 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA KHOA HỌC TỰ NHIÊN LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC CHUYÊN NGÀNH SINH HỌC KHẢO SÁT KHẢ NĂNG CỐ ĐỊNH ĐẠM VÀ HÒA TAN LÂN CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRÊN GIỐNG LÚA ML213 TRỒNG TRONG DUNG DỊCH KHOÁNG Cán hướng dẫn: Sinh viên thực hiện: GS.TS Cao Ngọc Điệp Ung Thị Anh Thư - 3102695 Lớp: Cử nhân Sinh học K36 Cần Thơ, 12/2013 Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN (ký tên) SINH VIÊN THỰC HIỆN (ký tên) Gs.Ts. Cao Ngọc Điệp Ung Thị Anh Thư DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………… …………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2013 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG (ký tên) i Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 LỜI CẢM ƠN Trong suốt trình học tập hoàn thành luận văn này, nhận giúp đỡ quý báu thầy cô, anh chị bạn. Với lòng kính trọng biết ơn sâu sắc xin bày tỏ lời cảm ơn chân thành tới: Gs. Ts. Cao Ngọc Điệp, người thầy kính mến hết lòng dạy bảo, định hướng tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình thực luận văn tốt nghiệp. Ths. Văn Thị Phương Như người góp ý sửa chữa sai sót giúp hoàn thiện thân. Chị Nguyễn Thị Xuân Mỵ - Cán phòng thí nghiệm toàn thể anh chị bạn phòng thí nghiệm Vi sinh vật đất, Viện nghiên cứu phát triển Công nghệ sinh học nhiệt tình giúp đỡ trình học tập nghiên cứu. Tôi xin cảm ơn thầy, cô công tác khoa Khoa học tự nhiên hết lòng dạy dỗ xây dựng tảng kiến thức vững suốt gần năm học tập trường Đại học Cần Thơ. Tôi xin cảm ơn cố vấn học tập Quách Quang Huy, Phạm Khánh Nguyên Huân tập thể lớp cử nhân Sinh học Khóa 36 - người bạn đường hành trình tìm tri thức - gắn bó, động viên giúp đỡ suốt năm đại học trình thực luận văn tốt nghiệp. Con xin chân thành cảm ơn gia đình nuôi dưỡng, bên cạnh động viên giúp đỡ lúc gặp khó khăn. Xin chân thành cảm ơn thầy cô hội đồng chấm luận văn cho đóng góp quý báu để hoàn chỉnh luận văn này. ii Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 TÓM LƯỢC Đề tài thực để khảo sát khả cố định đạm, hòa tan lân khó tan 10 dòng vi khuẩn nội sinh phân lập từ đất vùng rễ giống lúa ML213 trồng Phú Yên. Hạt lúa giống khử trùng bề mặt, xử lý nảy mầm môi trường agar bán lỏng (0,8% agar) 48 giờ. Hạt nảy mầm (rễ mầm khoảng cm) chủng mười dòng vi khuẩn ML1, ML2, ML3, ML4, ML5, ML6, ML7, ML8, ML9 ML10 (mật số 109 tế bào/ml) (hạt lúa giống nghiệm thức đối chứng dương đối chứng âm không chủng vi khuẩn) trồng dung dịch khoáng Yoshida. Thí nghiệm gồm 12 nghiệm thức đạm, 12 nghiệm thức lân (mỗi nghiệm thức lặp lại lần chai, chai chứa 200 ml dung dịch khoáng lỏng hạt lúa nảy mầm). Lấy tiêu chiều cao thân lúa, chiều dài rễ (ngày 7, ngày 14, ngày 21 ngày 28), trọng lượng khô rễ, trọng lượng khô toàn (ngày 28) nghiệm thức để xác định khả cố định đạm, hòa tan lân khó tan mười dòng vi khuẩn nội sinh. Kết mười dòng vi khuẩn khảo sát có khả cố định đạm, hòa tan lân hữu hiệu so với nghiệm thức đối chứng âm. Hai dòng vi khuẩn ML1, ML8 có khả cố định đạm bật thể qua tiêu chiều cao thân lúa chiều dài rễ, trọng lượng khô rễ trọng lượng khô toàn cao có ý nghĩa so với đối chứng dương, ba dòng ML1, ML2 ML5 ba dòng có khả hòa tan lân thúc đẩy phát triển chiều cao thân lúa, tăng dài rễ, trọng lượng khô rễ toàn khô cao đối chứng dương. Từ khóa: cố định đạm, giống lúa ML213, hòa tan lân, vi khuẩn nội sinh. iii Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 MỤC LỤC PHẦN KÝ DUYỆT i LỜI CẢM ƠN . ii TÓM LƯỢC . iii MỤC LỤC . iv DANH SÁCH HÌNH . vii TỪ VIẾT TẮT . viii CHƯƠNG GIỚI THIỆU . 