Đang tải... (xem toàn văn)
... tài Nghiên cứu đa dạng nấm men có khả lên men rƣợu vang nho Cabernet sauvignon, từ áp dụng vào sản xuất để tạo loại vang có chất lƣợng cao Nội dung đề tài 3.1 Phân lập chủng nấm men có khả lên men. .. thời để thƣơng hiệu vang Việt Nam có chỗ đứng thị trƣờng nƣớc nhƣ tiến tới xuất khẩu, định tiến hành đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu đa dạng nấm men có khả lên men rượu vang nho Cabernet sauvignon”... LUẬN 21 3.1 Phân lập chủng nấm nem có khả lên men rƣợu vang từ dịch nho Cabernet sauvignon 21 3.2 Tuyển chọn chủng nấm men có khả lên men rƣợu vang từ nho Cabernet sauvignon
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== VĂN THỊ OANH NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG CỦA NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƢỢU VANG NHO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học HÀ NỘI, 2015 TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN ====== VĂN THỊ OANH NGHIÊN CỨU SỰ ĐA DẠNG CỦA NẤM MEN CÓ KHẢ NĂNG LÊN MEN RƢỢU VANG NHO KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Vi sinh vật học Ngƣời hƣớng dẫn khoa học PGS. TS. ĐINH THỊ KIM NHUNG HÀ NỘI, 2015 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình tìm hiểu, nghiên cứu và hoàn thành luận văn tốt nghiệp tại phòng thí nghiệm Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, tôi đã nhận đƣợc những lời chỉ bảo, hƣớng dẫn tận tình của các thầy cô giáo, các anh chị em và các bạn. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới: Các thầy cô giáo trong Ban chủ nhiệm khoa cùng các thầy cô giáo trong tổ bộ môn Vi sinh vật, khoa Sinh – KTNN , cán bộ phòng thí nghiêm và các bạn cùng làm việc. Đặc biệt cho phép tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS. Đinh Thị Kim Nhung đã trực tiếp hƣớng dẫn và giúp đỡ cho tôi tận tình để tôi có thể hoàn thành tốt đề tài nghiên cứu của mình. Hà Nội, tháng 05 năm 2015 Sinh viên Văn Thị Oanh LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đề tài “Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men có khả năng lên men rượu vang nho”, là do tôi thực hiện, không trùng với đề tài nào khác và không sao chép lại của ai. Nếu sai tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiêm. Hà Nội, tháng 05 năm 2015 Sinh viên Văn Thị Oanh MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ................................................................................... 1 2. Mục tiêu của đề tài ................................................................................ 2 3. Nội dung của đề tài ............................................................................... 2 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tàì .................................................. 2 4.1. Ý nghĩa lý luận ............................................................................... 2 4.2. Ý nghĩa thực tiễn ............................................................................ 2 5. Điểm mới của đề tài .............................................................................. 3 NỘI DUNG. CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU ..................................... 4 1.1. Khái quát chung về lên men rƣợu vang ............................................. 4 1.1.1. Nguyên liệu sản xuất rƣợu vang ................................................. 4 1.1.2. Thành phần và giá trị dinh dƣỡng của rƣợu vang ....................... 5 1.1.3. Phân loại vang ............................................................................. 6 1.1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến quá trình lên men ............................. 7 1.1.5. Bệnh vang.................................................................................... 8 1.2. Tình hình sản xuất vang nho trong nƣớc và trên thế giới .................. 9 1.2.1. Tại Việt Nam ............................................................................... 9 1.2.2. Trên thế giới .............................................................................. 10 1.3. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang........................ 11 1.3.1. Nấm men ................................................................................... 11 1.3.1.1. Sơ lƣợc về nấm men ............................................................... 11 1.3.1.2. Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men ............................. 11 1.3.1.3. Sinh sản của tế bào nấm men ................................................. 12 1.3.2. Nấm mốc ................................................................................... 13 1.3.3. Vi khuẩn lactic .......................................................................... 13 1.3.4. VSV làm hỏng vang .................................................................. 13 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của tế bào nấm men ............................................................................................ 14 CHƢƠNG 2. NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU ......... 16 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu ...................................................................... 16 2.2. Trang thiết bị và hóa chất ................................................................. 16 2.2.1. Trang thiết bị ............................................................................. 16 2.2.2. Hóa chất .................................................................................... 16 2.3. Các loại môi trƣờng......................................................................... 17 2.3.1. Môi trƣờng Hansen (g/l) ........................................................... 17 2.3.2. Môi trƣờng nhân giống (g/l) ..................................................... 17 2.3.3. Môi trƣờng lên men (g/l)........................................................... 18 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu.................................................................. 18 2.4.1. Phƣơng pháp phân lập trên hộp petri ........................................ 18 2.4.2. Phƣơng pháp hoạt hóa giống..................................................... 18 2.4.3. Phƣơng pháp xác định hoạt lực lực lên men của nấm men ...... 19 2.4.4. Phƣơng pháp quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi ........ 19 2.4.5. Phƣơng pháp đếm SLTB bằng buồng đếm Goriaev ................. 19 2.4.6. Phƣơng pháp phân tích.............................................................. 19 2.4.6. Phƣơng pháp xác định khả năng kết lắng ................................. 20 2.4.7. Phƣơng pháp cảm quan ............................................................. 20 2.4.8. Phƣơng pháp xử lý kết quả bằng thống kê toán học ................. 20 2.5. Địa điểm thực hiện đề tài ................................................................. 20 CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN ........................ 21 3.1. Phân lập chủng nấm nem có khả năng lên men rƣợu vang từ dịch nho Cabernet sauvignon ................................................................... 21 3.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rƣợu vang từ nho Cabernet sauvignon ................................................................... 23 3.2.1. Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men .................... 23 3.2.2. Khả năng lên men đƣờng .......................................................... 24 3.2.3. Khả năng kết lắng...................................................................... 25 3.2.4. Khả năng tạo hƣơng thơm và độ trong của sản phẩm .............. 