Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội TRƯỜNG ĐẠI HỌC sư PHẠM HÀ NỘI KHOA SINH - KTNN NGUYỄN THU HIỀN XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐA HÌNH GIỮA GIỐNG CHO (KC25) VÀ GIÓNG NHẬN (NPT1) QTL/ GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyền ngành: Di truyền phân tử HÀ NỘI, 2015 Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành khóa luận này, nhận nhiều giúp đỡ thầy cô giáo. Đầu tiên xin gừi lời cảm ơn tới TS.Trần Đăng Khánh người thầy hướng dẫn tận tình, tạo điều kiện tốt giúp hoàn thành tốt khóa luận này. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới TS. Nguyễn Như Toản thầy cô giáo khoa Sinh - KTNN Trường Đại Học Sư Phạm Hà Nội 2, người truyền đạt cho kiến thức phương pháp nghiên cứu quý báu suốt thời gian học tập trường. Tôi xin gửi lời cảm ơn tới thầy cô, anh chị Viện Di truyền Nông nghiệp tận tình giúp đỡ tạo điều kiện giúp thời gian học tập, nghiên cứu viện. Và cuối cùng, xin gừi lời cảm ơn sâu sắc tới gia đình, bạn bè người quan tâm, giúp đỡ suốt thời gian học tập, nghiên cứu vừa qua. Trong thời gian hoàn thành khóa luận, lần làm nghiên cứu khoa học thời gian có hạn nên không tránh khỏi thiếu sót, mong nhận đóng góp ý kiến thầy cô bạn sinh viên để khóa luận hoàn thiện hơn. Xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thu Hiền Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan khóa luận hoàn thành kết nghiên cứu riêng tôi, số liệu khóa luận trung thực, không chép, không trùng lặp với kết nghiên cứu tác giả khác. Nấu sai xin hoàn toàn chịu trách nhiệm! Hà Nội, tháng năm 2015 Sinh viên Nguyễn Thu Hiền Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỤC LỤC 1. DANH MỤC CÁC KÍ HIỆU VÀ CHỮ VIẾT TẮT STT Chữ viết tắt Nghĩa chữ viết tắt ĐBSH Đồng Sông Hồng ĐBSCL Đồng Sông Cửu Long IRRI Viện nghiên cứu lúa Quốc tế MABC Marker assisted backcrossing MAS Marker-assisted selection PCR Polymerase Chain Reaction QTL Quantitative trait loci DANH MỤC BẢNG Bảng 2.1. Chỉ thị SSR dùng xác định đa hình vị trí QTL/gen quy định tính DANH MỤC HÌNH ẢNH Hình 1.1: Sơ đồ diện tích sản lượng lúa gạo giới giai đoạn 2002-2011 Hình 1.2: Xuất gạo Việt Nam từ năm 2005 đến năm 2011 (đơn vị: Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MỞ ĐẦU 1. Lí chọn đề tài. Cây lúa (Oryza sativa L.) - Lúa trồng châu Á, thuộc họ Hòa thảo (Cramnỉnae), tộc Oryza. Cây lúa lương thực quan trọng cho khoảng 2/3 dân số giới, trồng chiến lược đảm bảo an ninh lương thực giới Việt Nam không nước nghèo mà cho với nước phát triển. Ở Việt Nam, lúa nguồn lương thực chủ yếu 89 triệu dân với diện tích khoảng 7,4 triệu hecta, năm 2010 sản xuất 39,710 triệu thóc, xuất khoảng triệu đứng thứ giới xuất gạo sau Thái Lan. Nước ta có hai vùng trồng lúa Đồng Sông Cửu Long (ĐBSCL) diện tích 3,79 triệu chiếm 50% sản lượng lúa nước Đồng Sông Hồng (ĐBSH) diện tích 1,18 triệu chiếm 17% sản lượng (Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn, 2009). Trên giới, an ninh lương thực không vấn đề với nước nghèo mà trở thành vấn đề có tính toàn cầu. Dân số giới liên tục tăng (khoảng tỷ người năm 2050) diện tích đất dành cho việc trồng lúa không tăng mà ngày giảm quỹ đất chuyển sang sử dụng cho mục đích đô thị hóa xây dựng khu công nghiệp, trường học, nhà ở, khu du lịch . Do vậy, phát triển nguồn giống cải tiến cho suất cao, chất lượng tốt yếu tố quan trọng cho việc đảm bảo hệ thống sản lượng lúa. Chọn tạo giống lúa có khả năng suất cao cần thiết có ý nghĩa cho an toàn lương thực tăng thu nhập nông dân. Chọn giống nhờ thị phân tử lai trở lại (MABC) phương pháp thiết thực, hiệu việc chuyển locut gen quy định tính trạng di truyền số Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội lượng (QTL) hay gen vào giống mới. Phương pháp MABC cho phép rút ngắn trình chọn lọc, chọn lọc tính trạng khó đắt tiền hay nhiều gen lúc. Chọn giống MABC giảm giá thành thời gian. Chọn giống nhờ thị phân tò kỹ thuật hiệu so với phương pháp chọn giống truyền thống. Bởi vì, chọn giống nhờ thị phân tử cho phép chọn lọc trực tiếp hệ gen cá thể quần thể. Chọn giống nhờ thị phân tò sử dụng lượng lớn thị để kiểm tra di truyền dòng bố mẹ. Từ kiểm soát alen đặc biệt cá thể quần thể. Kiểm tra theo phương pháp kết hợp lai