Đang tải... (xem toàn văn)
... vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào thực vật xét cho kĩ thuật điều khiển phát sinh hình thái tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời điều kiện nhân tạo vô trùng) [4], [6] 1.2.2 Hiện trạng nuôi cấy mô. .. giống giảm giá thành thực nghiên cứu đề tài: Nhân nhanh hoa Dã yên thảo (petunia hybrida) kĩ thuật nu i m t o th vật Mục đích nghiên cứu Nhân giống hoa Dã yên thảo (petunia hybrida) phƣơng pháp... [3] 1.1.4 Một số đặc điểm hoa Dã yên thảo 1.1.4.1 Các loại Dã yên thảo Hoa Dã yên thảo có ba loại: Dã yên thảo đơn: bụi, có nhiều hoa nhƣng hoa có lớp cánh, đƣờng kính hoa lên tới 5-7,5 cm, dễ
TRƢỜNG ĐẠI HỌC SƢ PHẠM HÀ NỘI 2 KHOA SINH - KTNN =====***===== NGUYỄN THÙY VÂN NHÂN NHANH CÂY HOA DÃ YÊN THẢO (PETUNIA HYBRIDA NG THU T NU I CẤY M T ÀO TH C V T HÓA LU N TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Sinh lý học thực vật Ngƣời hƣớng dẫn khoa học Th.s La Việt Hồng HÀ NỘI - 2015 LỜI CẢM ƠN Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Th.s La Việt Hồng – Khoa Sinh KTNN Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2 đã tận tình hƣớng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin cảm ơn tới các Ban Giám hiệu trƣờng ĐHSP Hà Nội 2, Ban Chủ nhiệm khoa Sinh – KTNN trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo mọi điều kiện để tôi hoàn thành khóa luận này. Trong thời gian thực hiện đề tài tôi cũng nhận đƣợc sự giúp đỡ tận tình của cô Mai Thị Hồng – Phòng thí nghiệm Sinh lý thực vật, thầy Ong Xuân Phong - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ đã giúp đỡ, đóng góp ý kiến để tôi hoàn thành đề tài khóa luận, nhân đây tôi cũng xin gửi lời cảm ơn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn tập thể cán bộ Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ, Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng thí nghiệm Thực vật- trƣờng ĐHSP Hà Nội 2 đã tạo điều kiện thuận lợi về thiết bị, phƣơng tiện để tôi có thể hoàn thành khóa luận này. Cảm ơn gia đình và bạn bè đã luôn động viên, góp ý cho tôi trong qua trình học tập và hoàn thành đề tài. Hà Nội, ngày 10 tháng 04 năm 2015 Sinh viên NGUYỄN THÙY VÂN LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận là trung thực và chƣa đƣợc ai công bố. Hà Nội,10 tháng 04 năm 2015 Sinh viên NGUYỄN THÙY VÂN DANH MỤC CÁC CHỮ VI T TẮT NAA: Napthlacetic acid BAP: 6-Benzyl amino purin MS: Murashige và Skoog Tp.HCM: Thành phố Hồ Chí Minh Nxb: Nhà xuất bản Ctv Cộng tác viên DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Các công thức thí nghiệm xác định hiệu quả của chất khử trùng .. 18 Bảng 2.2. nh hƣởng của P và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên thảo ........................................................................................................... 19 Bảng 2.3. nh hƣởng của -N và nƣớc d a đến tạo rễ cây Dã yên thảo in vitro ................................................................................................................. 20 ảng 2.4. nh hƣởng của giá thể tới t lệ sống của ã yên thảo ................... 21 Bảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng đối với chồi cây hoa Dã yên thảo ........... 23 Bảng 3.2. nh hƣởng của nồng độ P và Kinetin đến hệ số nhân chồi cây Dã yên thảo...................................................................................................... 29 Bảng 3.3 nh hƣởng của -N và nƣớc d a đến sự hình thành rễ ở cây ã yên thảo ........................................................................................................... 31 ảng 3.4: nh hƣởng của giá thể tới rèn luyện cây ngoài tự nhiên ............... 33 DANH MỤC HÌNH Hình 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trƣởng ........................ 23 cây Dã yên thảo ............................................................................................... 23 Hình 3.2. hồi cây hoa Dã yên thảo. (Trái) mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy, (Phải) mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy........................... 24 Hình 3.3. ác bƣớc đơn giản tạo vật liệu in vitro t đỉnh sinh trƣởng của cây Dã yên thảo...................................................................................................... 25 Hình 3.4. Quá trình phát sinh phôi ở cây 2 lá mầm (Arabidopsis) ................. 27 Hình 3.5. Quá trình phát sinh phôi soma của cây Dã yên thảo....................... 28 Hình 3.6 nh hƣởng của nồng độ P và Kinetin đến hệ số nhân nhanh t chồi cây hoa Dã yên thảo ................................................................................ 29 Hình 3.7. Cụm chồi Dã yên thảo sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung BAP......................................................................................................... 30 Hình 3.8. Tạo rễ cây ã yên thảo in vitro ....................................................... 32 Hình 3.9. ã yên thảo trong giai đoạn rèn luyện ............................................ 34 Hình 3.10. ã yên thảo in vitro đã ra hoa ngoài tự nhiên ............................... 34 Hình 3.11. Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo in vitro ..................................... 35 MỤC LỤC MỞ ĐẦU ........................................................................................................... 1 1. Lý do chọn đề tài ........................................................................................... 1 2. Mục đích nghiên cứu ..................................................................................... 2 3. Nội dung nghiên cứu ..................................................................................... 2 4. Ý nghĩa của đề tài .......................................................................................... 2 N I UNG ....................................................................................................... 3 HƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU ........................................................... 3 1.1. Giới thiệu về cây Dã yên thảo (petunia hybrida)....................................... 3 1.1.1. Vị trí, phân loại ....................................................................................... 3 1.1.2. Mô tả ....................................................................................................... 3 1.1.3. Nguồn gốc, phân bố ................................................................................ 4 1.1.4. Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo.............................................. 5 1.1.5. K thuật chăm sóc hoa ã yên thảo........................................................ 7 1.2. Sơ lƣợc về nhân giống in vitro ................................................................... 8 1.2.1. ơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực vật.................................... 8 1.2.2. Hiện trạng nuôi cấy mô ở Việt Nam ....................................................... 