26 3.2.5. Xác định tên khoa học của chủng nấm men nghiên cứu .......... 26 3.3. Đánh giá sự đa dạng của nấm men dựa vào khả năng sử dụng các nguồn dinh dƣỡng và điều kiên nuôi cấy .......................................... 27 3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau ............................. 27 3.3.1.1. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đƣờng ............................ 27 3.3.1.2. Khả năng lên men ở các hàm lƣợng đƣờng khác nhau .......... 29 3.3.2. Ngiên cứu sự đa dạng dựa vào khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau .................................................................................. 31 3.3.2.1. Sự đa dạng từ việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ ................ 31 3.3.2.1. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 ở các hàm lƣợng khác nhau tới quá trình lên men. ............................................................................ 32 3.3.3. Nghiên cứu khả năng lên men ở các độ pH khác nhau đến quá trình lên men ............................................................................. 34 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ......................................................................... 36 1. Kết luận ............................................................................................... 36 2. Kiến nghị ............................................................................................. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO ............................................................................... 37 DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loại quả ......................................... 5 Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái và kích thƣớc của nấm men trong các mẫu phân lập .................................................................................................... 22 Bảng 3.3. Hoạt lực lên men của các chủng nấm nem sau 72h ........................ 24 Bảng 3.4. Khả năng lên men của các chủng nấm men ở các loại đƣờng khác nhau ................................................................................................. 25 Bảng 3.5. Khả năng kết lắng của ba chủng nấm men ..................................... 25 Bảng 3.6. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đƣờng trong dịch lên men của 3 chủng nấm men T1, T4 và T11.......................................................... 28 Bảng 3.7. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae T1, T4 và T11 trên môi trƣờng có hàm lƣợng đƣờng ở các mức khác nhau ........................ 30 Bảng 3.8. Sự đa dạng từ việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ của các chủng nấm men .......................................................................................... 31 Bảng 3.9. Ảnh hƣởng của (NH4)2SO4 ở các hàm lƣợng khác nhau tới quá trình lên men ............................................................................................ 33 Bảng 3.10. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau ................................... 34 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1. Sự đa dạng của tế bào nấm men ...................................................... 13 Hình 3.1. Chủng nấm men phân lập đƣợc trên môi trƣờng thạch đĩa ............ 21 Hình 3.2. Cấy truyền chủng nấm men T1, T4, T5, T9, T11 trên môi trƣờng thạch nghiêng ............................................................................................ 23 Hình 3.3.Tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học .................................. 26 có độ phóng đại 1000 lần ................................................................ 26 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT CNS: Chất nguyên sinh ĐHSP: Đại học Sƣ phạm HL: Hàm lƣợng Nxb: Nhà xuất bản S. cerevisiae: Saccharomyces cerevisiae SLTB: Số lƣợng tế bào TG: Thời gian VSV: Vi sinh vật MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Từ xa xƣa, con ngƣời đã biết cách tạo ra rƣợu và sử dụng rƣợu mặc dù chƣa hiểu rõ bản chất về quá trình này. Rƣợu trở thành một thứ đồ uống phổ biến và đƣợc ƣa chuộng trên toàn thế giới. Rƣợu vang là một loại rƣợu nhẹ đƣợc lên men trục tiếp từ dịch ép trái cây mà không cần qua quá trình chƣng cất, là một thức uống có giá trị dinh dƣỡng cao, hƣơng vị thơm ngon và có lợi cho sức khỏe con ngƣời khi dùng một cách điều độ. Trên thế giới ngƣời ta đã biết làm rƣợu vang từ 3000 năm trƣớc công nguyên. Hàng năm trên thế giới sản xuất khoảng 18 tỷ lít rƣợu vang trong đó có 1/3 của Pháp và Angeri. Ở Việt Nam ngành sản xuất vang mới bắt đầu từ những năm 80 của thế kỉ 20 với sự xuất hiện của vang mang nhãn hiệu “Thăng Long” trên thị trƣờng nội địa. Những năm sau đó dần xuất hiện các sản phẩm mới nhƣ vang Đà Lạt, vang Vina wine, vang Tháp Chàm… Sản phẩm rƣợu vang vẫn chƣa đƣợc quan tâm nhiều, quy mô sản xuất chủ yếu dƣới dạng thủ công, lên men tự nhiên chƣa có cơ sở khoa học cũng nhƣ phƣơng pháp hợp lí dẫn đến năng suất cũng nhƣ chất lƣợng sản phẩm chƣa cao. Hơn nữa vang của Việt Nam còn đƣợc làm từ nhiều loại quả nhƣ: nho, dâu, táo mèo,vải, dứa… nên chất lƣợng chƣa có tiêu chuẩn rõ ràng. Trong sản xuất rƣợu vang, nho là một nguyên liệu truyền thống rất đƣợc ƣa thích và có giá trị dinh dƣỡng cao. Nho đƣợc trồng nhiều ở các nƣớc Châu Âu nhất là ở Pháp và Mĩ. Ở Việt Nam vùng trồng nho cho năng suất và chất lƣợng cao để sản xuất rƣợu vang tập trung ở tỉnh Ninh Thuận và Bắc Bình Thuận [12], [13]. Mặt khác nho Cabernet sauvignon là một trong những loại nho đỏ để làm rƣợu nổi tiếng nhất thế giới. Nó phát xuất từ Bordelais thuộc vùng làm 1 rƣợu nho Bordeaux, và từ đó đƣợc trồng lan tràn khắp mọi nơi trên thế giới để sản suất rƣợu vang đỏ. Với mong muốn tạo ra một sản phẩm ổn định, đạt chất lƣợng cao đáp ứng đƣợc thị hiếu ngƣời tiêu dùng và đồng thời để thƣơng hiệu vang của Việt Nam có chỗ đứng tại thị trƣờng trong nƣớc cũng nhƣ tiến tới xuất khẩu, tôi quyết định tiến hành đề tài nghiên cứu: “Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men có khả năng lên men rượu vang nho Cabernet sauvignon”. 2. Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men có khả năng lên men rƣợu vang nho Cabernet sauvignon, từ đó áp dụng vào sản xuất để tạo ra một loại vang mới có chất lƣợng cao. 3. Nội dung của đề tài 3.1. Phân lập các chủng nấm men có khả năng lên men rƣợu vang từ nho Cabernet sauvignon 3.2. Tuyển chọn các chủng nấm men có khả năng lên men và định loại chủng nấm men đã tuyển chọn đƣợc 3.3. Đánh giá mức độ đa dạng sinh học của các chủng nấm men dựa vào nguồn dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy 4. Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tàì 4.1. Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu đƣợc sự đa dạng của các chủng nấm men phân lập từ dịch nho Cabernet sauvignon. Kết quả nghiên cứu này là giữ liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu và ứng dụng của nấm men trong đời sống. 4.2. Ý nghĩa thực tiễn Tận dụng đƣợc nguồn nguyên liệu sẵn có trong nƣớc nhằm sản suất một loại vang phù hợp với thị hiếu của ngƣời tiêu dùng, phát triển ngành công nghiệp sản xuất rƣợu vang, đem lại giá trị kinh tế. 2 5. Điểm mới của đề tài Đề tài là công trình đầu tiên ở Việt Nam nghiên cứu về mức độ đa dạng của nấm men dựa vào khả năng sử dụng nguồn dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy trong lên men rƣợu vang nho Cabernet sauvignon là một trong những giống nho nổi tiếng đƣợc sử dụng làm rƣợu vang. 3 NỘI DUNG CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Khái quát chung về lên men rƣợu vang Lên men là một quá trình trao đổi chất phức tạp, có sự tham gia của nấm men hoặc một số sinh vật khác, dƣới tác dụng của các enzyme tƣơng ứng gọi là chất xúc tác sinh học. Trong quá trình lên men rƣợu, đƣờng đƣợc biến đổi thành rƣợu etylic và CO2. Quá trình lên men kèm theo sự hình thành các sản phẩm phụ đồng thời giải phóng ra năng lƣợng. 