Kháng sinh đồ phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Môi trường 1.1 Thạch Mueller - Hinton Môi trường phải chuẩn hoá cao, giúp vi khuẩn gây bệnh thơng thường mọc tốt Có nhiều loại môi trường thạch Mueller - Hinton thạch tốt để làm thử nghiệm kháng sinh đồ vì: - Có đầy đủ yếu tố giúp cho hầu hết vi khuẩn gây bệnh phát triển - ức chế thấp với sulfonamide, trimethoprim, tetracyclin - Chất lượng môi trường ổn định từ mẻ đến mẻ khác - Đã tiến hành nghiên cứu với số lượng lớn Nếu mơi trường khơng thích hợp, nghèo dinh dưỡng, vi khuẩn phát triển vịng vô khuẩn lớn dẫn đến kết sai 1.2 Các yếu tố cần thiết để vi khuẩn phát triển Một số vi khuẩn cần thêm 5% máu cừu thỏ phát triển loại liên cầu, phế cầu ) Tuy nhiên mơi trường có máu vịng vơ khuấn nhỏ lại khoanh giấy oxacillin, methicillin (nhỏ 2-3 mm), vịng vơ khuẩn to xung quanh khoanh giấy sulfonamide trimethoprim Một số vi khuẩn cần thêm yếu tố bổ trợ để phát triển vitamin, yếu tố X, V để phát triển (H influenzae) 1.3 Thymidine Thymine - Mơi trường có chứa số lượng q lớn thymidine thymine dẫn đến việc ức chế sulfonamide, trimethoprim làm cho vịng vơ khuẩn nhỏ hơn, chí khơng có vịng vơ khuẩn, dẫn đến kết sai - Thêm thymidine phosphorylase máu cừu bị ly giải làm tăng rõ ràng vịng vơ khuẩn sulfonamide trimethoprim thử với đa số loại vi khuẩn gây bệnh (trừ Enterococci) Vì vậy, nên sử dụng chủng mẫu Enterococcus faecalis ATCC 29213 để kiểm tra chất lượng mơi trường có thêm máu cừu thỏ - Thạch Mueller-Hinton có chứa sẵn lượng vừa đủ thyamine tự 1.4 Các cation - Lượng ion Mg++ Ca++ có ảnh hưởng lớn đến hoạt động tetracycline aminoglycoside Các ion có hàm lượng khác hãng sản xuất khác lơ mơi trường khác - Vì vậy, cần phải tiến hành thử nghiệm giám sát chất lượng môi trường có mẻ mơi trường chủng mẫu p aeruginosa ATCC 27853 1.5 Độ pH - Độ pH nên khoảng 7,2 - 7,4 nhiệt độ phòng, đổ môi trường mẻ thạch cần kiểm tra pH, pH có ổn định kết kháng sinh đồ xác - Độ pH có ảnh hưởng tới tốc độ phát triển vi khuẩn tác động lên vi khuẩn gây ảnh hưởng đến kết kháng sinh đồ - Độ pH ảnh hưởng tới hoạt động kháng sinh: - pH thấp làm hoạt động kháng sinh giảm vịng vơ khuẩn nhỏ aminoglycoside, clindamycin, erythromycin, quynolon - pH thấp làm hoạt động kháng sinh tăng vịng vơ khuẩn rộng tetracycline, nitrofuratoin, novobiocin, methicillin, oxaciclin - Khi hấp lò nhiệt độ cao, thời gian kéo dài làm pH giảm, mơi trường có màu nâu xám 1.6 Độ ẩm thạch Trước ria cấy vi khuẩn vào mơi trường phải làm khơ mặt thạch mặt thạch ướt vi khuẩn mọc dày làm thu hẹp vịng ức chế Làm khơ mặt thạch cách để tủ ấm khoảng 15 - 30 phút, không để lâu làm q khơ mặt thạch, vi khuẩn khó mọc ảnh hưởng đến khuếch tán kháng sinh, làm vịng vơ khuẩn nhỏ lại 1.7 Độ dày thạch Độ dày trung bình thạch + 0.5 mm, không nên dày mỏng làm kháng sinh khuếch tán