9 1.2.3. Thành phần môi trƣờng dinh dƣỡng trong nuôi cấy mô ........................ 9 1.3. Các nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Dã yên thảo. ........................ 13 HƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP ............................................ 15 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu............................................................ 15 2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu ................................................................. 15 2.2.1. Đối tƣợng nghiên cứu............................................................................ 15 2.2.2. Thiết bị và dụng cụ................................................................................ 15 2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy. ............................................................................. 16 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro .................................................................... 17 2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu.......................................................................... 17 2.3.1. Bố trí thí nghiệm ................................................................................... 17 2.3.2. Nội dung nghiên cứu ............................................................................. 17 2.3.3. Phƣơng pháp phân tích số liệu .............................................................. 21 HƢƠNG 3: KẾT QU VÀ TH O LUẬN .................................................. 22 3.1. Tạo vật liệu khởi đầu in vitro t chồi cây hoa Dã yên thảo ..................... 22 3.2. Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phƣơng pháp tạo cụm chồi in vitro .. 26 3.2.1. Quan sát sự phát sinh hình thái trong quá trình tạo mô sẹo Dã yên thảo in vitro ............................................................................................................. 26 3.2.2. nh hƣởng của P và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên thảo .................................................................................................................. 28 3.3. Tạo rễ cây Dã yên thảo in vitro ( nh hƣởng của -N và nƣớc d a đến khả năng tạo rễ) ............................................................................................... 30 3.4. Rèn luyện cây Dã yên thảo in vitro ngoài môi trƣờng tự nhiên............... 32 HƢƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ .................................................. 36 4.1. Kết luận .................................................................................................... 36 4.2. Kiến nghị .................................................................................................. 36 TÀI LIỆU THAM KH O ............................................................................... 37 MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài Sau những phút giây bận bịu với công việc, mỗi ngƣời có thể tìm cho mình những thú chơi tao nhã giúp xả stress. ó ngƣời đến trung tâm thể dục thể thao, bơi lội để rèn luyện sức khỏe, có ngƣời lại tìm tới các lớp nấu ăn, làm đẹp, cũng có ngƣời lại ở nhà xem tivi, máy tình hay chơi điện tử… ên cạnh đó, có không ít ngƣời tìm đến thú vui trồng hoa để có khoảng không gian thoáng đảng với những chậu hoa rực rỡ sắc màu [13]. Xã hội đô thị hóa đất chật ngƣời đông với những ngƣời yêu thích cây xanh thì việc có một mảnh vƣờn trồng cây thì thật khó. Vì vậy việc tận dụng ban công để trồng hoa quả là ý kiến sáng suốt. Hiện nay việc trồng hoa trang trí ban công đang rất thịnh hành và đƣợc ƣa chuộng đặc biệt là các khu đô thị. Mỗi sớm thức dậy bạn có thể ra đứng hít thở khí trời, ngắm nhìn ánh bình minh hay ngắm cảnh mặt trời mọc, làm nhƣ thế nào để ngôi nhà nhỏ xinh của bạn trông quyến rũ, phong cách mà không cần ban công quá cầu kì. Xu hƣớng tận dụng ban công để làm đẹp cho ngôi nhà của mình ngày càng trở nên ƣa chuộng, đặc biệt đối với những ngôi nhà có diện tích không lớn, không thể đủ để thiết kế một sân vƣờn, hay một không gian thoáng rộng nơi mặt đất. Kết hợp ban công sắt với họa tiết trang trí đơn giản điểm tô một vài chậu hoa là ý kiến sáng tạo cho trang trí ngôi nhà bạn. Chỉ cần chút khéo léo kết hợp ban công sắt với cây cảnh, cỏ cây hoa lá, bạn sẽ sở hữu một không gian độc đáo ấn tƣợng [14]. Nhƣng giá thành của một số loài hoa, cây cảnh vẫn khá cao trong đó có hoa ã yên thảo – “nữ hoàng hoa ban công”. Hoa Dã yên thảo đƣợc du nhập vào nƣớc ta hiện nay chủ yếu là nhân giống t hạt. Tuy nhiên theo Verdork (2005) cây hoa Dã yên thảo có hạt nhỏ và rất chậm để xử lý nhân giống bằng hạt. Đối với nhân giống bằng cành thì hệ số nhân 1 thấp, không đồng đều nên chƣa thể đáp ứng nhu cầu khi cần trồng cây với số lƣợng lớn, đồng loạt. Trong khi đó nuôi cấy mô là một phƣơng pháp hiệu quả trong nhân giống. Để chủ động trong việc sản xuất cây giống và giảm giá thành chúng tôi thực hiện nghiên cứu đề tài: “Nhân nhanh cây hoa Dã yên thảo (petunia hybrida) bằng kĩ thuật nu i m t o th vật” 2. Mục đích nghiên cứu Nhân giống cây hoa Dã yên thảo (petunia hybrida) bằng phƣơng pháp tạo cụm chồi trong điều kiện in vitro. 3. Nội dung nghiên cứu - Tạo vật liệu in vitro t chồi đỉnh cây Dã yên thảo (petunia hybrida) - nh hƣởng của P đến khả năng tạo cụm chồi của cây Dã yên thảo (petunia hybrida) in vitro . - nh hƣởng của – N đến khả năng ra rễ của cây Dã yên thảo (petunia hybrida) in vitro. 4. Ý nghĩa của đề tài - Ý nghĩa lí luận: Góp phần bổ sung vào nguồn tài liệu nghiên cứu về nhân giống in vitro cây Dã yên thảo (petunia hybrida). - Ý nghĩa thực tiễn: Góp phần sản xuất cây giống ã yên thảo có hiệu quả cao, chất lƣợng tốt. 2 NỘI DUNG CHƢƠNG 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Giới thiệu về cây Dã yên thảo (petunia hybrida) 1.1.1. tr phân loại Giới: Plantea(Thực vật) Giới phụ: Tracheobionta Ngành: Magnoliophyta Ngành phụ: Spermatophyta Lớp: Magnoliopsida Lớp phụ: Asteridae Bộ: Solanales Họ: Solanaseae H nh 1.1. Hoa D yên thảo Giống: Petunia Tên khoa học: Petunia hybrida (petunia hybrida) Tên thông thƣờng: Petunia Tên việt nam: Dạ yên thảo, Dã yên thảo [15]. 