1.1.1. Nguyên liệu sản xuất rượu vang Từ lâu ngƣời ta chỉ chú trọng tới nho để sản xuất rƣợu vang vì: Nho cho chất lƣợng tốt nhất, hƣơng vị đậm đà, vị ngọt, nóng của cồn cân đối với vị chua chát của axit. Thành phần của nƣớc nho thích hợp cho việc lên men. Thành phần hóa học của quả, điều kiện chăm sóc, khí hậu… có ảnh hƣởng lớn đến chất lƣợng rƣợu vang. Thành phần hóa học của một số loại quả đƣợc dẫn ra ở bảng 1 [ 8]. 4 Bảng 1.1. Thành phần hóa học của một số loại quả Tên quả Thành phần hóa học cơ bản (%) Nƣớc Đƣờng Acid Pectin Tanin Dâu 84,74 9,19 0,49 0,31 0,035 Dứa 54,3 3,9 0,6 0,249 0,83 Mơ 73,8 9,0 1,1 0,249 0,83 Nho 73,1 9,88 0,56 0,092 0,07 Táo mèo 84 4,8 1,45 0,249 0,83 Vải 84,28 16,1 5,16 0,249 0,83 1.1.2. Thành phần và giá trị dinh dưỡng của rượu vang Các thành tố cơ bản của một rƣợu vang đã hoàn thành là nƣớc và alcohol, một số thành tố khác có hàm lƣợng rất nhỏ, nhƣng là tác nhân về chất lƣợng và đặc điểm của rƣợu. Đường (62 – 132 g/l): là nguyên liệu để tạo nên các loại rƣợu trong quá trình lên men vang. Trong dịch quả chín chủ yếu là các loại đƣờng fructozo, glucozo và một ít glactozo ngoài ra còn có cả đƣờng saccarozo. Cồn ethanol: là 1 trong những thành phần quan trọng của rƣợu. Cồn ethanol do lên men tự nhiên từ dịch trái cây nên nó là thứ cồn tinh khiết không lẫn andehit và este. Độ cồn của rƣợu vang từ 100 – 120. Các axit vô cơ, axit hữu cơ: Axit malic, axit citric, axit oxalic… Rƣợu vang là loại đồ uống có độ chua cao. Hàm lƣợng axit tổng số từ 4 – 7g/l. Độ pH của vang từ 3 – 4. Trong vang chứa hàm lƣợng phong phú các muối với hàm lƣợng thấp đó là muối của các nguyên tố: P,S, K, Na, Fe, Cu… 5 Rượu vang giàu các vitamin và axit amin: Có vai trò vói sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men, đồng thời làm cho vang có vị đặc trƣng: valin, lizin, treonin… Các chất tạo màu (0.01 đến 0.5%): các phức chất phenol tạo màu cho rƣợu và những khác biệt trong hƣơng vị giữa các vang đỏ và vang trắng. Vỏ trái nho chứa các phenol đa phân tử, dƣới dạng các anthocyanin và tannin, mà các sắc tố của chúng cấp màu cho vang đỏ. Các vang trắng có đƣợc một chút màu từ vỏ trái nho, từ gỗ trong quá trình trữ [11]. 1.1.3. Phân loại vang Ngƣời ta tiến hành phân loại vang theo nhiều cách nhƣ màu sắc, hàm lƣợng đƣờng, hàm lƣợng axit, tiêu chí của chất có ga, tiêu chí tuổi thọ,… xu hƣớng chung thì chia vang thành hai nhóm là vang có ga và vang không ga. Theo màu sắc Vang trắng (Aliwen trắng) Vang đỏ (Aliwen đỏ) Vang hồng (Aliwen hồng) Vang xám Theo tiêu chí lượng đường tự nhiên: Vang khô (Vin Sec): chứa dƣới 2g đƣờng/lít rƣợu Vang bán khô (Demi – Sec): từ 2g đến 30g đƣờng/lít rƣợu Vang mềm (Moelleux): từ 30g đến 50g đƣờng/lít rƣợu Vang ngọt (Liquoreux): trên 50g đƣờng/lít rƣợu Theo tiêu chí của chất có ga: Vang êm: thông qua bọt khí. Khi đạt 20 độ thì lƣợng khí carbonique nhỏ hơn 1 gram/lít rƣợu. Đa số rƣợu vang là loại êm. 6 Vang sủi: có bọt khí. Vang sủi lại có nhiều loại nhƣ vang ít bọt (perlant), vang bọt vừa phải (petillant) hay vang nhiều bọt (mousseux) mà tiêu biểu là rƣợu champagne [11]. 1.1.4. Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Nhiệt độ: Nhiệt độ lên men có ảnh hƣởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình lên men và chất lƣợng của sản phẩm. Nếu nhiệt độ < 200C sự lên men chậm chạp. Nhiệt độ < 100C không diễn ra quá trình lên men. Nếu nhiệt độ 350C đây là nhiệt độ nguy hiểm nấm men mất tác dụng, quá trình lên men ngừng lại nhƣng nấm men không bị chết. Nếu nhiệt độ > 350C quá trình lên men ngừng lại ảnh hƣởng đến sự chuyển đƣờng thành cồn và CO2. Nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rƣợu vang đã xác định khoảng nhiệt độ tối ƣu cho nấm men vang phát triển là 25 – 280C [11]. Oxi: Hầu hết các chủng nấm men trong lên men rƣợu vang thuộc giống Saccharomyces. Chúng là nhóm vi sinh vật kỵ khí tùy tiện. Khi trong môi trƣờng đủ lƣợng oxy nấm men phân hủy đƣờng dùng làm nguồn năng lƣợng và cấu tạo tế bào tăng sinh khối. pH: Trong quá trình nuôi cấy pH môi trƣờng luôn bị biến đổi đƣợc điều khiển bởi sự sinh sản của nấm men. Vùng pH tối thích của nấm men là 4 – 6. Tuy nhiên trong sản xuất rƣợu vang ngƣời ta thƣờng chuẩn bị môi trƣờng nƣớc quả có độ pH bằng 3.0 – 3.5. Nồng độ đường và áp suất thẩm thấu. Sự chênh lệch áp suất giũa tế bào nấm men với môi trƣờng nuôi cấy làm cho lƣợng đƣờng trong dung dịch dễ dàng hòa tan và thấm qua màng, sản phẩm của tế bào hòa tan vào môi trƣờng 7 khi nồng độ trong môi trƣờng quá cao tạo ra áp suất thẩm thấu lớn gây khô hạn sinh lí, co CNS phá hủy tính trạng sinh lí của tế bào nấm men. Nồng độ rượu: Khi lên men đƣờng thành rƣợu nồng độ cồn thấp làm tê liệt tế bào nấm men, nồng độ cồn cao ức chế quá trình đồng hóa hidrocacbon và nito. Trong môi trƣờng có nồng độ hợp lí đạt tiêu chuẩn cần có đối với nhóm nấm men trong sản xuất rƣợu sẽ tích lũy từ 9 – 14%. HL men giống: HL men giống tăng nhiều quá sẽ gây ra sự cạnh tranh của nấm men ảnh hƣởng đến chất lƣợng lên men. SLTB có trong dịch lên men càng thấp thì TG nhân giống và lên men vang sẽ bị kéo dài hơn, vang dễ bị nhiễm khuẩn. Ngƣợc lại HL men giống trong dịch lên men càng cao thì TG lên men sẽ ngắn hơn, hạn chế đƣợc khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men với các VSV khác. Thƣờng tỉ lệ men giống là 10%. Ảnh hưởng của SO2: Nấm men có khả năng chịu đƣợc sự ức chế hơi SO2 tăng hiệu suất lên men.Vậy để đạt đƣợc hiệu suất lên men cao nhất chúng ta phải đảm bảo chính xác tất cả các yếu tố trên. Ảnh hưởng của TG lên men: TG là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm vang. Trong TG lên men chính, nếu TG lên men quá ngắn, có thể lƣợng cồn tạo ra quá ít. Trong TG lên men phụ, nếu TG lên men không đủ để hƣơng hình thành, mùi vang sẽ không đặc trƣng. Đối với đa số nấm men, TG lên men chính tốt nhất là 7 – 20 ngày. TG lên men phụ và tàng trữ của các loại rƣợu phải từ vài tháng trở lên [1]. 1.1.5. Bệnh vang Hiện tƣợng bệnh vang của lên men rƣợu vang đƣợc Pasteur nghiên cứu và khám phá. Đó là hiện tƣợng rƣợu bị chua đi và chất lƣợng rƣợu bị giảm rất nhanh. Hiện tƣợng trên là do nguyên nhân rƣợu vang tiếp xúc với không khí 8 và do vi khuẩn axetic phát triển đã biến cồn thành axetic. Ngoài ra bệnh vang cũng có thể do các VSV lên men kị khí gây ra [8]. Một số bệnh vang thƣờng gặp: Bệnh vang dính Đặc điểm: Vang không chảy đều, lỏng nhƣ nƣớc mà dính lại. Bệnh này thƣờng kéo theo bệnh chua và bệnh đắng. Nguyên nhân: Do vi khuẩn lactic tiết ra một loại đƣờng riêng gọi là dextran. Bệnh vang đắng Đặc điểm: Rƣợu bị chua và có vị đắng. Nguyên nhân: Do vi khuẩn lactic phá hủy glixerin tạo thành các acrolrin. Vang chua lactic Đặc điểm: Rƣợu có mùi chua khó chịu. Nguyên nhân: Khi quả quá ngọt hoặc cho thêm quá nhiều đƣờng, kỹ thuật lên men thấp, làm cho nấm men ngừng hoạt động, hoặc do cấy men chƣa đủ, nhiệt độ cao, thiếu oxy,... vi khuẩn lactic sẽ chuyển hóa đƣờng khử thành đƣờng manit và axit bay hơi. Vang bị đục Đặc điểm: Vang có màu đục không trong [16]. 