nhiều theo chiều sâu chiều ngang làm sai kêt 1.8 Các môi trường đặc biệt - S aureus để thử Oxacillin - Thạch Mueler Hinton có máu cho S pneumoniae - Thạch Mueler Hinton có yếu tố X V cho Haemophylus Huyền dịch vi khuẩn dùng thử nghiệm Huyền dịch vị khuẩn dùng thử nghiệm 108 vi khuẩn/ ml So sánh với độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 (pha BaS04) có nồng độ tương đương với nồng độ 108 vi khuẩn/ml Có hai phương pháp chuẩn bị huyền dịch vi khuẩn: - Chọn trực tiếp khuẩn lạc: chủng vi khuẩn dùng phương pháp phải thuần, vừa nuôi cấy qua đêm Nhặt 3-5 khuẩn lạc loại môi trường nuôi cấy thuần, qua đêm Hoà - ml nước muối sinh lý Lắc tay máy lắc So sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0,5, điều chỉnh độ đục cách thêm nước muối sinh lý vi khuẩn - Nuôi cấy canh thang: Nhặt 3-5 khuẩn lạc loại môi trường ni cấy Hồ - ml canh thang thích hợp (tryptic soy broth, BHI) ủ ấm canh thang 35°C so sánh tương đương với độ đục chuẩn Mc Farland 0.5 (khoảng sau 2-6 giờ) Điều chỉnh độ đục cách thêm canh thang vi khuẩn Ria vi khuẩn Trong vòng 15 phút sau điều chỉnh độ đục, dùng que tăm bơng vơ trùng nhúng vào canh khuẩn, xoay trịn tăm vài lần vắt bớt nước cách ép tăm vào thành ống Dùng tăm vạch ngang lần vng góc mặt đĩa thạch Sau ria tăm bơng lên mặt thạch cách lần ria xoay đĩa 60° Khoanh giấy kháng sinh Bảo quản kháng sinh: khoanh giấy kháng sinh thấm hàm lượng định tính µg/ml Mỗi kháng sinh có độ bền khác Nhiệt độ độ ẩm cao dễ làm bất hoạt kháng sinh kháng sinh họ β-lactam Vì vậy, kháng sinh sử dụng hàng ngày phải bảo quản 2-8°C (ngăn tủ lạnh) Các kháng sinh bảo quản lâu phải bảo quản - 20°C (ngăn đá) Chọn kháng sinh: loại kháng sinh có phổ tác dụng định với loại vi khuẩn Vì loại vi khuẩn thử với số loại kháng sinh định Các kháng sinh chọn theo tài liệu hướng dẫn CLSI (Bảng hướng dẫn lựa chọn kháng sinh) Đặt kháng sinh: dùng kim đầu nhọn đặt nhẹ khoanh giấy cho tiếp xúc mặt thạch Khoảng cách khoanh giấy 24 mm, cách rìa đĩa thạch 15 mm Như đĩa thạch đường kính 10 cm đặt 5-6 khoanh giấy kháng sinh Điều kiện ủ ấm Nhiệt độ q cao làm đường kính vịng vơ khuẩn nhỏ lại Điều kiện ủ ấm cho vi khuẩn thơng thường 35-37°C/ khí trường thường/1820 Đặc biệt: - Campylobacter ủ 42°C - S aureus thử độ nhạy cảm với oxacillin ủ 30°C, 24 - Enterococci thử độ nhạy cảm với vancomycin cần ủ 24 - Yersinia pestis cần ủ 25°c - Haemophylus cần ủ điều kiện có 5-7% CO2 Đọc diễn giải kết Đo đường kính vịng vơ khuẩn xung quanh khoanh giấy kháng sinh, đường kính tính milimet Đường kính đựơc chia thành mức độ nhạy cảm, trung gian, đề kháng dựa vào bảng chuấn theo hướng dẫn tài liệu CLSI Kết kháng sinh đồ chia thành loại A, B, C, U, O để ưu tiên chọn lọc điều trị (Bảng diễn giải đường kính vùng ức chế) Kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Kiểm tra chất lượng 