1.1.2. Mô tả Dã yên thảo là cây sống hằng năm, cây cao 15 - 30 cm. Thân có lông mịn bao quanh, phân nhánh t các nách lá thật, một nách lá có thể phân nhiều nhánh. Lá đơn, mọc đối hay luân phiên, mặt trên và dƣới của lá có phủ lớp lông mịn. Lá hình oval, mềm mại, mép nguyên không có răng cƣa. Hoa cô độc, mọc trên một cọng dài 2 - 3 cm, đài hoa cao 1 - 2,5 cm. Hoa lƣỡng tính gồm 5 tiểu nhụy gắn ở phần dƣới của ống vành. Nang hủy ngăn thành hai mảnh, hạt nhiều và rất nhỏ [2]. Hoa Dã yên thảo nguyên thủy có hình phễu, tuy nhiên sự lai tạo đã cho nhiều dạng hoa khác nhau nhƣ: hoa cánh đơn, hoa cánh kép với mép có viền và gợn sóng, mép dúng hình cung 3 nhọn ở giữa. Màu sắc hoa có thể thay đổi t tía đến trắng, tía đến đỏ, đỏ đến cam, tím đến tím nhạt. Đặc biệt nhiều loại Dã yên thảo trắng thuần khiết hay xanh nhạt pha hơi đỏ (màu hoa oải hƣơng) có mùi thơm dịu dàng. Dã yên thảo là cây nhất niên, nở hoa vào mùa hè. Dã yên thảo ƣa sáng, sẽ trở nên mảnh khảnh và ít hoa nếu trồng trong tối. Cây thích hợp với điều kiện độ ẩm v a phải, có thể sống trong điều kiện hơi khô nhƣng không thích ứng với điều kiện ngập úng. Cây thích hợp với khí hậu nóng và ẩm, không chịu đƣợc nhiệt độ quá lạnh hay quá nóng. Dã yên thảo trồng đƣợc trên hầu hết các loại đất, nhƣng tốt nhất là đất màu mỡ, đất có pH t 6.0 – 7.0. Bấm đọt để kích thích cây đâm nhánh tạo độ rũ cho cây, nếu cây ốm yếu hay sau khi cho hoa rộ thì cũng nên tỉa lá bớt để cây phục hồi lại. Dã yên thảo thƣờng bị chết vì úng nƣớc, vì vậy cần tƣới nƣớc đúng liều lƣợng, không tƣới nƣớc lên lá và nụ tránh làm thối lá và nụ, cải thiện điều kiện vệ sinh và duy trì ẩm độ thích hợp. Ngoài ra, Dã yên thảo thƣờng bị héo rũ do nấm, bị thối nhũn do vi khuẩn cũng nhƣ sâu, sên, rệp cắn phá. Một số bệnh virus cũng ảnh hƣởng nhiều đến cây nhƣ làm biến dạng lá, cây chậm phát triển, hoa không có màu và hình dạng thay đổi, thân tàn lụi liên tục, thối đỉnh, lá có những sọc xanh sáng, bị lốm đốm và héo, có khi kết dính thành cụm [16]. 1.1.3. Nguồn gốc phân bố Hoa ã yên thảo thuộc chi 35 của một loài thực vật có hoa, liên quan chặt chẽ với cây thuốc lá, cà chua, khoai tây và ớt thuộc họ cà Solanaceae) [11]. Cây hoa Dã yên thảo có nguồn gốc t các nƣớc miền Nam châu M , hiện nay đƣợc gây trồng rộng rãi ở các bãi cỏ, các khu đất rộng, vƣờn hoa khắp nƣớc ta. Ở miền bắc, hoa nở vào dịp hè thu, còn ở miền nam, hoa nở vào dịp Tết. Cây có nhiều tên gọi khác nhau, theo Phạm Hoàng Hộ (2000) cây có tên là dã yên, theo Trần Hợp (2000) có tên là cây hoa cà. 4 Đây là một loại cây lai mà tổ tiên có t nhiều loài khác của chi petunia, ví nhƣ P.axillaris BSP (Large White Petunia) hoa dạng ống hẹp, màu trắng, hoặc P. violacea Lindl. (Violet-flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím. Ngày nay, các nhà vƣờn t loài lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất đẹp [3]. 1.1.4. Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo 1.1.4.1. Các loại Dã yên thảo Hoa Dã yên thảo có ba loại: Dã yên thảo đơn: cây bụi, có rất nhiều hoa nhƣng hoa chỉ có 1 lớp cánh, đƣờng kính của hoa lên tới 5-7,5 cm, dễ trồng và ít ảnh hƣởng đến sâu bọ. Cánh có thể đơn lớp và đa lớp, dạng gợn sóng. Hoa có thể có sọc, đốm hoặc viền quanh cánh với nhiều màu sắc khác nhau nhƣ đỏ tía, màu hoa cà, màu oải hƣơng, hồng, đỏ, trắng, vàng. Khi chạm vào lá và cuống hoa thấy hơi dính và có mùi thơm rất khác biệt. Dã yên thảo kép: hoa lớn với nhiều cánh, đƣờng kính của hoa có thể lên đến 13 cm. Dã yên thảo lƣợn sóng: là cây thân leo, mùi thơm benzen đặc trƣng vì trên cây có rất nhiều tinh dầu [17]. 5 Hoa ã yên thảo đơn Hoa ã yên thảo kép Hoa ã yên thảo biển sóng H nh 1.2. C c lo i D yên thảo ngoài tự nhiên 6 1.1.4.2. Cách trồng Dã yên thảo Có thể trồng bằng hai cách đó là giâm cành và trông t hạt, với cách trồng hoa dã yên thảo bằng hạt thì cần làm đất k và đủ ánh nắng trƣớc khi gieo hạt, hạt gieo 4-6 ngày sẽ cho cây con và có thể đem trồng ở vƣờn ƣơm sau 20 ngày. Sau 20 - 25 ngày nữa thì đem trồng ở vƣờn hoa, đất trồng cần đủ phân. Đối với cành giâm, sau 20 ngày đã có rễ và sau 1 tháng bứng trồng ở nơi cố định. ây chóng cho hoa, nhƣng nở rộ và chóng tàn, quả cần thu hoạch kịp thời (1g quả có 10.000 - 12.000 hạt) [18]. ã yên thảo thƣờng đƣợc côn trùng thụ phấn, ngoại lệ với loài P.exserta là một loài hiếm có hoa màu đỏ thì đƣợc chim ruồi thụ phấn. Hầu hết ã yên thảo là loài lƣỡng bôi có 14 nhiễm sắc thể [9], [10]. Những bông hoa hình ống đƣợc ƣa chuộng bởi một số loài Lepidoptera, bao gồm cả chim bƣớm (Hummingbird) [19]. 1.1.4.3. Nhượ điểm của hoa Dã yên thảo - Là cây thân thảo, nhạy cảm đặc biệt trƣớc các thay đổi của thời tiết và nhiệt độ cao mùa hè. - Không chịu đƣợc mƣa nhiều, không chịu úng (Chậu hoa nên đăt nơi không chịu mƣa trực tiếp). - Bộ rễ rất nhạy cảm với nhiệt độ ngoại cảnh, trên 36°C dễ bị nẫu bộ rễ khi nhiệt độ lên cao (nên che mát bồn chậu trồng khi ở nhiệt độ này). - Bị nhiễm nấm làm nhũn thối cổ rễ, hoặc khô teo tại gốc giữa các cành kết với thân chính do tổn thƣơng khi đóng gói vận chuyển. - Cây sẽ bị chết ngay do mất nƣớc (Khi cây thiếu nƣớc có biểu hiện héo rũ, bổ sung nƣớc lại cũng sẽ rất khó phục hồi do dã yên thảo có lá mỏng, hoa, lá nhiều,thân rỗng) vì vậy cần quan tâm bổ sung đều nƣớc [18]. 1.1.5. thu t chăm sóc hoa Dã yên thảo - Thƣờng ngắt ngọn khi cây còn nhỏ và để cây gia tăng số lƣợng mầm. 7 - Không trồng trong chậu quá nhỏ. Đất thịt, đất mịn quá là không thích hợp, không bền cây. - Khi cây quá già thực hiện cắt bớt thân ngọn, giữ gìn các phần thân (Thực hiện vào ngày mát) có thể thay đất hoặc chậu to hơn vào mùa xuân), bổ xung dinh dƣỡng cây sẽ bật mầm lộc dày và trong thời gian ngắn lại tiếp tục cho Hoa nhiều vì cây đƣợc trẻ hóa, lƣu ý đây là loài cây ƣa ẩm, háu ăn nhƣng chúng ta phải trồng bằng những giá thể thật xốp thoáng giàu chất hữu cơ. - Tránh đặt chậu cây nơi có gió lớn, cây hoa dễ bị tổn thƣơng. Khi cây già cỗi có biểu hiện lá nhỏ,cành gầy, sắc hoa không thắm, cần bổ xung thêm phân giàu đạm (có thể dùng nƣớc giải pha loãng) và tổng hợp dinh dƣỡng vi lƣợng - Tƣới nƣớc thƣờng xuyên, v a đủ. Trời ẩm không tƣới hoặc tƣới ít, trời hanh khô tƣới nhiều hơn: Kiểm tra độ ẩm bằng cách: Dùng que tre nhỏ cắm sâu vào giữa bầu đất: Que ƣớt: Th a nƣớc Que se ẩm: Đủ nƣớc Que sáng màu: Thiếu nƣớc [18]. 1.2. Sơ lƣợc về nhân giống in vitro 1.2.1. Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực v t ơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng totipotence) của tế bào. Theo Haberlandt G. (1902), nhà thực vật học ngƣời Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái sinh và phát triển thành cá thể hoàn chỉnh [8]. 8 Thực tế đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh t một tế bào riêng rẽ. Hàng trăm loài cây trồng đã đƣợc nhân giống trên quy mô thƣơng mại bằng cách nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [12] Nhƣ vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) [4], [6]. 1.2.2. Hiện trạng nuôi cấy mô ở iệt Nam Ở Việt Nam, công việc nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong khoảng năm 1977 ở Phân Viện Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh. Hiện nay có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô ở các Trƣờng Đại học, các Viện nghiên cứu, các Sở khoa học và Công nghệ ở các Tỉnh, Thành phố. Đà Lạt là nơi có nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô của tƣ nhân phục vụ cho công tác nhân giống hoa cảnh và rau củ [7]. 1.2.3. Thành phần môi trường dinh dưỡng trong nuôi cấy mô Đến nay có hàng trăm loại môi trƣờng dinh dƣỡng nhân tạo đã đƣợc xây dựng và thử nghiệm có kết quả. Hầu hết các loại môi trƣờng đều bào gồm những nhóm chất chính sau đây: 1. Các loại muối khoáng 2. Nguồn carbon 3. Vitamin 4. Các chất điều khiển sinh trƣởng 5. Các nhóm chất bổ sung 6. Chất độn [1]. Thành phần của môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan đƣợc nuôi cấy. Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhƣng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trƣờng sử 9 dụng cũng khác nhau khá cơ bản. Môi trƣờng nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và phát triển của mẫu cấy [3]. 1.2.3.1. Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dung trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi cấy mô và tế bào thực vật đƣợc phân chia thành 2 nhóm theo hàm lƣợng sử dụng: nhóm đa lƣợng và nhóm vi lƣợng. Các nguyên tố khoáng đa lƣợng. Bao gồm các nguyên tố khoáng đƣợc sử dụng ở nồng độ trên 30 ppm, tức là trên 30mg/l. Những nguyên tố đó là: N, S, P, K, Mg, Ca. - Nito N): Đƣợc sử dụng ở hai dạng NO3 và NH4 riêng rẽ hoặc phối hợp với nhau. - Lƣu huỳnh (S): Chủ yếu và tốt nhất là muối SO4. Các dạng ion khác nhƣ SO3 hoặc SO2 thƣờng kém tác dụng, thậm chí còn độc. - Phospho (P): Mô và tế bào thực vật nuôi cấy cso nhu cầu về phospho rất cao. Phospho là một trong thành phần cấu trúc phân tử acid nucleic. Ngoài ra khi phosphor ở dạng H2PO4- và HPO42- còn tác dụng nhƣ một hệ thống đệm (buffer) làm ổn định pH của môi trƣờng trong quá trình nuôi cấy. Các nguyên tố khoáng vi lƣợng. Là những nguyên tố đƣợc sử dụng ở nồng độ thấp hơn 30ppm. Đó là Fe, B, Mn, I, Mo, Cu, Zn, Ni, Co - Sắt (Fe): Thiếu sắt, tế bào mất khả năng phân chia. Fe thƣờng tạo phức hợp với các thành phần khác và khi pH môi trƣờng thay đổi phức hợp này thƣờng mất khả năng giải phóng Fe cho các nhu cầu trao đổi chất trong tế bào. Tốt nhất là nên sử dụng Fe ở dạng phức chelat với citrate hoặc với EDTA (Ethylen Diamin Tetraacetic Acid). T các phức chất này, Fe đƣợc giải phóng ra trong một phạm vi pH khá rộng. - Mangan (Mn): Thiếu Mn cũng làm cho hàm lƣợng các amino acid tự do và N tăng lên, nhƣng lƣợng RNA và sinh tổng hợp protein giảm dẫn đến kém phân bào. 10 - Bo (B): Thiếu trong môi trƣờng gây nên biểu hiện nhƣ th a auxin vì thực tế B làm cho các chất ức chế auxin oxydase trong tế bào giảm. Mô nuôi cấy có biểu hiện hóa mô sẹo mạnh, nhƣng thƣờng là loại mô sẹo xốp, mọng nƣớc, kém tái sinh. - Molypden Mo): là ion đóng vai trò co-factor trong hệ thống nitrat reductase, nhƣ vậy Mo tác động trực tiếp lên quá trình trao đổi đạm trong tế bào thực vật [1]. 1.2.3.2. Nguồn cacbon Mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro sống chủ yếu theo phƣơng thức dị dƣỡng, mặc dù ở nhiều trƣờng hợp chúng có thể sống bán dị dƣỡng nhờ điều kiện ánh sang nhân tạo và lục lạp có khả năng quang hợp. Vì vậy việc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy nguồn cacbon hữu cơ là điều bắt buộc. Nguồn cacbon thông dụng nhất đã đƣợc kiểm chứng là saccharose. Nồng độ thích hợp phổ biến là 2-3%. Tiếp đến là glucose và maltose cũng hay đƣợc đƣa vào môi trƣờng nuôi cấy. Các loại đƣờng khác nhƣ fructose, raffinose, lactose, galactose…cũng đã đƣợc thử nghiệm, nhƣng tỏ ra kém hiệu quả và chỉ đƣợc dùng trong những trƣờng hợp đặc biệt [1]. 1.2.3.3. Vitamin Mặc dù tất cả các loại mô và tế bào thực vật nuôi cấy in vitro có khả năng tự tổng hợp đƣợc hầu hết các loại vitamin, nhƣng thƣờng không đủ về lƣợng, do đó phải bổ sung thêm t bên ngoài vào, đặc biệt là các vitamin thuộc nhóm B [1]. Vitamin thƣờng đƣợc sử dụng nhất là Nicotinic acid, Pyridoxin (B6), Thiamin (B1), Myo- inositol [7]. 11 1.2.3.4. Các hỗn hợp ch t t nhiên Nƣớc d a: kết quả phân tích thành phần của nƣớc d a t non đến già của tulecke và ctv (1961) cho thấy, trong nƣớc d a có: amino acid tự do, amino acid dạng liên kết, axit hữu cơ, đƣờng, RNA và DNA Dịch chiết mầm lúa mỳ (mạch nha): thành phần hóa học chƣa đƣợc phân tích k , chủ yếu chứa một số đƣờng, vitamin và một số chất có hoạt tính điều khiển sinh trƣởng [1]. 1.2.3.5. Các ch t điều khiển sinh trưởng Auxin : Đƣợc gọi là hooc môn sinh trƣởng do Went và Thimann (1937) phát hiện, chủ yếu kích thích sinh trƣởng của tế bào, nhƣng cũng làm tăng phân bào. Có 4 loại auxin thƣờng đƣợc sử dụng trong nuôi cấy mô là: - Indolylacetic acid (IAA) tồn tại tự nhiên - Naphthylacetic acid (NAA) - 2,4-Dichlorphenoxyacetic acid (2,4-D) - Indolylbutyric acid (IBA) Riêng IAA là auxin tự nhiên, còn lại NAA, IBA và 2,4-D là các auxin nhân tạo. Thƣờng thì các enzyme nhân tạo có hoạt tính mạnh hơn do đặc điểm phân tử của chúng nên các enzyme oxy hóa auxin (auxinoxidase) không có tác dụng. Cytokinin: lần đầu tiên đƣợc Skoog (khoảng 1950) phát hiện trong một thí nghiệm chiết xuất acid nucleic bị sơ suất. 3 loại cytokynin chính thƣờng đƣợc dùng trong nuôi cấy mô là: kinetin, zeatin, BAP Trong thực tiễn nuôi cấy mô, ngƣời ta chỉ dùng zeatin trong những trƣờng hợp đặc biệt vì quá đắt, mà thƣờng sử dụng kinetin hoặc một sản phẩm tổng hợp nhân tạo là BAP. Hoạt lực của P cao hơn nhiều so với kinetin và bản thân BAP bền vững hơn zeatin dƣới tác động của nhiệt độ cao [1]. 12 1.2.3.6. Chất độn – th ch (Agar) Là một loại polysaccharide thu đƣợc t một số loại tảo (chủ yếu là tảo hồng Rhodophyta), trong đó có rau câu mọc ở vùng đầm phá Việt Nam (Glacia spp.) Đƣợc sử dụng làm chất đệm cho môi trƣờng dinh dƣỡng rắn lại. ở 80C thạch ngậm nƣớc chuyển sang trạng thái sol và ở 40C trở về trạng thái gel. Khả năng ngậm nƣớc của thạch là 6-12 thạch/1 lít nƣớc [1]. 1.2.3.7. Nước Nƣớc pha môi trƣờng cấy phải là loại nƣớc hoàn toàn sạch ion. Thông thƣờng ngƣời ta sử dụng nƣớc cất 2 lần và tốt nhất là sử dụng hệ thống cất nƣớc thủy tinh [1]. 1.2.3.8. Độ pH của m i trường Độ pH của môi trƣờng dinh dƣỡng ảnh hƣởng trực tiếp tới quá trình thu nhận các chất dinh dƣỡng t môi trƣờng vào tế bào. Vì vậy đối với mỗi loại môi trƣờng nhất định và đối với t ng trƣờng hợp cụ thể của loài cây phải chỉnh độ pH của môi trƣờng về mức ổn định ban đầu. Đối với mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thƣờng là 5,5-6,0. Sau 4 tuần nuôi cấy đạt đƣợc 6,0-6,5. Những thí nghiệm nuối cấy tế bào đơn hay tế bào trần trọng lƣợng môi trƣờng nhỏ thì việc chỉnh độ ph bắt buộc [1]. 1.3. C c nghiên cứu về nhân giống in vitro cây D yên thảo. - Kết quả nghiên cứu của Trần Nguyên Vũ và ctv. 1999) cho thấy các đoạn thân và lá của chồi non đang tăng trƣởng trong điều kiện in vitro đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MS có BA hoặc BA và NAA. Kết quả đƣợc ghi nhận trên giống hoa kép và hoa đơn sau 10 ngày nuôi cấy. T lệ (%) thành lập chồi cao nhất t mẫu cấy lá đƣợc ghi nhận trên môi trƣờng MS có 0,5 µM đối với giống hoa kép và 2 µM 13 đối với hoa đơn. hồi đƣợc tái tạo t lóng thân của cả hai giống trên môi trƣờng MS bổ sung 0,5 µM BA và 0,05 µM NAA. Việc bổ sung nƣớc d a 5% kích thích cho sự kéo dài chồi non. Cây con có bộ rễ khỏe mạnh đƣợc trồng thủy canh trong ½ MS trong 710 ngày trƣớc khi ra vƣờn ƣơm. - Theo Kedong 2001) môi trƣờng MS có bổ sung 1 mg/l cũng rất thích hợp cho sự tái sinh chồi t lá của cây hoa dã yên thảo. - Kết quả nghiên cứu của Huỳnh Ngọc Minh Tâm 2005) đã cho thấy môi trƣờng tốt nhất để nhân giống dã yên thảo gồm có: nƣớc cá, nồng độ đƣờng 50 g/l và auxin đƣợc chọn là N . Điều kiện thuần dƣỡng có tỉ lệ sống cao nhất là trùm bọc nilon kín trong vòng 1 tuần. - Theo kết quả nghiên cứu của Hassan và ctv.