1.1. Đặt vấn đề 1.2. Mục tiêu đề tài CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU . 2.1. Tổng quan lúa 2.1.1. Vị trí phân loại . 2.1.2. Nguồn gốc phân bố 2.1.3. Đặc điểm hình thái, sinh lý . 2.1.4. Đặc điểm sinh trưởng . 2.1.5. Sơ lược giống lúa ML213 2.2. Tầm quan trọng nguyên tố N, P 2.2.1. Đạm (N) . 2.2.2. Lân (P) . 2.2.3. Thực trạng sử dụng phân hóa học nước ta . 10 2.3. Vi khuẩn nội sinh 11 2.3.1. Nguồn gốc . 11 2.3.2. Sự xâm nhập nội sinh mô thực vật 11 2.3.3. Khái quát cố định nitơ sinh học vi sinh vật 12 2.3.4. Khái quát hòa tan lân khó tan vi sinh vật . 14 2.3.5. Các nhóm vi khuẩn nội sinh lúa . 16 2.3.6. Tình hình nghiên cứu vi khuẩn nội sinh . 20 CHƯƠNG PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP . 23 3.1. Thời gian địa điểm nghiên cứu . 23 3.1.1. Thời gian 23 iv Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 3.1.2. Địa điểm 23 3.2. Phương tiện nghiên cứu 23 3.2.1. Vật liệu 23 3.2.2. Thiết bị 24 3.2.3. Dụng cụ . 26 3.2.4. Hóa chất . 27 3.3. Phương pháp nghiên cứu . 29 3.3.1. Chuẩn bị mẫu . 29 3.3.2. Đánh giá hiệu cố định đạm sinh học, hòa tan lân khó tan 10 dòng vi khuẩn nội sinh với giống lúa ML213 . 30 3.3.3. Chỉ tiêu theo dõi . 31 3.3.4. Phương pháp thống kê, xử lý phân tích số liệu . 32 Chương KẾT QUẢ - THẢO LUẬN . 33 4.1. Ảnh hưởng 10 dòng vi khuẩn lên chiều cao lúa ML213 trồng dung dịch khoáng . 33 4.2. Ảnh hưởng 10 dòng vi khuẩn lên chiều dài rễ lúa ML213 trồng dung dịch khoáng . 36 4.3. Ảnh hưởng 10 dòng vi khuẩn lên trọng lượng khô rễ, trọng lượng khô toàn 39 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ . 42 5.1. Kết luận 42 5.2. Kiến nghị 42 v Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 DANH SÁCH BẢNG Bảng 1. Nhu cầu phân bón hóa học sản xuất cho nông nghiệp Việt Nam từ năm 2000-2010 10 Bảng 2. Tên khoa học 10 dòng vi khuẩn 23 Bảng 3. Công thức môi trường Nfb (Nguồn: Kirchhof ctv, 1997) 27 Bảng 4. Môi trường dinh dưỡngYoshida (IRRI, 1976) . 28 Bảng 5. Các nghiệm thức đạm . 30 Bảng 6. Các nghiệm thức lân . 31 Bảng 7. Chiều cao lúa trồng dung dịch khoáng giai đoạn ngày, 14 ngày, 21 ngày 28 ngày (cm) 33 Bạn mồi thiết kế .27 a. Thí nghiệm 1: Khảo sát tính đặc hiệu cặp mồi pmi loại trồng.27 b. Thí nghiệm 2: Khảo sát tính đặc hiệu cặp mồi 35S loại trồng.28 3.4.3 Đánh giá tính đặc hiệu cặp mồi CryIA(b) 29 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN .30 4.1 Thiết kế cặp mồi .30 4.1.1 Thiết kế cặp mồi 35S: 30 4.1.2. Thiết kế cặp mồi pmi 30 4.2 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi thiết kế 31 4.2.1 Đánh giá cặp mồi pmi1 31 4.2.2 Đánh giá cặp mồi Pmi2 32 4.2.3 Tính đặc hiệu cặp mồi 35S 33 4.3 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi CryIA(b) 35 CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ .37 5.1. Kết luận 37 5.2. Đề nghị .37 TÀI LIỆU THAM KHẢO .38 PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình điện di sản phẩm PCR Phụ lục 2: Kết kiểm tra GM đối tượng nghiên cứu Phụ lục 3: Hình thiết bị Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1: Diện tích trồng công nghệ sinh học năm 2012 Bảng 2: Các mẫu DNA thực vật sử dụng đề tài nghiên cứu 24 Bảng 3: Trình tự cặp mồi .26 Bảng 4. Thành phần phản ứng PCR. 26 