1.2. Tình hình sản xuất vang nho trong nƣớc và trên thế giới 1.2.1. Tại Việt Nam Khoảng 100 năm trở lại đây nhờ sƣ̉ dụng quy trì nh sản xuất rƣợu vang chất lƣợng cao chúng ta cho ra đời dòng vang đầu tiên khá t hành công Vine Wine. Theo công nghệ sản xuất đó một loạt nhƣ̃ng dòng vang khác lần lƣợt ra đời: Vang Gia Lâm , vang Đông Đô , vang Tây Hồ ,… Đến nay nhiều công trình nghiên cứu trong lĩnh vực sản xuất rƣợu vang nho cũng đã và đang đƣợc 9 tiến hành mang lại nhiều kết quả tốt . Đồng thời vang Việt Nam cũng bắt đầu bƣớc vào thời kỳ hội nhập các sản phẩm cũng đƣợc xuất khẩu đến 1 số nƣớc trên thế giới. Vang Đà Lạt, Anh Đào, Sao La là những sản phẩm đƣợc yêu thích ở Việt Nam bởi mùi vị và chất lƣợng. Đặc biệt năm 2008 vang Đà Lạt đƣợc Phòng Thƣơng mại Công nghiệp Việt Nam và AC Nielsen Việt Nam trao tặng danh hiệu Thƣơng hiệu nổi tiếng (trong top 500 thƣơng hiệu nổi tiếng nhất tại thị trƣờng Việt Nam).Theo thống kê của Hiệp hội Rƣợu Bia và Nƣớc giải khát Việt Nam, hiện cả nƣớc có hơn 15 doanh nghiệp sản xuất và đóng chai rƣợu vang với sản lƣợng mỗi năm tăng khoảng 12 – 13 triệu lít [11]. 1.2.2. Trên thế giới Rƣợu vang rất đƣợc ƣa chuộng trên thế giới đặc biệt là các nƣớc Châu Âu. Nó là một loại đồ uống phổ biến, gắn liền với thƣơng hiệu nổi tiếng nhƣ rƣợu vang của Pháp, Italia, Chile, Bồ Đào Nha… Ngày nay, rƣợu vang không chỉ là một đồ uống mà đã trở thành một chủ đề văn hóa khắp nơi trên thế giới. Rƣợu vang có một lịch sử phát triển rất lâu đời, bằng chứng khảo cổ sớm nhất cho thấy con ngƣời đã làm rƣợu vang tại Gruzia vào khoảng 6000 năm TCN, một số địa điểm khảo cổ đáng chú ý khác là Iran và Armenia cũng phát hiện các bằng chứng về rƣợu vang từ nho có niên đại tƣơng ứng là 5000 năm và 4000 năm TCN [18], [19]. Bằng chứng khảo cổ học cũng cho thấy nho thuần hóa đã đƣợc trồng vào Thời đại đồ đồng sớm ở Cận Đông, Sumer và Ai Cập từ khoảng thiên niên kỷ thứ ba TCN. Châu Âu đƣ́ng đầu thế giới về sản xuất rƣợu vang với 80 % tổng sản lƣợng rƣợu vang trên toàn thế giới , châu Mỹ 14 %, châu Phi 5%, châu Á - Úc 0,5%. Sản lƣợng rƣợu vang toàn cầu đã đạt mức đỉnh vào năm 2004 - khi cung vƣợt cầu khoảng 600 triệu thùng (1 thùng gồm 12 chai, tƣơng đƣơng với 9 lít) và đang trên đà sụt giảm kể từ đó đến nay. Theo khảo sát mới đây của công ty nghiên cứu Austraylia 10 thuộc tập đoàn tài chính Morgan Stanley (Mỹ), nhu cầu đối với rƣợu vang đã vƣợt nguồn cung hơn 300 triệu thùng vào năm 2012. Trong năm 2012 vụ thu hoạch nho “khiêm tốn” làm cho việc sản xuất rƣợu vang gặp nhiều khó khăn, sản lƣợng vang giảm. Năm 2013 sản lƣợng vang toàn cầu có thể đƣợc coi là tƣơng đối cao, mang đến hy vọng về một sản lƣợng rƣợu vang cao trong những năm kế tiếp [18]. 1.3. Hệ vi sinh vật tham gia vào quá trình lên men vang 1.3.1. Nấm men 1.3.1.1. Sơ lược về nấm men Nấm men là tên chung chỉ nhóm nấm có cấu tạo tế bào, sinh sản bằng cách nảy chổi. Chúng phân bố rộng rãi trong môi trƣờng đất, nƣớc, không khí, đặc biệt có nhiều trong các loại quả. Nấm men đƣợc dùng trong lên men rƣợu vang là S. cerevisiae chứa trung bình 75% nƣớc, 25% chất khô. Ngƣời ta phân loại nấm men trong sản xuất rƣợu vang thành một số loại sau: S.cerevisiae, Saccharomyces vini, S. oviomis… Nhƣng sử dụng rộng rãi nhất trong sản xuất là chủng S.cerevisiae. Chủng nấm men này có khả năng lên men dịch có HL đƣờng cao và tạo đƣợc 20 – 30%V cồn, khả năng lắng kết và tạo hƣơng vị cho vang tốt [3], [4]. 1.3.1.2. Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men Hình thái của tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan hoặc hình trứng... kích thƣớc tƣơng đối lớp: đƣờng kính khoảng 7µm. Hình dạng có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi trƣờng, điều kiện nuôi cấy và tuổi tế bào. Nấm men mang đầy đủ tính chất của một cơ thể sống, gồm: Thành tế bào: thành phần chính là glucan và mannan chiếm khoảng 90%, còn lại là prrotein, lipit và một số thành phần nhỏ khác nhƣ kitin... 11 Màng nguyên sinh chất: là một lớp tế bào mỏng bao quanh tế bào chất gồm các hợp chất phức tạp nhƣ photpholipit, protein, enzim permaza... Tế bào chất: ở dạng thể keo không đồng nhất, chứa đầy đủ các cơ quan tử của tế bào nhƣ ty thể, nhân, riboxom, không bào, các hạt dự trữ... Thành phần cấu tạo chủ yếu của tế bào chất là nƣớc, protit, gluxit, lipit, các muối khoáng... Ty thể: Khác với vi khuẩn, nấm men đã có ty thể giống nhƣ ở tế bào bậc cao, đó là cơ quan sinh năng lƣợng của tế bào. Ty thể nấm men có hình bầu dục, đƣợc bao bọc bởi hai lớp màng, màng trong gấp khúc thành nhiều tấm răng lƣợc hoặc nhiều ống nhỏ làm cho diện tích bề mặt của màng trong tăng lên. Nhân tế bào: là cấu tử bất biến của nấm men, thành phần cơ bản của nhân là ADN mang thông tin di truyền. Thành phần nucleotit trong ADN phụ thuộc từng loài. Không bào, các thể vùi và các thành phần dự trữ trong tế bào[3]. 1.3.1.3. Sinh sản của tế bào nấm men Ở nấm men có 3 hình thức sinh sản Sinh sản sinh dưỡng: là hình thức sinh sản đơn giản nhất của nấm men. Có 2 hình thức sinh sản sinh dƣỡng: nảy chồi và hình thức phân đôi tế bào nhƣ vi khuẩn. Ở hình thức nảy chồi, từ một cực của tế bào mẹ nảy chồi thành một tế bào con, sau đó hình thành vách ngăn ngang giữa hai tế bào. Tế bào còn có thể tách khỏi tế bào mẹ hoặc có thể dính với tế bào mẹ và lại tiếp tục nảy chồi làm cho nấm men giống nhƣ hình dạng cây xƣơng rồng tai nhỏ. Sinh sản đơn tính: bằng hai hình thức bào tử túi và bào tử bắn. Sinh sản hữu tính: do hai tế bào nấm men kết hợp với nhau hình thành hợp tử. Hợp tử phân chia thành các bào tử nằm trong nang, nang chín bào tử 12 đƣợc phát tán ra ngoài. Nếu 2 tế bào nấm men có hình thái kích thƣớc giống nhau tiếp hợp với nhau thì đƣợc gọi là tiếp hợp đẳng giao. Nếu 2 tế bào nấm men khác nhau thì gọi là tiếp hợp dị giao [13]. Hình 1.1. Sự đa dạng của tế bào nấm men 1.3.2. Nấm mốc Nấm mốc phát triển ở quả, chất bã của quá trình sản xuất rƣợu vang, thùng chứa thiết bị hoặc không khí đƣa đến nhƣ nấm mốc thuộc chi Rhizopus, Aspergillus [4], [13]. 1.3.3. Vi khuẩn lactic Trong dịch quả cũng nhƣ trong vang thƣờng gặp khá nhiều loài vi khuẩn lactic, trong đó có rất nhiều loài cần thiết cho quá trình sản xuất vang từ các loại quả giàu axit malic. Ví dụ các chủng vi khuẩn lên men lactic thuộc các giống Pediococus và Leuconostoc. Ngày nay, ngƣời ta xác định cả các vi khuẩn lactic lên men đồng hình nhƣ: Lactobacillus plantarum, L.casie và các vi khuẩn lên men lactic dị hình: L.buchneri, L.brevis đều có thể lên men [8], [14]. 1.3.4. VSV làm hỏng vang Có không ít các loài vi khuẩn làm cho vang bị đục, có vi chua, mùi khó chịu làm chi vang bị hỏng nhƣ: 13 Pichia, Candida,… là các loại nấm men tạo màng trên bề mặt vang, phân giải đƣờng thành các acid hữu cơ: xitric, axetic… làm cho vang bị đục, độ chua tăng cao, vị không ngon [2], [3]. Các chủng vi khuẩn thuộc Acetobacter oxy hóa etylic thành axit axetic và CO2. 1.4. Các yếu tố ảnh hƣởng đến sự sinh trƣởng và phát triển của tế bào nấm men Nguồn cacbon Các hợp chất hữu cơ khác nhau nhƣ các loại đƣờng và dẫn xuất, rƣợu, axit hữu cơ, axit amin... có thể là nguồn dinh dƣỡng cacbon của nấm men, trong đó nguồn đƣờng là chủ yếu. Nấm men có thể sử dụng nhiều nguồn đƣờng khác nhau nhƣ glucozo, saccarozo, maltozo... Hợp chất cacbon chiếm vị trí hàng đầu cho sự sống của nấm men. Nguồn nitơ vô cơ và hữu cơ Nitơ rất cần cho sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men, đa số nấm men không đồng hóa đƣợc nitrat mà chỉ có khả năng sử dụng các muối amon ở dạng hòa tan, có thể là đạm hữu cơ hoặc vô cơ. Nguồn nito hữu cơ thƣờng dùng là axit amin, pepton, ure, amid. Đạm vô cơ là là các muối amon khử nitrat, sulfat… Ngồn photpho vô cơ Photpho có vai trò quan trọng đối với tế bào nấm men, là nguyên liệu tổng hợp axit nucleic, các enzim, các hợp chất cao năng ATP,… Nguồn nguyên tố khoáng Trong môi trƣờng dinh dƣỡng cần có một lƣợng khoáng P, S, Mg, Fe, Mn... để đảm bảo cho sự phát triển của tế bào nấm men. 14 Oxi Cần trong giai đoạn đầu giúp nấm men sinh trƣởng, tăng sinh khối hóa của quá trình lên men rƣợu diễn ra trong điều kiện yếm khí. Vitamin Các vitamin, các purin và prymidin là nhân tố sinh trƣởng cơ bản của nấm men. Nhóm nấm men không sinh sắc tố thƣờng sử dụng các vitamin nhóm B, nhóm sinh sắc tố đỏ cần tiamin, axit paraminobenzoic. Nhiều loại vitamin có tác dụng tăng cƣờng sự hoạt hóa của một số enzim trong quá trình lên men rƣợu [3], [10]. 