B ộ Y TÊ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI NGUYỄN NGỌC DŨNG TRIỂN KHAI PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG KETOPROFEN (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược SỸ KHOÁ Người hướng dẫn 1998 - 2003) : PGS. TS TRAN t a n : ThS NGUYỄN THỊ K lỀư ANH Nơi thực : BỘ MÔN HOÁ PHÂN TÍCH Thời gian thực : 3- /2003 I LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Tử An ThS. Nguyễn Thị Kiều Anh tận tình hướng dẫn hoàn thành luận văn này. Tôi bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới thầy cô môn HOÁ PHÂN TÍCH tận tình giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho trình thực khoá luận . Tôi xỉn chân thành cảm ơn! Hà nội, ngày 02/06/2003 Sinh viên Nguyễn Ngọc Dũng. MỤC LỤC Trang Đặt vấn đề Phần 1: Tổng quan 1.1 Đại cương Ketoprofen 1.1.1 Công thức tính chất lý hoá 1.1.2 Tính chất dược lý dược động học .2 1.1.3 Chỉ định . . 1.1.4 Chống định . 1.1.5 Tác dụng không mong muốn .3 1.1.6 Liều dùng 1.1.7 Dạng bào chế 1.1.8 Các phương pháp định lượng .4 1.2 Phương pháp điện di mao quản 1.2.1 Nguyên tắc điện di mao q u ản 1.2.2 Phân loại điện di mao quản . 1.2.3 Điện di mao quản vùng 1.2.4 Cách tính kết phương pháp HPCE 12 1.3. Phương pháp quang phổ . 13 Phần : Thực nghiệm kết q u ả .14 2.1 Nguyên vật liệu phương pháp nghiên cứu .14 2.1.1 Nguyên vật liệu hoá chất 14 2.1.2 Phương pháp nghiên cứu 15 2.2 Kết thực nghiệm 16 2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích . 16 2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen 21 2.2.4 So sánh phương pháp định lượng Ketoprofen xâydựng với phương pháp định lượng Ketoprofen theo tiêu chuẩn sở ban hành . 32 Phần :Kết luận đề xuất . 34 Tài liệu tham khảo . 36 ĐẶT VÂN ĐỂ Hiện nay, thị trường mặt hàng Dược phẩm ngày đa dạng. Các kỹ thuật phân tích đại dần ứng dụng rộng rãi. Phương pháp điện di mao quản kỹ thuật phân tích mói đại đưa vào chuyên luận chung dược điển Anh (BP 2001) dược điển Mỹ (ƯSP 24). Đây kỹ thuật phát triển nhanh ứng dụng có hiệu cao việc tách, phân tích định tính định lượng chất khác từ vô đến hữu hỗn hợp mẫu, mà sắc ký cổ điển không đáp ứng tốc độ phân tích cao, độ nhạy tốt, cần mẫu, tách nhiều hỗn hợp mẫu phức tạp, loại mẫu sinh học y dược học. Kỹ thuật phân tích bắt đầu triển khai Bộ môn hoá Phân tích - Trường đại học Dược Hà nội để ứng dụng nghiên cứu phân tích định tính, định lượng chất chế phẩm thuốc. Ketoprofen thuốc giảm đau chống viêm phi steroid, thuộc dẫn chất acid aryl propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm, ức chế trình tổng hợp prostaglandin ức chế kết tập tiểu cầu. Ketoprofen thuốc đưa vào sản xuất nước ta chưa có chuyên luận định lượng chế phẩm có chứa Ketoprofen Dược điển Việt Nam (2002). Do thực đề tài “Triển khai phương pháp điện di mao quản để định lượng Ketoprofen ” với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng Ketoprofen kỹ thuật điện di mao quản. - Áp dụng định lượng số chế phẩm thuốc chứa Ketoprofen. - So sánh kết định lượng Ketoprofen phương pháp điện di với kết định lượng Ketoprofen theo tiêu chuẩn sở ban hành. PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 ĐẠI CƯƠNG VỂ KETOPROFEN 1.1.1 Công thức tính chất lý