TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN THÂN THỊ THÚY “BƯỚC ĐẦU NGHIÊN cứu QUY TRÌNH NHÂN NHANH GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ANOSMUN) PHÂN BỐ TẠI VĨNH PHÚC BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TỂ BÀO” KHÓA LUẬN TỔT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyên ngành: Di truyền học HÀ NỘI - 2015 Lời em xin bày tỏ lòng biết ơn tói Th.s Phan Thị Thu Hiền TS. Nguyễn Như Toản - Giảng viên khoa Sinh - KTNN - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2, tận tình hướng dẫn, bảo, giúp đỡ em suốt trình thực hoàn thành khóa luận này. LỜI CẢM ƠN Em xin chân thành cảm ơn thày cô giáo Trường Đại học Sư phạm Hà Nội nhiệt tình giảng dạy tạo điều kiện cho em học tập nghiên cứu. Qua em xin bày tỏ lời cảm ơn sâu sắc đến gia đình, người thân bạn bè động viên, giúp đỡ em thòi gian qua. Em xin chân thành cảm ơn! Ngày tháng năm 2015 Sinh viên thực tập Thân Thị Thúy Tôi xin cam đoan kết nghiên cứu riêng tôi. Các số liệu, kết nghiên cứu khóa luận “Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) phân bố Vĩnh Phúc công nghệ nuôi cấy mô tế bào ” trung thực chưa có công bố công trình khác. Tác giả LỜI CAM ĐOAN Thân Thị Thúy MỤC LỤC 2.4.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo yật liệu bệnh nuôi cấy V CÁC CHỮ VIẾT TẤT TRONG LUẬN VĂN AS: Điều kiện ánh sáng BAP: 6-Benzyl Aĩĩũno Purin Cs: Cộng CT: Công thức ĐC: Đối chứng IBA: - Indol Butyric Acid MS: Murashige Skoog NN: Nhân nhanh TR: Tạo rễ THT: Than hoạt tính DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Bảng 3.1 * Tên bảng Kêt nghiên cứu khử trùng Ca(OCl 2)2 đên tỷ lệ Trang 21 sống hạt lan Phi điệp tím (sau 10 ngày nuôi cấy). Bảng 3.2 Anh hưởng chât điêu hòa sinh trưởng lên khả 22 nhân nhanh lan Phi điệp tím. Bảng 3.3 Anh hưởng cường độ chiêu sáng tới sinh trưởng 23 chồi Bảng 3.4 Anh hưởng nông độ IBA lên khả tạo rê 24 lan Phi điệp tím. Bảng 3.5 Bảng 3.6 Anh hưởng nông độ than hoạt tính đên hình thái rê lan Phi điệp tím (sau 30 ngày nuôi cấy) Kêt huân luyện lan Phi điệp tím. DANH MỤC CÁC HÌNH 25 26 Hình Tên hình Trang Cây Phi điệp tím {Dendrobỉum anosmum) Quy trình khử trùng gieo hạt lan Phi điệp tím. 18 Hạt lan Phi điệp tím sau khử trùng cấy vào môi 20 trường Sinh trưởng chôi Phi điệp tím điêu kiện ánh 23 sáng khác Rễ lan Phi điệp tím môi trường có nồng độ chất kích thích khác 25 Các giai đoạn phát triển lan Phi điệp tím thí nghiệm 28 MỞ ĐẦU 1. Lí chon đề tài • Cây hoa Lan (Orchidaceae) giống cảnh nhiều người ưa chuộng, giá tri làm cảnh trang trí, hoa lan sử dụng với nhiều mục đích khác như: dùng làm thực phẩm (giống Orchis), rau xanh (giống Anoetochilus), ttà uống (loài Jumellea fragrans), hương liệu (Vannila plannifolia) đặc biệt lan dùng làm dược liệu, có tác dụng chữa bệnh số loài thuộc chi Orchis, Platanthera, Gymnadenda, Dactylorhiza đặc biệt chi Hoàng thảo ịDendrobỉum nobile, Caulỉs Dendrobium, Dendrobium loddgesii, Dendrobium chrysanthum, Dendrobium fimbriatum, Dendrobỉum nobile Lỉndl) [3], [7], [9]. Hoàng Thảo chi lớn của họ Lan ịOrchỉdaceae). Theo A. Takhajan (1966), giới chi Hoàng thảo (Dendrobium) có khoảng 1400 loài, chủ yếu phân bố Đông Nam Á đảo thuộc Philippine, Malaysia, Indonesia, Papua New Guinea, Đông Bắc Australia. Ở Việt Nam có 107 loài thứ, phân bố vùng núi từ Bắc vào Nam số đảo ven biển [17]. Tuy nhiên, nhiều nguyên nhân khác nhau, đến nhiều loài bị tuyệt chủng bị đe dọa. Để bảo tồn phát triển loài lan quý hiếm, không cách khác phải tiến hành nhân giống nuôi trồng chúng quy mô lớn [2]. Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) có hình thái đẹp, hương thơm đậm mùi trầm, số loại Hoàng Thảo ưu chuộng hàng đầu. Giống Phi điệp tím phân bố ngày hẹp khai thác bừa bãi người, cần nhân nhanh lưu trữ nguồn gen, phục vụ thị hiếu người tiêu dùng. Hiện nay, số loài lan quý bị đe dọa tuyệt chủng tự nhiên bảo tồn nhờ phương thức nảy mầm từ hạt [22], ừên môi trường Vi MS sau đến môi trường KC vw [25], nhân nhanh in vitro với nguồn nguyên liệu ban đầu hạt gieo môi trường MS +15% đường saccarose + 2,0 mg/1 IBA [16]. Theo Lê Văn Hoàng [8], phương pháp nuôi cấy mô phương pháp 2.4.1. Nghiên cứu phương pháp khử trùng tạo vật liệu bệnh nuôi cấy chồi lan Thí nghiệm 1: Xác định hiệu khử trùng dung dịch Ca(OCl 2)2 đổi với lan. Bố trí công thức, thí nghiệm bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên, lần nhắc, lần nhắc 150 mẫu/công thức. Nền môi trường cấy mẫu MS + 20 g/1 saccarose + g/1 agar. Cách tiến hành: Khử trùng cách rửa qua vòi nước chảy —> rửa nước xà phòng loãng —» dùng lau bề —> rửa cho xà 13 phòng —> lắc cồn 70° phút (trong tủ cấy) —» rửa lại nước cất tiệt trùng (trong tủ cấy) —» lắc dung dịch Ca(OCỈ 2)2 10 phút —> rửa lại nước cất vô trùng - lần —> cắt vỏ tách lấy hạt đưa vào nuôi cấy môi trường chuẩn bị sẵn: MS + 20 g/1 saccarose + g/1 agar. Bố trí thí nghiệm: bố trí công thức: CT1: Ca(OCl2)2 20% CT2: Ca(OCl2)2 50% CT3: Ca(OCl2)2100% Sau cấy vào môi trường, theo dõi xác định số mẫu sống, số mẫu chết mẫu nhiễm sau 10 ngày nuôi cấy. 2.4.2. Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến khả nhân nhanh, tạo hoàn chỉnh in vitro loài lan Phi điệp tím Thí nghiệm 2: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ kỉnetin lên khả nhân nhanh chồi. Sau vào mẫu thành công, chuyển mẫu sang môi trường nhân nhanh với nồng độ chất kích thích sinh trưởng khác nhau. Chất kích thích sinh trưởng dùng kinetin kết hợp với BAP (đều thuộc nhóm xytokinin nhân tạo) kết tốt nhất, ừong nồng độ BAP không đổi, kinetin thay đổi. Bố trí công thức thí nghiệm, công thức 150 chồi, lần lặp lại. NN1: mg/1 BAP + 0,5 mg/1 kinetin NN3: mg/1 BAP +1,5 mg/1 kinetin NN2: mg/1 BAP + mg/1 kinetin NN4: mg/1 BAP + mg/1 kinetin Sau 40 ngày nuôi cấy, ghi nhận số chồi tạo thành tính hệ số nhân nhanh chồi công thức thí nghiệm. 2 Các công thức thí nghiệm bổ sung 30 g/1 khoai tây, 10% nước dừa 30 g/1 saccarose. Thí nghiệm 3: Nghiên cứu ảnh hưởng cường độ chiểu sáng lên sinh trưởng chồi. Ánh sáng nuôi cấy mô thực vật ánh sáng nhân tạo, cường độ ánh sáng 1000 ~ 5000 lux, 16h chiếu sáng. Để chồi loài lan in vitro phát triển hoàn chỉnh cần điều chỉnh cường độ ánh sáng thích hợp. Trong công thức với dải cường độ ánh sáng khác bố trí sau: AS1: NN2 điều kiện 800 luxAS3: NN2 điều kiện 1800 lux AS2: NN2 điều kiện 1300 lux AS4: NN2 điều kiện 2300 lux. NN2 công thức tốt thí nghiệm trước, sử dụng tiếp cho thí nghiệm sau, công thức thí nghiệm bổ sung 30 g/1 khoai tây, 10% nước dừa 30 g/1 saccarose. Theo dõi ảnh hưởng cường độ ánh sáng đến sinh trưởng chồi dựa vào tiêu: - Chiều cao (cm): lấy trung bình chiều cao chồi. - Số (chiếc): trung bình tổng số