15 CHƢƠNG 2 NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Đối tƣợng nghiên cứu Dịch nho Cabernet sauvignon Các chủng nấm men tuyển chọn từ nguồn nguyên liệu là dịch quả nho Cabernet sauvignon 2.2. Trang thiết bị và hóa chất 2.2.1. Trang thiết bị Tủ sấy, tủ ấm, box cấy vô trùng, máy li tâm, kính hiển vi quang học, bình tam giác, hộp peptri, ống nghiệm, nồi khử trùng cao áp, máy lắc ổn, đèn cồn… 2.2.2. Hóa chất Glucozo, fructozo, mantozo... Cao nấm men, pepton, (NH4)2SO4... Thuốc nhộm: Fucsin, Lugon... MgSO4.7H20, K2HPO4, axit axetic, aga... 16 2.3. Các loại môi trƣờng 2.3.1. Môi trường Hansen (g/l) Hóa chất g/l Đƣờng glucoza 50 Pepton 5 MgSO4.7H20 0,5 K2HPO4 1 (NH4)2SO4 1 Thạch Agar 20 Nƣớc 1000ml 2.3.2. Môi trường nhân giống (g/l) Hóa chất g/l Đƣờng glucoza 50 Pepton 5 MgSO4.7H20 0,5 K2HPO4 1 (NH4)2SO4 1 Nƣớc 1000ml 17 2.3.3. Môi trường lên men (g/l) Hóa chất g/l Dịch siro hoa quả 200ml MgSO4.7H20 0,5 K2HPO4 1 (NH4)2SO4 1 Nƣớc 1000ml 2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Phương pháp phân lập trên hộp petri Để chọn một tập hợp tế bào nấm men ta sử dụng phƣơng pháp phân lập trên hộp petri. Môi trƣờng để tuyển chọn các lạc khuẩn nấm men là môi trƣờng Hansen (môi trƣờng 1). Cách làm: Môi trƣờng phân lập đƣợc vô trùng và đƣợc phân bố vào các hộp vô trùng petri để nguội theo phƣơng pháp Pasteur. Dịch nho đƣợc pha loãng từ 10-1 – 10-9 bằng nƣớc cất. Dùng pipet đã vô trùng nhỏ 1 – 2 giọt huyền phù với độ pha loãng từ 10-5 – 10-9 lên bề mặt thạch rồi dùng que trang dàn đều. Gói kín lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 28 – 300C trong 3 ngày. Sau 3 ngày trên bề mặt thạch sẽ xuất hiện những khuẩn lạc đặc trƣng cho nấm men [6]. 2.4.2. Phương pháp hoạt hóa giống Trƣớc khi đƣa vào môi trƣờng lên men để có những tế bào to khỏe ta tiến hành hoạt hóa giống bằng cách nuôi trên môi trƣờng thạch nghiêng 28 – 300C trong 24h. Sau đó cấy vào dịch nhân giống trong 24h đƣợc giống cấp 2 [2]. 18 2.4.3. Phương pháp xác định hoạt lực lực lên men của nấm men Để xác định hoạt lực lên men của nấm men so sánh giữa các chủng ta dung các phƣơng pháp sau: Phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng: dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250ml môi trƣờng, cùng có một lƣợng trung bình nấm men của các giống khác nhau. Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng khi chênh lệch giữa 2 lần là 0,1 thì dừng lại [8]. 2.4.4. Phương pháp quan sát hình dạng tế bào trên kính hiển vi Quan sát hình thái tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần. 2.4.5. Phương pháp đếm SLTB bằng buồng đếm Goriaev Đây là phƣơng pháp đếm trực tiếp SLTB VSV trong mẫu phân tích. Pha loãng dịch huyền phù VSV đến 10-n, nhỏ 1 giọt dung dịch huyền phù ở độ pha loãng (n) vào giữa buồng đếm và đậy lá kính, di chuyển nhẹ buồng đếm cho dịch chiếm đầy khoang. Đếm SLTB theo các ô theo đƣờng chéo hoặc theo các góc ở trung tâm buồng đếm. Thƣờng đếm 4 ô lớn ở 4 góc và một ô lớn ở trung tâm của buồng đếm để tính SLTB trung bình của ô lớn. Sau đó dùng công thức sau để tính số tế bào trong 1ml lúc đầu [6]. 2.4.6. Phương pháp phân tích Xác định hàm lƣợng đƣờng bằng khúc xạ kế. Xác định độ cồn bằng ancol kế và phƣơng pháp hóa học. Xác định độ pH bằng giấy đo pH. Xác định hàm lƣợng axit tổng dung dịch lên men bằng cách dựa vào nguyên tắc trung hòa axit bằng dung dịch NaOH 0,1N. Từ số ml dung dịch NaOH 0,1N dùng để chuẩn độ ta suy ra đƣợc hàm lƣợng axit có trong dung dịch [2], [6]. 19 2.4.6. Phương pháp xác định khả năng kết lắng Khả năng kết lắng của nấm men đƣợc xác định dựa trên tốc độ lắng của sinh khối. 2.4.7. Phương pháp cảm quan Cảm nhận và quan sát bằng mắt thƣờng 2.4.8. Phương pháp xử lý kết quả bằng thống kê toán học Chúng tôi xử lý các kết quả thống kê thí nghiệm theo một số phƣơng pháp nhƣ: Số trung bình cộng: dùng để tính giá trị trung bình của các lần lặp lại thí nghiệm: X 1 n Xi n i 1 n Trung bình bình phƣơng các sai lệch: (X i 1 i X )2 n 1 Sai số đại diện của trung bình cộng: 2.5. Địa điểm thực hiện đề tài Phòng thí nghiệm VSV, khoa Sinh – KTNN, Trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 20 CHƢƠNG 3 KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập chủng nấm nem có khả năng lên men rƣợu vang từ dịch nho Cabernet sauvignon Để phân lập các chủng nấm men ngƣời ta sử dụng môi trƣờng Haxen thanh trùng theo phƣơng pháp Pasteur sau đó chia vào các đĩa peptri đã vô trùng. Tiến hành: Chuẩn bị 10 ống nghiệm định mức, dùng pipet hút 9ml nƣớc cất vào mỗi ống. Lấy 1ml dịch quả cho vào ống thứ nhất (dịch pha loãng ở 10 1 ). Sau đó lại hút 1ml dịch ở ống thứ nhất cho vào ống thứ 2 đƣợc dung dịch có độ pha loãng 10-2. Làm tƣơng tự với các ống tiếp theo cho đến ống 9 sẽ có độ pha loãng 10-9. Có thể chọn ở các nồng độ 10-6 – 10-9. Dùng giấy báo gọi lại và nuôi trong tủ ấm ở nhiệt độ từ 25 – 300C. Sau 4 – 5 ngày lấy ra quan sát [16]. Trên bề mặt thạch ta thấy xuất hiện những khuẩn lạc, dựa vào hình thái khuẩn lạc nấm men ta chọn những khuẩn lạc to, tròn, lồi, nhẵn bóng có màu trắng đục đặc trƣng cho nấm men. Hình 3.1. Chủng nấm men phân lập được trên môi trường thạch đĩa 21 Kết quả phân lập, chúng tôi chọn đƣợc ra 15 mẫu nấm men (kí hiệu từ T1 đến T15). Sau khi đo kích thƣớc khuẩn lạc chúng tôi chia số mẫu trên thành các nhóm đƣợc miêu tả tại bảng sau: Bảng 3.2. Đặc điểm hình thái và kích thước của nấm men trong các mẫu phân lập Nhóm Mẫu nấm men Đặc điểm hình thái khuẩn lạc Kích thƣớc Tròn, màu trắng ngà, bề mặt trơn 1 T2, T8, T13, T14 nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có 1.5 – 2mm tâm, bờ không có răng cƣa 2 3 T3, T6, T7, T10, T12, T15 T1, T4, T5, T9, T11 Tròn, màu trắng ngà, bề mặt trơn nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có 2 – 2.5mm tâm, bờ không có răng cƣa Tròn, màu trắng ngà, bề mặt trơn nhẵn, nhìn nghiêng lồi, không có >2.5mm tâm, bờ không có răng cƣa Từ kết quả thể hiện qua bảng trên, chúng tôi tiến hành tuyển chọn đƣợc 5 mẫu khuẩn lạc có kích thƣớc lớn đƣờng kính >2mm, trơn, bóng, nhẵn đƣợc kí hiệu là T1, T4, T5, T9, T11dùng làm đối tƣợng nghiên cứu tiếp theo và tạm gọi là các chủng nấm men. Sau đó các khuẩn lạc này đƣợc cấy sang các ống thạch nghiêng đã có sẵn môi trƣờng Hansen vô trùng để giữ giống, sau 2 – 3 ngày lấy ống thạch nghiêng ra quan sát. 22 Hình 3.2. Cấy truyền chủng nấm men T1, T4, T5, T9, T11 trên môi trường thạch nghiêng Kết quả, chúng tôi đã phân lập 15 mẫu nấm men, dựa vào hình thái và kích thước khuẩn lạc tôi chọn sơ bộ được 5 chủng là T1, T4, T5, T9, T11. 3.2. Tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men rƣợu vang từ nho Cabernet sauvignon Việc tuyển chọn đƣợc chủng nấm men có chất lƣợng tốt cho quá trình lên men rƣợu Cabernet sauvignon chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm men dựa vào đặc tính sinh học nhƣ: Khả năng lên men các loại đƣờng. Khả năng đồng hóa các muối nitrat. Khả năng hình thành bào tử kết hợp quan sát khuẩn lạc. Quan sát hình dạng tết bào trên kính hiển vi. Sinh sản nảy chồi từ nhiều phía [12]. 3.2.1. Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm men Cách tiến hành: Các mẫu nấm menT1, T4, T5, T9, T11 đƣợc lên men ở môi trƣờng lên men (MT3) trong các bình lên men có dung tích 100 ml với HL đƣờng ban đầu là 250 g/l, HL men giống ban đầu 10%, pH: 4, nhiệt độ 26 23 – 280C. Sau 72h, đem cân trọng lƣợng bình ban đầu sau đó mở nắp bình lên men, tiếp tục đem cân trọng lƣợng bình thấy trọng lƣợng bình giảm đi. Đó chính là lƣợng CO2 sinh ra trong quá trình lên men. Lƣợng CO2 sinh ra càng nhiều thì trọng lƣợng bình càng giảm, chứng tỏ hoạt lực lên men càng cao. Kết quả thu đƣợc ở bảng sau: Bảng 3.3. Hoạt lực lên men của các chủng nấm nem sau 72h Chủng nấm men Lƣợng CO2 (g/100ml) T1 2.85 ± 0.02 T4 3.02 ± 0.02 T5 1.97 ± 0.03 T9 2.10 ± 0.02 T11 2.67 ± 0.01 Kết quả nghiên cứu cho thấy 3 chủng T1, T4, T11 có lƣợng CO2 thoát ra nhiều đạt 2.67 – 3.02 g/100ml chứng tỏ tế bào nấm men phát triển nhanh làm cho vi khuẩn và nấm men dại khó xâm nhập. Các chủng T5, T9 có lƣợng CO2 thoát ra ít hơn (1.97 – 2.10 g/100ml). Như vậy, 3, chủng T1, T4 và T11 có hoạt lực lên men mạnh. 3.2.2. Khả năng lên men đường Xác định khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men thu đƣợc chúng tôi tiến hành xác định HL đƣờng sót và nồng độ cồn trong dịch lên men. Các chủng nấm men đƣợc đƣa vào môi trƣờng dịch quả 100ml, HL đƣờng 250g/l, pH: 4, nhiệt đô 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 106 tế bào/ml. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.4. 24 Bảng 3.4. Khả năng lên men của các chủng nấm men ở các loại đường khác nhau Chủng nấm men Chỉ tiêu đánh giá T1 T4 250 ±0.02 250 ± 0.02 250 ± 0.02 250 ± 0.02 250 ± 0.02 4.2 ± 0.01 5.0 ± 0.01 6.2 ± 0.01 6.3 ± 0.02 5.4 ± 0.02 10.2 ± 0.02 10.4 ± 0.03 7.1 ± 0.05 6.9 ± 0.02 9.8 ± 0.04 Đƣờng tổng số (g) HL đƣờng sót (%) HL cồn (%V) T5 T9 T11 Từ kết quả ở bảng, chúng tôi thấy 3 chủng T1, T4 và T11 lên men có HL đƣờng sót (4.2 – 5.4%), thấp hơn so với các chủng T5 6.2% và T9 6.3%, HL cồn và hiệu suất lên men của 3 chủng T1, T4 và T11 cũng cao nhất sau đó là các chủng T5, T9. Như vậy, 3 chủng T1, T4 và T11 có khả năng lên men đường mạnh. 3.2.3. Khả năng kết lắng Trong quá trình lên men khả năng kết lắng tốt sẽ làm cho dịch lên men trong, lọc sản phẩm dễ hơn [13]. Chúng tôi tiến hành bằng cách hòa sinh khối nấm men thu đƣợc vào dung dịch đệm axetat rồi lắc trên máy lắc với tốc độ 200 vòng/phút TG 3 – 5 phút và để lắng 15 phút. Chúng tôi thu đƣợc kết quả ở bảng 3.5. Bảng 3.5. Khả năng kết lắng của ba chủng nấm men Tên chủng T1 T4 T5 T9 T11 26.2 23.5 19.5 20.7 24.8 Chiều cao cột sinh khối (mm) 25 Kết quả nghiên cứu cho thấy, các chủng T1, T4 và T11 có lớp cặn men >23mm, do đó chúng có khả năng kết lắng tốt, cho dịch lên men trong hơn 2 chủng còn lại. Kết luận cho thấy 3 chủng T1, T4 và T11 có khả năng kết lắng tốt. 3.2.4. Khả năng tạo hương thơm và độ trong của sản phẩm Sau khi lên men đƣợc 30 ngày, chúng tôi tiến hành xác định khả năng tạo hƣơng thơm, độ trong bằng phƣơng pháp cảm quan. Từ kết quả cho thấy 3 chủng nấm men T1, T4 và T11 đạt độ trong và hƣơng thơm tốt hơn 2 chủng còn lại. Tổng hợp các kết quả từ các thí nghiệm trên cho thấy chủng nấm men T1, T4 và T11 có khả năng lên men tốt nhất và tạo sản phẩm có nhiều ƣu điểm. Vì vậy, chúng tôi chọn chủng T1, T4 và T11 để tiếp tục nghiên cứu. 3.2.5. Xác định tên khoa học của chủng nấm men nghiên cứu Sau đó tôi tiến hành quan sát hình thái tế bào học của các mẫu nấm men bằng cách làm tiêu bản sau đó soi trên kính hiển vi Olympus CX31với độ phóng đại 1000 lần. Hình 3.3.Tế bào nấm men trên kính hiển vi quang học có độ phóng đại 1000 lần Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1971) [15], và các kết quả thí nghiệm đối với các chủng nấm men T1, T4 và T11 đặc tính: 26 Khuẩn lạc có hình tròn, màu trắng, viền xung quanh nhẵn (hình 3.1). Tế bào đều có hình ovan, hình trứng, hình cầu (hình 3.3) Sinh sản bằng hình thức nảy chồi (hình 3.3) Có khả năng lên men các loại đƣờng nhƣ saccaroza, glucoza… Điều kiện không thuận lợi hình thành 1 – 4 bào tử. Từ đó có thể khẳng định đƣợc 3 chủng nấm men phân lập đƣợc từ dịch nho Cabernet sauvignon là S. cerevisiae thuộc chi Saccharomyces. Chúng tôi đặt tên là S. cerevisiae T1, S. cerevisiae T4 và S. cerevisiae T11. Tổng hợp kết quả ở các phần 3.2.1, 3.2.2, 3.2.3, 3.2.4 cho thấy 3 chủng T1, T4 và T11 là chủng tốt, có hoạt lực lên men cao, và kết lắng cao, chất lƣợng cảm quan tốt. Như vậy, từ dịch nho Cabernet sauvignon tuyển chọn được 3 chủng T1, T4 và T11 làm đối tượng để tiếp tục nghiên cứu tiếp theo. 3.3. Đánh giá sự đa dạng của nấm men dựa vào khả năng sử dụng các nguồn dinh dƣỡng và điều kiên nuôi cấy 3.3.1. Khả năng sử dụng nguồn cacbon khác nhau 3.3.1.1. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đường Nguồn dinh dƣỡng cacbon của nấm men rất đa dạng, chúng có thể là các loại đƣờng và dẫn xuất, các rƣợu, các axit hữu cơ, axit amin... Trong đó nguồn dinh dƣỡng cacbon đƣợc ƣu tiên sử dụng là các loại đƣờng. Để xác định khả năng lên men với các loại đƣờng của mẫu T1, T4, T11 chúng tôi sử dụng phƣơng pháp lên men trong các bình lên men có thể tích 100 ml bằng cách lấy từng mẫu vào 3 loại môi trƣờng lên men (mỗi môi trƣờng ứng với một loại đƣờng đƣợc bổ sung) với HL đƣờng ban đầu là 250 g/l, HL men giống 10%, pH: 4, nhiệt độ 26 – 280C với TG lên men là 8 ngày. 27 Chúng tôi dựa vào một số chỉ tiêu sau để đánh giá khả năng lên men các loại đƣờng là: HL đƣờng sót. HL cồn. Lƣợng CO2 tạo thành. Kết quả thu đƣợc sau 8 ngày lên men đƣợc thể hiện ở bảng 3.6. Bảng 3.6. Khả năng sử dụng đa dạng các loại đường trong dịch lên men của 3 chủng nấm men T1, T4 và T11 Chỉ tiêu Loại đƣờng Glucozo Saccarozo Mantozo Chủng nấm HL đƣờng sót men (%) T1 5.3 ± 0.2 9.8 ± 0.2 T4 5.1 ± 0.1 10.0 ± 0.2 T11 4.9 ± 0.2 9.7 ± 0.2 T1 7.3 ± 0.2 8.2 ± 0.1 T4 7.7 ± 0.3 7.7 ± 0.1 T11 7.8 ± 0.1 8.6 ± 0.2 T1 9.2 ± 0.1 5.7 ± 0.3 T4 9.7 ± 0.3 5.5 ± 0.2 T11 9.6 ± 0.3 5.8 ± 0.3 Etanol (%V) Từ kết quả tên ta nhận thấy chủng S. cerevisiae T1, T4 và T11 có khả năng sử dụng cả 3 loại đƣờng glucozo, saccarozo và mantozo. Tuy nhiên khả năng sử dụng các loại đƣờng là khác nhau. Với đƣờng saccarozo: nấm men có khả năng hấp thụ tốt, lƣợng CO 2 thoát ra nhiều chứng tỏ hoạt lực lên men mạnh, cho sinh khối nấm men lớn, sản phẩm tạo ra có mùi thơm nhẹ. 28 Đƣờng mantozo: nấm men hấp thụ mạnh hơn cho sinh khối lớn, sản phẩm tạo ra cho chất lƣợng cảm quan tốt với hƣơng thơm, màu sắc và độ trong cao. Đƣờng glucozo: đây là loại đƣờng thích hợp cho lên men rƣợu vang, lƣợng CO2 thoát ra nhiều, sinh khối tăng cao. Sản phẩm cho chất lƣợng tốt. còn đối với môi trƣờng có đƣờng saccaroza và mantozo có khả năng lên men nhƣng không mạnh bằng. Kết quả nghiên cứu của tôi phù hợp với tác giả Phạm Thị Vƣợng [16]. Như vậy, 3 chủng nấm men sử dụng được cả 3 loại đường glucozo, saccarozo và mantozo. Tuy nhiên glucozo là nguồn đường thích hợp với quá trình lên men vang nho. 3.3.1.2. Khả năng lên men ở các hàm lượng đường khác nhau Đƣờng là nguồn cacbon đóng vai trò quan trọng nhất trong việc tạo thành rƣợu trong vang nho. Để nghiên cứu ảnh hƣởng của HL đƣờng tới quá trình lên men vang nho, chúng tôi chọn HL đƣờng ban đầu ở các mức khác nhau là: 230g/l, 250g/l, 270g/l, 290g/l. Môi trƣờng lên men đƣợc bổ sung với HL men giống là 10%, pH: 4, tiến hành lên men ở nhiệt độ 26 – 280C trong các bình lên men có dung tích 100ml với TG lên men là 8 ngày [10]. Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.7. 