(2010) trong thí nghiệm nhân chồi thì số chồi dã yên thảo trung bình cao nhất với môi trƣờng bổ sung 0,8mg/l và N 0,1 mg/l. Đối với thí nghiệm tái sinh chồi t mẫu cấy lá của hoa dã yến thảo thì t lệ chồi đƣợc tái sinh là 45% đã đƣợc quan sát trong môi trƣờng MS có bổ sung BA 2 mg/l. - Theo Trần Quốc ƣờng (2011), môi trƣờng MS có bổ sung BA 2,0 mg/l NAA 0,5 mg/l cho t lệ chồi tái sinh t lá tốt là 88,9% và cho số chồi cao (4 chồi). Môi trƣờng MS có bổ sung TDZ 0,2 mg/l cho t lệ chồi tái sinh t lá đạt 100%, số chồi tái sinh cao nhất với 9,9 chồi, chiều cao chồi cao nhất là 2,3 cm. 14 CHƢƠNG 2: V T LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Thời gian và địa điểm nghiên cứu Thí nghiệm đƣợc tiến hành t tháng 7/2014 đến tháng 4/2015 tại Phòng thí nghiệm Sinh lí thực vật, Phòng nuôi cấy mô tế bào thực vật - Trung tâm Hỗ trợ Nghiên cứu Khoa học và Chuyển giao Công nghệ và Phòng thực vật học, Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 2.2. Vật liệu và thiết bị nghiên cứu 2.2.1. Đối tượng nghiên cứu Mẫu cây Dã yên thảo (petunia hybrida) thu ngoài tự nhiên, khi đỉnh sinh trƣởng cao khoảng 6-8cm tiến hành thu mẫu cho nghiên cứu nuôi cấy mô tại phòng Sinh lí thực vật - Trƣờng Đại học Sƣ phạm Hà Nội 2. 2.2.2. Thiết b và dụng cụ Các thiết bị: Tên thiết bị ân kĩ thuật Model & h ng sản xuất GM612, Đức Máy đo pH HM30G/TO , Đức Nồi hấp khử trùng HV – 110/HIR Y M , Nhật Tủ lạnh Hitachi 31AG5D, Thái lan Máy cất nƣớc hai lần Trung Quốc uồng cấy vô trùng AV – 110/TELSTAR Cân phân tích P224S, Đức Micropipet Jinson Pháp ác loại 200 - 1000µl) Tủ ấm Máy khuấy t gia nhiệt UNIVERS L 320R/ HETTI H, Đức ARE/VELP, Italia 15 Dụng cụ: Các loại bình tam giác, cốc thủy tinh, ống falcon (loại 50 ml, 15 ml,...), nút bông, giấy báo, giấy thấm, giấy bạc, túi nilon, dao, khay cấy, panh, kéo,... 2.2.3. Môi trƣờng nuôi cấy. Môi trƣờng sử dụng nuôi cấy là MS cải tiến (Murashige và Skoog, 1962): Khoáng đa lƣợng Khoáng vi lƣợng Sắt EDTA Vitamin Thành phần Nồng độ (mg/l) NH4NO3 1650 KNO3 1900 CaCl2.2H2O 440 MgSO4.7H2O 370 KH2PO4 170 MnSO4.4H2O 23,3 ZnSO4.7H2O 8,6 H3PO3 6,2 KI 0,83 Na2MoO4.2H2O 0,25 CuSO4.5H2O 0,025 CoCl2.6H2O 0,025 Na2.EDTA 37,3 FeSO4.7H2O 27,8 Myo-Inositol 100 Thiamin (B1) 0,5 Nicotinic acid 0,5 Pyridoxine (B6) 0,5 Glycine 2 16 Các chất điều hòa sinh trƣởng thực vật đƣợc sử dụng: BAP, NAA (mg/l). Các thành phần khác: Đƣờng saccarose: 30 g/l Agar: 8 g/l Môi trƣờng đƣợc điều chỉnh về pH=5,8 ± 0,05 (bằng NaOH 1N và HCl 1N) trƣớc khi hấp khử trùng bằng nồi hấp khử trùng ở 117oC, 1atm trong 15 phút đối với các dụng cụ thí nghiệm, dụng cụ thủy tinh không chứa môi trƣờng thì khử trùng ở 121oC, 1atm trong 15 phút). 2.2.4. Điều kiện nuôi cấy in vitro Thời gian chiếu sáng: 16 giờ sáng/ 8 giờ tối Nhiệt độ: 25 ± 2o C Độ ẩm: 50 – 60 % ƣờng độ ánh sáng: 2000 lux. 2.3. Phƣơng ph p nghiên cứu 2.3.1. Bố tr th nghiệm Thí nghiệm đƣợc bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, mỗi công thức đƣợc nhắc lại 3 lần, 50 mẫu/công thức. 2.3.2. Nội dung nghiên cứu 2.3.2.1. Thí nghiệm 1: T o vật liệu in vitro t chồi cây hoa D yên thảo. Chồi cây hoa Dã yên thảo đƣợc cắt dài khoảng 3 - 4 cm, cắt bỏ lá non, xử lý sơ bộ bằng cách: Rửa sạch nhiều lần dƣới vòi nƣớc máy, sau đó rửa trong dung dịch nƣớc xà phòng và đƣợc rửa lại bằng nƣớc cất 2-3 lần, đƣa mẫu vào trong tủ cấy vô trùng. Trong tủ cấy vô trùng: - Rửa chồi bằng nƣớc cất vô trùng. - Lắc etanol 70% (v/v) trong 2 phút. - Rửa lại 3 lần bằng nƣớc cất vô trùng. 17 - Lắc mẫu bằng hóa chất khử trùng với nồng độ và thời gian theo thí nghiệm. - Rửa lại 3 - 5 lần bằng nƣớc cất vô trùng. Chồi cây hoa Dã yên thảo đã khử trùng sơ bộ đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho thí nghiệm này theo các công thức bảng 2.1. ảng 2.1. C c công thức thí nghiệm x c định hiệu quả của chất khử trùng Công thức Chất xử lý/thời gian ĐC Xử lý sơ bộ T1 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/5 phút T2 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/10 phút T3 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/12 phút T4 Xử lý sơ bộ + Javen 5% (v/v)/15 phút T5 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/3 phút T6 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/5 phút T7 Xử lý sơ bộ + Javen 10% (v/v)/7 phút Mẫu cấy sau khi đƣợc khử trùng trong tủ cấy sẽ đƣợc cắt bỏ bề mặt tiếp xúc với chất khử trùng, vì các tế bào ở bề mặt tiếp xúc dƣới tác dụng của chất khử trùng mạnh dễ bị chết. Để đảm bảo cho chồi có thể hấp thụ chất dinh dƣỡng t môi trƣờng thì thao tác này rất quan trọng. Sau khi cắt tiến hành thấm khô mẫu, cấy vào bình tam giác có chứa môi trƣờng MS cơ bản. Đặt mẫu lên giàn nuôi cấy theo dõi t lệ mẫu nhiễm, t lệ mẫu sạch, t lệ mẫu sống sau 7 ngày nuôi cấy. Chỉ tiêu theo dõi: -T lệ mẫu nhiễm (%): (Tổng số mẫu nhiễm / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - T lệ mẫu sống (%): (Tổng số mẫu sống / Tổng số mẫu cấy vào)x100 - T lệ mẫu chết (%): (Tổng số mẫu chết / Tổng số mẫu cấy vào)x100 18 2.3.2.2. Thí nghiệm 2: Nhân nhanh cây Dã yên thảo bằng phương pháp tạo m chồi in vitro. Trong thí nghiêm này chúng tôi sử dụng BAP và Kinetin là 2 chất điều hoà sinh trƣởng thực vật thuộc nhóm ytokinin để tìm hiểu ảnh hƣởng của chúng đến khả năng tạo cụm chồi in vitro cây hoa Dã yên thảo. Chúng tôi bổ sung P với nồng độ thay đổi t 0 – 1 mg/l và kinetin nồng độ 0,3mg/l, 0,5mg/l vào môi trƣờng MS để tiến hành thí nghiệm. sạch ở thì nghiệm 1 đƣợc chuyển sang môi trƣờng có bổ sung ác mẫu P và Kinetin và theo dõi theo t ng tuần. a) Thí nghiệm 2a: Quan sát sự phát sinh hình thái trong quá trình tạo mô sẹo ã yên thảo in vitro. b) Thí nghiệm 2b: nh hƣởng của P và Kinetin đến khả năng tạo cụm chồi cây ã yên thảo ảng 2.2. Ảnh hƣởng của AP và inetin đến khả năng t o cụm chồi cây Dã yên thảo Công thức Thành phần môi trƣờng CT1 MS Đối chứng) CT2 MS + 0,5 mg/l BAP CT3 MS + 0,7 mg/l BAP CT4 MS + 1,0 mg/l BAP CT5 MS + 0,3 mg/l Kinetin CT6 MS + 0,5 mg/l Kinetin Chỉ tiêu theo dõi: Hệ số nhân chồi = ∑ chồi tạo thành / ∑ chồi đƣa vào 2.3.2.3. Thí nghiệm 3: Tạo rễ cây Dã yên thảo in vitro 19 Các chồi phát sinh sau khi thực hiện thí nghiệm 2 có kích thƣớc 2 – 3 cm đƣợc đƣa vào các môi trƣờng có bổ sung -NAA hoặc có bổ sung nƣớc d a với nồng độ khác nhau, nhằm xác định nồng độ -NAA và nƣớc d a thích hợp cho quá trình tạo rễ và tạo cây con khỏe mạnh. Nồng độ -N thay đổi t 0,1 – 0,5mg/l, nồng độ nƣớc d a thay đổi t 5% - 15%, các chồi sau khi cấy vào đƣợc theo dõi theo t ng tuần. ảng 2.3. Ảnh hƣởng của α-NAA và nƣớc d a đến t o rễ cây D yên thảo in vitro Công thức Thành phần môi trƣờng CT1 MS Đối chứng) CT2 MS + 0,1 mg/l NAA CT3 MS + 0,3 mg/l NAA CT4 MS + 0,5 mg/l NAA CT5 MS + 5% nƣớc d