy Xác định hiệu suất, độ nhớt và khối lượng phân tử của sản phẩm Chọn thời gian thủy phân thích hợp Hình 2.6. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định thời gian thủy phân thích hợp  Mục đích: Xác định thời gian thủy phân thích hợp để thủy phân chitosan ở trạng thái rắn nhằm thu hồi chitosan phân tử lượng thấp.  Thuyết minh quy trình: Cân 2.5 (g) chitosan có kích thước đã được xác định cho vào các bình thí nghiệm. Tiến hành quá trình tiền xử lý, sử dụng nồng độ NaOH xác định với tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v), nhiệt độ 30oC và thời gian xác định. Kết thúc giai đoạn tiền xử lý, các bình thí nghiệm được bổ sung H2O2: tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC, nồng độ được xác định ở trên với các mốc thời gian (30, 60, 90, 120, 150, 180 phút). Mỗi thời gian được lặp lại thí nghiệm 3 lần. Sau khi thủy phân xong, mẫu được rửa và lọc thu rắn bằng nước cất đến trung tính rồi đem sấy ở nhiệt độ 50oC đến trạng thái khô ta thu được chitosan sản phẩm. Sản phẩm được xác định độ ẩm nhằm đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định độ nhớt biểu kiến bằng máy đo độ nhớt có bể ổn nhiệt và khối lượng phân tử bằng thiết bị đo độ nhớt nội. Căn cứ vào các kết quả thu được và mục tiêu đề ra, lựa chọn thời gian thủy phân hợp nhất cho quá trình cắt mạch tạo chitosan phân tử lượng thấp. 26 2.2.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến quá trình tạo chitosan phẩn tử lượng thấp  Bố trí thí nghiệm: Chitosan kích thước xác định Nồng độ NaOH xác định, tỷ lệ 1:15, 30oC với thời gian xác định Bổ sung H2O2 thời gian và nồng độ xác định ở 30 oC với các tỷ lệ 1:0.5 1:1 1:2 1:3 1:4 1:5 1:6 Rửa, lọc, sấy Xác định hiệu suất, độ nhớt và trọng lượng phân tử của sản phẩm Chọn tỷ lệ chitosan/H2O2 thích hợp Hình 2.7. Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định tỷ lệ chitosa/H2O2 thích hợp  Mục đích: Xác định tỷ lệ xử lý giữa chitosan và H2O2 thích hợp để thủy phân chitosan ở trạng thái rắn nhằm thu hồi chitosan phân tử lượng thấp.  Thuyết minh quy trình: Cân 2.5 (g) chitosan có kích thước đã được xác định cho vào các bình thí nghiệm. Tiến hành quá trình tiền xử lý, sử dụng nồng độ NaOH xác định với tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v), nhiệt độ 30oC và thời gian xác định. Kết thúc giai đoạn tiền xử lý, các bình thí nghiệm được bổ sung H2O2: nồng độ và thời gian đã được xác định ở trên với các tỷ lệ chitosan/H2O2 khác nhau (1-0.5, 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6) (w/v). Mỗi tỷ lệ được lặp lại thí nghiệm 3 lần và các mẫu thí nghiệm được đặt trên máy lắc trong suốt quá trình thủy phân. Sau khi thủy phân xong, mẫu được rửa và lọc thu rắn bằng nước cất đến trung tính rồi đem sấy ở nhiệt độ 50oC đến trạng thái khô ta thu được chitosan sản phẩm. 27 Sản phẩm được xác định độ ẩm nhằm đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định độ nhớt biểu kiến bằng máy đo độ nhớt có bể ổn nhiệt và khối lượng phân tử bằng thiết bị đo độ nhớt nội. Căn cứ vào các kết quả thu được ở trên và mục tiêu đề ra, lựa chọn tỷ lệ thủy phân chitosan/H2O2 thích hợp nhất cho quá trình cắt mạch ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp. 2.3. Phương pháp phân tích 2.3.1. Xác định khối lượng phân tử chitosan bằng thiết bị đo độ nhớt nội 2.3.2. Xác định độ deacetyl chitosan bằng phương pháp quang phổ (Tao và cộng sự, 2008) 2.3.3. Xác định protein theo phương pháp Microbiuret (Ruth F. Itzhaki và cộng sự, 1964) 2.3.4. Xác định hàm lượng tro tổng số theo TCVN 5405-1990 2.3.5. Xác định hàm lượng ẩm bằng theo TCVN 3700-1990 2.3.6. Xác định độ đục bằng phương pháp đo trên máy HACH 2.3.7. Xác định độ tan của chitosan bẳng phương pháp xác định trọng lượng 2.4. Phương pháp xử lý số liệu Số liệu báo cáo là giá trị trung bình của 3 lần phân tích. Kết quả được xử lý bằng phương pháp thông kê sinh học với sự hỗ trợ của chương trình MS - Excel 2007 và phần mềm xử lý số liệu SPSS. Giá trị của p < 0.05 được xem là có ý nghĩa về mặt thống kê. 28 Chương 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Nguồn chitosan ban đầu Nguồn chitosan cho quá trình nghiên cứu được sản xuất bằng phương pháp hóa học cải tiến dựa theo quy trình sản xuất của PGS. Ts Trang Sỹ Trung năm 2003 với các bước thực hiện như sau: Vỏ tôm Rửa - để ráo Bổ sung HCl 5%, ủ 12 giờ, nhiệt độ phòng, tỷ lệ chitosan/HCl: 1/10 (w/v) Rửa đến trung tính - để ráo Bổ sung NaOH 4%, ủ 24 giờ, nhiệt độ phòng, tỷ lệ chitosan/NaOH: 1/10 (w/v) Rửa đến trung tính - để ráo Bổ sung NaOH 2%, ủ 24 giờ, nhiệt độ phòng, tỷ lệ chitosan/NaOH: 1/10 (w/v) Rửa đến trung tính – để ráo Deacetyl: NaOH 50% (w/w), ủ 8 giờ ở 90oC, tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/10 (w/v) Deacetyl: NaOH 50% (w/w), ủ 8 giờ ở 90oC, tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/10 (w/v) Rửa đến trung tính Phơi khô Chitosan sản phẩm Hình 3.1. Sơ đồ quy trình sản xuất chitosan bằng phương pháp hóa học (Sản xuất tại Phòng thí nghiệm Trường Đại học Nha Trang) Sau khi hoàn thành quá trình sản xuất, chitosan ban đầu được tiến hành kiểm tra các thông số, kết quả được trình bày ở Bảng 3.1. 29 Bảng 3.1. Các thông số chitosan ban đầu Thông số kiểm tra Kết quả Khối lượng phân tử (kDa) 1288 ± 32 Độ nhớt biểu kiến (cP) 1400 ± 40 Độ deacetyl (%) 96.68 ± 2.2 Hàm lượng protein (%) 0.93 ± 0.12 Độ đục (FTU) 7±1 Độ tan (%) 98.87 ± 1.6 Hàm lượng ẩm (%) 11.75 ± 0.8 Hàm lượng tro (%) 0.68 ± 0.04 Trạng thái Dạng vảy Màu sắc Trắng ngà Hình 3.2. Chitosan sản xuất bằng phương pháp hóa học Dựa vào số liệu được trình bày ở Bảng 3.1 cho thấy, sản phẩm chitosan sản xuất bằng quy trình hóa học có khối lượng phân tử được xác định bằng thiết bị đo độ nhớt nội đạt 1288 (kDa), độ nhớt biểu kiến được xác định bằng máy đo độ nhớt đạt 1400 (cP), độ deacetyl xác định theo phương pháp đo quang phổ có kết quả 96.68%, hàm lượng protein xác định bằng phương pháp MicroBiuret đạt 0.93%, sử dụng máy đo độ đục xác định được độ đục của sản phẩm chitosan là 7 (FTU), độ tan được xác định bằng phương pháp ly tâm và sấy cho kết quả 98.87%, hàm lượng ẩm và hàm lượng tro được xác định bằng phương pháp sấy và nung cho kết quả 11.75% và 0.68%. 