chồi. - Số rễ (chiếc): trung bình tổng số rễ chồi. Thí nghiệm 4: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả tạo rễ lan Phi điệp tím. IBA chất thuộc nhóm auxin nhân tạo, có ảnh hưởng đến khả tạo rễ chồi. Để tìm nồng độ IBA thích hợp cho rễ tiến hành bố trí thí nghiệm với công thức: TRI: 0,6 mg/1 IBA TR3: 1,2 mg/1 IBA TR2: 0,9 mg/1 IBA TR4: 1,5 mg/1 IBA Các công thức thí nghiệm bổ sung 30 g/1 khoai tây, 10% nước dừa 30 g/1 saccarose. Theo dõi ảnh hưởng nồng độ IBA đến khả tạo rễ sau 20 ngày cấy qua tiêu: - Số lượng rễ trung bình ttên (chiếc). - Chiều dài rễ trung bình (cm). Thí nghiệm 5: Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến rễ chồi lan Phỉ điệp tím. Nồng độ than có ảnh hưởng đến rễ cây, tùy thuộc vào đặc điểm giống. Đe tìm nồng độ than hoạt tính tốt nhất, bố trí công thức thí nghiệm sau: CTl : g/1 than hạt tính CT4: 1,5 g/1 than hoạt tính CT2: 0,5 g/1 than hoạt tính CT5: g/1 than hoạt tính CT3: g/1 than hoạt tính Nen môi trường TR2, môi trường có nồng độ chất kích thích rễ tốt nhất, công thức thí nghiệm bổ sung 30 g/1 khoai tây, 10% nước dừa 30 g/1 saccarose. Theo dõi sau 30 ngày nôi cấy theo tiêu: - Tỉ lệ tạo rễ (%). - Số rễ trung bình (chiếc). - Chiều dài rễ trung bình (cm). - Hình thái rễ. 2.4.3. Giai đoạn Sau tuần bình rễ đem khu huấn luyện, khoảng 10-15 ngày đưa vườn ươm. Giá thể trồng lan quan trọng, liên quan đến suốt trình sinh trưởng phát triển cây. Có nhiều loại giá thể khác nhau, để đạt kết nuôi cấy mô tốt tiến hành thí nghiệm ảnh hưởng giá thể đến chất lượng vườn ươm khảo sát số sống sót giá thể sau tuần. Các giá thể dùng nghiên cứu là: dớn, than, dừa miếng, . Theo dõi qua tiêu: - Chiều cao (cm) - Số trang bình (chiếc) - Độ dài (cm). 2.4.4. Xử lý số liệu Số liệu xử lý ứng dụng Data analysis, Microsoft Excel 2007. Chương 3: KẾT QUẢ NGHIÊN cứu 3.1. Ảnh hvởng phvorag pháp khử trùng lên khả nảy mầm mẫu Vào mẫu khâu quan trọng giúp có nguồn mẫu sạch, nguyên liệu cho trình khác ttong trình nhân nhanh in vỉtro. Với điều kiện thực tế cho phép, chứng nghiên cứu phương pháp khử trùng lan. Quá trình khử trùng lan tóm tắt qua hình 2: r ^ Hình 2: Quy trình khử trùng gieo hạt lan Phỉ điệp tím. A: Khử trùng dung dịch Javen; B, c, D, E: Gắp quả, cắt lấy hạt cấy vào môi trường chuẩn bị sẵn; F: Hạt lan sau gieo tháng. Quả lan môi trường tương đối bệnh, bảo vệ hạt lan khỏi xâm nhập vi sinh vật. Mẩu bị nhiễm chủ yếu khử trùng bề mặt chưa tốt. Sau 10 ngày nuôi cấy thu kết thể bảng 3.1. Bảng 3.1: Kết nghiên cứu khử trùng dung dịch Ca(OCl2)2 đến tỷ lệ sổng hạt lan Phỉ điệp tím (sau 10 ngày nuôi cấy) Công Số bình nuôi Số mẫu Số mẫu Tỷ lệ Tỷ lệ nhiễm thức sống nhiễm sống(%) chết (%) chết CT1 150 95 55 63,33 36,67 CT2 150 142 94,67 5,33 CT3 150 126 24 84,00 16,00 Dựa vào kết bảng 3.1, khử trùng nồng độ khác cho hiệu khử trùng khác nhau. Xử lí nồng độ dung dịch Ca(OCl 2)2 thấp (20%) tỉ lệ mẫu nhiễm chết cao (36,67%) (hình 3B); tăng nồng độ Ca(OCl2)2 lên (50%) tỉ lệ mẫu sống cao (94,67%) (hình 3A), tỉ lệ mẫu nhiễm chết thấp (5,33%). Tuy nhiên tiếp tục tăng nồng độ hóa chất lên (100%), tỉ lệ mẫu nhiễm chết lại tăng lên (16%), nguyên nhân tượng hóa chất nồng độ cao gây ảnh hưởng đến khả sống mẫu. Theo Vũ Ngọc Lan Nguyễn Thị Lý Anh, sử dụng cồn kết hợp với HgCl 2khử trùng lan cho kết tốt, tỉ lệ sống đạt 97% [10]. Tuy nhiên xét độ an toàn, thấy Ca(OCỈ 2)2 an toàn, độc hại hơn, yậy sử dụng Ca(OCl2)2 thay HgCl2 mà hiệu khử trùng đạt kết cao. Qua phân tích kết trên, thấy nồng độ thích hợp để khử trùng mẫu Ca(OCl2)2 50%, với tỉ lệ mẫu sống 94,67%, tỉ lệ nhiễm chết 5,33%. Hình 3: Hạt lan Phi điệp tím sau khử trùng cấy vào môi trường A: Mẩu nảy mầm sau cấy 40 ngày; B: Mẩu nhiễm, chết. 3.2. Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng lên khả nhân nhanh lan Phỉ điệp tím Bổ sung chất kích thích sinh trưởng điều cần thiết nhằm đạt kết tốt nuôi cấy mô. Chất kích thích sinh trưởng nội sinh mà có, song tùy giống mà lượng chất kích thích nội sinh khác nhu cầu bổ sung thêm chất kích thích khác nhau. Do đó, cần lựa chọn nồng độ chất kích thích thích hợp,tạo in vitro đạt yêu cầu. Kết thí nghiệm thu sau 40 ngày nhân nhanh môi trường khác thể bảng 3.2. Bảng 3.2: Ảnh hưởng chất điều hòa sinh trưởng lên khả nhân nhanh lan Phỉ đỉi :p tím. Công thức Số chồi ban đầu Số chồi sau 40 ngày cấy Số chồi Hệ số nhân NN1 150 378 2,52 NN2 150 546 3,64 NN3 150 411 2,74 NN4 150 369 2,46 Kết bảng 3.2 cho thấy, môi trường có bổ sung kinetin (0,5 - mg/1) có ảnh hưởng tốt đến khả nhân nhanh chồi, nồng độ thích hợp cho nhân nhanh mg/1 kinetin, số chồi sau 40 ngày nuôi cấy đạt hệ số nhân tới 3,64. Tăng nồng độ kinetin hệ số nhân giảm (hệ số nhân 2,46 tăng nồng độ kinetin lên mg/1). Nếu giảm nồng độ xuống 0,5 mg/1 kinetin hệ số nhân đạt 2,52. Điều nồng độ chất kích thích cao gây ức chế sinh trưởng chồi. Kết cao so với kết Hồng hoàng ịCymbidium Irỉdỉoides) [15], sử dụng mg/1 kinetin (hoặc 0,5 mg/1 BAP) chồi đạt hệ số nhân 2,76. Như vậy, môi trường phù hợp cho giai đoạn nhân nhanh giống lan phi điệp tím MS có bổ sung mg/1 BAP mg/1 kinetin, 30 g/1 khoai tây, 10% nước dừa 30 g/1 saccarose. 3.3. Ảnh hưởng cường độ ánh sáng lên khả sinh trưởng chồi Ánh sáng cần cho quang hợp để sinh trưởng phát triển tốt. Nhu cầu ánh sáng loại không giống nhau, đặc biệt giai đoạn sinh trưởng định. Chúng nghiên cứu dải ánh sáng thích hợp cho sinh trưởng chồi lan Phi điệp tím thu kết sau tuần bảng 3.3. Bảng 3.3: Ảnh hưởng cường độ chiếu sáng tói sinh trưởng chồi. Công Chiêu cao TB/cây (cm) Sô TB/cây (chiêc) Sô rê TB/cây (chiêc) thức Ban đầu Sau tuần Ban đầu Ban đầu Sau Sau AS1 3,5 3,87 3,0 tuần 3,29 AS2 3,5 4,37 3,0 3,67 3,0 3,58 AS3 3,5 4,88 3,0 4,16 3,0 4,08 AS4 3,5 4,18 3,0 3,44 3,0 3,24 3,0 tuần 3,09 Trong công thức với dải cường độ ánh sáng khác chu kỳ chiếu sáng. Qua bảng ttên ta thấy cường độ ánh sáng tăng, sinh trưởng mạnh. Ở AS3, Phi điệp tím nuôi cấy cường độ chiếu sáng 1800 lux phát triển mạnh nhất: mở to, màu xanh sẫm, số đạt 4,16 chiếc/cây; thân mập, cao 4,88 cm; rễ phát triển mạnh, số rễ đạt 4,8chiếc/cây (hình 4C). Ở điều kiện chiếu sáng với cường độ yếu hơn, phát triển kém: chiều cao đạt 3,87 cm; nhỏ, ít, rễ phát triển (800 lux) (hình 4A). Tăng cường độ ánh sáng lên 2300 lux, sinh trưởng bị chậm lại, ánh sáng mạnh, kìm hãm phát triển (hình 4D). Vậy cường độ chiếu sáng tốt cho phát triển lan Phi điệp tím 1800 lux. A B c D Hình 4: Sinh trưởng chồi Phi điệp tím điều kiện ánh sáng khác A: Cây điều kiện chiếu sáng AS1; B: Cây điều kiện chiếu sáng AS2 C: Cây điều kiện chiếu sáng AS3; D: Cây điều kiện chiếu sáng AS4 3.4. Ảnh hưởng chất kích thích sinh trưởng lên khả tạo rễ lan Phỉ điệp tím IBA hoocmon thuộc nhóm auxin phổ biến dùng nuôi cấy mô kích thích rễ mô nuôi cấy. Tùy loại khác mà nồng độ IBA bổ sung vào môi trường khác nhau, cần tìm hiểu xác nồng độ IBA cần thiết cho tạo rễ cây. Kết thử nghiệm nồng độ IBA thích hợp cho tạo rễ chồi Phi điệp tím thể bảng 3.4. Bảng 3.4: Ảnh hưởng nồng độ IBA lên khả tạo rễ chồi lan Phi điệp tím. Công thức Số rễ TB/cây sau 40 ngày Số lượng rễ TB/cây (chiếc) Chiều dài TB (cm) TRI 3,15 0,85 TR2 4,55 1,28 TR3 3,08 0,82 TR4 2,93 0,81 Qua bảng cho thấy sử dụng IBA nồng độ 0,9 mg/1 (TR2) sau 40 ngày số lượng rễ tăng lên cao nhất, đạt 4,55 rễ/chồi; chiều dài rễ lớn 1,28 cm. Khi tăng nồng độ IBA lên l,2mg/l số lượng rễ giảm (3,08 chiếc/cây), chiều dài rễ giảm (0,82 cm). Tăng nồng độ IBA lên 1,5 mg/1 số lượng rễ chiều dài rễ tiếp tục giảm (2,93 chiếc/cây 0,81 cm). Hiện tượng nồng độ IBA cao gây ức chế khả rễ cây. Kết phù hợp với kết Nguyễn Văn Song lan Kim điệp, tạo rễ chồi tốt ừên môi trường có mg/1 NAA (5,93 rễ/chồi) [16]. Vậy nồng độ IBA thích hợp 0,9 mg/1, tạo rễ có chiều dài lớn (1,28 cm) số lượng rễ cao (4,55 chiếc). Hình 5: Rễ lan Phỉ điệp tím ừong môi trường cố nồng độ IBA khác A: Công thức TRI; B: Công thức TR2; C: Công thức TR3; D: Công thức TR4 3.5. Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính ỉên khả tạo rễ lan Phỉ đỉệp tím. Vai trò than hoạt tính nuôi cấy mô tế bào thực vật chủ yếu tạo điều kiện “tối” cho môi trường nuôi cấy, hấp thụ chất độc chất ức chế sinh trưởng thực vật phenolic, dịch rì nâu sinh từ mẫu môi trường nuôi cấy [20], [25], Ngoài ra, than hoạt tính hấp thụ vitamin, cytokinin auxÌQ [21], 22], làm thay đổi tỉ lệ thành phần chất có ừong môi trường nuôi cấy pH môi trường. Sau 30 ngày nuôi cấy, môi trường bổ sung nồng độ than hoạt tính khác nhau, rễ khác biệt rõ rệt. Kết thể bảng 3.5. Bảng 3.5. Ảnh hưởng nồng độ than hoạt tính đến hình thái rễ lan Phi điệp tím (sau 30 ngày nuôi cấy). Công thức Hình thái rễ Chiều dài rễ số rễ Tỷ lệ tạo re (%) TB(cm) TB/chiếc m ? A . /\ 0g/lTHT 82,00 3,0 1,28 Vừa, trắng ngà 0,5 g/1 THT g/lTHT 100,00 3,46 2,14 Mập, tròn, trắng 100,00 3,21 2,05 1,5 g/1 THT g/l THT 100,00 3,09 2,27 100,00 2,88 2,54 Mảnh, có lông tơ Mảnh, nhiêu lông tơ Mảnh, dẹt, nhiều lông tơ Từ bảng kết cho thấy, thay đổi nồng độ than hoạt tính từ g/1 - g/1 tỉ lệ chồi tạo rễ tăng từ 82% lên 100%. Nồng độ than hoạt tính 0,5g/l cho kết tốt nhất, số rễ trung bình đạt 3,46 chiếc/cây, chiều dài rễ vừa phải (2,14 cm), rễ mập tròn; tăng dần nồng độ than lên g/1, số rễ đạt 3,21 chiều dài rễ giảm 2,05 cm, rễ mảnh bắt đàu có lông tơ. Càng tăng nồng độ than hoạt tính lên số rễ giảm (2,88 chiếc/cây), chiều dài rễ tăng (2,54 cm), hình thái rễ xấu, có nhiều lông tơ. Kết có sai khác với kết Hoàng Thị Nga Và cộng nghiên cứu lan Hồng hoàng (Cymbidium Irỉdioides), nồng độ thích hợp g/1 than hoạt tính, số rễ trung bình đạt 2,53 rễ/cây [16] . Điều giống khác chịu ảnh hưởng than hoạt tính khác nhau. Vậy nồng độ than hoạt tính thích hợp 0,5 g/1, cho số rễ trung bình đạt 3,46 chiếc/cây, chiều dài rễ 2,14 cm, rễ mập tròn giúp hút dinh dưỡng, phát triển tốt nhất. 3.6. Kết huấn luyện lan Phi điệp tím Sau chuyển từ chai mô khay vườn ươm mau chóng ổn định thích nghi. Cây có thay đổi rõ rệt: từ màu xanh nhạt chuyển sang xanh đậm, cứng hơn, rễ màu trắng xanh nhạt chuyển sang màu xanh đậm rõ. Khi chuyển