a CT6 MS + 10% nƣớc d a CT7 MS + 15% nƣớc d a Chỉ tiêu theo dõi: - Công thức nào tạo rễ (+) và công thức nào không tạo rễ (-) sau 4 tuần nuôi cấy. - hiều dài trung bình rễ cm), số rễ/chồi sau 4 tuần nuôi cấy. 2.3.2.4. h nghiệm 4 n u ện cây Dã yên thảo in vitro ngo i m i trường t nhiên Trong thí nghiệm này chúng tôi sử dụng cây in vitro đã hoàn chỉnh có đủ rễ, thân, lá để làm thí nghiệm. Để cho cây ra ngoài tự nhiên cần có túi bầu, giá thể thích hợp, cây ở ống nghiệm lấy ra nhẹ nhàng tránh làm gãy, rửa sạch thạch còn bám ở rễ cây không rũ tránh làm đứt rễ. Vì hệ rễ của cây còn yếu và chƣa thích nghi với 20 việc hút nƣớc, muối khoáng t đất lên khi cho cây ra ngoài chúng tôi sử dụng giá thể xốp nhƣ bảng 2.4. ảng 2.4. Ảnh hƣởng của gi thể tới t lệ sống của D yên thảo Giá thể Số cây cấy át ẩm 20 Đất thịt + cát + mùn cƣa 20 Tro trấu + sơ d a +đất thịt +cát 20 hỉ tiêu theo dõi là số cây chết và số cây sống sau 4 tuần. T lệ sống của cây = ( ∑ cây sống / ∑ cây cấy ) x 100 2.3.2. Phương pháp phân t ch số liệu Số liệu thu thập đƣợc xử lý thống kê bằng chƣơng trình Excel 2007 theo mô tả của Nguyễn Văn Mã và ctv, 2013 [5]. 21 CHƢƠNG 3: T QUẢ VÀ THẢO LU N 3.1. T o vật liệu khởi đầu in vitro t chồi cây hoa D yên thảo Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật trong đó có môi trƣờng MS) là môi trƣờng thích hợp cho nấm mốc và vi khuẩn phát triển. Khi môi trƣờng bị nhiễm mốc thì cây in vitro sẽ không sạch bệnh, cây giống ra ngoài môi trƣờng sau này cũng không bằng cây ngoài tự nhiên, nhƣ vậy thì nuôi cấy mô sẽ vô nghĩa. òn khi môi trƣờng bị nhiễm khuẩn thì cây in vitro sẽ bị thối và chết, chính vì vậy mà thí nghiệm nuôi cấy mô đòi hỏi mức độ vô trùng là tuyệt đối. Thí nghiệm 1 này có vai trò quyết định trong nuôi cấy mô tế bào, nếu thí nghiệm không thành công thì sẽ không có mẫu vô trùng để thực hiện các thí nghiệm tiếp theo. Mục đích của thí nghiệm 1 là tìm ra công thức khử trùng tối ƣu, v a vô trùng mà mẫu vẫn sống và sinh trƣởng tốt. ông thức khử trùng này phụ thuộc vào nồng độ các chất khử trùng, thời gian khử trùng, thao tác của ngƣời làm… Nếu nồng độ các chất khử trùng và thời gian khử trùng quá cao hoặc quá thấp thì khử trùng đều không cho kết quả tốt, bên cạnh đó thao tác của ngƣời làm cũng rất quan trọng. Trong khi thực hiện các thao tác ngƣời làm cần chú ý hạn chế cho tay ra khỏi buồng vô trùng, thƣờng xyên khử trùng tay bằng cách xịt cồn, khử trùng dụng cụ bằng cách đốt cồn. Kết quả cần đạt đƣợc trong thí nghiệm này là tạo đƣợc vật liệu khởi đầu mẫu đã vô trùng và sống tốt) để làm nguyên liệu phục vụ cho các thí nghiệm tiếp theo. Xử lý sơ bộ đóng vai trò quan trọng tới sự thành công của quá trình tạo vật liệu in vitro. Trong giai đoạn này, chúng tôi sử dụng etanol 70% để khử trùng sơ bộ, vì etanol là chất lỏng, có sức căng bề mặt thấp, tạo điều kiện cho các chất khử trùng khác có thể xâm nhập tốt hơn. hồi ã yên thảo sau khi xử lý sơ bộ đƣợc sử dụng làm nguyên liệu cho các công thức khử trùng nhƣ bảng 2.1. Kết quả sau khi đánh giá đƣợc thể hiện trong bảng 3.1 và hình 3.1 nhƣ sau: 22 ảng 3.1. Hiệu quả chất khử trùng đối với chồi cây hoa D yên thảo T lệ mẫu chết Công thức T lệ mẫu nhiễm (%) (%) Hiệu quả khử trùng (%) ĐC 100 0 0 T1 100 0 0 T2 46 24 30 T3 40 14 46 T4 18 28 54 T5 52 6 42 T6 10 32 58 T7 4 96 0 H nh 3.1 Hiệu quả chất khử trùng trên mẫu đỉnh sinh trƣởng cây D yên thảo 23 Kết quả cho thấy, mẫu khử trùng ở các công thức Đ và CT1 (Javen 5%/5 phút) không cho hiệu quả khử trùng, mẫu khử trùng bị nhiễm khuẩn và mốc sau vài ngày nuôi cấy. Còn CT7 (Javen 10%/7 phút) cũng không cho hiệu quả khử trùng vì thời gian khử trùng và nồng độ Javen cao làm chết các tế bào thực vật. Các công thức còn lại cho hiệu quả khử trùng vẫn ở mức thấp, trong đó hiệu quả cao nhất là CT6 (Javen 10%/5 phút) đây đƣợc coi là công thức tối ƣu vì nồng độ và thời gian khử trùng phù hợp với cây. Các công thức: CT2(Javen 5%/10 phút), T3 Javen5%/12 phút) Javen cũng cho thấy hiệu quả khử trùng nhƣng hiệu quả chƣa cao. Vì nồng độ Javen thấp khả năng diệt nấm mốc và khuẩn thấp lên t lệ mẫu nhiễm vẫn ở mức cao. Còn CT4(Javen 5%/15 phút) tuy nồng độ Javen thấp nhƣng vì thời gian khử trùng cao lên số mẫu chết vẫn nhiều, CT5 (Javen10%/3 phút) tuy nồng độ Javen cao nhƣng vì thời gian khử trùng ngắn lên số mẫu nhiễm vẫn cao, hiệu quả khử trùng vẫn thấp. Hình 3.2. Chồi cây hoa D yên thảo. (Tr i mẫu in vitro vô trùng sau 5 ngày nuôi cấy, (Phải mẫu in vitro bị nhiễm sau 5 ngày nuôi cấy 24 Sơ đồ quy trình đơn giản tạo vật liệu in vitro t đỉnh sinh trƣởng của cây Dã yên thảo ở hình 3.3. ƣớc 1. ã yên thảo ngoài tự nhiên ƣớc 4. Khử trùng mẫu ƣớc 2. Đỉnh sinh trƣởng sử dụng làm thí nghiệm ƣớc 5. Thấm khô, cắt mẫu ƣớc 3. Rửa mẫu với xà phòng dƣới vòi nƣớc máy ƣớc 6. Mẫu sau khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng Hình 3.3. C c bƣớc đơn giản t o vật liệu in vitro t đỉnh sinh trƣởng của cây D yên thảo 25 3.2. Nhân nhanh cây D yên thảo bằng phƣơng ph p t o cụm chồi in vitro Mục đích của thí nghiệm nhân nhanh cây ã yên thảo là tạo ra lƣợng lớn chồi in vitro t một chồi ban đầu, lƣợng chồi tạo ra trong thí nghiệm này đƣợc dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp theo. Trong đó quan trọng nhất là thí nghiệm rèn luyện cây in vitro để tạo cây giống đây cũng là mục đích quan trọng của đề tài nghiên cứu. Trong thí nghiệm này đối với các loài cây khác nhau thì hệ số nhân giống khác nhau ví dụ đối với cây úc thì hệ số chồi đạt đƣợc trong khoảng 5 – 20 chồi). Hầu hết các loài t một chồi cấy vào môi trƣờng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng sẽ bật ra nhiều chồi, nhƣng với cây ã yên thảo t một chồi cấy vào sẽ tạo mô sẹo. Mô sẹo sau này mới phát triển thành các chồi, chính vì vậy trong thí nghiệm nhân nhanh ã yên thảo chúng tôi làm thêm thí nghiệm quan sát sự phát sinh hình thái ở giai đoạn mô sẹo. 3.2.1. Quan sát sự phát sinh hình thái trong quá trình tạo mô sẹo Dã yên thảo in vitro Ở cây hai lá mầm: Sự phát triển phôi theo nghĩa hẹp, bắt đầu với hợp tử và kết thúc ở giai đoạn lá mầm. Sự phát triển thông qua các giai đoạn hình cầu, hình tim, hình ngƣ lôi hình cá đuối) và giai đoạn lá mầm có thể phân chia thành các bƣớc có trình tự khác nhau, đƣợc đại diện ở 3 sự kiện chủ yếu: - Sự phân chia không đối xứng của hợp tử, dẫn đến làm cho các tế bào ở đỉnh thì nhỏ, các tế bào cơ bản thì lớn. - Sự hình thành khuôn mẫu một cách rõ ràng, xảy ra ở giai đoạn hình cầu. - Sự chuyển biến của giai đoạn lá mầm xảy ra đồng thời với sự bắt đầu của mầm rễ, mầm lá thông qua mầm của thân [19]. Diễn biến các pha: Giai đoạn hình cầu duy trì trong một thời gian, sự phân chia của những tế bào bên trong dẫn đến sự hình thành trục phôi và sự biệt hóa vùng. ở giai 26 đoạn phôi hình cầu, khi số lƣợng tế bào tăng lên hơn 100 thì phôi chuyển sang hình tim bởi vì sự phát triển định vị tại hai điểm đối diện nhau trong vùng đỉnh. Đầu giai đoạn phôi hình tim, có xấp xỉ 200 tế bào và là nguồn gốc chủ yếu của các cơ quan trong hạt nhƣ lá mầm, trụ dƣới lá mầm, rễ nguyên thủy, cũng nhƣ những loại mô cơ bản, tiền mạch, vỏ phân sinh ngọn và vỏ là thấy rõ về mặt cấu trúc. Kết thúc là giai đoạn hai lá mầm đã hình thành rõ rệt, sự biệt hóa các vùng, cơ quan [20]. Hình 3.4. Quá trình phát sinh phôi ở cây 2 lá mầm (Arabidopsis)[21] Nguồn tham khảo hình 3.4: https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=angiosperm+embryo+devel opment Quá trình tạo mô sẹo của cây ã yên thảo cũng xảy ra sự phát sinh phôi giống nhƣ phát sinh phôi hợp tử. ác chồi đƣợc cấy trong môi trƣờng bổ xung P tạo mô sẹo theo dõi theo t ng tuần bắt đầu t tuần 1. Thứ tự xuất hiện phôi trên mô sẹo bắt đầu t phôi cầu tiếp đến là phôi tim, cá đuối và cuối cùng là lá mầm. Ở môi trƣờng bổ sung P 1mg/l một số mẫu có hiện tƣợng mô sẹo phát triển không giới hạn tạo các cụm chồi vô định hình cho tới khi môi trƣờng hết chất dinh dƣỡng thì chết chứ không bật thành t ng chồi. òn ở các môi trƣờng khác thì mô sẹo vẫn phát triển và phát sinh thành chồi riêng biệt. 27 Phôi hình cầu Phôi hình tim Phôi cá đuối Phôi 2 lá mầm Hình 3.5. Quá trình phát sinh phôi soma của cây D yên thảo 3.2.2. Ảnh hưởng của BAP và inetin đến khả năng tạo cụm chồi cây Dã yên thảo Thí nghiệm tiến hành trên môi trƣờng MS (Murashige & Skoog, 1962) có bổ sung BAP với nồng độ t 0 mg/l đƣợc ở bảng sau: 28 P đến 1,0 mg/l BAP kết quả thu ảng 3.2. Ảnh hƣởng của nồng độ AP và inetin đến hệ số nhân chồi cây D yên thảo Công thức Nồng độ BAP (mg/l) Chồi/ bình an đầu Hệ số nhân Sau 7 tuần chồi Đ 0,0 2 4 2,00 CT1 0,5 2 135 67,5 CT2 0,7 2 183 91,5 CT3 1,0 2 206 103 CT4 0,3 2 2 0 CT5 0,5 2 2 0 Hình 3.6 Ảnh hƣởng của nồng độ AP và inetin đến hệ số nhân nhanh t chồi cây hoa D yên thảo Kết quả bảng 3.2 và hình 3.6 trên cho thấy: Mẫu cấy trong môi trƣờng MS không bổ sung P đối chứng) cho hệ số nhân thấp và mẫu có xu hƣớng phát triển thành cây hoàn chỉnh, trong khi môi trƣờng bổ sung P cho hiệu quả nhân nhanh rõ rệt. Trong đó nồng độ P tăng t 0,5mg/l tới 1,0 mg/l làm hệ số nhân chồi tăng bằng chứng là ở nồng độ 0,5mg/l hệ số nhân chỉ là 67,5, nhƣng ở nồng độ 1,0mg/l thì hệ số 29 cao hơn hẳn tới 103. Tuy nhiên ở các nồng độ bổ sung P chất lƣợng chồi không cao, chồi con còi, chậm cao. Ở thí nghiệm này chúng tôi còn thực hiện cấy mẫu vào môi trƣờng bổ sung chất kích thích sinh trƣởng Kinetin, nhƣng qua vài tuần quan sát cho thấy môi trƣờng này không cho hệ số nhân nhanh chồi mà chồi cấy vào còn có hiện tƣợng bị trắng lá và không sinh trƣởng. Hình 3.7. Cụm chồi D yên thảo sau 8 tuần nuôi cấy trên môi trƣờng có bổ sung AP 3.3. T o rễ cây D yên thảo in vitro (Ảnh hƣởng của α-NAA và nƣớc d a đến khả năng t o rễ Rễ là bộ phận không thể thiếu của cây, rễ giúp cây hút nƣớc và muối khoáng, để cây in vitro có thể sinh trƣởng tốt ngoài môi trƣờng tự nhiên thì cần hoàn thiện bộ rễ. hính vì vậy thí nghiệm này có mục đích tìm ra môi trƣờng thích hợp kích thích sự ra rễ của cây Dã yên thảo in vitro. Trong thí nghiệm này môi trƣờng MS đƣợc bổ sung -N với nồng độ thay đổi t 0,1mg/l đến 0,5mg/l, ngoài ra chúng tôi còn sử dụng nƣớc d a cho thí nghiệm tạo rễ. Vì nƣớc d a có chứa nhiều chất hơn môi trƣờng MS cơ bản giúp cây sinh trƣởng tốt và kích thích sự ra rễ. 30 ảng 3.3 Ảnh hƣởng của α-NAA và nƣớc d a đến sự h nh thành rễ ở cây D yên thảo Công Nồng độ thức (mg/l) Sự t o rễ Chiều dài (cm) Đ MS + 2 CT1 0,1 - - CT2 0,3 - - CT3 0,5 - - CT4 5% + 3 CT5 10% + 2,5 CT6 15% + 1,5 T kết quả trên cho thấy: Môi trƣờng MS có bổ sung -N không có tác dụng kích thích ra rễ mà còn làm cây sinh trƣởng kém hơn môi trƣờng MS bình thƣờng. T NAA 0,1mg/l), CT2( -NAA 0,3mg/l), CT3 ( -N T1 - 0,5mg/l) sau 4 tuần nuôi cấy đều không thấy ra rễ, mẫu cấy có hiện tƣợng tạo mô sẹo callus) nhƣng không bật chồi, và cây sinh trƣởng kém. òn môi trƣờng Đ MS cơ bản) và T4 nƣớc d a 5%), T5 nƣớc d a 10%), T6 nƣớc d a 15%) thì cho hiệu quả ra rễ tốt sau 4 tuần. Số rễ nhiều, rễ to khỏe, cây sinh trƣởng và phát triển nhanh. Riêng các T4, T5, T6 mẫu cấy tạo nhiều chồi hơn so với môi trƣờng MS cơ bản. T kết quả trên chúng tôi kết luận T5 môi trƣờng MS có bổ sung nƣớc d a nồng độ 5%) là thích hợp nhất để kích thích ra rễ ở cây ã yên thảo. 31 A) B) C) D) Hình 3.8. T o rễ cây D yên thảo in vitro Hình A, B mẫu chồi Dã yên thảo trong môi trƣờng α-NAA không ra rễ Hình C, D mẫu chồi Dã yên thảo trong môi trƣờng nƣớc d a có ra rễ 3.4. Rèn luyện cây D yên thảo in vitro ngoài môi trƣờng tự nhiên Mục đích của thí nghiệm nuôi cấy mô này là tạo ra cây giống với số lƣợng lớn, chính vì vậy việc cho cây t môi trƣờng ống nghiệm ra môi trƣờng tự nhiên thành công thì thí nghiệm mới thành công. Vì cây in vitro trong môi trƣờng ống nghiệm đƣợc cung cấp s n chất dinh dƣỡng, ánh sáng, độ ẩm và pH đều thích hợp lên việc rèn luyện cây với môi trƣờng tự nhiên rất khó khăn. Khi cho cây ra ngoài tự nhiên chúng tôi cho cây làm quen dần dần để cây có 32 thể thích nghi tốt. Một tuần đầu tiên chúng tôi để cây trong túi bóng cỡ lớn giúp cây không bị mất nƣớc và héo, trong thời gian này chúng tôi phun bổ sung vi lƣợng và N nồng độ thấp giúp cây có đủ chất dinh dƣỡng. ác tuần tiếp theo chúng tôi mở túi bóng ra để cây làm quen với không khí bên ngoài. Sau khi cây đã cứng cáp và không bị héo chúng tôi cho cây ra ngoài, khi rèn luyện cây chúng tôi tƣới nƣớc thƣờng xuyên ngày 1 lần để đảm bảo độ ẩm. Ngoài ra cần tƣới nƣớc bằng vòi phun sƣơng, không tƣới thẳng vào gốc cây sẽ bị ủng và thối rễ. ảng 3.4: Ảnh hƣởng của gi thể tới r n luyện cây ngoài tự nhiên Giá thể át ẩm Số cây sống Số cây chết T lệ sống 2 18 10% 5 15 25% 8 12 40% Đất thịt + cát + mùn cƣa Tro trấu + sơ d a +đất thịt +cát T kết quả cho thấy giá thể cát ẩm cho t lệ cây sống thấp nhất, vì cát ẩm làm rễ cây in vitro khó thích nghi, rễ hay bị thối. ác giá thể còn lại cho t lệ sống khá cao, các giá thể này có độ tới xốp tốt giúp rễ cây hô hấp và phát triển dễ, ngoài ra giá thể này không tích nƣớc làm cây bị úng và thối rễ nhƣ giá thể cát ẩm. 33 H nh 3.9. D yên thảo trong giai đo n r n luyện H nh 3.10. D yên thảo in vitro đ ra hoa ngoài tự nhiên 34 T những thí nghiệm trên chúng tôi đƣa ra sơ đồ nhân nhanh cây hoa ã yên thảo bằng k thuật in vitro. hồi đỉnh cây hoa ã yên thảo Javen 5%/15 phút Tạo vật liệu khởi đầu in vitro P 1mg/l trong 6 tuần Nhân nhanh tạo cụm chồi in vitro Nƣớc d a 5% trong 5 tuần Tạo rễ in vitro Tro trấu+sơ d a+đất thịt+cát trong 3 tuần Rèn luyện cây in vitro thích nghi Hình 3.11. Nhân nhanh cây hoa D yên thảo in vitro 35 CHƢƠNG 4: 4.1. T LU N VÀ I N NGHỊ ết luận Qua những thí nghiệm đã thực hiện chúng tôi đã rút ra đƣợc những kết luận sau về việc nhân giống in vitro cây ã yên thảo: Đƣa ra quy trình đơn giản tạo vật liệu khởi đầu in vitro t đỉnh sinh trƣởng của cây ã yên thảo bằng cách xử lý mẫu sơ bộ dƣới vòi nƣớc sạch, rửa bằng cồn 70% trong 2 phút, lắc mẫu với Javen 5% trong 15 phút, rửa lại bằng nƣớc cất 2-3 lần, làm khô mẫu trên giấy lọc khử trùng cho hiệu quả khử trùng đạt 38%. Môi trƣờng thích hợp để tạo cụm chồi cây ã yên thảo là môi trƣờng MS + 30 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + 1mg/l BAP với hệ số nhân chồi là 103. Môi trƣờng thích hợp để tạo cây ã yên thảo in vitro hoàn chỉnh (môi trƣờng tạo rễ) là môi trƣờng MS + 30 g/l đƣờng saccarose + 8 g/l agar + 5% nƣớc d a cây sinh trƣởng và phát triển tốt nhất. Môi trƣờng thích hợp rèn luyện cây hoa Dã yên thảo cho ra ngoài tự nhiên là môi trƣờng hỗn hợp bao gồm tro trấu + xơ d a + đất thịt + cát với t lệ sống 40%. 