hoá: [1] [3] [9] o - Phân tử lượng : 254, 29 - Tê n khoa học : acid 2( - benzoyl phenyl) propionic - Tính chất: Bột kết tinh trắng, không mùi. Thực tế không tan nước 200C, tan hoàn toàn kiềm mạnh, ethanol 960, aceton, cloroform ether pKa = 5,94 hỗn hợp methanol - nước (3 : 1). Cực đại hấp thụ methanol bước sóng 255 nm. Nhiệt độ nóng chảy khoảng 95° c. 1.1.2 Tính chất dược lý dược động học: [3][6][7] - Ketoprofen thuốc chống viêm phi steroid, thuộc dẫn chất acid aryl propionic, có tác dụng giảm đau, hạ sốt, chống viêm. Ketoprofen ức chế trình tổng hợp prostaglandin ức chế kết tập tiểu cầu. - Ketoprofen hấp thu nhanh vào máu, đạt nồng độ tối đa sau 60 - 90 phút sau uống. Liên kết vói protein huyết tương 99%, thời gian bán thải 1,5- 2,5 giờ. Sau uống nồng độ Ketoprofen bao hoạt dịch cao máu. Thuốc qua hàng rào thai. Một phần nhỏ chuyển hoá cách hydroxyl hoá, phần lớn liên hợp với acid glucuronic, thải trừ chủ yếu qua nước tiểu (75 - 90%), qua phân (1 - 8%). Ở nước tiểu (65- 75%) dạng glucuronic, 1% dạng chưa biến đổi. Sau uống Ketoprofen bị thải trừ 50% qua thận. 1.1.3 Chỉ định: [3][6][7] Ketoprofen định điều trị dài hạn triệu chứng ĩ - Viêm thấp khớp mạn tính, đặc biệt viêm đa khớp dạng thấp, viêm cứng khớp cột sống. - Bệnh cứng khớp gây đau tàn phế. Điều trị ngắn hạn triệu chứng trong-các cấp tính bệnh: - Bệnh thấp khớp khớp (đau vai cấp tính, viêm gân .)• - Viêm khớp vi tinh thể. - Thoái hoá khớp. Dạng viên nang dùng để giảm đau: đau lưng, đau rễ thần kỉnh . 1.1.4 Chống định: [6] [7] - Dị ứng vói Ketoprofen thuốc chống viêm phi steroid loại. - Loét dày - tá tràng tiến triển. - Suy thận nặng, suy gan tế bào nặng. - Phụ nữ có thai (3 tháng cuối) cho bú. 1.1.5 Tác dụng không mong muốn: [7] - Tác dụng phụ đường tiêu hoá : khó chịu vùng dày - ruột, đau dày, buồn nôn, nôn mửa, táo bón, tiêu chảy, nặng loét dày, xuất huyết tiêu hoá thủng ruột. - Nhức đầu, chóng mặt, buồn ngủ. - Phản ứng mẫn da (nổi ban, mề đay, ngứa) đường hô hấp (suyễn, nguời dị ứng với aspirin kháng viêm không steroid khác). - Giảm nhẹ hồng cầu người bị thiếu máu, vài trường hợp giảm bạch cầu nhẹ ghi nhận. 1.1.6 Liều dùng : [7] - Liều khởi đầu : 300 mg chia làm lần, uống no. - Liều trì : 150 - 200 mg nạp ngày - viên thuốc đạn. - Tiêm bắp ngày 100 - 200 mg chia lần. - Không nên phối hợp Ketoprofen với thuốc chống đông máu đường uống kháng viêm không steroid khác (kể salicylat liều cao) làm tăng nguy loét xuất huyết tiêu hoá. 1.1.7 Dạng bào chế: [3] [7] - Viên nang 25 mg, 50 mg, 75 mg. - Viên nén 100 mg, 150 mg. - Viên bao tan ruột 50 mg. - Viên bao tác dụng kéo dài 200 mg, viên nang tác dụng kéo dài 100 mg, 150 mg, 200 mg. - Thuốc tiêm 100 mg. - Thuốc gel 2,5%. * Biệt dược: Biprofenid, Profenid, Kefenid, Fastum, Ketopron . 1.1.8 Các phương pháp định lượng. * Phương pháp acid - base : [9] - Định lượng Ketoprofen nguyên liệu, xác định điểm tương đương thị đỏ phenol phương pháp đo điện thế. - Nguyên tắc định lượng nhóm chức acid (COOH) phân tử Ketoprofen. *Phương pháp quang phổ: [2] [8] [9] - Dùng để định lượng Ketoprofen chế phẩm. *Phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao: [9] - Dùng để định lượng Ketoprofen huyết tương xác định tạp nguyên liệu. *Phương pháp điện di mao quản: [11] [12] [13] - Định lượng Ketoprofen huyết tương tách đồng phân Ketoprofen. 