trở lại đến hệ thu cá thể với di truyền dòng mẹ mang gen chuyển. Các dòng cho tự thụ, thu hạt để làm thí nghiệm thử nghiệm đồng ruộng. Bằng phương pháp chọn giống nhờ thị phân tò lai trở lại (MABC), nhà chọn giống IRRI thành công mang lại kết việc tạo giống lúa vừa có suất cao, vừa có khả chống chịu với điều kiện sinh học phi sinh học bất lợi. Những giống lúa cải tiến tạo kết họp hai phương pháp chọn giống truyền thống đại. Bước đột phá việc chọn giống lúa siêu cao sản trở nên thực sau locut điều khiển tính trạng tăng suất (QTL) xác định. Bằng việc sử dụng phương pháp chọn giống nhờ thị phân tử lai trở lại đẩy nhanh trình quy tụ gen vào giống suất cao (Marker assisted backcrossing MABC; Thomson ctv., 2009; Septizningsih ctv., 2009). Yì vậy, việc ứng dụng công nghệ sinh học việc lai chuyển gen tăng suất vào giống lúa trồng đại trà vấn đề cấp thiết. Nhằm góp phần vào công tác chọn tạo giống lúa suất cao; xin thực đề tài: “Xác định thị phân tử đa hình giống cho (KC25) giống nhận (NPT1) QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt bông”. Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2. Mục đích nghiên cứu. Xác định thị phân tò đa hình giống cho (KC25) giống nhận (NPT1) QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt góp phần chọn tạo cải tiến giống lúa tăng suất. 3. Ý nghĩa khoa học thực tiễn 3.1. Ỷ nghĩa khoa học Xác định thị phân tử đa hình vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt dòng/giống cho gen dòng/giống nhận gen. 3.2. Ỷ nghĩa thực tiễn Sau nghiên cứu xác định thị cho đa hình vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt dòng cho gen KC25 giống nhận gen (NPT1) sử dụng để đánh giá xác định kiểu gen hệ lai, tìm cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt triển vọng. Chương 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. Nguồn gốc vai trò lúa - Nguồn gốc lúa: Tổ tiên lúa Châu Á (Oryza sativa L.) loại lúa hoang dại phổ biến (O. rufipogon) có nguồn gốc khu vực xung quanh vùng Đông Nam Á. Hiện giống lúa gieo trồng làm lương thực khắp giới. Hơn 10.000 năm trước, cư dân nơi trồng loài lúa nước xem nơi xuất văn minh lúa nước, nơi xem trung tâm nông nghiệp giới. - Vai trò lúa: Lúa năm loại lương thực giới, với ngô (Zea Mays L.), lúa mì (Triticum sp.), sắn (Manihot escuỉenta Crantz) khoai tây (Solalum tuberosum L.). Theo quan niệm xưa, lúa sáu loại lương thực chủ yếu Lục cốc. Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Theo thống kê Bộ Nông nghiệp Hoa Kỳ, giới có khoảng 1.561 triệu đất dùng cho việc trồng lúa, sản lượng 6.979 triệu tấn, 90% diện tích thuộc nước Châu Á với 651 triệu thóc chiếm 92% tổng sản lượng lúa gạo giới (Bộ Nông nghiệp Phát triển Nông thôn, 2010). Ở Việt Nam, lúa nguồn lương thực chủ yếu 89 triệu dân với diện tích khoảng 7,4 triệu hecta, năm 2010 xuất khoảng triệu đứng thứ giới xuất gạo sau Thái Lan. Nước ta có vùng trồng lúa ĐBSCL diện tích 3,79 triệu chiếm 50% sản lượng ĐBSH diện tích 1,18 triệu 17% sản lượng (Bộ Nông nghiệp Phát triển nông thôn, 2009). 1.2. Tình hình sản xuất, tiều thụ lúa gạo giói Tình hình sản xuất lúa gạo giới từ năm 2002 đến năm 2011 tăng diện tích sản lượng (Hình 1.1). Tuy có nhiều bất ổn thời tiết không thuận lợi châu Á khu vực sản xuất tới 90,3% tương đương với 435/481 triệu gạo tổng số sản lượng lúa gạo giới năm 2011. Trong đó, nước: Trung Quốc, Ấn Độ, Pakistan Việt Nam nước dẫn đầu sản lượng lúa gạo khu vực. Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Nguồn: Vietrade.gov.vn Hình 1.1: Sơ đồ diện tích sản lượng lúa gạo giới giai đoạn 2002-2011 Theo báo cáo Trần Huỳnh Thúy Phượng (2013), nhập gạo quốc gia châu Phi khoảng 10,5 triệu tấn, giảm 2% so với năm 2011. Nguyên nhân giảm nhập gạo hầu hết phủ quốc gia quan tâm sản xuất nước làm sản lượng lúa nội địa tăng lên. Quốc gia nhập nhiều gạo châu Phi Nigeria đặt mục tiêu năm 2015 tự cung gạo nâng mức thuế nhập gạo vào quốc gia này. Điều gây khó khăn cho xuất gạo Việt Nam chịu cạnh tranh liệt từ nước có nguồn cung cấp gạo dồi Thái Lan, Ấn Độ . Tại nước Mỹ La tinh nhập khoảng 3,7 triệu năm 2012 tăng 6% so với năm 2011 sản lượng gạo số nước có xu hướng giảm như: Braxin, Haiti, Panama, Mexico . Đối với việc xuất gạo vào châu Âu khỏ khăn quốc gia tăng cường biện pháp nghiêm ngặt (thời gian đến địa điểm nhập hàng, tiến hành kiểm tra lô hàng xem có loại sinh vật biến đổi gen trái phép không .). Đặc biệt gạo sản phẩm từ gạo có nguồn gốc Trung Quốc (Trần Huỳnh Thúy Phượng, 2013). 