30 Theo báo cáo tổng kết dự án sản xuất thử nghiệm cấp Bộ sản xuất chitin-chitosan từ phế liệu chế biến thủy sản do PGS.TS Trần Thị Luyến chủ nhiệm năm 2004 cho biết, chitosan sau khi được sản xuất theo các chế độ tối ưu thu được các chỉ tiêu chất lượng như sau: về màu sắc trắng ngà, độ ẩm 8.5%, hàm lượng tro 0.025%, độ nhớt 17.4 oE tương đương với 129.09 (cP), độ tan 98.45%, độ deacetyl 82.07%. So sánh với kết quả đạt được có thể thấy mỗi quy trình sản xuất sẽ có kết quả chitosan đạt được khác nhau, tuy vậy, sản phẩm chitosan được trình bày ở Bảng 3.1 có sự phù hợp về chất lượng chitosan. Theo nghiên cứu của Sun Y và cộng sự năm 2009, chitosan khối lượng phân tử cao được sử dụng cho nghiên cứu quá trình phân phối thuốc qua đường mũi là 850 (kDa). Như vậy, so sánh khối lượng phân tử với nghiên cứu này và độ nhớt biểu kiến với nghiên cứu của Zehui Zhang và cộng sự năm 2009 thì chitosan sản phẩm được sản xuất theo quy trình Hình 3.1. có khối lượng phân tử cao. 3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của chế độ tiền xử lý đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của kích thước chitosan đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 Để xác định được kích thước chitosan thích hợp, thí nghiệm được tiến hành với các kích thước chitosan khác nhau. Trừ dạng vảy ban đầu, các kích thước chitosan được xay bằng máy nghiền mẫu khô để tạo chitosan có kích thước 8 (mm), 4 (mm), 2 (mm), 1 (mm). Hình ảnh về kích thước chitosan ban đầu được thể hiện như sau: Hình 3.3. Chitosan ban đầu với các kích thước khác nhau 31 Các kích thước chitosan nghiên cứu được lặp lại thí nghiệm 3 lần và tiến hành quá trình tiền xử lý với NaOH 0.1%, ở nhiệt độ 30oC, thời gian 3 giờ và tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v). Sau quá trình tiền xử lý, các mẫu kích thước được bổ sung H2O2 0.2%, nhiệt độ 30oC, thời gian 2 giờ và tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v). Mẫu được đặt trên máy lắc trong suốt quá trình thủy phân. Kết thúc quá trình thủy phân, mẫu được rửa và lọc bằng nước cất đến trung tính, đem sấy ở 50oC đến trạng thái khô ta thu được sản phẩm chitosan cắt mạch. Sản phẩm được xác định độ ẩm nhằm đánh giá hiệu suất thu hồi, xác định độ nhớt biểu kiến bằng máy đo độ nhớt có bể ổn nhiệt và khối lượng phân tử bằng thiết bị đo độ nhớt nội. Kết quả được trình bày ở Hình 3.4. và 3.5. Hình 3.4. Ảnh hưởng của kích thước chitosan đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Dựa vào kết quả ở Hình 3.2 cho thấy, kích thước chitosan có ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu hồi và độ nhớt của sản phẩm sau khi cắt mạch. Khi kích thước chitosan giảm 32 dần, khả năng cắt mạch chitosan bằng tác nhân H2O2 càng cao nhưng hiệu suất thu hồi lại giảm dần theo kích thước. Đối với kích thước chitosan dạng vảy, sau quá trình cắt mạch, hiệu suất thu hồi ở kích thước này khá cao và cao nhất so với các kích thước khác đạt 99.51%. Đồng thời, độ nhớt mà sản phẩm đạt được có giá trị là 158.8 (cP) cao hơn so với các kích thước thí nghiệm khác. Khi kích thước chitosan giảm xuống 8 (mm), hiệu suất thu hồi có chiều hướng giảm so với kích thước vảy nhưng không đáng kể đạt 99.16%, tuy nhiên, độ nhớt của sản phẩm ở kích thước này lại giảm xuống một cách rõ rệt từ 158.8 (cP) ở kích thước vảy xuống còn 62.27 (cP) ở kích thước 8 (mm). Tiếp tục với các kích thước 4, 2 và 1 (mm) cho thấy, hiệu suất thu hồi lúc này giảm so với 2 kích thước trên nhưng mức độ giảm không đáng kể khi so sánh giữa 3 kích thước. Về độ nhớt, ở kích thước 4 (mm), độ nhớt sản phẩm đạt được là 51.93 (cP), kích thước 2 (mm) đạt 42.27 (cP) và kích thước 2 (mm) đạt 37.87 (cP). Sau khi xác định khối lượng phân tử, kết quả cho thấy: Hình 3.5. Ảnh hưởng của kích thước chitosan đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) 33 Dựa vào Hình 3.4 cho thấy, kích thước có ảnh hưởng rất lớn đến khối lượng phân tử sau khi cắt mạch. So với khối lượng phân tử ban đầu, sản phẩm sau khi cắt mạch có khối lượng phân tử giảm xuống rất nhiều và giảm dần theo kích thước. Từ 2 kết quả trên có thể nhận định rằng, kích thước chitosan lớn, diện tích bề mặt tiếp xúc giữa chitosan với các gốc tự do của tác nhân cắt mạch nhỏ, vì vậy, quá trình thủy phân chỉ xảy ra ở lớp ngoài của chitosan. Các gốc tự do khó di chuyển để tiếp xúc với các lớp trong của chitosan, gây khó khăn cho quá trình thủy phân. Đối với kích thước chitosan càng nhỏ, khả năng tiếp xúc giữa bề mặt chitosan và các gốc tự do của tác nhân cắt mạch càng cao, vì vậy, quá trình thủy phân diễn ra dễ dàng hơn. Theo nghiên cứu của Vũ Lệ Quyên năm 2012, nghiên cứu này sử dụng kích thước chitosan là (320 - 360) µm, sau khi sử dụng tác nhân cắt mạch H2O2 sản phẩm cắt mạch thu được hiệu suất 93.2% và khối lượng phân tử giảm xuống còn 50 (kDa) từ nguyên liệu chitosan 266 (kDa). Đây là kích thước khá nhỏ trong quá trình xử lý chitosan, kích thước này tốn rất nhiều năng lượng cho quá trình xử lý và có khả năng hao hụt lớn sau khi thu hồi. Đồng thời dựa vào độ nhớt biểu kiến mục tiêu của đề tài, từ kết quả Hình 3.3. cho thấy kích thước 8 (mm) có độ nhớt phù hợp với mục tiêu đề ra. Ở kích thước này, trong lượng phân tử của sản phẩm là 123 (kDa). Theo nghiên cứu của Nalamura và Tomonori năm 1990, chitosan sau khi được cắt mạch với H2O2 có nồng độ từ 0.1 - 20% tạo sản phân chitosan phân tử lượng thấp 260 (kDa). So sánh với kết quả đạt được ta thấy, với khối lượng phân tử 123 (kDa) là kết quả chitosan phân tử lượng thấp phù hợp với nghiên cứu trước. Từ kết quả phân tích trên, để phù hợp với sản phẩm chitosan mục tiêu có độ nhớt từ 50 -100 (cP), đồng thời giảm thiểu tối đa nguồn năng lượng cần sử dụng cho quá trình thủy phân thì kích thước chitosan 8 (mm) là kích thước thích hợp nhất và được lựa chọn làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. 3.2.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ NaOH trong quá trình tiền xử lý đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 34 Quá trình tiền xử lý chitosan là quá trình quan trọng ảnh hưởng tới hiệu quả cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn. vì vậy, tác giả tiến hành nghiên cứu nồng độ NaOH thích hợp cho quá trình tiền xử lý chitosan. Sau khi lựa chọn được kích thước chitosan thích hợp, sử dụng các nồng độ NaOH khác nhau (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6)%, tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v) ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 3 giờ. Kết thúc quá trình tiền xử lý, bổ sung H2O2 0.2%, tỷ lệ chitosan/ H2O2 là 1/3 (w/v), ở nhiệt độ 30oC trong thời gian 2 giờ. Kết quả thí nghiệm được thể hiện ở Hình 3.6. Hình 3.6. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Ở quá trình tiền xử lý của NaOH, nồng độ NaOH khác nhau sẽ cho độ nhớt biểu kiến của sản phẩm khác nhau. Kết quả trên cho thấy, nồng độ NaOH có ảnh hưởng rất lớn đến khả năng cắt mạch chitosan của H2O2. Tuy nhiên, quá trình tiền xử lý bằng NaOH ít ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi của sản phẩm khi sử dụng chitosan kích thước 8 (mm). 35 Hiệu suất thu hồi ở các nồng độ NaOH gần như không có sự sai khác về mặt ý nghĩa thống kê, hiệu suất thu hồi của các nồng độ nằm trong khoảng 98.17 - 98.81%. Từ nồng độ NaOH 0.05 - 0.2%, độ nhớt biểu kiến của chitosan sản phẩm có chiều hướng giảm dần, nhưng khi tiếp tục tăng nồng độ NaOH lên đến 0.6% thì độ nhớt biểu kiến cũng tăng theo. Ở nồng độ 0.05%, sản phẩm cắt mạch có độ nhớt 112.67 (cP), tăng nồng độ lên 0.1%, độ nhớt đạt 88.47 (cP), nồng độ 0.2% có độ nhớt 69.87 (cP), đến nồng độ 0.3% độ nhớt bắt đầu tăng lên với giá trị 135.93 (cP). Khi tăng nồng độ NaOH lên đến 0.6%, độ nhớt sản phẩm đạt tới 167.4 (cP). Với các nồng độ NaOH thí nghiệm, khi kiểm tra khối lượng phân tử, kết quả được thu nhận ở Hình 3.7. Hình 3.7. Ảnh hưởng của nồng độ NaOH đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Khối lượng phân tử có sự khác nhau đối với các nồng độ NaOH khác nhau. Tương tự với độ nhớt biểu kiến, khối lượng phân tử cũng có chiều hướng giảm từ nồng độ NaOH 0.05 - 0.2% và tiếp tục tăng nồng độ thì khối lượng phân tử của sản phẩm cũng tăng theo. Với độ nhớt biểu kiến mục tiêu từ 50 - 100 (cP), kết quả Hình 3.5 cho thấy nồng độ 36 NaOH 0.1% phù hợp với mục tiêu. Đối chiếu với Hình 3.6 khối lượng phân tử của sản phẩm ở nồng độ này đạt được là 155 (kDa). Trong quá trình tiền xử lý chitosan, NaOH là nhân tố giúp cho việc thủy phân các thành phần protein có trong cấu trúc của chitosan được tốt hơn, đồng thời dịch NaOH làm trương nở cấu trúc chitosan dễ dàng cho sự xâm nhập của tác nhân cắt mạch H2O2 vào các vị trí liên kết β-D-1,4-glucoside. Điều này được thể hiện ở nồng độ NaOH 0.05 - 0.2%. Tuy nhiên, khi tăng nồng độ NaOH lên cao (trên 0.3%), cấu trúc của chitosan có khả năng co lại và nồng độ kiềm cao gây khó khăn cho việc xâm nhập vào sâu các liên kết trong cấu trúc chitosan của các gốc tự do, vì vậy làm cho khả năng cắt mạch chitosan diễn ra kém hơn. Do đó, sảm phẩm chitosan ở nồng độ cao có độ nhớt biểu kiến và khối lượng phân tử tăng lên theo nồng độ. Như vậy, so sánh với nghiên cứu của Nalamura và Tomonori năm 1990, cùng với các kết quả nghiên cứu trên và sản phẩm mục tiêu đặt ra cho thấy, NaOH 0.1% là nồng độ thích hợp nhất cho quá trình tiền xử lý nhằm tạo chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2. 3.2.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 Để xác định được thời gian tiền xử lý thích hợp cho quá trình cắt mạch chitosan diễn ra tốt nhất, thí nghiệm được tiến hành với chitosan có kích thước 8 (mm) ở các mốc thời gian (30, 60, 90, 120, 150, 180, 240) phút khi bổ sung NaOH với nồng độ 0.1% được lựa chọn qua thí nghiệm trình bày ở mục 3.2.2. với tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v) và nhiệt độ 30oC. Sau quá trình tiền xử lý, các mẫu chitosan được bổ sung H2O2 0.2%, tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC trong thời gian 2 giờ. Sau khi được rửa đến trung tính, lọc thu hồi phần rắn và sấy ở 50oC đến trạng thái khô thu được được sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp. Sản phẩm được xác định hiệu suất thu hồi, độ nhớt biểu kiến và khối lượng phân tử. Kết quả được trình bày ở Hình 3.8. 37 Hình 3.8. Ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Kết quả Hình 3.5 cho thấy, thời gian tiền xử lý kéo dài cũng làm ảnh hưởng đến độ nhớt biểu kiến của sản phẩm. Tuy nhiên, về hiệu suất thu hồi ở các mốc thời gian khác nhau gần như không có sự sai khác về mặt thống kê, giá trị hiệu suất của các mốc thời gian nằm trong khoảng 98.38 - 98.85%. Với NaOH 0.1%, Khi tăng dần thời gian từ 30 - 180 phút, độ nhớt của sản phẩm cũng giảm dần theo thời gian cho đến khi tăng thời gian lên 240 phút, thì độ nhớt gần như không có sự thay đổi nhiều. Ở thời gian 30 phút, độ nhớt biểu kiến của sản phẩm giảm xuống 134.13 (cP) , khi thời gian lên 150 phút, độ nhớt giảm xuống còn 87.73 (cP), tiếp tục tăng đến 180 và 240 phút thì độ nhớt đạt 74.4 và 72.6 (cP). Song song với kết quả đó, khối lượng phân tử cũng được kiểm tra và kết quả thu được như sau: 38 Hình 3.9. Ảnh hưởng của thời gian tiền xử lý chitosan đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Tương tự với kết quả của độ nhớt biểu kiến, khối lượng phân tử của sản phâm chitosan sau khi được cắt mạch cũng một phần phản ánh được hiệu quả cắt mạch chitosan ở các mốc thời gian tiền xử lý khác nhau. Với độ nhớt biểu kiến là 87.73 (cP) ở thời gian 150 phút, khối lượng phân tử thu được là 158 (kDa), kết quả này gần tương tự với kết quả ở mục 3.2.3. Thời gian kéo dài, các phân tử protein trong mạch chitosan bị phân hủy nhiều hơn bởi NaOH đồng thởi dung dịch NaOH sẽ làm trương nở cấu trúc của mạch chitosan làm cho các gốc tự do của tác nhân H2O2 dễ dàng xâm nhâp vào trong và cắt các liên kết β-D1,4-glucoside. Tuy nhiên, khi tiếp tục tăng thời gian của quá trình tiền xử lý cũng không ảnh hưởng đến cấu trúc chitosan nhiều, vì vậy, quá trình cắt mạch cũng không có sự thay đổi nhiều ở 180 - 240 phút. Như vậy, từ các kết quả nghiên cứu trên và mục tiêu đề ra, nhận thấy thời gian 150 phút thích hợp cho quá trình tiền xử lý chitosan tạo chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2. 39 3.3. Nghiên cứu các chế độ cắt mạch chitosan tạo chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 3.3.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn Nồng độ H2O2 là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả thủy phân và chất lượng của sản phẩm. Để xác định được nồng độ H2O2 thích hợp cho quá trình thủy phân, thí nghiệm được tiến hành với chitosan kích thước 8 (mm), thực hiện quá trình tiền xử lý với dung dịch NaOH đã được xác định các thông số nồng độ 0.1%, tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v), ở nhiệt độ 30 oC trong thời gian 3 giờ. Tiếp theo, các mẫu chitosan được bổ sung H2O2 tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC trong thời gian 2 giờ với các nồng độ H2O2 khác nhau (0.05, 0.1, 0.2, 0.3, 0.4, 0.5, 0.6)%. Sản phẩm chitosan sau khi cắt mạch thu được kết quả như sau: Hình 3.10. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Từ kết quả ở Hình 3.7 cho thấy, hiệu suất thu hồi ở các nồng độ H2O2 không có sự sai khác về mặt thống kê, giá trị hiệu suất nằm trong khoảng 98.87 - 99.30%. Về độ nhớt 40 có sự khác nhau giữa các nồng độ và giảm mạnh từ 0.05 - 0.2% H2O2, từ nồng độ 0.3 0.6% độ nhớt có xu hướng giảm nhưng rất ít. Khi nồng độ H2O2 được sử dụng ở 0.05%, độ nhớt của sản phẩm đạt được 176.67 (cP), nồng độ 0.1% sản phẩm có độ nhớt 122.73 (cP), nồng độ 0.2% độ nhớt giảm xuống còn 60.4 (cP), tiếp tục tăng nồng độ từ 0.4 - 0.6% độ nhớt sản phẩm giảm xuống 42.47 25.8 (cP). Kết quả khối lượng phân tử của sản phẩm chitosan sau quá trình cắt mạch cũng được thể hiện như Hình 3.13. Hình 3.11. Ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Nồng độ H2O2 càng cao, khối lượng phân tử chitosan càng giảm, từ chitosan gốc có khối lượng phân tử là 1288 (kDa) sau quá trình cắt mạch khối lượng phân tử ở nồng độ thấp nhất 0.05% H2O2 là 275 (kDa), cho đến nồng độ H2O2 0.6%, khối lượng phân tử đạt 64 (kDa) gần bằng với nồng độ 0.5% H2O2 đạt 65 (kDa). Như vậy, khi ta tăng nồng độ H2O2 (0.05 - 0.5%) khả năng cắt mạch chitosan tăng nhưng nếu tiếp tục tăng (0.6%) thì độ giảm trọng lượng phân tử không còn đáng kể. Và với độ nhớt mục tiêu mà nồng độ H2O2 41 0.2% đạt được từ kết quả của Hình 3.9 thì khối lượng phân tử tương ứng của sản phẩm này là 163 (kDa). Dựa vào cơ chế thủy phân chitosan bằng H2O2 được trình bày ở Chương 1 nhận thấy, hiệu quả của quá trình thủy phân phụ thuộc rất lớn vào sự có mặt của các gốc tự do HO*, Khi nồng độ H2O2 thấp (0.05 - 0.1%) lượng gốc tự do tạo ra không đủ nhiều để tham gia vào phản ứng cắt mạch, nên quá trình cắt mạch chỉ xảy ra ở một số vị trí của mạch chitosan. Vì vậy, sản phẩm tạo thành có mạch phân tử còn khá dài, nên độ nhớt sản phẩm còn cao. Khi nồng độ H2O2 đủ lớn (0.2 - 0.3%), gốc tự do HO* tạo thành đủ để phản ứng với các phân tử chitosan cho tạo sản phẩm có độ nhớt thấp trong khoảng 50 - 100 (cP). Và khi nồng độ H2O2 lên đến 0.5 - 0.6% thì cho thấy sản phẩm gần như có độ nhớt không thay đổi nhiều. So sánh với nghiên cứu của Vũ Lệ Quyên năm 2012, nồng độ mà nghiên cứu này sử dụng là 1.5% và không có quá trình tiền xử lý, như vậy nồng độ này cao hơn rất nhiều để tạo ra chitosan phân tử lượng thấp. Mà thí nghiệm trên cho thấy ở nồng độ 0.2% H2O2 cũng có thể tạo ra chitosan phân tử lượng thấp mà khi tăng ở nồng độ cao là không cần thiết. Đồng thời theo nghiên cứu của Hiroi, Osamu, Kawahata, Kazuo năm 1979 cho thấy, khi sử dụng H2O2 0.007 - 0.35% cho quá trình cắt mạch chitosan thì sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp đạt được là 240 (kDa). Như vậy, để sản xuất chitosan phân tử lượng thấp có độ nhớt mục tiêu từ 50 - 100 (cP) và nhằm hạn chế lượng hóa chất bổ sung vào phản ứng thì nồng độ H2O2 0.2% tạo sản phẩm chitosan có độ nhớt 60.4 (cP) và khối lượng phân tử 163 (kDa) cho thấy sự phù hợp với mục tiêu đề ra và các nghiên cứu trước. 3.3.2. Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 Tiếp tục với nghiên cứu xác định thời gian của quá trình thủy phân, mẫu chitosan có kích thước 8 (mm) được thực hiện quá trình tiền xử lý với NaOH 0.1%, tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v), nhiệt độ 30oC trong thời gian 3 giờ, sau đó tiến hành quá trình cắt mạch với H2O2 nồng độ 0.2% đã lựa chọn được qua thí nghiệm mục 3.3.1. tỷ lệ 42 chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v), nhiệt độ 30oC với các mốc thời gian khác nhau (30, 60, 90, 120, 150, 180 phút). Sản phẩm được xác định hiệu suất thu hồi, độ nhớt biểu kiến và khối lượng phân tử. Kết quả được thể hiện ở Hình 3.12. và 3.13. Hình 3.12. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Kết quả thu được cho thấy, hiệu suất thu hồi của các mốc thời gian thủy phân không có sự sai khác về mặt thống kê, giá trị đạt được nằm trong khoảng 98.44 - 98.76%. Độ nhớt biểu kiến có chiều hướng giảm khi tăng thời gian thủy phân. Ở thời gian 30 - 150 phút, độ nhớt biểu kiến giảm mạnh và sau khi tiếp tục tăng thời gian thì độ nhớt gần như không có sự thay đổi nhiều. Tại thời gian 30 phút, độ nhớt biểu kiến của sản phẩm ở 195.4 (cP), khi tăng thời gian lên 90 phút, độ nhớt giảm xuống 115.33 (cP), thời gian lên 120 phút, độ nhớt lúc này là 67 (cP), nếu tiếp tục tăng thời gian lên 150 và 180 phút thì độ nhớt đạt giá trị có sự thay đổi không đáng kể là 37.13 và 35.4 (cP). Sau khi xác định trọng lượng phân tử, kết quả cho thấy: 43 Hình 3.13. Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Thời gian thủy phân cũng ảnh hưởng rất lớn đến khối lượng phân tử của sản phẩm giống như độ nhớt. tại thời điểm 120 phút, độ nhớt biểu kiến của sản phẩm đạt 67 (cP) thì khối lượng phân tử thu nhận được là 105 (kDa). Theo thời gian phản ứng, khi tăng thời gian các gốc tự do HO* tạo ra được nhiều hơn gây ra sự phân cắt mạch mạnh mẽ hơn. Khi thủy phân chitosan ở trạng thái rắn, gốc tự do HO* xâm nhập từ ngoài vào trong nên phản ứng thủy phân sẽ diễn ra khá chậm, nếu thời gian thủy phân quá ngắn, phản ứng chỉ xảy ra ở lớp ngoài cùng nên chitosan thu được có độ nhớt còn cao (195.4 cP) và khối lượng phân tử là 318 (kDa). Tiếp tục tăng thời gian phản ứng, thì khả năng cắt mạch diễn ra tốt hơn cho đến tại thời điểm 180 phút thì khả năng cắt mạch gần như không đáng kể. Như vậy, tại thời điểm 120 phút là thời gian thích hợp nhất cho quá trình thủy phân tạo sản phẩm chitosan mục tiêu. So với nghiên cứu của Đỗ Thị Liền, Vũ Lệ Quyên [3, 6] cho thấy, đây là thời gian nhỏ hơn rất nhiều mà vẫn có thể tạo chitosan phân tử lượng thấp nhờ có sự hỗ trợ của quá trình tiền xử lý chitosan. 44 3.3.3. Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 Tỷ lệ bổ sung H2O2 cho phản ứng thủy phân chitosan là yếu tố khá quan trọng tránh ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm và giảm thiểu được lượng hóa chất cần thiết. Để xác định được tỷ lệ thủy phân thích hợp, thí nghiệm sử dụng chitosan kích thước 8 (mm), với quá trình tiền xử lý dung dịch NaOH 0.1%, tỷ lệ chitosan/NaOH là 1/15 (w/v), nhiệt độ 30 oC trong thời gian 3 giờ. Tiếp tục tiến hành quá trình cắt mạch bằng H2O2 ở nồng độ 0.2% và thời gian 2 giờ đã được xác định ở thí nghiệm trên, ở nhiệt độ 30oC với các tỷ lệ chitosan/H2O2 khác nhau (1-0.5, 1-1, 1-2, 1-3, 1-4, 1-5, 1-6) (w/v). Sau quá trình thủy phân, các mẫu thí nghiệm được rửa đến trung tính, lọc bằng màng lọc để loại bỏ phần dịch, thu lấy phần rắn và đem sấy ở tủ sấy với nhiệt độ 500C đến trạng thái khô ta thu được sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp. Sản phẩm được xác định hiệu suất thu hồi, độ nhớt biểu kiến và khối lượng phân tử cho kết quả như sau: Hình 3.14. Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến độ nhớt biểu kiến (cP) và hiệu suất thu hồi (%) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) 45 Từ tất cả các kết quả đã thu nhận được cho thấy, chitosan có kích thước 8 (mm) với các yếu tố về quá trình tiền xử lý, nồng độ H2O2, thời gian thủy phân và tỷ lệ chitosan/H2O2 của quá trình thủy phân, không làm ảnh hưởng nhiều đến hiệu suất thu hồi của sản phẩm. Tỷ lệ chitosan/H2O2 có ảnh hưởng đến sự thay đổi độ nhớt của sản phẩm, tỷ lệ này càng cao thì độ nhớt càng giảm dần và khi tỷ lệ này đạt tới ngưỡng thì độ nhớt giảm không còn đáng kể. Nhìn vào Hình 3.11 cho thấy, khi tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/0.05 (w/v) thì độ nhớt của sản phẩm là 265.57 (cP), cho đến khi tăng tỷ lệ lên 1/3 (w/v) thì độ nhớt sản phẩm giảm xuống còn 83.07 (cP), tiếp tục tăng tỷ lệ độ nhớt cũng giảm theo đến 37.67 (cP) ở tỷ lệ 1/6 (w/v). Với kết quả độ nhớt trên, khối lượng phân tử của sản phẩm cũng cho thấy sự tương quan: Hình 3.15. Ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/H2O2 đến khối lượng phân tử (kDa) của sản phẩm sau khi cắt mạch Giá trị được trình bày là giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn, các chữ cái khác nhau chỉ sự khác biệt có ý nghĩa thống kê (p < 0.05) Kết quả hình 3.14 cho thấy, khi tăng tỷ lệ chitosan/H2O2 sẽ làm tăng khả năng cắt mạch chitosan để tạo chitosan phân tử lượng thấp. Độ giảm khối lượng phân tử theo tỷ lệ có chiều hướng tương tự với độ nhớt biểu kiến. Ở tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v) có độ 46 nhớt là 83.07 (cP) thì khối lượng phân tử đạt được là 147 (kDa), kết quả này phù hợp với các nghiên cứu trước. Theo cơ chế cắt mạch chitosan của H2O2 ở trạng thái rắn, các gốc tự do tạo ra phải đủ lớn để có thể xâm nhập được hết vào các liên kết của phân tử chitosan ở thời gian và nồng độ nhất định. Tức là lượng H2O2 bổ sung vào phản ứng cắt mạch chitosan phải được phân bố đều trong dịch thủy phân. Như vậy, tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v) là tỷ lệ thích hợp cho quá trình thủy phân chitosan ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp có độ nhớt mục tiêu. 3.4. Đề xuất quy trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 Sau khi nghiên cứu toàn bộ các chế độ thủy phân chitosan ở trạng thái rắn để tạo chitosan phân tử lượng thấp, từ các kết quả đã thu được phù hợp với mục tiêu đề ra, tôi đề xuất quy trình tối ưu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 như sau: Chitosan NaOH 0.1%, tỷ lệ 1:15, 30 oC , thời gian 150 phút H2O2 0.2%, tỷ lệ 1:3, 30oC , thời gian 120 phút Lọc Bỏ dịch Thu rắn Rửa đến trung tính Sấy ở nhiệt độ 50 oC Sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp Hình 3.16. Đề xuất quy trình tối ưu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 47 Với quy trình này, sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp được đánh giá và so sánh với chitosan ban đầu cho thấy kết quả như sau Bảng 3.2. Thông số chitosan ban đầu và sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp Kết quả Thông số chitosan Chitosan ban đầu Chitosan PTLT Khối lượng phân tử (kDa) 1288 ± 32 152 ± 23 Độ nhớt biểu kiến (cP) 1400 ± 40 83 ± 4.2 Độ deacetyl (%) 96.68 ± 2.2 96.32 ± 3.4 Hàm lượng protein (%) 0.93 ± 0.12 0.78 ± 0.16 7±1 4±1 Độ tan (%) 98.87 ± 1.6 98.96 ± 1.36 Hàm lượng ẩm (%) 11.75 ± 0.8 8.77 ± 0.42 Hàm lượng tro (%) 0.68 ± 0.04 0.36 ± 0.02 Kích thước (mm) Dạng vảy 8 Màu sắc Trắng ngà Trắng ngà Độ đục (FTU) Hình ảnh trước và sau khi cắt mạch được thu nhận: Hình 3.17. Chitosan ban đầu và chitosan phân tử lượng thấp 48 Từ kết quả thu được ở Bảng 3.2. cho thấy, chitosan phân tử lượng thấp sau khi được cắt mạch có các thông số về khối lượng phân tử, độ nhớt, độ đục, hàm lượng protein, hàm lượng khoáng… giảm hơn nhiều so với chitosan ban đầu, sản phẩm chitosan tạo ra có màu sắc trắng sáng. So sánh với các kết quả nghiên cứu của Đỗ Thị Liền năm 2008 và Vũ Lệ Quyên năm 2012 đều cho thấy sự phù hợp về các thông số mà sản phẩm đạt được. Khi so sánh giữa phương pháp sử dụng tác nhân H2O2 và một số hóa chất khác để sản xuất chitosan phân tử lượng thấp cho thấy, theo nghiên cứu của Zamani và Taherzadeh năm 2010, khi sản xuất chitosan phân tử lượng thấp bằng tác nhân H2SO4 tạo ra chitosan có khối lượng phân tử là 174 (kDa) đạt hiệu suất 82% từ chitosan 1388 (kDa) trong điều kiện thủy phân ở 120oC, nồng độ 72 mM với thời gian 30 phút. Điều kiện này có sự tác động rất lớn bởi nhiệt độ, như vậy sản phẩm tạo thành dễ bị ảnh hưởng về mặt tính chất. Ngoài ra, với nghiên cứu của Kittur và cộng sự năm 2003, Varum và cộng sự năm 2001, các nghiên cứu này đã sử dụng HCl cho quá trình thủy phân chitosan, cách tiếp cận này được cho là tăng khả năng thủy phân nhưng lại dễ xảy ra hiện tượng phá vòng chitosan. Mặt khác, khi thủy phân chitosan bằng các tác nhân H2SO4, HCl hay một số tác nhân hóa học khác phải thực hiện ở trạng thái lỏng, điều này dẫn đến khó khăn cho quá trình tinh sạch sản phẩm và lượng hóa chất tạo ra có nguy cơ ô nhiễm môi trường cao. Như vậy, sản xuất chitosan phân tử lượng thấp bằng tác nhân H2O2 ở trạng thái rắn cho thấy hiệu quả về mặt thu hồi, ít gây ảnh hưởng đến chất lượng sản phẩm, giảm thiểu chi phí sản xuất, ít gây ô nhiễm môi trường… Từ các phân tích trên có thể cho thấy, phương pháp thủy phân chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 là phương pháp đơn giản và tối ưu cho quá trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp. 49 Chương 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận Chitosan phân tử lượng thấp có thể sản xuất bằng phương pháp thủy phân chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2. Hiệu suất quá trình phân cắt đạt cao nhất khi chitosan được tiền xử lý cơ học đến kích thước 8 mm và ngâm trong NaOH 0,1% với thời gian 150 phút trước khi thực hiện quá trình phân cắt được tiến hành bằng H2O2 0,2% trong thời gian 120 phút với tỷ lệ chitosan/H2O2 là 1/3 (w/v). Sản phẩm chitosan phân tử lượng thấp thu tử quy trình cắt mạch bằng phương pháp rắn với tác nhân H2O2 có phân tử lượng 152 (kDa), độ nhớt biểu kiến 83 (cP). 