1.2. PHƯƠNG PHÁP ĐIỆN DI MAO QUẢN (CAPILLARY ELECTROPHORESIS: CE) Điện di mao quản hiệu suất cao hay điện cao kỹ thuật tách chất dựa sở di chuyển khác phân tử chất (chủ yếu ion mang điện tích) dung dịch chất điện giải có chất đệm pH từ trường điện E định, V đặt vào hai đầu mao quản sinh ra. Kỹ thuật tách nghiên cứu phát triển Tiselius (1937), sở nghiên cứu tách phân tích hỗn hợp protein, amino axit kỹ thuật CE thấp (110 - 220V). Hiện kỹ thuật phân tích HPCE (hay HVCE) phát triển mức độ cao ứng dụng hiệu nhiều lĩnh vực khác nhau, y học sinh học. 1.2.1 NGUYÊN TẮC CỦA ĐIỆN DI MAO QUẢN ( CE ): [5] [9] [10] Nguyên tắc chung kỹ thuật điện di mao quản, CE (Capillary Electrophoresis) dựa sở di chuyển khác phân tử chất tan (các ion chất tan) ống mao quản chất điện ly chất đệm pH thích hợp, tác dụng từ trường điện E xác định cung cấp nguồn cao chiều (10 -50 kV) đặt vào hai đầu mao quản. Nghĩa CE kỹ thuật tách thực cột mao quản nhờ lực từ trường điện E. Việc dùng cột mao quản có nhiều ưu việt, tốn chất mẫu, kinh tế, số đĩa lý thuyết lớn, tách chất xảy nhanh (tốc độ tách lớn) hiệu cao. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống máy HPCE gồm phận: 1. Bộ phận buồng điện cực, điện cực bình điện cực. 2. Cột tách - ống mao quản. 3. Nguồn cấp cao chiều (1 -5 kV) biến thiên được. 4. Bộ phận nạp mẫu vào mao quản. 5. Bộ phận phát chất (detector). 6. Bộ phận ghi nhận sắc đồ tách. 7. Bộ phận điều nhiệt cho ống mao quản. I Hình 1: Sơ đồ nguyên tắc cấu tạo hệ CEC - Để phân tích, lượng mẫu cần nạp vào ống mao quản nhỏ thông thường vùng từ - 20 nl cho lần tách. Người ta sử dụng cách sau để nạp mẫu vào mao quản : 1. phương pháp điện động lực 2. Phương pháp thuỷ lực (áp lực hút đẩy) 3. Phương pháp Xiphông. - Sự phát chất trình điện di, thực cách phát trực tiếp hay gián tiếp, tuỳ thuộc vào chất chất phân tích. Nói chung, dựa tính chất: + Sự hấp thụ xạ u v - VIS chất, + Sự phát huỳnh quang chất, bị kích thích, + Tính chất điện hoá chất. - Chất phân tích phát detector đo phổ ƯV, u v - VIS, song điều khác HPLC loại detector v - VIS hay huỳnh quang, flowcell đoạn nhỏ cuối ống mao quản. I 1.2.2 PHÂN LOẠI ĐIỆN DI MAO QUẢN (CE): [5] [9] [10] - Dựa theo chế, chất đặc điểm điện di mao quản người ta chia điện di mao quản thành mode sau: 1. Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis :CZE) 2. Điện di mao quản điện động học Micell (Micellary Electro-Kinetic Capillary : MEKC) 3. Điện di mao quản loại gel (Capillary Gel Electrophoresis : CGE) 4. Điện di mao quản hội tụ đẳng điện (Capillary Iso-Eletric Focusing : CIEF) 5. Điện di mao quản đẳng tốc độ (Capillary Iso-Tacho-Phoresis : CITP) 1.2.4 ĐIỆN DI MAO QUẢN VÙNG [5][9][10] (CAPILLARY ZONE ELECTROPHORESIS :CZE) *Cơ sở tách CZE. [5][9][10] - Điện di mao quản vùng (Capillary Zone Electrophoresis :CZE), kiểu ứng dụng phổ biến kỹ thuật HPCE, tính đơn giản hoạt động tách tính linh hoạt nó. - CZE kiểu đơn giản kỹ thuât phân tích CE. Vì ống mao quản cần làm đầy dung dịch đệm chất dẫn điện có pH thích hợp. Sau mẫu phân tích nạp vào mao quản, đặt điện trường cao định, tạo