1.3. Tình hình sản xuất, tiêu thụ lúa gạo Việt Nam Lúa gạo mặt hàng xuất chủ lực ngành nông nghiệp Việt Nam nước có diện tích gieo trồng sản lượng lúa gạo cao giới. Giai đoạn 2005 - 2008 sản lượng gạo xuất tương đối ổn định mức 4,5 triệu có mức đột phá từ năm 2009 (Hình 1.2). Cụ thể, mùa vụ 2010-2011, Việt Nam xuất 7,1 triệu gạo tổng sản lượng 26,37 triệu tấn. Mùa vụ năm 2011-2012, nước xuất 7,72 triệu tổng sản lượng 27,15 triệu tấn, tiếp tục đứng vị trí thứ xuất gạo sau Ấn Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 10 Khỏa luận tốt nghiệp - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Thêm 400 ^il đệm CTAB (0,2 M Tris HC1 (pH 8,0): M NaCl: 0,05 M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt vào nhiệt độ 65°c 15 phút, trộn, lắc đều. - Cho tủ hút, thêm vào 800 |_il chloroíòrm/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn từ - phút nhằm loại bỏ protein. - Ly tâm 13.500 vòng/phút 10 phút. Dung dịch bên eppendorf tách thành phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch phía sang eppendorf mới. Nếu chưa chiết lại lần chloroíòrm/isoamyl alcohol (24:1). - Thêm 2,5 lần thể tích ethanol 96% giữ tủ lạnh sâu (-20°C). - Ly tâm 13.500 vòng/phút 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa trắng đáy ống. - Rửa tiếp 400 |J.1 cồn 70% đưa vào máy ly tâm 13.500 vòng/phút phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho vào máy làm khô chân không khoảng 10 phút làm khô tủa (ADN), sau cho 100 f4.1 TE (10:1) vào eppendorí hoà tan tủa. - Giữ ADN tủ lạnh sâu (- 20°C) để sử dụng cho bước nghiên cứu tiếp theo. 2.3.2. Phương pháp PCR với mồi thí nghiệm Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR chuẩn bị PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng chất phản ứng bảng 2.2 Bảng 2.2. Thành phần phản ứng PCR STT Thành phần Thể tích (pi) H20 cất khử trùng 8.95 Buffer 10X 1,5 Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 34 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội MgCl2 (50 mM) 0,45 dNTP (1 raM) 1,0 Taq DNA polymeraza (5 U) 0,1 Primer forward f4.M 0,5 Primer Revert |J,M 0,5 ADN (35 ng/ ịiì) 2,0 Tổng thể tích: 15 Sau có đủ thành phần, hàm lượng chất cần thiết, tiến hành đặt chương trình chạy cho máy. Chu trinh nhiệt máy PCR sau: Bảng 2.3. Chương trình chạy phản ứng PCR Bước Nhiệt độ (°C) Thời gian số chu kỳ 94 phút 94 30 giây 35 55* 30 giây 72 45 giây 72 phút 10 00 (*): Nhiệt độ gắn mồi - thay đổi tùy theo cặp mồi thí nghiệm 2.3.3. Phương pháp điện di gel agarose 0,8% ❖ Các bước tiến hành - Cân 0,8 g agarose, đong 100 ml TBE 0,5X (5,4 g Tris base; 2,76 g axít boric; ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho vào bình tam giác. Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 35 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội - Đun lò vi sóng tạo thành dung dịch đồng nhất. - Để nguội đến khoảng 50 - 60°c, thêm 5(4.1 ethidium bromide (10 mg/ml) lắc đều. - Chuẩn bị khay lược. Đổ dung dịch agarose vào khay cho bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông. - Rút lược, đặt gel vào bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng mm. - Tra sản phẩm PCR trộn với Xylen cyanol vào giếng. Tỷ lệ [4.1 Xylen cyanol /15 Ị0.1 mẫu. Thời gian điện sử dụng để điện di dài hay ngắn phụ thuộc vào kích thước cặp mồi thí nghiệm cần kiểm tra. Các mẫu chạy với ladder 25 bp. 2.3.4. Soi gel máy soi cực tím. Phương pháp điện di gel polyacrylamide biến tính ♦♦♦ Chuẩn bị kỉnh - Lau kỹ bề mặt hai kính lần nước cất, sau lau lại lần ethanol 95%, để khô sau lần lau. - Lau kính dài với giấy lụa tẩm Rain-X. Để phút cho khô dung dịch. Chủ ý. Tránh làm dính dung dịch lên kính ngắn. - Lau kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) tạo thành cách thêm (J.1 Bind Silane vào ml chứa 95% ethanol 5% glacial acetic acid. - Để cho kính khô, lau tiếp ethanol 95% lần. - Lắp ghép kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4 mm. ♦♦♦ Chuẩn bị gel polyacrylamide Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380 g; bisacrylamide 20 g pha lít nước). Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 36 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội - Đổ 60 ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: ml TBE ÌOX: 6,75 ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1) vào cốc đong 100 ml. Thêm 300 |J,1 10% APS (ammonium persulfate) 60 |J,1 TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều. - Bơm dung dịch gel vào hai kính cho bọt khí. - Cài lược vào hai kính (răng lược hướng phía ngoài). Dùng kẹp cố định lược. - Để gel polyme hóa 1-2 giờ. ❖ Điện di - Tháo lược loại bỏ hết mảnh gel thừa bám mặt kính. - Lắp ráp điện di. Cho lít đệm TBE IX vào buồng đệm dưới. - Dùng xylanh đuổi hết bọt khí bề mặt phía khuôn gel. - Chạy tiền điện di (prerun) với cường độ dòng điện 50 - 60 A, công suất 92-100 w. - Biến tính sản phẩm PCR 95°c phút, đặt vào đá phủ đá lên phút. - Sản phẩm PCR lúc trộn với ịú Sequencing Stop solution (10 mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol). - Tra vào giếng Ị4.1 sản phẩm PCR làm biến tính, mẫu chạy với ladder 50 bp. - Thời gian tra mẫu không kéo dài dài để gel không bị nguội nhiều. - Tiến hành điện di với công suất 60 w 50°c, thời gian chạy ngắn hay dài tùy kích thước mồi sử dụng. + Chuẩn bị dung dịch Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 37 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội - Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100 ml glacial acetic acid 900 ml nước cất. - Dung dịch nhuộm (Staining solution) tạo thành cách hòa tan g bạc nitrat (AgN03) vào lít nước cất, sau bổ sung thêm 1,5 ml formaldehyd (H2CO) 37%. - Dung dịch (Developing solution): Hòa tan 30 g natri cacbonat (Na2C03) lít nước cất làm lanh -20°c. Chú ý. (Trước sử dụng thêm 1,5 ml formaldehyde (H2CO) 37% 200 Ị4.1 natri thiosulfat 10% (Na2S20.5H20). + Tiến hành nhuộm Sau chạy điện di, tháo gỡ kính bám gel tiến hành bước sau: - Cố định gel: Đặt kính vào khay cho mặt bám gel hướng lên trên, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng để khoảng 30 phút. Sau lấy gel khỏi dung dịch. Chú ý: Giữ lại dung dịch để dùng cho bước sau. - Rửa gel nước cất lần lần phút. Cho gel vào dung dịch nhuộm, lắc nhẹ 30 phút. Thêm íòrmaldehyd sodium thiolsufat vào dung dịch hiện. Lấy gel khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại nước cất 5-10 giây. - Đưa gel vào dung dịch lắc nhẹ đến băng xuất hiện. Cho gel vào dung dịch cố định/dừng phản ứng 3-6 phút. Rửa lại gel nước cất. Để gel khô tự nhiên sau ghi nhận kết quả. 2.4. Địa điểm thời gian nghiền cứu - Địa điềm nghiền cứu: Đề tài thực Viện Di truyền Nông nghiệp, Bộ môn Kĩ thuật Di truyền. - Thời gian nghiên cứu: Từ tháng 8/2014 đến tháng 4/2015. Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 38 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Chương 3. KẾT QUẢ NGHIÊN cứu VÀ THẢO LUẬN 3.1. Kết nghiền cứu 3.1.1. Tách chiết tinh sach ADN Tách chiết ADN bước quan trọng nghiên cứu sinh học phân tó. Neu có ADN đủ độ tinh điều kiện tốt cho bước nghiên cứu tiếp theo. Trong nghiên cứu này, chọn phương pháp tách chiết ADN CTAB. Lá non tuần sau cấy giống nghiên cứu thu để tách chiết ADN. Nồng độ độ tinh ADN kiểm tra điện di gel agarose 0,8% với ADN chuẩn. Nhuộm gel dung dịch ethidum bromide ghi nhận kết máy soi cực tím. Kết tách chiết ADN minh hoạ hình 3.1 Hình 3.1. Kết kiểm tra ADN tổng số tách chiết theo phưong pháp CTAB gel agarose 0,8%. Giếng số 1- Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng//JỈ), giếng sổ - NPT1, giếng sổ - KC25 Kết tách chiết ADN cho thấy phương pháp tách chiết ADN CTAB cho hiệu cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Các mẫu ADN không bị đứt gãy, việc loại bỏ ARN RNase tiến hành tốt thể Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 39 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội băng điện di gọn, rõ. Những mẫu ADN đủ điều kiện để sử dụng cho thí nghiệm sinh học phân tử tiếp theo. 3.1.2. Khảo sát đa hình vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt bông. Đa hình hai giống lúa phát chiều dài khác đoạn lặp lại khuếch đại phản ứng PCR sử dụng cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giống