4.2. Kiến nghị Cần phân tích thêm các chỉ tiêu chất lượng của chitosan như XRay, FTIR để đánh giá tác động của quá trình cắt mạch đến cấu trúc phân tử và độ rắn của sản phẩm chitosan. 50 TÀI LIỆU THAM KHẢO  Tài liệu Tiếng Việt 1. Nguyễn Trọng Bách (2004), Nghiên cứu sản xuất màng bảo quản thực phẩm từ chitosan phối hợp phụ liệu, Luân văn Thạc sỹ kỹ thuật, Đại học Nha Trang. 2. Lưu Văn Chính, Châu Văn Minh, Phạm Hữu Điển, Vũ Mạnh Hùng, Ngô Thị Thuận (2000), Tổng hợp và nghiên cứu tác dụng hạ Cholesterol máu của N, N-Trimetylchitosan, Tạp chí Dược học, số 9. 3. Đỗ Thị Liền (2008), Nghiên cứu cắt mạch chitosan bằng hydroperoxide và thử nghiệm khả năng kháng khuẩn của chúng, Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật, Đại học Nha Trang. 4. Đỗ Hải Lưu (2009), Nghiên cứu ảnh hưởng của chitosan, chitosan oligosaccharide đến một số vi sinh vật gây bệnh trên cá Sòng bảo quản bằng nước đá và đề xuất công nghệ bảo quản sau thu hoạch, Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật, Đại học Nha Trang. 5. Trần Thị Luyến và cộng sự (2007), Nghiên cứu sản xuất oligosaccharide từ chitinchitosan bằng enzyme, Báo cáo khoa học đề tài cấp trường, Mã số Tr.2006-33-10. 6. Vũ Lệ Quyên (2012), Nghiên cứu quy trình cắt mạch chitosan trạng thái rắn bằng hydroperoxide để sản xuất chitosan có phân tử lượng thấp, Luận văn Thạc sỹ kỹ thuật, Đại học Nha Trang. 7. Phạm Thị Đan Phượng, Phạm Thị Minh Hải, Trang Sỹ Trung, Trình Văn Liễn, Ngô Văn Lực (2008), Xử lý carotenoprotein thu hồi từ quá trình sản xuất chitin và bước đầu thử nghiệm phối trộn trong thức ăn cá, Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản, 2, 37-43. 8. Trang Sỹ Trung, Phạm Thị Đan Phượng (2005), Nghiên cứu ứng dụng chitosan trong việc làm giảm độ phân rã thức ăn tôm, Tạp chí Khoa học-Công nghệ Thủy sản, 4, 18-22. 9. Trang Sỹ Trung, Trần Thị Luyến, Nguyễn Anh Tuấn, Nguyễn Thị Hằng Phượng (2010), Chitin - chitosan từ phế liệu thủy sản và ứng dụng, Nhà xuất bản Nông nghiệp. 51  Tài liệu Nước Ngoài 10. Allan, G.G.and Peyron, M (1995), Molecular weight manipulation of chitosan I Kinetics of depolymerization by nitrious acid, Carbohydrate Research 277, pp.257272. 11. Byung - Ok Jung, Chun - Ho Kim, Kyu - Suk Choi, Young Moo Lee, Jae - Jin Kim (1999), Preparation of amphiphilic chitosan and their antimicrobila activities, Polyme Science, vol. 72, 1713 - 1719. 12. Chandrkrachang, S. (2002) The applications of chitin and chitosan in agriculture in Thailand. Advances in Chitin Science, Vol. 5, pp. 458. 13. Chang, L.B., Tai, M.C. and Cheng, F (2001), Kinetics and products of the degradation of chitosan by hydrogen peroxide, Journal of Agriculture Food Chemistry 49, pp. 4845-4851 14. Dodane, V., Vilivalam, V. D. (1998), Pharmaceutical applications of chitosan, PSTT, 1, 6, 246-253. 15. Deidra Shannon Lyons (2001), Depolymerization of Chitosan by High Pressure Homogenization and the Effect on Antimicrobial Properties, ScienceDirect 16. Dzung, N.A. (2009), Research on impact of application of chitosan and chitosan oligomer on biophysical characteristics, growth, development and drought resistance of coffee, Proceedings of The 11th International Conference on chitin and chitosan & The 8th Asia-Pacific chitin and chitosan Symposium. Taiwan. 17. Emmanuel Belamie, Alain Domard, Marie - Madeleine Giraud - Guille (1997), Study of the solid – state hydrolysis of chitosan in presense of HCl, Polyme Science Volume 35, pp. 3181-3191. 18. Feng Tian, Yu Liu, Keao Hu and Binyuan Zhao (2003), Study of the depolymerization behavior of chitosan by hydrogen peroxide, Carbohydrate Polimers, Volume 57, pp. 31-37. 19. Feng Tian, Yu Liu, Keao Hu, Bintuan Zhao (2003), The depolymerization mechanism of chitosan by hydrogen peroxide, Journal of materials science 38, 47094712. 20. Guibal, E., 2004. Interactions of metal ions with chitosan-based sorbents: a review, Sep. Purif. Technol, 38, 43-74. 21. I.M. Helander, E. - L. Nurmiaho - Lassila, R. Ahvenainen, J. Rhoades, S.Roller (2001), Chitosan disrupts the barrier properties of the outer membrane of gramnegative bacteria, Journal of Food Microbiology 71, pp. 235- 244. 52 22. Hirano, S. (1996), Chitin biotechnology application, Biotechnology Annual Review, 2, 237-258. 23. Jaroslaw M. Wasikiewicz, Fumio Yoshii, Naotsugu Nagasawa, Radoslaw A. Wach, Hiroshi Mitomo (2005), Degradation of chitosan anh sodium alginate by gamma radiation, sonochemical and ultraviolet methods, Radiation Physics and Chemistry Volume 73, Issue 8, pp. 287-295. 24. Jiang, Y., Li, Y., 2001. Effects of chitosan coating on postharvest life and quality of longan fruit, Food Chemistry, 73, 139-143. 25. Jiang, Y., Li, J., Jiang, W. (2005), Effects of chitosan coating on shelf life of coldstored litchi fruit at ambient temperature, LWT, 38, 757-761. 26. Juan Carlos Cabrera, Pierre Van Cutsem (2005), Preparation of chitooligosaccharides with degree of polymerization higher than 6 by acid or enzymeatic degradation of chitosan, Biochemical Engineering Journal 25, pp. 165172. 27. Kim, C. Y., Choi, H. M. and Cho, H. T. (1997) Effect of deacetylation on sorption of dyes and chromium on chitin, Journal of Applied Polymer Science, 63, 725-736. 28. Knorr, D. (1983), Dye Binding Properties of Chitin and Chitosan, Journal of Food Science, 48, 36-41. 29. Luan, L. Q., Nagasawa, N., Tamada, M. (2006), Enhancement of plant growth activity of irradiated chitosan by molecular weight fractionation, Radioisotopes, 55, 21-27. 30. Nguyen Ngoc Duy, Dang Van Phu, Nguyen Tue Anh, Nguyen Quoc Hien (2011), Synergistic degradation to prepare oligochitosan by γ- irradiation of chitosan solution in the presence of hydrogen peroxide, Radiation Physics and Chemmistry 80, pp. 848 – 853. 31. N. N. Kabal’ Nova, K. Yu. Murinov, I. R. Mullagaliev, N.N. Krasnogorskaya, V. V. Shereshovets, Yu. B Monakov, G. E. Zikov (2001), Oxidative destruction of chitosan under the effect of Ozone and hydrogen peroxide, Polymer Science, Volume 81, pp. 875-881. 32. Pinotti, A., Bevilacqua A., Zaritzky, N. (1997), Optimization of the flocculation stage in a model system of a food emulsion waste using chitosan as polyelectrolyte, Journal of Food Engineeering, 32, 69-81. 