1.1 Mục đích - Giám sát tính xác thử nghiệm kháng sinh đồ - Giám sát vật liệu, môi trường sử dụng thử nghiệm - Giám sát kỹ thuật tiến hành đọc kết người xét nghiệm 1.2 Chọn chủng kiểm tra chất lượng Các chủng kiểm tra chất lượng chủng mẫu ATCC có độ nhạy cảm định với kháng sinh (độ nhạy số không đổi) - E coli ATCC 25922 (Kiểm tra hàng ngày hàng tuần) - S aureus ATCC 25923 (Kiểm tra hàng ngày hàng tuần) - p aeruginosa ATCC 27853 (Kiểm tra có mẻ mơi trường mới) - E faecalis ATCC 29212 (Kiểm tra kháng sinh đồ có thêm máu) - S pneumoniae ATCC 49619 (Kiểm tra song song với chủng phế cầu) - H influenzae ATCC 49247 (Kiểm tra song song với chủng H influenzae) 7.3 Đánh giá chất lượng Để đánh giá tính xác thử nghiệm, tiến hành thử kháng sinh đồ chủng phân lập song song với chủng mẫu ATCC theo ngày theo tuần môi trường điều kiện thử nghiệm Khi đọc kết đường kính vịng vơ khuẩn chủng mẫu ATCC giới hạn cho phép có nghĩa kỹ thuật thực xác (Bảng kiểm tra chất lượng) Nếu giới hạn cho phép ta phải kiểm tra lại xem khâu sai sót kỹ thuật tiến hành, môi trường, người thực để sửa chữa Đối với thử nghiệm so sánh hàng ngày sai sót cho phép 1/20, so sánh hàng tuần sai sót cho phép 1/30 Bảo quản chủng chuẩn quốc tế - 20°C, cấy chuyển hàng tháng Chủng sử dụng hàng tuần giữ thạch nghiêng, chuyển đĩa trước sử dụng Những sai sót thường gặp - Đọc kết đường kính vơ khuẩn sai - Chủng bị nhiễm bẩn nhầm lẫn thành chủng khác - Nồng độ vi khuẩn pha vào đặc q lỗng - Độ đục Mac Faland 0.5 khơng chuẩn - Điều kiện ủ ấm nhiệt độ, thời gian, khí trường khơng quy định - Mơi trường không chuẩn, hạn sử dụng, hấp môi trường sai - Bảo quản kháng sinh không tốt ảnh hưởng đến hoạt lực Nên tiến hành thử nghiệm lại kiểm tra lại Giới hạn phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Phương pháp chuẩn hoá cho vi khuẩn ưa khí, dễ mọc Staphylococci, Streptococci, Enterococci, Enterobacteriaceae, v.choierae, p.aeruginosa, Acinetobacter spp Là phương pháp cải tiến cho vi khuẩn khó mọc Heamophilus, Streptococci, N gonorrhoeae, S pneumoniae Đối với vi khuẩn khác Campylobacter, Bacillus, Corynebacterium spp không nên thử phương pháp địi hỏi phải có mơi trường, khí trường, thời gian ủ đặc biệt Kết nhầm thử số kháng sinh số vi khuẩn đặc biệt: - Salmonella Shigella thử với cephalosporin hệ 1, aminoglycoside - S aureus kháng methicillin thử với kháng sinh nhóm P-lactam (trừ oxacillin) - Enterococci thử với cephalosporin, aminoglycoside, clindamycin, co trimoxazol - Listeria thử với cephalosporin Khoanh giấy kháng sinh khuếch tán chi phương pháp thử nghiệm in vitro nên có trường hợp kết nhạv cảm thực tế điều trị lại khơng có tác dụng phụ thuộc vào số yếu tố: - Kháng sinh: đường vào, liều lượng, thời gian dược lực học - Vi khuẩn - Người bệnh 10 Những vấn đề kháng kháng sinh cần ý (1) S aureus kháng methicillin (MRSA) S aureus giảm nhạy cảm với vancomycin (VRSA) (2) Enterococci kháng penicillin, ampicillin Enterococci kháng vancomycin (VRE) (3) E coli, Klebsiella sinh ß-lactamase phổ rộns (ESBL) kháng cephalosporin hệ 3,4 (4) Salmonella, Shigella kháng quinoion (5) S pneumoniae kháng penicillin (6) Neisseria gonorrhoeae kháng penicillin (7) H influenzae sinh ß-lactamase (8) Moraxella catarrhalis sinh ß-lactamase Bảng lựa chọn kháng sinh thử nghiêm diễn giải đường kính vùng ức chế E.coli trực khuẩn đường ruột khác TT 10 11 12 13 14 15 16 Kháng sinh Nồng độ (µg) Ký hiệu Ampiciline 10 AM Piperacillin 100PIP Ertapenem 10 ETP Imipenem 10 IMP Meropenem 10 MEM Cephalothine 30 CF Cefuroxime 30 CXM Ceftazidime 30 CAZ Ceftriaxone 30 CRO Cefotaxime 30 CTX Cefoxitin 30 FOX Cefepime 30 FEP Amo+A.clavula 20/10 AMC Ampi + Sulbact 20 'SAM Piper+Tazobact 10 TZP Gentamicine 10 GM Ký hiêu Đườngkính S,I,R Whonet AMP PIP ETP IMP MEM CEF CXA CAZ CRO CTX FOX FEP AMC SAM TZP GEN 14-16 18-20 16-18 14-15 14-15 15-17 15-17 18-20 20-22 23-25 15-17 15-17 14-17 12-14 18-20 13-14 Ghi 17 18 19 20 21 22 Tobramicine Amikacin Ciprofloxacin Levofloxacin Co-trimoxazol Fosmycin 10 30 5 25 50 TM AN CIP LVX SXT FOS TOB AMK CIP LYX SXT FOS 13-14 15-16 15-21 13-17 11-15 13-15 - Trong trình điều trị số vi khuẩn xuất đề kháng lúc đầu thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn nhạy cảm trở thành đề kháng sau 3-4 ngày điều trị - Thường gặp vi khuẩn Enterobacter, Citrobacter, Serratia thử với Cephalosporin hệ - p aeruginosa thử với tất kháng sinh - S aureus thử với kháng sinh nhóm quinolon - Trong trường hợp nên tiến hành lại thử nghiệm kháng sinh đồ Bảng lựa chọn kháng sinh nghiệm diễn giải đường kính vùng ức chế p.aeruginosa Pseudomonas spp khác TT Kháng sinh Piperacillin Nồng Ký hiệu độ(µg) 100 PIP Ký Đường hiêuWhonet kính S,I,R PIP ≥ 18 Ghi Ticarcillin 75 TIC Aztreonam 30 ATM Imipenem IMP 10 Meropenem MEM 10 Ceftazidime 30 CAZ Cefepime 30 FEP Tica+A.clavulanic 75/10 TCC Piper+T azobactam 10 TZP TIC ATM IMP MEM CAZ FEP TCC TZP ≥ 15 16-21 14-15 14-15 15-17 15-17 ≥ 15 ≥ 18 10 11 12 13 14 15 16 Gentamycine Tobramycine Amikacin Ciprofloxacin Levofloxacin Colistin Polymixin GEN TOB AMK CIP LVX COL POL 13-14 13-14 15-16 16-20 14-16 ≥ 11 ≥ 12 GM 10 TM 10 30 AN CIP LVX cs 10 300 IUPB Bảng Lựa chọn kháng sinh thử nghiêm diễn giải kính vùng ức chế Acineiobacter baumannii Nồng TT Kháng sinh Piperacillin Imipenem Meropenem Ceftazidime Ceftriaxone Cefotaxime Ký hiệu độ (µg) 100PIP 10 IMP 10 MEM 30 CAZ 30 CRO 30 CTX Ký hiệuWhonetĐường kính S,I,R PIP IMP MEM CAZ CRO CTX 18-20 14-15 14-15 15-17 14-20 15-22 Ghi Nồng Kháng sinh độ (µg) Cefepime 30 Ampi + Sulbact 20 T ica+A.clavulanic 75/10 Piper+Tazobactam 10 Gentamycine 10 Tobramycine 10 Amikacin 30 Ciprofloxacin Levofloxacin Doxycycllin 30 Minocyclin 