29 Bảng 3.7. Khả năng lên men của chủng S.cerevisiae T1, T4 và T11 trên môi trường có hàm lượng đường ở các mức khác nhau HL đƣờng (g/l) Đơn vị Chỉ tiêu HL đƣờng sót (%) Etanol (%V) 230 250 270 290 T1 5.6 ± 0.2 3.4 ± 0.2 6.0 ± 0.2 9,2 ± 0.2 T4 5.0 ± 0.2 3.1 ± 0.2 6.5 ± 0.2 9.8 ± 0.2 T11 4.9 ± 0.2 3.0 ± 0.2 6.7 ± 0.2 9.5 ± 0.2 T1 9.7 ± 0.1 11.6 ± 0.1 10.5 ± 0.1 8.7 ± 0.1 T4 10.4 ± 0.1 11.7 ± 0.1 10.8 ± 0.1 9.3 ± 0.1 T11 10.2 ± 0.1 12.0 ± 0.1 11.4 ± 0.1 9.2 ± 0.1 Kết quả cho thấy trong môi trƣờng có HL đƣờng 25% thì lƣợng rƣợu tạo thành cao 11.6 – 12.0%, HL đƣờng sót trong dịch lên men thấp chỉ còn 3.0 – 3.4%. Với mẫu có HL đƣờng 29% thì nấm men phát triển kém, HL đƣờng sót cao tới 9.2 – 9.8%, HL cồn tạo ra thấp 8.7 – 9.2%, do vậy rất khó bảo quản và ổn định chất lƣợng của vang trong quá trình tàng trữ. Kết quả nghiên cứu của tôi phù hợp với một số tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Thế Trang [10] [15]. Từ kết quả trên tôi xác định HL đường thích hợp cho quá trình lên men vang nho đối với chủng S. cerevisiae N1 là 25%. Tổng hợp kết quả nghiên cứu từ 3.3.1.1 và 3.3.1.2, chúng tôi nhận thấy nguồn đường glucozo là thích hợp cho quá trình lên men của chủng S. cerevisiae T1, T4 và T11 và HL đường thích hợp cho quá trình này là 25%. 30 3.3.2. Ngiên cứu sự đa dạng dựa vào khả năng sử dụng các nguồn nitơ khác nhau 3.3.2.1. Sự đa dạng từ việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ Nguồn nitơ ảnh hƣởng trực tiếp đến sự sinh trƣởng và phát triển của nấm men. Trong lên men ngƣời ta thƣờng sử dụng nguồn nitơ vô cơ để tránh gây mùi cho sản phẩm. Tiến hành khảo sát khả năng sử dụng nguồn nitơ của 3 chủng nấm men với các muối (NH4)2SO4, NH4Cl, NH4OHnồng độ 0.2‰. HL men giống 10%, nuôi cấy trên may lắc trong TG 4 – 5 ngày với tốc độ 150 vòng/phút. Sau đó chúng tôi tiến hành đếm SLTB nấm men trên 1ml dịch lên men để xác định sự phát triển của chủng nấm men S. cerevisiae T1, T4 và T11 . Kết quả đếm đƣợc dẫn ra ở bảng 3.8. Bảng 3.8. Sự đa dạng từ việc sử dụng các nguồn nitơ vô cơ của các chủng nấm men Loại nitơ (NH4)2SO4 NH4Cl NH4OH Chủng nấm men SLTB (x. 106) T1 124 ± 0.2 T4 129 ± 0.2 T11 120 ± 0.2 T1 105 ± 0.2 T4 98 ± 0.2 T11 103 ± 0.2 T1 89 ± 0.2 T4 95 ± 0.2 T11 102 ± 0.2 Kết quả cho thấy, khả năng sử dụng nguồn nitơ của các chủng nấm men rất đa dạng. Chúng phát triển tốt trên môi trƣờng dinh dƣỡng chứa(NH4)2SO4, NH4Cl, NH4OH. Tuy nhiên tùy từng môi trƣờng mà chúng phát triển mạnh hay không. 31 NH4OH: Đây là nguồn nitơ dễ hấp thụ với tế bào nấm men, nó tạo cho nấm men có khả năng trao đổi chất tốt. Do đó lƣợng CO2 thoát ra nhiều, khả năng tích tụ cao, cho sinh khối nấm men lớn. NH4Cl: Nấm men hấp thụ mạnh hơn do đó sinh khối nấm men lớn hơn, sản phẩm tạo ra có màu sắc và độ trong cao, mùi vị khá ngon. (NH4)2SO4: Nguồn nitơ này nấm men có thể hấp thụ mạnh nhất, lƣợng CO2 thoát ra rất mạnh. Do nguồn nitơ ở dạng NH4+ gần với tiền chất của nitơ hữu cơ nấm men dễ sử dụng, sinh khối tăng cao. Sản phẩm cho chất lƣợng cảm quan tốt. Kết quả nghiên cứu này phù hợp với một số tác giả Vũ Thu Hồng, Trần Thị Tâm [8], [14]. Vì vậy, chúng tôi thấy rằng nguồn nitơ vô cơ mà các chủng nấm men sử dụng rất đa dạng có thể là (NH4)2SO4, NH4Cl hoặc NH4OH. Tuy nhiên thích hợp là (NH4)2SO4. 3.3.2.1. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 ở các hàm lượng khác nhau tới quá trình lên men. Nghiên cứu xác định HL (NH4)2SO4 phù hợp nhất đối với sự phát triển của chủng nấm men S.cerevisiaeT1, T4 và T11 chúng tôi tiến hành thí nghiệm nghiên cứu trong môi trƣờng lên men, HL đƣờng 250g/l, pH: 4, HL men giống 10%, (NH4)2SO4 ở các nồng độ 0.1‰, 0.2‰, 0.3‰, 0.4‰, 0.5‰, với TG lên men là 7 – 9 ngày. Kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra ở bảng 3.9. 32 Bảng 3.9. Ảnh hưởng của (NH4)2SO4 ở các hàm lượng khác nhau tới quá trình lên men Nồng độ (NH4)2SO4‰ Đơn vị Chỉ tiêu 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 HL đƣờng T1 5.7 4.6 4.7 6.5 7.7 sót T4 5.9 4.8 4.0 6.6 7.5 (%) T11 5.8 4.0 4.1 5.8 7.9 T1 7.7 9.9 9.6 8.5 8.4 T4 8.4 10.5 10.2 8.2 7.8 T11 8.8 10.7 10.6 9.0 7.6 T1 3.5 3.8 3.9 3.4 3.1 T4 3.7 3.9 4.2 3.5 3.1 T11 3.4 3.9 4.0 3.2 3.0 Etanol (%V) pH Từ kết quả ở bảng 3.9 chúng tôi thấy rằng khả năng sử dụng (NH4)2SO4 ở các HL khác nhau rất đa dạng. Nồng độ (NH4)2SO4 trong khoảng 0.2‰ – 0.3‰ thích hợp cho quá trình lên men. Vì ở nồng độ này dịch lên men có HL đƣờng sót thấp từ 4.0 – 4.6 g/l, HL cồn ở mức 9.6 – 10.7%V. Bên cạnh đó chúng ta thấy rằng nồng độ (NH4)2SO4 trong dịch lên men tăng 0.4 – 0.5‰ thì HL đƣờng sót cũng tăng 5.8 – 7.9‰, trong khi đó độ cồn đạt đƣợc giảm do pH của dung dịch thay đổi làm rối loạn quá trình TĐC của tế bào nấm men. Nếu ít 0.1‰ sẽ làm tốc độ lên men yếu, HL đƣờng sót cũng tăng, HL cồn giảm. Kết quả nghiên cứu phù hợp với các tác giả Đinh Thị Kim Nhung, Vũ Thu Hồng [8], [10]. 33 Như vậy, 3 chủng nấm men phát triển tốt trong môi trường chứa (NH4)2SO4 ở các HL khác nhau. Tuy nhiên chúng tôi quyết định chọn nguồn nitơ vô cơ từ (NH4)2SO4 với HL 0.2‰ – 0.3‰ để bổ sung vào dịch lên men. Tổng hợp kết quả nghiên cứu từ 3.3.2.1 và 3.3.2.2, chúng tôi nhận thấy chủng S. cerevisiae T1, T4 và T11 sử dụng (NH4)2SO4 với HL 0.2‰ – 0.3‰ là thích hợp cho quá trình lên men vang nho. 3.3.3. Nghiên cứu khả năng lên men ở các độ pH khác nhau đến quá trình lên men Trong quá trình lên men rƣợu vang pH luôn luôn thay đổi đã ảnh hƣởng tới quá trình lên men. Để xác định khả năng lên men của các chủng lên men ở các độ pH khác nhau, chúng tôi tiến hành lên men trong các bình tam giác 100 ml, HL đƣờng 250g/l, nhiệt độ 25 – 280C, số lƣợng giống ban đầu 3,5 x 106 KH2PO4 0.8% ở pH biến đổi khác nhau (pH: 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5). pH đƣợc điều chỉnh bằng dung dịch NaOH 0.1N, dung dịch axit axetic 98% và đo độ pH bằng giấy đo pH. Xác định lƣợng CO2 thoát ra sau 48h nuôi cấy, kết quả nghiên cứu đƣợc dẫn ra bảng 3.10. Bảng 3.10. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau pH Chủng 3 3.5 4 4.5 5 T1 + + ++++ ++++ ++ T4 + ++ ++++ ++++ + T11 + + +++ ++++ + 34 Trong đó: ++++: HL CO2 đƣợc tạo ra > 30g/l dịch lên men +++ : HL CO2 đƣợc tạo ra từ 20 – 30 g/l dịch lên men ++ : HL CO2 đƣợc tạo ra trên 10 – 20 g/l dịch lên men + : HL CO2 đƣợc tạo ra trên < 10 g/l dịch lên men Từ kết quả thu đƣơc chúng tôi thấy rằng 3 chủng T1, T4, T11 có khả năng lên men mạnh ở môi trƣờng có pH cao (pH: 4.5), HL CO 2 đƣợc tạo ra lớn > 30g/l dịch lên men. Ở pH: 3 – 4 HL CO2 đƣợc tạo ra thấp dƣới 30g/l dịch lên men,môi trƣờng axit ức chế quá trình sinh trƣởng của tế bào nấm men. Ở pH > 5 HL CO2 đƣợc tạo ra cũng thấp < 10 g/l các tế bào nấm men phát triển chậm môi trƣờng dịch lên men thuận lợi cho nấm mốc phát triển ảnh hƣởng đến chất lƣợng rƣợu. Nhƣng thực tế pH: 4 – 4.5 là phù hợp với pH dịch quả do đó chủng T1, T4 và T11 vẫn là chủng có khả năng lên men tốt nhất. Như vậy, 3 chủng nấm men có khả năng lên men ở các độ pH từ 3 – 5. Tuy nhiên chúng tôi thấy pH: 4 – 4.5 là phù hợp với nhất đối với sự phát triển của 3 chủng nấm men T1, T4 và T11. 35 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận 1.1. Kết quả nghiên cứu, dựa vào đặc điểm hình thái, kích thƣớc khuẩn lạc chúng tôi đã phân lập đƣợc 15 mẫu nấm men sau đó chọn sơ bộ đƣợc 5 chủngT1, T4, T5, T9 và T11. 1.2. Tuyển chọn đƣợc các chủng nấm men có khả năng sinh trƣởng, phát triển, hoạt lực lên men cao 2.67 – 3.02 (g/100ml), HL đƣờng sót trong dịch lên men thấp >3.4% , độ lắng của 5 chủng nấm men cao. Sau đó chọn đƣợc 3 chủng T1, T4 và T11 có các chỉ tiêu cao hơn cả rồi tiến hành quan sát tế bào trên kính hiển vi quang học với độ phóng đại 1000 lần. Căn cứ vào khóa phân loại của Lodder (1971) chúng tôi xác định đƣợc tên của các chủng nấm men chọn đƣợc là S. cerevisiae T1, S. cerevisiae T4,S. cerevisiae T11. 