sang trồng thực chậu giá thể, chững lại chút, giá thể khác phát triển khác nhau. Kết thể bảng 3.6. Bảng 3.6. Ảnh hưởng giá thể đến sinh trưởng cây. Giá thể Cao (cm) Số Dài (cm) Số chồi Dớn 3,84 3,73 2,3 Than 3,27 2,5 4,4 1,46 Than + dớn 3,4 2,75 4,74 1,55 Dừa miếng 3,79 3,2 4,9 Dừa sợi 3,47 2,65 7,3 1,73 Qua bảng 3.6, giá thể thích hợp cho sinh trưởng lan Phi điệp tím dớn, đạt chiều cao cao (1,84 cm), độ dài vừa phải (3,73 cm). Ngoài ra, sử dụng giá thể dừa miếng cho kết tốt: chiều cao đạt 1,79 cm, số trung bình 3,2 lá, độ dài 4,9 cm. Kết cao so vói kết Nguyễn Thị Mỹ Duyên Dendrobium mini, chiều cao đạt 1,8cm, dài 1,9 cm (30 ngày sau cấy) [6]. Điều chất giống khác nhau. 3 Hình 6: Các giai đoạn phát triển lan Phi điệp tím thí nghiệm A. Hạt bắt đầu nảy mầm ; B. Mau sau 60 ngày cấy; c. Mau cấy vào môi trường nhân nhanh; D. Mau sau nhân nhanh tuần; E. Cây hoàn chỉnh đạt tiêu chuẩn; F. Ra cây. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận Qua kết thu được, rút kết luận sau: Sử dụng cồn 70° phút kết hợp với Ca(OCl 2)2 50% lắc 10 phút cho tỉ lệ mẫu sống cao đạt 94,67%, tỉ lệ mẫu nhiễm chết thấp (5,33%). Môi trường thích hợp cho nảy mầm hạt lan là: MS + 20 g/1 sacarose + g/1 agar ; pH = 5,7. Môi trường nhân nhanh tối ưu là: MS + mg/1 IBA + mg/1 kinetin + 30 g/1 khoai tây + 10% nước dừa + 30 g/1 saccarose + g/1 agar + 0,5 g/1 than hoạt tính (pH = 5,7), cho hệ số nhân nhanh cao đạt 3,64. Môi trường rễ thích hợp là: MS + 0,9 mg/1 IBA + 30 g/1 khoai tây + 10% nước dừa + 30 g/1 saccarose + g/1 agar + 0,5 g/1 than hoạt tính (pH = 5,7). Thực thí nghiệm điều kiện cường độ ánh sáng 1800 lux giúp phát triển mạnh nhất: mở to, màu xanh sẫm, số đạt 4,16 chiếc/cây; thân mập, cao. Giá thể dùng để dớn cho kết tốt nhất. 2. Kiến nghị Trên sở kết nghiên cứu thu được, bước đầu đề xuất ứng dụng kết thu nhân giống in vitro cho giống Phi điệp tím, đồng thời làm tiền đề cho nghiên cứu giống giống lan Phi điệp khác. Do thời gian nghiên cứu hạn chế nên chưa thể đánh giá đặc điểm sinh trưởng, đặc điểm chất lượng giống lan vườn ươm. Vì mong muốn có thêm thời gian để thực phàn thí nghiệm đánh giá tiêu sinh trưởng, phát triển tiêu chất lượng in vitro vườn. TÀI LIỆU THAM KHẢO • Tài liệu tiếng Việt: - Nguyễn Tiến Bân (1990), cẩm nang tra cứu nhận biết họ thực vật hạt kín (Magnoliophyta angios permae) Việt Nam, NXB Nông nghiệp Hà Nội. - Nguyễn Tiến Bân (2007), Sách Đỏ Việt Nam, Phần Thực vật, NXB Khoa học Tự nhiên Công nghệ, Hà Nội. - Đỗ Huy Bích (2004), Cây thuốc động vật làm thuốc Việt Nam, tập II: 803 - 804, NXB Khoa học Kỹ thuật. - Võ Văn Chi (1978a), Phân loại thực vật, NXB Giáo dục Đào tạo, Hà Nội. - Võ Văn Chi, Dương Đức Tiến (1978b), Phân bại thực vật - thực vật bậc cao, NXB Đại học Trung học chuyên nghiệp. - Nguyễn Thị Mỹ Duyên (2009), Nghiên cứu loại giá thể trồng lan Dendrobium mini thích hợp cho hiệu cao, Đại học An Giang. - Lê Trần Đức (1997), Cây thuốc Việt Nam, NXB Nông nghiệp. - Lê Văn Hoàng (2008), Giáo trình nuôi cấy mô tể bào thực vật, Đại học Đà Nằng. - Dương Đức Huyến (2007), Thực vật Việt Nam, - Họ lan (Orchidceae), NXB khoa học kỹ thuật. 10 - Vũ Ngọc Lan, Nguyễn Thị Lý Anh (2013), Nhân giong in vitro loài lan địa Dendrobium nobile Lindl, Tạp chí Khoa học Phát triển 7: 917 925. 