4.2. iến nghị Tiếp tục nghiên cứu và thực hiện sản xuất thực nghiệm cây hoa ã yên thảo bằng quy trình đã tìm ra. 36 TÀI LIỆU THAM HẢO Tài liệu tiếng Việt 1. Lê Trần ình, Hồ Hữu Nghị, Lê Thị Muội 1993), ng nghệ sinh h th vật trong ải ti n giống â trồng, Nxb Nông nghiệp, tr 68 - 73. 2. Phạm Hoàng Hộ, 2000. Cây cỏ Việt Nam, Quyển II (in lần 2), Nhà xuất bản trẻ 3. Trần Hợp (2000), Cây cảnh hoa Việt Nam, Nxb nông nghiệp, tr279-280 4. Nguyễn Nhƣ Khanh, Nguyễn Văn Đính 2006), Sinh h c phát triển th c vật, Nxb Giáo dục Hà Nội. 5. Nguyễn Văn Mã, La Việt Hồng, Ong Xuân Phong (2013), Phương pháp nghiên cứu sinh lý h c th c vật, Nxb Đại học Quốc gia Hà Nội, tr 111 – 114. 6. Nguyễn Đức Thành (2000), Nuôi c y mô t bào th c vật nghiên cứu và ứng d ng, Nxb Nông nghiệp Hà Nội 7. Nguyễn Bảo Toàn (2004), Giáo trình nuôi c y mô và t bào th c vật, Tủ sách Đại học Cần Thơ. 8. Vũ Văn Vụ (1999), Sinh lý th c vật ứng d ng, Nxb Giáo dục Hà Nội. Tài liệu tiếng Anh 9. Ando, T., Nomura, M. Tsukahara, J., Watanabe, H., Kokubun, H., Tsukamoto, T., Hashimoto, G., Marchesi, E., Kitching, I. (2001) “Reproductive isolation in a native population of Petunia sensu Jussieu (Solanaceae)” Ann. Bot. (Lond.) 88:403–413. 10. Griesbach, R.J.(2007). In Flower breeding and genetics: Issues, challenges and opportunities for the 21st century, Petunia, ed Anderson N.O. (Springer, Dordrecht, The Netherlands), pp 301–336. 11. Maberly, D.J. 1990. “The Plant Book. A portable dictionary of the higher plants”. Cambridge Univ. Press, Cambridge, U.K. 12. Murashige, T. 1980), “Plant growth substances in commercial uses of tissue culture”. In: Plant growth Substances 1979, ed. by F.Skoog. Springer- Verag, Berlin Heidelberg New York, pp. 426 – 434. 37 Tài liệu t Internet 13. http://www.caycanhthanglong.com.vn 14. http://khonggianhiendai.net/ban-cong-sat-dep-voi-hoa/ 15. http://plants.usda.gov 16.http://www.clemson.edu/extension/hgic/index.html 17.http://caycanhthanglong.vn/A59B3034/hoa-da-yen-thao-nhieu-mau-rucro.html 18.Hoala.vn/hoa nhiệt đới/741/chăm sóc hoa dạ yến thảo.html 19. http://123doc.org/document/920694-tai-lieu-qua-trinh-phat-trien-phoi-othuc-vat-pptx.htm?page=5 20. http://qua-trinh-phat-trien-phoi-o-thuc-vat-216378.html 21.https://www.google.com.vn/search?tbm=isch&q=angiosperm+embryo+de velopment 38 [...]... cá thể hoàn chỉnh [8] 8 Thực tế đã chứng minh đƣợc khả năng tái sinh của một cơ thể thực vật hoàn chỉnh t một tế bào riêng rẽ Hàng trăm loài cây trồng đã đƣợc nhân giống trên quy mô thƣơng mại bằng cách nuôi cấy trong môi trƣờng nhân tạo vô trùng và tái sinh chúng thành cây với hệ số nhân giống vô cùng lớn [12] Nhƣ vậy, kĩ thuật nuôi cấy mô và tế bào thực vật xét cho cùng là kĩ thuật điều khiển sự phát... về cây Dã yên thảo (petunia hybrida) 1.1.1 tr phân loại Giới: Plantea (Thực vật) Giới phụ: Tracheobionta Ngành: Magnoliophyta Ngành phụ: Spermatophyta Lớp: Magnoliopsida Lớp phụ: Asteridae Bộ: Solanales Họ: Solanaseae H nh 1.1 Hoa D yên thảo Giống: Petunia Tên khoa học: Petunia hybrida (petunia hybrida) Tên thông thƣờng: Petunia Tên việt nam: Dạ yên thảo, Dã yên thảo [15] 1.1.2 Mô tả Dã yên thảo là cây. .. môi trƣờng nuôi cấy mô tế bào thay đổi tùy theo loài thực vật, loại tế bào, mô và cơ quan đƣợc nuôi cấy Đối với cùng một loại mô, cơ quan nhƣng mục đích nuôi cấy không giống nhau, môi trƣờng sử 9 dụng cũng khác nhau khá cơ bản Môi trƣờng nuôi cấy còn thay đổi theo giai đoạn sinh trƣởng và phát triển của mẫu cấy [3] 1.2.3.1 Các loại muối khoáng Các nguyên tố khoáng dung trong môi trƣờng dinh dƣỡng nuôi. .. nƣớc [18] 1.2 Sơ lƣợc về nhân giống in vitro 1.2.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mô tế bào thực v t ơ sở khoa học của phƣơng pháp nuôi cấy mô tế bào in vitro là học thuyết về tính toàn năng totipotence) của tế bào Theo Haberlandt G (1902), nhà thực vật học ngƣời Đức, tất cả các tế bào của cây đều mang toàn bộ lƣợng thông tin di truyền của cơ thể, khi gặp điều kiện thích hợp, mỗi tế bào đều có khả năng tái... violacea Lindl (Violet-flowered Petunia) hoa dạng ống dài, thùy rộng, màu tím Ngày nay, các nhà vƣờn t loài lai này còn cho ra các dạng hoa kép hay cánh hoa xòe ngón rất đẹp [3] 1.1.4 Một số đặc điểm của cây hoa Dã yên thảo 1.1.4.1 Các loại Dã yên thảo Hoa Dã yên thảo có ba loại: Dã yên thảo đơn: cây bụi, có rất nhiều hoa nhƣng hoa chỉ có 1 lớp cánh, đƣờng kính của hoa lên tới 5-7,5 cm, dễ trồng và ít... sự phát sinh hình thái của tế bào thực vật (khi nuôi cấy tách rời trong điều kiện nhân tạo và vô trùng) [4], [6] 1.2.2 Hiện trạng nuôi cấy mô ở iệt Nam Ở Việt Nam, công việc nuôi cấy mô tế bào bắt đầu thực hiện trong khoảng năm 1977 ở Phân Viện Khoa học Thành phố Hồ Chí Minh Hiện nay có rất nhiều phòng thí nghiệm nuôi cấy mô ở các Trƣờng Đại học, các Viện nghiên cứu, các Sở khoa học và Công nghệ ở các... Excel 2007 theo mô tả của Nguyễn Văn Mã và ctv, 2013 [5] 21 CHƢƠNG 3: T QUẢ VÀ THẢO LU N 3.1 T o vật liệu khởi đầu in vitro t chồi cây hoa D yên thảo Môi trƣờng nuôi cấy mô thực vật trong đó có môi trƣờng MS) là môi trƣờng thích hợp cho nấm mốc và vi khuẩn phát triển Khi môi trƣờng bị nhiễm mốc thì cây in vitro sẽ không sạch bệnh, cây giống ra ngoài môi trƣờng sau này cũng không bằng cây ngoài tự nhiên,... thảo đơn Hoa ã yên thảo kép Hoa ã yên thảo biển sóng H nh 1.2 C c lo i D yên thảo ngoài tự nhiên 6 1.1.4.2 Cách trồng Dã yên thảo Có thể trồng bằng hai cách đó là giâm cành và trông t hạt, với cách trồng hoa dã yên thảo bằng hạt thì cần làm đất k và đủ ánh nắng trƣớc khi gieo hạt, hạt gieo 4-6 ngày sẽ cho cây con và có thể đem trồng ở vƣờn ƣơm sau 20 ngày Sau 20 - 25 ngày nữa thì đem trồng ở vƣờn hoa, ... máy ƣớc 6 Mẫu sau khử trùng đƣợc cấy vào môi trƣờng Hình 3.3 C c bƣớc đơn giản t o vật liệu in vitro t đỉnh sinh trƣởng của cây D yên thảo 25 3.2 Nhân nhanh cây D yên thảo bằng phƣơng ph p t o cụm chồi in vitro Mục đích của thí nghiệm nhân nhanh cây ã yên thảo là tạo ra lƣợng lớn chồi in vitro t một chồi ban đầu, lƣợng chồi tạo ra trong thí nghiệm này đƣợc dùng làm nguyên liệu cho các thí nghiệm tiếp... của loài cây phải chỉnh độ pH của môi trƣờng về mức ổn định ban đầu Đối với mô sẹo của nhiều loài cây, pH ban đầu thƣờng là 5,5-6,0 Sau 4 tuần nuôi cấy đạt đƣợc 6,0-6,5 Những thí nghiệm nuối cấy tế bào đơn hay tế bào trần trọng lƣợng môi trƣờng nhỏ thì việc chỉnh độ ph bắt buộc [1] 1.3 C c nghiên cứu về nhân giống in vitro cây D yên thảo - Kết quả nghiên cứu của Trần Nguyên Vũ và ctv 1999) cho thấy các