30 Co-trimoxazol 25 Ký Đưởngkính Ký hiệu kiêuWhonet S,I,R FEPFEP SAMSAM - TCCTCC TZPTZP GMGEN TMTOB ANAMK CIPCĨP LVXLVX DODOX MNOMNO SXTSXT 15-17 12-14 15-19 18-20 13-14 13-14 15-16 16-20 14-16 10-12 13-15 11-15 Ghi Bảng lựa chọn kháng sinh thử nghiêm diễn giải đường tính vùng ức chế Staphylococcus aureus TT Kháng sinh Nồng độ (µg) Penicillin 10 30 Cefoxitin Erythromycine 15 Azithromycin 15 Clindamycin 30 Vancomycin Gentamycine 10 Ciprofloxacin Levofloxacin 30 10 Chlorampheni col 30 11 Tetracycline 25 12 Co-trimoxazol 13 Lizonalid 30 Ký hiệu Ký hiệuWhonet P FOX E AZM CM VA GM CIP LVX CL TE SXT LZD PEN FOX ERY AZM CLI VAN GEN CIP LVX CHL TCY SXT LNZ Đường Ghi kính S,I,R ≥ 29 ≥ 22 14-22 14-17 15-20 MIC 13-14 16-20 14-16 13-17 15-18 11-15 ≥ 21 Lựa chọn kháng sinh thử nghiệm diễn mải đường kính vùng ức chế Enterococci TT Kháng sinh Penicillin Erythromycine Vancomycin Nồng Ký độ(µg) hiệu p 10 15 E 30 VA Ký Đường hiệuWhonet kínhS,I,R PEN ERY VAN ≥29 14-22 15-16 Ghi 10 11 Ciprofloxacin Levofloxacin Chloramphenicol Doxycycllin Minocyclin Lizonalid Nitrofuratoin Fosmycin 5 30 30 30 30 300 50 CIP LVX CL DO MNO LZD FT FOS CIP LVX CHL DOX MNO LNZ NIT FOS 16-20 14-16 13-17 13-15 15-18 21-22 15-16 13-15 Nước tiểu Nước tiểu Bảng kiểm tra chất lượng với chủng mẫu E coli ATCC 25922 TT Tên kháng sinh Nồng độ (µg) Ký hiệu Đường kính Ampicilline 10 AM S,I,R 16-22 Ciprofloxacine CIP 30-40 Amoxicillin+a.clavulanic 20/10 AMC 19- 25 Gentamycine 10 GM 19-26 Co- trimoxazol 1.25/ 23.75 SXT 24-32 Chloramphenicol 30 CL 21 - 27 Ceftriaxone 30 CRO 29-35 Bảng kiểm tra chất lượng với chủng mẫu P.aeruginosa ATCC 27853 Nồng đô TT Tên kháng sinh Ceftriaxone Gentamycine Ciprofloxacine Đường kính S,I, Ký hiêu (µg) 30 10 CRO GM CIP R 17-23 16 - 21 25-33 Bảng kiểm tra chất lương vởi chủng mẫu S.aureus ATCC 25923 TT Tên kháng sinh Penicilline Ampicilline Nồng độ (ßg) 10 units Ký hiệu Đường kính S, I,R P 26-37 10 20/10 AM 27-35 AMC 28 - 36 Oxacilline OX1 Ceftriaxone 30 CRO 22-28 Erythomycine 15 E 22 - 30 Vancomycine 30 VA 17-21 Gentamycine GM 19-27 Ciprofloxacine 10 CIP 22 - 30 10 Chloramphenicol 30 C 19 - 26 11 Co- trimoxazol SXT 24-32 Amoxycillin+A.clavulanic 1.25/ 23.75 18-24 ... đĩa 60° Khoanh giấy kháng sinh Bảo quản kháng sinh: khoanh giấy kháng sinh thấm hàm lượng định tính µg/ml Mỗi kháng sinh có độ bền khác Nhiệt độ độ ẩm cao dễ làm bất hoạt kháng sinh kháng sinh họ... trường sai - Bảo quản kháng sinh không tốt ảnh hưởng đến hoạt lực Nên tiến hành thử nghiệm lại kiểm tra lại Giới hạn phương pháp khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Phương pháp chuẩn hố cho vi khuẩn... khuẩn thử với số loại kháng sinh định Các kháng sinh chọn theo tài liệu hướng dẫn CLSI (Bảng hướng dẫn lựa chọn kháng sinh) Đặt kháng sinh: dùng kim đầu nhọn đặt nhẹ khoanh giấy cho tiếp xúc mặt