53 33. Shahidi, F., Abuzaytoun, R. (2005), Chitin, chitosan, and co-products: chemistry, production, applications, and health effects, Advances in Food and Nutrition Research, 49, 93-135. 34. Shirui Mao, Xintao Shuai, Florian Unger, Michael Simon, Dianzhou Bi, Thomas Kissel (2004), The depolymerization of chitosan: effects on physicochemical and biological properties, International Journal of Pharmaceutics, 281 (2004) 45-54 35. Varma, A.J., Deshpandey, S.V., Kennedy, J.F. (2004), Metal complexation by chitosan and its derivatives: a review, Carbohyd. Polyme., 55, 77-93 36. Zehui Zhang, Changzhi Li, Qian Wang, Zongbao K. Zhao (2009), Efficient hydrolysis of chitosan in ionic liquids, Carbohydrate Polymers, 78, 685–689. 37. Zhishen Jia and Dongfeng Shen (2002), Effect of reaction temperature and reaction time on the preparation of low-molecular-weight chitosan using phosphoric acid, Carbohydrate Polymers, Volume 49, Issue 4, pp. 393-396.  Tài liệu Website 38. Nguyễn Hữu Đức, Hồ Thị Tú Anh (2005), Bước đầu nghiên cứu tác dụng kháng khuẩn Helicobacter pylori của chitosan, Nguồn tin trên trang web http://www.ykhoa.net ngày 26/04/2005. 39. http://doan.edu.vn/do-an/de-tai-tim-hieu-ve-chi-tin-chitosan-5928/ 40. http://www.fistenet.gov.vn/thong-ke-tinh-hinh-san-xuat-thuy-san-nam-2014/ 41. http://www.slideshare.net/cnshk31/du-an-san-xuat-chitin-va-chitosan-tu-phe-lieu 42. http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/18951272 PHỤ LỤC Phụ lục 1. Các phương pháp phân tích chính sử dụng trong đề tài 1. Xác định hàm lượng ẩm Cốc sấy được sấy khô ở nhiệt độ 105oC trong khoảng 16 giờ đến khối lượng không đổi, sau đó đặt vào bình hút ẩm để làm nguội. Cân cốc để xác định khối lượng của cốc sấy là W1. Mẫu sấy được cho vào cốc ta cân được khối lượng W2. Sấy mẫu và cốc ở 105 oC trong khoảng 16 giờ đến khối lượng không đổi, sau đó lấy mẫu và cốc cho vào bình hút ẩm để làm nguội. Cân mẫu và cốc xác định khối lượng W3. Tất cả các khối lượng được tính ở đơn vị gram. Hàm lượng ẩm được tính theo công thức: W 2 W3 % Hàm lượng ẩm =   * 100%  W 2  W1  2. Xác định hành lượng tro Cốc nung được sấy khô ở nhiệt độ 105oC trong khoảng 16 giờ đến khối lượng không đổi, sau đó đặt vào bình hút ẩm để làm nguội. Cân cốc để xác định khối lượng của cốc nung là W1. Mẫu nung được cho vào cốc ta cân được khối lượng W2. Nung mẫu và cốc ở 660 oC trong khoảng 16 giờ đến khối lượng không đổi, sau đó lấy mẫu và cốc cho vào bình hút ẩm để làm nguội. Cân mẫu và cốc xác định khối lượng W3. Tất cả các khối lượng được tính ở đơn vị gram. Hàm lượng tro được tính theo công thức: W 3  W1  %Hàm lượng tro =   * 100%  W 2  W1  3. Xác định khối lượng phân tử của chitosan - Pha đệm acid acetic 0.25M/sodium acetate 0.25M. - Chitosan được hòa tan trong dung dịch đệm, lọc qua màng lọc có kích thước 5µm và pha loãng thành các nồng độ khác nhau có tỷ lệ chitosan/dung dịch đệm lần lượt là: (44, 5-3, 6-2, 7-1, 8-0) (v/v). Hút 4 (ml) lần lượt từ dung môi đến các nồng độ chitosan cho vào thiết bị đo độ nhớt nội AVS - 470 để xác định thời gian chảy của dịch chitosan qua ống mao quản ở nhiệt độ 25oC. Thời gian chảy của dung môi và các nồng độ chitosan được thay vào công thức để xác định độ nhớt tương đối (r), độ nhớt riêng (sp), độ nhớt nội (g). Công thức được tính như sau: Độ nhớt tương đối:  r   t   0 t0 Độ nhớt riêng:  sp   r  1 Độ nhớt nội:  g  lim C 0 Trong đó:  sp C 0 : Độ nhớt dung môi : Độ nhớt dung dịch chitosan t0 : Thời gian chảy của dung môi t: Thời gian chảy của dung dịch chitosan r : Độ nhớt tương đối  sp : Độ nhớt riêng g : Độ nhớt nội Vẽ đồ thị tương quan giữa độ nhớt nội và nồng độ chitosan, từ đố xác định độ nhớt nội của chitosan, thay độ nhớt nội vào Phương trình Mark-Hauwink-Sakurada sau để xác định khối lượng phân tử (M):    KM g a v Với K và a là hằng số cho hệ thống chất tan-dung môi và nhiệt độ. 4. Xác định hàm lượng protein theo phương pháp Micro Biuret - Hàm lượng protein được xác định dựa trên đường chuẩn protein. Chuẩn bị mẫu: ngâm 1 g mẫu chitosan khô trong dung dịch NaOH 3% với tỷ lệ 1/10 (w/v) sau đó ủ ở 80oC trong 8 giờ. Sau khi ủ, phần bã và phần dịch lỏng được tách biệt bằng lọc chân không, phần dịch lọc được làm đầy đến một thể tích xác định bằng nước cất (V1) ta được dung dịch protein. Để dựng đường chuẩn protein, chuẩn bị dung dịch protein chuẩn (BSA) với hàm lượng 10 mg/ml và 6 ống nghiệm, cho vào mỗi ống nghiệm lần lượt 0, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 ml dung dịch protein chuẩn trên, thêm nước cất vào lần lược 6 ống trên với lượng như sau 1, 0.8, 0.6, 0.4, 0.2, 0 ml. Tiếp tục thêm 200µl thuốc thử Micro Biuret đã được chuẩn bị, lắc đều rồi ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, dung dịch trên được xác định độ hấp thụ quang học ở bước sóng 330 nm. Dựa vào mối tương quan giữa hàm lượng protein và độ hấp thụ quang học (absorbance) để thiết lập phương trình đường chuẩn protein. Phương trình đường chuẩn protein có dạng: Y  a * X  b (1) Trong đó: - Y: Độ hấp thụ quang học tại bước sóng 330 nm. X: Hàm lượng protein (mg/ml). a, b: Hệ số. Xác định hàm lượng protein trong mẫu: lấy 10 ml dịch lọc trên, tiến hành lọc lần 2 qua giấy lọc Whatman filter paper No 1. Lấy 1 ml dịch sau khi lọc lần 2 bổ sung thêm 200 µl thuốc thử Micro Biuret đã được chuẩn bị, lắc đều rồi ủ 15 phút ở nhiệt độ phòng. Sau khi ủ, tiến hành đo độ hấp thụ quang học của dung dịch ở bước sóng 330nm, ta xác định được giá trị Ym. Thay giá trị Ym vào công thức ở phương trình (1) ta tính được giá trị Xm. - Kết quả hàm lượng protein được xác định theo công thức: % protein  Vl ( ml ) * X m (mg / ml ) * 100 W ( g ) * 1000( mg / g ) Trong đó: Vl: Thể tích dịch lọc (ml) Xm : Hàm lượng protein trong 1 ml dịch lọc (mg/ml) W: Khối lượng mẫu (g). 