1.3. Đánh giá sự đa dạng của các chủng nấm men dựa vào dựa trên khả năng sử dụng nguồn dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy. Sử dụng đa dạng các nguồn đƣờng glucozo, saccarozo, mantozo. Tuy nhiên glucozo là thích hợp với hàm lƣợng là 25%. Khả năng sử dụng đa dạng các nguồn nitơ (NH4)2SO4, NH4Cl hoặc NH4OH. Tuy nhiên thích hợp là (NH4)2SO4 ở nồng độ 0.2 – 0.3‰. Khả năng lên men ở các độ pH khác nhau (pH: 3; 3.5; 4; 4.5; 5; 5.5), nhƣng phù hợp là pH: 4 – 4.5. 2. Kiến nghị Với kết quả thu đƣợc, chúng tôi mong muốn chủng nấm men đã đƣợc lựa chọn ở trên cùng với những kết quả nghiên cứu sẽ đƣợc áp dụng vào sản xuất rƣợu vang nho Cabernet sauvigon ở Việt Nam, góp một phần nhỏ vào thị trƣờng vang trong nƣớc cũng nhƣ với mong muốn vang Việt sẽ vƣơn tầm ra thế giới. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO [1]. Nguyễn Thị Trân Châu, Trần Thị Áng (2011). Hóa sinh hoc, Nxb Giáo dục (pp 156 – 161) [2]. Nguyễn Lân Dũng và cộng tác viên (1976). Một số phƣơng pháp nghiên cứu vi sinh vật tập II, III, Nxb Khoa học kỹ thuật [3]. Nguyễn Thành Đạt (1979). Vi sinh học đại cƣơng, Nxb Giáo dục [4]. Nguyễn Thành Đạt, Mai Thị Hằng (2000). Sinh học vi sinh vật, Nxb Giáo dục [5]. Nguyễn Thị Hào (2010). Phân lập, tuyển chọn chủng nấm men có khả năng lên men vang táo mèo, Khóa luận tốt nghiệp trường ĐHSP Hà Nôi 2 [6]. Mai Thị Hằng, Đinh Thị Kim Nhung, Vƣơng Trọng Hào (2011), Thực hành vi sinh vật học, Nxb Đại học Sư phạm [7]. Vũ Công Hậu (1982). Chế vang trái cây trong gia đình, Nxb Nông nghiệp [8]. Vũ Thu Hồng (2012). Nghiên cứu ảnh hưởng của nitơ tới quá trình lên men rượu vang, Khóa luận tốt nghiệp Đai học Sư phạm Hà Nội 2 [9]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Phƣơng Châm, Đặng Thị Thu Hiền (1998). Tuyển chọn chủng nấm men dùng cho lên men rượu vang, Thông báo khoa học trường ĐHSP Hà Nội 2, số 1 [10]. Đinh Thị Kim Nhung, Nguyễn Ngọc Linh (2011). Nghiên cứu ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng tới sự phát triển của chủng S.cerevisiae H2 và H8, Thông báo khoa học, trường ĐHSP Hà Nội 2, số 1 (pp 300 – 310) 37 [11]. Lƣơng Đức Phẩm (2004). Công nghệ vi sinh vật,Nxb Nông nghiệp HN (pp 237 – 243) [12]. Lƣơng Đức Phẩm (2009). Nấm men công nghiệp, Nxb Khoa học và kĩ thuật [13]. Lê Xuân Phƣơng (2011). Vi sinh vật học công nghiệp, Nxb Giáo dục [14]. Trần Thị Tâm (2014). Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men trong lên men kombucha từ trà Thái Nguyên, Luận văn thạc sĩ, trường ĐHSP Hà Nội 2 [15]. Nguyễn Thế Trang, Nguyễn Văn Hiếu, Lƣơng Đức Phẩm, Trần Đình Mấn, Nguyễn Thị Diễn (2001). Phân lập và tuyển chọn các chủng nấm men S. cerevisiae sp phù hợp với yêu cầu sản xuất rượu vang từ dịch quả nho,Tuyển tập báo cáo khoa học Hội nghị Quốc tế Sinh học Hà Nội 7/2001, Nxb Nông nghiệp Hà Nội, tập 2 (pp 476 – 481) [16]. Phạm Thị Vƣợng (2014). Nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cacbon đến quá trình lên men rượu vang, Khóa luận tốt nghiệp đại học Sư phạm Hà Nội 2 [17]. J. Lodder (1971). “The yeast. A taxonomic study”, North Holland. Publ. Co. Amsterdam London [18]. Mark Berkowitz (September/October năm 1996). “World's Earliest Wine”, Archaeology(Archaeological Institute of America) 49 (5), truy cập ngày 13 tháng 1 năm 2011 [19]. David Keys (28 tháng 12 năm 2003), “Now that's what you call a real vintage: professor unearths 8,000-year-old wine”,The Independent (independent.co.uk), bản gốc lƣu trữ 15 tháng 5, 2011, truy cập ngày 13 tháng 1 năm 2011. 38 [...]... tiến hành đề tài nghiên cứu: Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men có khả năng lên men rượu vang nho Cabernet sauvignon” 2 Mục tiêu của đề tài Nghiên cứu sự đa dạng của nấm men có khả năng lên men rƣợu vang nho Cabernet sauvignon, từ đó áp dụng vào sản xuất để tạo ra một loại vang mới có chất lƣợng cao 3 Nội dung của đề tài 3.1 Phân lập các chủng nấm men có khả năng lên men rƣợu vang từ nho Cabernet sauvignon... chủng nấm men có khả năng lên men và định loại chủng nấm men đã tuyển chọn đƣợc 3.3 Đánh giá mức độ đa dạng sinh học của các chủng nấm men dựa vào nguồn dinh dƣỡng và điều kiện nuôi cấy 4 Ý nghĩa lý luận và thực tiễn của đề tàì 4.1 Ý nghĩa lý luận Nghiên cứu đƣợc sự đa dạng của các chủng nấm men phân lập từ dịch nho Cabernet sauvignon Kết quả nghiên cứu này là giữ liệu góp phần bổ sung cho các nghiên cứu. .. thì TG nhân giống và lên men vang sẽ bị kéo dài hơn, vang dễ bị nhiễm khuẩn Ngƣợc lại HL men giống trong dịch lên men càng cao thì TG lên men sẽ ngắn hơn, hạn chế đƣợc khả năng nhiễm khuẩn do sự áp đảo của nấm men với các VSV khác Thƣờng tỉ lệ men giống là 10% Ảnh hưởng của SO2: Nấm men có khả năng chịu đƣợc sự ức chế hơi SO2 tăng hiệu suất lên men. Vậy để đạt đƣợc hiệu suất lên men cao nhất chúng ta... Ảnh hưởng của TG lên men: TG là yếu tố quan trọng ảnh hƣởng đến chất lƣợng sản phẩm vang Trong TG lên men chính, nếu TG lên men quá ngắn, có thể lƣợng cồn tạo ra quá ít Trong TG lên men phụ, nếu TG lên men không đủ để hƣơng hình thành, mùi vang sẽ không đặc trƣng Đối với đa số nấm men, TG lên men chính tốt nhất là 7 – 20 ngày TG lên men phụ và tàng trữ của các loại rƣợu phải từ vài tháng trở lên [1]... chứng tỏ tế bào nấm men phát triển nhanh làm cho vi khuẩn và nấm men dại khó xâm nhập Các chủng T5, T9 có lƣợng CO2 thoát ra ít hơn (1.97 – 2.10 g/100ml) Như vậy, 3, chủng T1, T4 và T11 có hoạt lực lên men mạnh 3.2.2 Khả năng lên men đường Xác định khả năng lên men đƣờng của các chủng nấm men thu đƣợc chúng tôi tiến hành xác định HL đƣờng sót và nồng độ cồn trong dịch lên men Các chủng nấm men đƣợc đƣa... trình lên men Nếu nhiệt độ 350C đây là nhiệt độ nguy hiểm nấm men mất tác dụng, quá trình lên men ngừng lại nhƣng nấm men không bị chết Nếu nhiệt độ > 350C quá trình lên men ngừng lại ảnh hƣởng đến sự chuyển đƣờng thành cồn và CO2 Nhiều công trình nghiên cứu về sản xuất rƣợu vang đã xác định khoảng nhiệt độ tối ƣu cho nấm men vang phát triển là 25 – 280C [11] Oxi: Hầu hết các chủng nấm men trong lên men. .. trong sản xuất là chủng S.cerevisiae Chủng nấm men này có khả năng lên men dịch có HL đƣờng cao và tạo đƣợc 20 – 30%V cồn, khả năng lắng kết và tạo hƣơng vị cho vang tốt [3], [4] 1.3.1.2 Hình thái và cấu trúc của tế bào nấm men Hình thái của tế bào nấm men thƣờng có dạng hình cầu, ovan hoặc hình trứng kích thƣớc tƣơng đối lớp: đƣờng kính khoảng 7µm Hình dạng có thể thay đổi tùy thuộc vào điều kiện môi... rƣợu vang là loại êm 6 Vang sủi: có bọt khí Vang sủi lại có nhiều loại nhƣ vang ít bọt (perlant), vang bọt vừa phải (petillant) hay vang nhiều bọt (mousseux) mà tiêu biểu là rƣợu champagne [11] 1.1.4 Các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men Nhiệt độ: Nhiệt độ lên men có ảnh hƣởng đến đời sống của nấm men, đến quá trình lên men và chất lƣợng của sản phẩm Nếu nhiệt độ < 200C sự lên men chậm chạp Nhiệt... chủng nấm men có chất lƣợng tốt cho quá trình lên men rƣợu Cabernet sauvignon chúng tôi tiến hành tuyển chọn các chủng nấm men dựa vào đặc tính sinh học nhƣ: Khả năng lên men các loại đƣờng Khả năng đồng hóa các muối nitrat Khả năng hình thành bào tử kết hợp quan sát khuẩn lạc Quan sát hình dạng tết bào trên kính hiển vi Sinh sản nảy chồi từ nhiều phía [12] 3.2.1 Xác định hoạt lực lên men của các mẫu nấm. .. lực lực lên men của nấm men Để xác định hoạt lực lên men của nấm men so sánh giữa các chủng ta dung các phƣơng pháp sau: Phƣơng pháp cân bình trọng lƣợng: dịch lên men trong các bình có cùng thể tích 250ml môi trƣờng, cùng có một lƣợng trung bình nấm men của các giống khác nhau Sau 24h lên men đem cân trọng lƣợng khi chênh lệch giữa 2 lần là 0,1 thì dừng lại [8] 2.4.4 Phương pháp quan sát hình dạng tế