cho gen nhận gen với thị liên kết chặt điều kiện tiên để sử dụng thị phân tử nhằm phát có mặt gen cần chuyển cá thể Dòng KC25 có mang QTL/gen (Yd7) quy định tăng số hạt bông. Nhằm mục đích tìm kiếm thị sử dụng để phát gen Yd7 cá thể lai tiến hành phản ứng PCR với ADN giống lúaNPTl KC25. Sử dụng thị SSR nằm vị trí gen hai phía gen Yd7 nhiễm sắc thể số 7. Đã xác định thị cho đa hình giống NPT1 KC25 RM445, RM500, RM21615. Kết thể qua Hình 3.2. RM445 123456 RM21615 123456 RM500 123456 Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 40 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội Hình 3.2. Kết khảo sát đa hình ADN giống NPT1 dòng KC25 với thị RM445, RM500, RM21615 (4-NPT1: 5-KC25) Quan sát hình 3.2 ta thấy thị RM445, RM500, RM21615, đường chạy số (mẫu ADN giống KC25) xuất băng DNA cao băng đường chạy số (mẫu ADN dòng NPT1). Sự chênh lệch vị trí băng ADN đường chạy với thể đa hình dòng NPT1 với giống KC25. 3.2. Thảo luận Mặc dù có nhiều tiến nghiên cứu tính trạng tăng suất lúa, nhiều thách thức cần phải chứng minh chế phân tử quy định tính hình thành tính trạng suất. Hầu hết tất tính trạng suất bao gồm số khóm, số hạt bông, khối lượng hạt biểu nhiều biến dị liên tục quần thể di truyền giống thương mại, tính trạng nhiều gen hay QTL quy định. Cơ sở liệu Gramene lưu trữ xác định hàng ngàn QTL/gen liên quan đến tính trạng suất từ nghiên cứu lập đồ chi tiết đa số QTL có hiệu ứng di truyền nhỏ, gây nhiều khó khăn xác định thông qua phân tích đột biến. Gần nhà khoa học trường Đại học Nagoya Nhật Bản thành công ứng dụng thị phân tử để chuyển QTL/gen Gual quy định tính trạng tăng suất vào số giống lúa trồng đại trà. Kết cho thấy giống lúa mang QTL/gen Gual góp phần tăng suất 20-25% so với giống đối chứng (Matsuoka cs, 2008). CHƯƠNG 4. KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận. Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 41 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội - Xác định 3/6 thị cho đa hình vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt dòng nhận NPT1 giống cho KC25 gồm: Chỉ thị RM445, RM500 RM2161. 4.2. Kiến nghị. - Sử dụng thị RM445, RM500 RM2161 cho thí nghiệm nhằm sàng lọc cá thể mang QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt hệ lai. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Tài liệu tiếng Việt 1. Nguyễn Duy Bảy, Nguyễn H.T., Bùi Chí Bửu Bùi Bá Bổng (2001) Chọn giống nhờ Marker Phân tích QTL, Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long, 44-58. 2. Ngô Thế Dân (2002) Kết nghiên cứu thử nghiệm giống trồng giai đoạn 1996-2000. Tạp khoa học công nghệ. 3. Bộ Nông Nghiệp Phát triển Nông thôn (2009) Quy hoạch sử dụng đất lúa cho vùng nước. 4. Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang (2004) Đi truyền phân tử. NXB Nông nghiệp TP. HCM, 288-305. 5. Nguyễn Thị Lang (2002) Những phương pháp công nghệ sinh học. NXB Nông nghiệp TP. HCM. 6. Nguyễn Đình Luận (2013) Xuất gạo Việt Nam: Thực trạng giải pháp. Tạp Kinh tế Phát triển, số 193:9-14. 7. Trần Huỳnh Thúy Phượng (2013) Xuất gạo Việt Nam năm 2012 định hướng năm 2013. Tạp chí nghiên cứu trao đổi. số (19):48- 56. 8. Lê Duy Thành (2000) Cơ sở di truyền chọn giống thực vật. NXB Khoa Học Kỹ Thuật, Hà Nội, Việt Nam. Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 42 Khỏa luận tốt nghiệp Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 9. Nguyễn Quang Vinh (1976) Triển vọng sử dụng thành tựu sinh học phân tử nông nghiệp. 2. Tài liệu tiếng Anh 10. Akagi H, Shimada H and Fujimura T (1995) High frequency interparental recombination between mitochondrial genome of rice hybrids. Current Genetics. 29:58-65 Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 43 Khỏa luận tốt nghiệp Truong Dai hoc Supham Ha Noi 11. Brondani C, Rangel PHN, Brondani RPV, Ferreira ME (2002) QTL mapping and introgression of yield-related traits from Oryza glumaepatula to cultivated rice (Oryza sativa) using microsatellite markers. TheorAppl Genet. 104:1192-1203 12. Chen, X., M. Line, R., F. and Leung, H. 1998. Genome Scanning for RAGs in rice, Barley, and wheat by high resolution electrophoresis. Theor Appl Gennet. 