11- Nguyễn Đức Lượng, Lê Thị Thủy Tiên (2002), Công nghệ tế bào, NXB Đại học Quốc gia, thành phố Hồ Chí Minh. 12 - Trần Văn Minh (2006), Công nghệ nuôi cấy mô, NXB Khoa học kỹ thuật. 13 - Chu Thị Ngọc Mỹ, Đặng Văn Đông, Trần Duy Quý (2009), Điều tra phân bố hoa lan Việt nam kết lưu giữ, đánh giá sổ giống lan quý Gia Lâm - Hà Nội, Tạp chí Khoa học Công nghệ Việt Nam, số (12)/2009: 96 -101. 14 - Hoàng Thị Nga, Nguyễn Quang Thạch, Đỗ Đức Thịnh, Hoàng Minh Tú (2008), Xây dựng quy trình nhân nhanh giống lan Hồng hoàng (Cymbỉdỉum Iridioides) kĩ thuật nuôi cấy mô tế bào, Tạp chí Khoa học Phát triển 4: 387 - 394. 15 - Trần Duy Quý (2005), sổ tay người Hà Nội chơi lan, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 16 - Nguyễn Văn Song (2011), Nhân nhanh in vitro lan Kim Điệp (Dendrobium chrysotoxum) - loài lan rừng có nguy tuyệt chủng, Tạp chí Khoa học Đại học Huế 64: 127 -136. 17 - Đào Thanh Vân Đặng Thị Tố Nga (2008), Giáo trình hoa, NXB Nông nghiệp Hà Nội. 18 - Vũ Văn Vụ, Hoàng Minh Tấn, Vũ Thanh Tâm (2001), Sinh học thực vật, NXB Giáo dục. Tài liệu tiếng Anh: 19 - Biniak s., Kazmierczak J. and Swiatkowski A., 1990. Adsorption of phenol from aqueous solutions on activated carbons with different oxygen contents. Polish J. Chem., 64: 182 -191. 20 - Ebert A. and Taylor H. F., 1990. Assessment of the changes of 2,4 dichlorophenoxyacetic acid concentrations in plant tissue culture media in the presence of activated charcoal. Plant Cell Tiss. Org. Cult., 20: 165 -172. 21 - Fridborg G., Pederson M., Landstrom L. E. and Eriksson T., 1978. The effect of activated charcoal on tissue cultures: adsorption of metabolites inhibiting morphogenesis. Physiol. Plant, 43: 194 - 106. 22 - Kauth p. (2005), In vitro seed germination and seedling development of Calopogon tuberosus and Sacoila lanceolata var. lanceolata: Two Florida native teưestrial orchids, Master thesis, University of Florida. [...]... lý do trên tôi tiến hành thực hiện đề tài Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Phi điệp tím (Dendrobỉum anosmum )phân bố tại Vĩnh Phúc bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào 2 Mục tiêu của đề tài Nhân nhanh thành công giống lan Phi điệp tím ịDendrobỉum anosmum) bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào in vitro, góp phần bảo tồn nguồn gen, cung cấp cây giống có chất lượng cao cho thị trường 3 Ý nghĩa... pháp nuôi cấy mô - tế bào thực vật Nuôi cấy mô - tế bào là phương pháp sử dụng các điều kiện nhân tạo để duy trì sự sống của tế bào trong ống nghiệm Mục đích chung của nuôi cấy mô tế bào là sử dụng các điều kiện như nhiệt độ, ánh sáng, thành phần dinh dưỡng, để điều khiển quá trình sinh trưởng và phát triển của tế bào, mô nuôi cấy theo mục tiêu, yêu cầu đặt ra 1.3.1 Cơ sở khoa học của nuôi cấy mò - tế. .. mô tế bào thực vật Bao gồm: + Nuôi cấy cây con và cây trưởng thành + Nuôi cấy cơ quan: rễ, thân, lá, hoa, quả, bao phấn, noãn chưa thụ tinh + Nuôi cấy phôi: phôi non và phôi trưởng thành + Nuôi cấy mô sẹo (callus) + Nuôi cấy tế bào đơn + Nuôi cấy protoplast: nuôi cấy phần bên trong tế bào thực vật sau khi đã tách vỏ còn gọi là nuôi cấy tế bào trần Đây là phương pháp nhân giống hiện đại được thực hiện... cung cấp những dẫn liệu khoa học về quy trình nhân nhanh giống lan Phi điệp tím phục vụ cho những nghiên cứu tiếp theo Ỷ nghĩa thực tiễn Việc nhân nhanh bằng công nghệ nuôi