từ trường điện E, để thực trình điện di. Cơ chế điện di mao quản vùng di chuyển khác phân tử chất tan, tác dụng lực điện trường E định (Electric Field Force : EFF) tính chất đặc trưng dòng điện thẩm (Eletro-Osmotic Flow: EOF), điện di phụ thuộc điện tích kích thước phân tử chất tan. Hình 4: Sắc đồ điện di ketoprofen chất chuẩn nội 2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng Ketoprofen • Khảo sát khoảng tuyến tính : - Pha dãy dung dịch hỗn hợp Ketoprofen IS với nồng độ Ketoprofen 5|j.g/ml; 7,5|j.g/ml;10|ag/ml;12,5|ig/ml ;15 |ag/ml nồng độ IS 20 |ag/ml. Tiến hành điện di với điều kiện trang 20. Xác định diện tích, tỷ số diện tích pic ketoprofen IS. Kết trình bày theo bảng .3: Bảng :Sựphụ thuộc tỷ số diện tích RKe/15 với nồng độ Ketoprofen. Nồng độ (|ig/ml) ^Ke A-IS 2,612 5,537 0,487 7,5 4,009 5,937 0,675 10 5,894 6,801 0,852 12,5 8,432 7,851 1,074 15 9,792 7,765 1,261 21 Tỷ số diện tích RịCe/is Hình :ĐỒ thị phụ thuộc RKe/is- c - Phương trình hồi qui y = 0,079 lx +0,076 Trong : y tỷ số diện tích Ketoprofen chất chuẩn nội IS X nồng độ Ketoprofen (Ị-ig/ml). - Hệ số tương quan hồi quy : r = 0,9995. - Như kết khảo sát cho thấy có tương quan tuyến tính nồng độ Ketoprofen với tỷ số diện tích pic Ketoprofen với IS khoảng nồng độ từ p.g/ml - 15 |ig/ml. • Khảo sát tính xác phương pháp. - Pha mẫu có chứa Ketoprofen với nồng độ 7,5 |ig/ml; 10|ig/ ml; 12,5 ịuig/ml IS nồng độ 20|ig/ml. Tiến hành chạy điện di với điều kiện trang 20 mẫu để xác định độ lặp lại phương pháp. Kết trình bày bảng 4: 22 Bảng '.Kết khảo sát tính xác phương pháp 7.5|j,g/ml sk 10ng/ml 12.5ịag/ml Alíe A-IS R-ke/is A][...]... 2.2.4 So sánh phương pháp định lượng Ketoprofen đã xây dựng vói phương pháp định lượng Ketoprofen theo tiêu chuẩn cơ sở đã ban hành Sử dụng chương trình Excel 5.0 để so sánh kết quả định lượng Ketoprofen của hai phương pháp: Kết quả so sánh hai phương pháp được trình bày theo bảng 12 và 13: I/ Phương pháp điện di mao quản II/ Phương pháp định lượng Ketoprofen theo tiêu chuẩn cơ sở (Phương pháp đo quang)... di mao quản : Viên nang Prefenlid 50 mg - Chế phẩm Profenid gel 2,5 % dùng ngoài *Định lượng các chế phẩm chứa Ketoprofen theo tiêu chuẩn cơ sở bằng phương pháp đo quang: [2][8] *So sánh kết quả định lượng Ketoprofen bằng phương pháp điện di với kết quả định lượng Ketoprofen theo tiêu chuẩn cơ sở đã ban hành 15 2.2 KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM 2.2.1 Khảo sát điều kiện phân tích Các thông sô điện di • Mao quản. .. Ketoprofen và tỷ số di n tích pic giữa Ketoprofen và chất chuẩn nội • Khảo sát tính chính xác của phương pháp: Làm nhiều lần ở cùng một nồng độ để xác định sai số của phương pháp • Khảo sát tính đúng của phương pháp: Thêm chính xác một lượng chất chuẩn vào mẫu thử đã biết nồng độ Ketoprofen Tính phần trăm Ketoprofen chuẩn tìm lại được *Định lượng các chế phẩm chứa Ketoprofen bằng phương pháp điện di. .. tích) để đánh giá độ lặp lại của phương pháp định lượng Ketoprofen ở các nồng độ 7,5fig/ml; 10|j,g/ml; 12,5|j,g/ml với n = 6 cho thấy phương pháp có độ chính xác cao RSD < 2% 23 Khảo sát tính đúng của phương pháp: - Chúng tôi tiến hành xác định tính đúng của phương pháp trên hai chế