97:345-355 13. Cui KH, Peng SB, Xing YZ, Yu SB and Xu CG (2002) Genetic analysis of the panicle traits related to yield sink size of rice. Acta genetica Sinica. 29:144-152 14. Grant, M., Godiard, L., Straube, E., Ashfield, T., Lewald, J., Saatler. A., Innes, R, and Dangl. J. 1995. Structure of the Arabidopsis RPM1 gene anabling dual specificity disease resistance. Science. 269:843-846. 15. Hittalmani S, Huang N, Courtois B, Venuprasad R, Shashidhar HE, Zhuang JY, Zheng KL, Liu GF, Wang GC, Sidhu JS, Srivantaneeyakul S, Singh VP, Bagali PG, Prasanna HC, McLaren G and Khush GS (2003) Identification of QTL for growth- and grain yield-related traits in rice across nine locations of Asia. TheorAppl Genet. 107:679-690 16. Hittalmani S, Shashidhar HE, Bagali PG, Huang N, Sidhu JS, Singh VP and Khush GS (2002) Molecular mapping of quantitative trait loci for plant growth, yield and yield related traits across three diverse locations in a doubled haploid rice population. Euphytica. 125:207-214 17. Hua JP, Xing YZ, Xu CG, Sun XL, Yu SB and Zhang Q (2002) Genetic dissection of an elite rice hybrid revealed that heterozygotes are not always advantageous for performance. Genetics. 162:1885-1895 Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 44 Khỏa luận tốt nghiệp Truong Dai hoc Supham Ha Noi 18. IRGSP. (2005) The map-based squence of the rice genome. Nature 436: 793-800 19. Kobayashi S, Fukuta Y, Sato T, Osaki M and Khush GS (2003) Molecular marker dissection of rice (Oryza sativa L.) Plant architecture under temperate and tropical climates. Theor Appl Genet. 107:13501356 20. Li JM, Thomson M and McCouch SR (2004) Fine mapping of a grain weight quantitative trait locus in the pericentromeric region of rice chromosomes 3. Genetics. 168:2187-2195 21. Li XH , Xu CG, Gao YJ, Yu SB, Zhang Q, Li JX and Tan YF (2000) Analyzing quantitative trait loci for yield using a vegetatively replicated F2 population from a cross between the parents of an elite rice hybrid. Theor Appl Genet. 101:248-254 22. Li ZK, Pinson SR., Park WD, Paterson AH and Stansel JW (1997) Epistasis for three grain yield components in rice (Oryza sativa L). Genetics. 145:453-465 23. Liao CY, Wu P, Hu B and Yi KK (2001) Effects of genetic background and environment on QTLs and epistasis for rice (Oryza sativa L.) panicle number. Theor Appl Genet. 103:104-111 24. Lin HX, Qian HR, Zhuang JY, Lu J, Min SK., Xiong ZM, Huang N and Zheng KL (1996) RFLP mapping of QTLs for yield and related characters in rice (Oryza sativa L.). Theor Appl Genet. 92:920-927 25. Lin HX, Zhu MZ, Yano M, Gao JP, Liang ZW, Su WA, Hu XH, Ren ZH, Chao DY (2004). QTLs for Na+ and K+ uptake of the shoots and roots controlling rice salt tolerance. Theor Appl Genet. 108:253-260 Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 45 Khỏa luận tốt nghiệp Truong Dai hoc Supham Ha Noi 26. Lin W, Anuratha CS, Datta K, Portrykus I, Muthukrishnan S and Datta SK (1995) Genetic engineering of rice for resistance to sheath blight. Bio/technology. 13:686-691 27. Linh L.H, Hang N. T., Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S.N (2008). Introgression of a quantitative trait locus for spikelets per panicle from Oryza minuta to the O. sativa cultivar Hwaseongbyeo. Plant Bred. 127:262-267 28. Linh L.H, Jin F.X, Kang K.H, Lee Y.T, Kwon S.J, Ahn S.N (2006). Mapping quantitative trait loci for heading date and awn length using an advanced backcross line from a cross between Oryza sativa and O. minuta. Bred Sci. 56: 341-349 29. Lu C, Shen L, Tan Z, Xu Y, He P, Chen Y, Zhu L and Xu YB (1996) Comparative mapping of QTLs for agronomic traits of rice across environments using a doubled haploid population. Theor Appl Genet. 93:1211-1217 30. Lu CF, Shen LH, Tan ZB, Xu YB, He P, Chen Y and Zhu LH (1997) Comparative mapping of QTLs for agronomic traits of rice across environments by using a doubled-haploid population. Theor Appl Genet. 94:145-150 31. Matsuoka M and Takeda S (2008) Genetic approaches to crop improvement: responding to environmental and population changes. Nat. Rev. Genet. 