cấy mô in vitro tạo ra những cây sạch bệnh, chất lượng tốt, góp phần đáp ứng nhu càu của con người Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Sơ lược về chi Hoàng Thảo (Dendrobium) và cây lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) 1.1.1 Sơ lược... của tế bào 1 6 > Tỉnh phân hoá và phản phân hoá của tế bào: Tính phân hoá của tế bào là sự biến đổi của các tế bào phôi sinh thành các tế bào của các mô chuyên hoá đảm nhiệm các chức năng khác nhau Trong cơ thể thực vật có khoảng 15 loại mô khác nhau đảm nhiệm các chức năng khác nhau (mô dậu, mô dẫn, mô bì, mô khuyết, ) nhưng chúng đều có nguồn gốc từ tế bào phôi sinh đã trải qua giai đoạn phân hoá tế. .. cấy mò - tế bào thực vật 1.3.1.1 Nhân giong in vitro Nuôi cấy mô - tế bào thực vật là phạm trù khái niệm chung cho các loại nuôi cấy nguyên liệu thực vật hoàn toàn sạch các vi sinh vật, ừên môi trường dinh dưỡng nhân tạo, trong điều kiện vô trùng Nhân giống vô tính cây trồng in vitro hay vi nhân giống (Micropropagation) là một lĩnh vực ứng dụng có hiệu quả nhất trong công nghệ nuôi cấy mô tế bào thực... sinh có khả năng phân chia liên tục mà mất hẳn chức năng của các cơ quan dinh dưỡng như lá, thân Sự phân hoá và phản phân hoá giữa tế bào phôi sinh và tế bào đã chuyên hoá được thể hiện theo sơ đồ sau: Tế bào phôi sinh « Phân hoá tế bào zz^ Tế bào chuyên hoá Phản phân hoá tế bào về bản chất sự phân hoá và phản phân hoá là quá trình hoạt hoá của gen, tại một thời điểm nào đó trong quá trình phát triển... tựu nuôi cấy mô ở cây Phong Lan Phong lan là một ừong những loại cây trồng đạt thành công nhất trong nhân giống vô tính bằng phương pháp nuôi cấy mô ở mức độ công nghiệp Trên thế giới, có rất nhiều công trình nghiên cứu về nhân nhanh các giống lan nhằm bảo tồn và tăng số lượng phục vụ sản xuất Điển hình như Kusumoto, Furukawa [23], Kauth [22], Tawaro Supavadee et al [25] sử dụng kỹ thuật nuôi cấy nhân. .. cấy nhân giống đã tạo ra sự phát triển vượt bậc trong phát triển nghề trồng phong lan ở quy mô lớn Cho tới nay, hàu hết các loài phong lan đều được nhân nhanh bằng phương pháp nuôi cấy mô tế bào và đã thu được rất nhiều thành tựu Từ năm 1960 trở lại đây kĩ thuật nuôi cấy mô đã đạt được những thành tựu như: 1960, Cooking tách được tế bào trần và từ đó trở đi nuôi cấy tế bào tách rời đã có những bước phát...duy nhất có thể nhân giống lan cho hệ số nhân cao, số lượng cây giống lớn và giá thành hợp lý Tuy nhiên, cho đến nay ở nước ta, nghiên cứu nhân giống và nuôi trồng chi Hoàng thảo chủ yếu với các giống lan lai nhập nội nhằm sản xuất hoa cắt cành hay trồng chậu làm cây cảnh Việc nhân giống bằng kỹ thuật nuôi cấy mô loài Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) chưa được đề cập đến . tài Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Phi điệp tím (Dendrobỉum anosmum )phân bố tại Vĩnh Phúc bằng công nghệ nuôi cấy mô tế bào . 2. Mục tiêu của đề tài Nhân nhanh thành công giống. SINH - KTNN THÂN THỊ THÚY “BƯỚC ĐẦU NGHIÊN cứu QUY TRÌNH NHÂN NHANH GIỐNG LAN PHI ĐIỆP TÍM (DENDROBIUM ANOSMUN) PHÂN BỐ TẠI VĨNH PHÚC BẰNG CÔNG NGHỆ NUÔI CẤY MÔ TỂ BÀO” KHÓA LUẬN TỔT NGHIỆP ĐẠI. quả nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong khóa luận Bước đầu nghiên cứu quy trình nhân nhanh giống lan Phi điệp tím (Dendrobium anosmum) phân bố tại Vĩnh Phúc bằng công