phẩm chứa Ketoprofen là viên nang prefenlid 50mg và profenid gel 2,5% Tính đúng của phương pháp định lượng được xác định. .. của kỹ thuật điện di mao quản vùng là sự di chuyển dưới tác dụng của lực điện trường E Nhưng bản chất chính của sự hoạt động trong ống mao quản của kỹ thuật tách CZE là dòng điện thẩm Dòng EOF là một loại của dòng chảy khối của chất lỏng trong ống mao quản Nó có quan hệ mật thiết với lớp điện tích trên thành ống mao quản Dòng chảy này được quyết định bởi từ trường điện đặt vào ống mao quản và bị ảnh... 0,05) ^T < * T N L N= 8 98,82 Phương sai oo 0 Hàm lượng % ketoprofen 0,1942 II Alte (Độ hấp thụ) So sánh phương sai ( Test F ) I I Khối lượng( g) Tính toán thống kê 1 I Tỷ số di n tích pic R e/IS -K 0,851 0,243 Từ kết quả tính toán thống kê so sánh hai phương pháp theo bảng 12 và 13 cho thấy : - Độ chính xác của phương pháp điện di mao quản (CE) so vói phương pháp định lượng theo TCCS khác nhau không... : khối lượng bột viên nang cân Mc : khối lượng Ketoprofen chuẩn H : hàm lượng của Ketoprofen chuẩn M : khối lượng trung bình của bột thuốc trong một viên nang Kết quả định lượng Ketoprofen trong viên nang Profenid 50 mg bằng phương pháp đo quang phổ được trình bày ở bảng 10: 29 Bảng 10 :Kết quả định lượng Ketoprofen bằng phương pháp đo quang phổ trong chế phẩm viên nang Prefenlid 50mg Khối lượng( g)... • Phương pháp bơm mẫu: Phương pháp bơm mẫu bằng thuỷ động học dùng áp suất đựoc lựa chọn do bản chất của phương pháp là dùng một áp suất thích hợp để nén vào lọ chứa mẫu và tạo chân không ở đầu kia mao quản trong một thời gian nhất định Do áp lực đẩy và hút mà một lượng mẫu nhất định sẽ được đưa vào mao quản Mẫu có nồng độ đồng đều và giống vói nồng độ chất tan trong mẫu Chọn tiêm mẫu bằng phương pháp. .. nồng độ Ketoprofen chuẩn làlOp.g/ml, tính kết quả theo phương pháp so sánh Hàm lượng % Ketoprofen trong gel so với hàm lượng Ketoprofen ghi trên nhãn được tính theo công thức: R t XM c XH X100 X100 R c xM tx2,5 27 Rx : tỷ số di n tích pic Ketoprofen và IS của mẫu thử Rc : tỷ số di n tích pic Ketoprofen và IS của mẫu chuẩn Mx: khối lượng gel cân Mc: khối lượng Ketoprofen chuẩn H : hàm lượng của Ketoprofen. .. quả định lượng profenid gel 2,5% đươc trình bày ở bảng 9: Báng 9: Kết qủa định lượng Ketprofen bằng phương pháp điện di mao quản trong chế phẩm Profenid gel 2,5% Khối lượng( g) Rt Hàm lượng % Ketoprofen so với HL ghi trên nhãn 0,4123 0,851 98,15 0,4166 0,862 98,39 0,4243 0,872 97,73 0,4129 0,849 97,78 0,4102 0,853 98,88 Trung bình 98,19 Phương sai 0,225 Với Rc= 0,852; Mc=0,0102g; H=0,993 Hình 6: Điện di . đề tài Triển khai phương pháp điện di mao quản để định lượng Ketoprofen ” với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng Ketoprofen bằng kỹ thuật điện di mao quản. - Áp dụng định lượng một. bào chế 4 1.1.8 Các phương pháp định lượng 4 1.2 Phương pháp điện di mao quản 5 1.2.1 Nguyên tắc của điện di mao quản 5 1.2.2 Phân loại điện di mao quản 7 1.2.3 Điện di mao quản vùng 7 1.2.4 Cách. kiện phân tích 16 2.2.2 Xây dựng phương pháp định lượng ketoprofen 21 2.2.4 So sánh phương pháp định lượng Ketoprofen đã xây dựng với phương pháp định lượng Ketoprofen theo tiêu chuẩn cơ sở đã