9:444-457 32. Moncada P, Martinez CP, Borrero J, Chatel M, Gauch H, Guimaraes E, Tohme J and McCouch SR (2001) Quantitative trait loci for yield and yield components in an Oryza sativa X Oryza rufipogon BC2F2 Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 46 Khỏa luận tốt nghiệp Truong Dai hoc Supham Ha Noi population evaluated in an upland environment. Theor Appl Genet. 102:41-42 33. Moncada P, Martinez CP, Borrero J, Chatel M, Gauch H, Guimaraes E, Tohme J and McCouch SR (2001) Quantitative trait loci for yield and yield components in an Oryza sativa X Oryza rufipogon BC2F2 population evaluated in an upland environment. Theor Appl Genet. 102:41-52 34. Monna L, Miyao A, Inoue T, Fukuoka S, Yamazaki M, Zhong HS, Sasaki T and Minoke Y (1994) Determination of RAPD markers in rice and their conversion into sequence tagged sites (STSs) and STS- specific primers. DNA Research. 1:139-148 35. Paterson, A., H. 1996. Making genetic maps. In: Paterson AH (ed.) Genome mapping in plants, San Diego, California: Academic Press, Austin, Texas, 23-39. 36. Septiningsih EM., Pamplona AM., Sanchez DL., Maghirang- Rodriguez R, Neeraja CN, Vergara GV, Heuer S, Ismail AM, Mackill DJ. 2009. Development of submergence-tolerant rice cultivars: The Subl gene and beyond. Ann. Bot. 103:151-160. 37. Tansley, S.D (1993), Mapping polygenes. Annu. Rev. Gent (27), pp. 205 - 233 38. Thomson MJ, Ismail AM, McCouch SR, Mackill DJ. 2009. Marker Assisted Breeding. In: Pareek A, Sopory SK, BohnertHJ, Govindjee (eds); Abiotic Stress Adaptation in Plants: Physiological, Molecular and Genomic Foundation. Chapter 20. Springer, Dordrecht 39. Thomson MJ, Tai TH, McClung AM, Lai XH, Hinga ME, Lobos KB, Xu Y, Martinez CP and McCouch SR (2003) Mapping quantitative trait Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 47 Khỏa luận tốt nghiệp Truong Dai hoc Supham Ha Noi loci for yield components and morphological traits in an advanced backcross population between Oryza rujipogon and the Oryza sativa cultivar Jefferson. Theor Appl. Genet. 107:479-493 Towards rice genome scanning by map-based AFLP fmgprinting. Mol Gen Genet. 261:1320-1328 40. Venuprasad R, Shashidhar HE, Hittalmani S and Hemamalini GS (2002) Tagging quantitative trait loci associated with grain yield and root morphological traits in rice (Oryza sativa L.) under contrasting moisture regimes. Euphytica. 128:293-300 41. Williams, J.G.K., Kubelik, A.R., Livak, K.J., Rafalski, J.A., Tingey, S.V. 1990. DNA polymorphisms amplified by arbitrary primers are useful as genetic markers. Nucleic Acids Res. 18:6531-6535. 42. Xiao J, Li J, Yuan L, Tanksley SD (1996) Identification of QTLs affecting traits of agronomic importance in a recombinant inbred population derived from a subspecific rice cross. Theor Appl Genet 92:230-244 43. Xiao J, Li JM, Grandillo S, Ahn SN, Yuan LP, Tanksley SD and McCouch SR. (1998) Identification of trait-improving quantitative trait loci alleles from a wild rice relative, Oryza rufipogon. Genetics. 150:899-909 44. Xiao JH, Li JM, Yuan LP and Tanksley SD (1996) Identification of QTLs affecting traits of agronomic importance in a recombinant inbred population derived from a subspecific rice cross. Theor Appl Genet. 92:230-244 45. Xing Z, Tan F, Hua P, Sun L, Xu G and Zhang Q (2002) Characterization of the main effects, epistatic effects and their Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 48 Khỏa luận tốt nghiệp Truong Dai hoc Supham Ha Noi environmental interactions of QTLs on the genetic basis of yield traits in rice. Theor Appl Genet. 105:248-257 46. Xu D; Duan X; Wang B; Hong B; Ho THD and Wu R, (1996), Expression of a late embryogenesis abnundant (LEA) protein gen, Nguyễn Thu Hiền - K37A Sư phạm Sinh 49 [...]... định tính trạng số hạt trên bông liên kết chỉ thị phân tò RM20-C104, RZ537-RZ900 (Moneada và cs, 2001), và RM254-C950 (Thomson và cs, 2003) Một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt liên kết chỉ thị phân tò RM286(Xing và cs, 2001; Brondani và cs, 2002) Xiao và cs, (1996) xác định một QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt trên nhiễm sắc thể số 11 Bốn QTLs quy định tính trạng số bông trên khóm được xác định. .. Sinh 31 Khỏa luận tốt nghiệp - Trường Đại học Sư phạm Hà Nội 2 Sử dụng 06 chỉ thị SSR trên NST số 7 (Bảng 2.1) xác định chỉ thị đa hình tại vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông giữa giống cho và giống nhận gen Bảng 2.1 Chỉ thị SSR dùng xác định đa hình tại vị trí QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông STT Primer Forward Primer Reverse Primer 1 RM445 CGTAACATGCATATCACGCC... Ba QTLs quy định tính trạng số hạt trên bông được xác định liên kết chỉ thị phân tử RM20A-C732B (Thomson và cs, 2003), RG869 (Thomson và cs, 2003), CD0459-RG235 (Zhuang và cs, 1997; Xiao và cs, 1998) Một QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên cây được xác định tại vị trí gần tâm động của nhiễm sắc thể số 12 (Xiao và cs, 1996) Hai QTLs quy định tính trạng số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tò... và cs, 1996; Hua và cs, 2002; Thomson và cs, 2003) Một QTL quy định tính trạng tổng số hạt trên bông được xác định tại vị trí chỉ thị phân tử RM422-RM215 (Xiao và cs, 1996; Xiao và cs, 1998; Thomson và cs, 2003) Bốn QTLs quy định tính trạng hạt chắc trên bông được xác định bởi tác giả Thomson và cs, (2003) tại vị trí RM215 Một QTL quy định tính trạng số bông trên khóm tại vị trí RG667-RM404 (Xiao và. .. khoảng cách di truyền là 6,3 cM trên nhiễm sắc thể số 8 (Bùi Chí Bửu, Nguyễn Thị Lang và ctv (2001) Riêng vói tính trạng số hạt trên bông, việc áp dụng chỉ thị phân tử để xác định QTL/ gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông là một lĩnh vực nghiên cứu mới Nó mở ra một hướng mới cho nghiên cứu giống lúa dựa trên chỉ thị phân tử liên kết với các tính trạng, nhằm tạo ra các giống lúa năng suất cao, hứa... QTL quy định tính trạng số bông trên khóm liên kết chỉ thị phân tử RM210 (Xiao và cs, 1996; Brondani và cs, 2002) Hai QTLs quy định tính trạng năng suất được xác định tại vị trí gần tâm động (Xiao và cs, 1996; Li và cs, 2000), và một tại vị trí liên kết chỉ thị phân tử RZ66-RG598 (Zhuang và cs, 1997) Nhiễm sắc thể số 9: Một QTL quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tó RM257-RG667... và cs, 1996; Zhuang và cs, 1997), và RM26C147 (Brondani và cs, 2002; Hua và cs, 2002) Hai QTL quy định tính trạng khối lượng nghìn hạt liên kết chỉ thị phân tử RG360-R3166 trên vai ngắn (Hua và cs, 2002), và tại RG13-RG470 (Li và cs, 1997; Hua và c, 2002; Thomson và cs, 2003) Hai QTL quy định tính trạng số hạt trên cây tại vị trí chỉ thị phân tử RZ556-RG360 (Xiao và cs, 1996), và gần RG13 (Nagata và. .. trí chỉ thị phân tò RZ398-RM204 (Thomson và cs, 2003), và RG653-G342 (Xiao và cs, 1996; Hua và cs, 2002) Nhiễm sắc thể số 7: Ba QTLS quy định tính trạng khối lượng 1000 hạt liên kết chỉ thị phân tử RG128-C1023 trên vai ngắn (Hua và cs, 2002), RM125 gần tâm động, và RM11-RZ626 (Xiao và cs, 1996; Brondani và cs, 2002) Bốn QTLs quy định tính trạng tổng số hạt trên cây được xác định liên kết chỉ thị phân. .. liên kết tính trạng số hạt chắc trên bông tại vị trí RG360- RG182 trên vai ngắn (Zhuang và cs, 1997; Li và cs, 2000), và tại vị trí RM164-C624 trên vai dài (Li và cs, 2000) Bốn QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt được xác định liên kết chỉ thị phân tử RZ390-RM153 (Thomson và cs, 2003), RZ296 (Xiao và cs, 1996) và G366-C624 (Lu và cs, 1997), tại vị trí chỉ thị phân tử RG435 trên vai dài (Xiao và cs,... định tính trạng tỷ lệ đậu hạt được xác định liên kết chỉ thị phân tử OG32 Trong khi đó, Thomson và cs, (2003) xác định QTL quy định tính trạng tỷ lệ đậu hạt tại vị trí RM276 Ba QTLs số bông trên khóm được xác định tại vi trí Wx-RG213 (Lin và cs, 1996), RM3-CD078 (Moneada và cs, 20001), RG653 (Xiao và cs, 1996; Kobayashi và cs, 2003) Hai QTLs quy định tính trạng năng suất được xác định bởi một số tác giả . HIỀN XÁC ĐỊNH CHỈ THỊ PHÂN TỬ ĐA HÌNH GIỮA GIỐNG CHO (KC25) VÀ GIÓNG NHẬN (NPT1) QTL/ GEN QUY ĐỊNH TÍNH TRẠNG TĂNG SỐ HẠT TRÊN BÔNG KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC Chuyền ngành: Di truyền phân tử HÀ. giống lúa năng suất cao; tôi xin thực hiện đề tài: Xác định chỉ thị phân tử đa hình giữa giống cho (KC25) và giống nhận (NPT1) QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trên bông . Khỏa luận tốt. quy định tính trạng tăng số hạt trên bông giữa dòng /giống cho gen và dòng /giống nhận gen. 3.2. Ỷ nghĩa thực tiễn Sau khi nghiên cứu xác định được các chỉ thị cho đa hình tại vị trí QTL/gen quy