1000: Hệ số chuyển đổi giữa g và mg. 5. Xác định độ deacetyl chitosan bằng phương pháp đo quang phổ - Để xác định được độ deacetyl, trước hết phải xây dựng đường chuẩn N-acetyl glucosamine bằng cách hòa tan 0.1105 g N-acetyl glucosamine trong 10 ml H3PO4 thu được dung dịch có nồng độ 0.05M, lấy 2 ml dung dịch trên và thêm 98 ml nước cất thu được dung dịch có nồng độ 0.001M. Pha dung môi với 1 ml H3PO4 với 99 ml nước cất. Chuẩn bị 7 ống nghiệm, mỗi ống lặp lại 3 lần, từ dung dịch trên pha thành các dung dịch lần lượt là 5, 4.5, 4, 3, 2, 1, 0 ml dung môi và 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0.8, 1 ml dung dịch 0.001M. Sau khi có dãy nồng độ tiến hành đo OD ở bước sóng 210 nm để xây dựng đường chuẩn N-acetyl glucosamine. - Xác định độ deacetyl của mẫu chitosan: hòa tan 100 mg chitosan trong 20 ml H3PO4 85%, khấy đảo ở 60oC trong vòng 40 phút. Lấy 10 ml dung dịch này định mức đến 100 ml bằng nước cất, ủ sung dịch trên trong 2 giờ ở 60 oC sau đó, đo OD với bước sóng 210 nm. Từ kết quả đo được, thay vào đường chuẩn N-acetyl glucosamine để tính ra lượng N-acetyl glucosamine có trong mẫu chitosan. - Kết quả độ deacetyl được tính bằng công thức:   molGlcNAC  DD  100 * 1   molGclNAC  molGcl   molGcl  w   molGclNAC * 0 .20321  0 .16117 Trong đó: W: khối lượng khô tuyệt đối µmol Gcl NAC: hàm lượng N-acetyl glucosamine xác định theo đường chuẩn µmolGcl: hàm lượng glucosamine Phụ lục 2. Kết quả thí nghiệm xác định thông số cho quá trình thủy phân chitosan ở trạng thái rắn bằng tác nhân H2O2 để tạo chitosan phân tử lượng thấp Bảng P2.1. Ảnh hưởng của kích thước chitosan đến hiệu suất thu hồi, độ nhớt biểu kiến và khối lượng phân tử Kích thước chitosan Hiệu suất (%) Độ nhớt biểu kiến (cP) KLPT(kDa) Vảy 99.51 ± 0.18b 158.8 ± 1.78e 230 ± 41e 8 (mm) 99.17 ± 0.24ab 62.67 ± 0.83d 123 ± 15d 4 (mm) 98.43 ± 0.30a 51.93 ± 0.41c 110 ± 23c 2 (mm) 98.41 ± 0.34a 43.27 ± 0.14b 82 ± 11b 1 (mm) 98.31 ± 0.28a 37.87 ± 0.70a 65 ± 13a Kết quả tính trên lượng chất khô tuyệt đối. Các giá trị trung bình của cột có các ký tự khác nhau thì khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê (p[...]... mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 - Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 - Nghiên cứu ảnh hưởng của thời gian xử lý đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 - Nghiên cứu ảnh hưởng của tỷ lệ chitosan/ H2O2 đến khả năng cắt mạch chitosan ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 Tính mới của đề tài: Thủy phân. .. tài: Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp bằng phương pháp thủy phân ở trạng thái rắn với tác nhân H2O2 được tiến hành Mục đích của đề tài: nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp tiết kiệm, đơn giản, nhằm tăng hiệu quả về mặt kinh tế đồng thời đảm bảo được chất lượng và hoạt tính sinh học của chitosan Nội dung của đề tài: - Nghiên cứu ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý chitosan. .. phân chitosan ở trạng thái rắn là một hướng đi mới với nhiều ưu điểm hơn so với các phương pháp thủy phân chitosan ở trạng thái lỏng như: giảm thiểu ô nhiễm môi trường, quy trình sản xuất đơn giản, giảm chi phí cho quá trình loại bỏ ở công đoạn tinh sạch, tăng hiệu quả thu hồi và chất lượng sản phẩm Ý nghĩa khoa học của đề tài: Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp ở trạng thái rắn với tác nhân. .. trình cắt mạch tạo chitosan phân tử lượng thấp 2.2.3 Nghiên cứu quá trình cắt mạch chitosan bằng H2O2 ở trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng thấp 2.2.3.1 Nghiên cứu ảnh hưởng của nồng độ H2O2 đến quá trình tạo chitosan phân tử lượng thấp  Bố trí thí nghiệm: Chitosan kích thước xác định Nồng độ NaOH xác định, tỷ lệ 1:15, 30oC với thời gian xác định Bổ sung H2O2 tỷ lệ 1:3, 30oC, 2 giờ với các nồng độ... xuất chitosan phân tử lượng thấp Chitosan phân tử lượng thấp là chitosan có khối lượng phân tử có sự dao động từ 20 - 200 (kDa), độ nhớt biểu kiến dao động từ 20 - 200 (cP) [36] và mang đầy đủ tính chất vật lý, hóa học, sinh học của chitosan 1.2.1 Vai trò của chitosan phân tử lượng thấp Chitosan phân tử lượng thấp có thể nhận biết khi so sánh với chitosan phân tử lượng cao thông qua độ nhớt của chitosan. .. Tuy nhiên, Thủy phân bằng phương pháp vật lý phải hòa tan chitosan trong môi trường acid với nồng độ (0.1 - 1)%, đồng thời phản ứng thủy phân dễ xảy ra quá trình phá vỡ các cấu trúc bên ngoài của chitosan  Thủy phân chitosan bằng phương pháp hóa học Trên thực tế có rất nhiều tác nhân hóa học đã được nghiên cứu và ứng dụng để thủy phân chitosan thu chitosan phân tử lượng thấp hoặc oligochitosan như:... rằng, sản lượng chitosan trên thế giời sẽ đạt tới 118.000 tấn/năm, trong đó Nhật Bản và Hoa Kỳ là hai nước sản xuất chính Cho đến nay có rất nhiều các phương pháp sản xuất chitosan và chitosan phân tử lượng thấp, tuy nhiên, trong pham vi Đề tài, chúng tôi quan tâm đến các phương pháp thủy phân chitosan tạo chitosan phân tử lượng thấp với mục đích giảm thiểu nguy cơ ô nhiễm môi trường và quy trình sản xuất. .. siêu âm để thủy phân chitosan, kết quả thu được oligo chitosan có phân tử lượng khá thấp (>25 kDa) Năm 2011, Nguyễn Ngọc Duy đã kết hợp phương pháp vật lý và phương pháp hóa học để thủy phân chitosan bằng tia gamma trong môi trường có bổ sung H2O2 và thu được olygochitosan có khối lượng phân tử thấp (5 – 10 kDa) [30] 12 Phương pháp này có ưu điểm là phản ứng thủy phân diễn ra nhanh nhờ tác động mạnh... loãng Như vậy, độ nhớt là nhân tố quan trọng để xác định trọng lượng phân tử của chitosan [42] Ta có thể thấy rằng, chitosan phân tử lượng thấp sẽ có độ nhớt thấp bởi mạch phân tử chitosan ngắn sẽ làm giảm sự tương tác giữa các phân tử với nhau Ngược lại, nếu mạch phân tử chitosan cao, các phân tử trong môi trường có sự ràng buộc lẫn nhau tạo 9 thành trạng thái rối làm cho chitosan có độ nhớt cao hơn... nhóm acetyl nên hiệu quả thủy phân chưa cao  Thủy phân chitosan bằng tác nhân vật lý Sử dụng tác nhân vật lý cho thủy phân chitosan cũng đã được các nhà khoa học nghiên cứu khá nhiều Khi thủy phân bằng tác nhân vật lý, người ta thường sử dụng các tia chiếu xạ cho quá trình thủy phân Có thể kể đến như: - Chiếu xạ ở trạng thái khô: dùng tia gamma phát ra từ nguồn 60 Co với liều lượng là 0.56 Gy s - - ... 1.2 Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp .8 1.2.1 Vai trò chitosan phân tử lượng thấp 1.2.2 Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp 10 1.2.2.1 Nghiên cứu sản. .. sản xuất chitosan phân tử lượng thấp giới 10 1.2.2.2 Nghiên cứu sản xuất chitosan phân tử lượng thấp Việt Nam 13 1.2.3 Sử dụng H2O2 cho trình thủy phân trạng thái rắn tạo chitosan phân tử lượng. .. hưởng tỷ lệ chitosan/ H2O2 đến khả cắt mạch chitosan trạng thái rắn với tác nhân H2O2 44 3.4 Đề xuất quy trình sản xuất chitosan phân tử lượng thấp trạng thái rắn với tác nhân H2O2