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1: Vi tiêm gen ngoại lai vào tiền nhân trứng thụ tinh 12 Hình 2: Tạo chuyển gen phương pháp chuyển gen gián tiếp nhờ 15 Hình 3: Các giai đoạn phản ứng PCR(a) sơ đồ phản ứng chuỗi polymerase(b) .18 Hình 4: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen (pmi) .18 Hình 5: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR với Pmi .28 Hình 6: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR với 35S 28 Hình 7: Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR với Cry 29 Hình 8: Kết PCR với cặp mồi pmi .32 Hình 9: Sản phẩm PCR với cặp mồi pmi2 .32 Hình 10: Kết PCR với cặp mồi pmi2 33 Hình 12: Sản phẩm PCR với cặp mồi 35S số đối tượng nghiên cứu 34 Hình 13: Kết PCR với cặp mồi CryIA(b) 36 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TỪ VIẾT TẮT Bp base pair Bt Bacillus thuringiensis CAMV Cauliflower Mosaic Virus CNSH Công nghệ Sinh học CTAB Cetyl trimethyl ammonium bromide DNA DeoxyriboNucleic Acid dNTPs Deoxynucleotide Triphosphates E. coli Escherichia coli ELISA Enzyme-Linked Immunosorbent Assay EtBr Ethidium Bromide FDA Food and Drug administration GM Genetically Modified GMO Genetically Modified Organism ISAAA International Service for the Acquisition of Agri-biotech Application mRNA messenger RiboNucleic Acid PCR Polymerase Chain Reaction Pmi phosphomannose isomerase PVP Polyvinyl pyrrolidone RAPD Random Amplified Polymorphic DNA SDS Sodium dodecyl sulphate SSR Simple Sequence Repeat Taq Thermus aquaticus TBE Tris Borate EDTA TE Tris EDTA Chuyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 NT3 0,029000 E F G NT9 0,028800 F G NT10 0,028733 G ĐC- 0,024867 H Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of NT Simultaneous confidence level = 35,00% Phụ lục 11: Xử lý số liệu trọng lượng khô toàn (g) lúa nghiệm thức đạm giai đoạn 28 ngày One-way ANOVA: Trọng lượng khô toàn versus NT Source DF SS MS F P NT 11 0,0021573 0,0001961 344,06 0,000 Error 24 0,0000137 0,0000006 Total 35 0,0021709 S = 0,0007550 R-Sq = 99,37% R-Sq(adj) = 99,08% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev ĐC- 0,056733 0,001222 ĐC+ 0,077533 0,001137 NT1 0,081600 0,000693 NT10 0,069733 0,001102 NT2 0,082133 0,000611 NT3 0,070933 0,000503 NT4 0,078733 0,000306 NT5 0,072400 0,000346 NT6 0,074267 0,000611 NT7 0,079200 0,000400 NT8 0,087733 0,000643 NT9 0,068733 0,000757 ----+---------+---------+---------+----(*) (* (* (*) (*) (*) (*) *) (*) (*) (*) (*) ----+---------+---------+---------+----- Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 0,060 0,070 0,080 0,090 Pooled StDev = 0,000755 Grouping Information Using Fisher Method NT N Mean Grouping NT8 0,087733 NT2 0,082133 B NT1 0,081600 B NT7 0,079200 C NT4 0,078733 C D ĐC+ 0,077533 D NT6 0,074267 NT5 0,072400 NT3 0,070933 G NT10 0,069733 G H NT9 0,068733 H ĐC- 0,056733 A E F I Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of NT Simultaneous confidence level = 35,00% Phụ lục 21: Xử lý số liệu chiều cao thân lúa (cm) lúa nghiệm thức lân giai đoạn ngày One-way ANOVA: Chiều cao thân lúa versus NT Source DF SS MS F P NT 11 90.6200 8.2382 120.56 0.000 Error 24 1.6400 0.0683 Total 35 92.2600 S = 0.2614 R-Sq = 98.22% R-Sq(adj) = 97.41% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 ĐC- 8.167 0.115 (-*-) ĐC+ 12.833 0.252 NT1 13.667 0.153 NT10 11.100 0.100 NT2 12.567 0.115 NT3 11.533 0.153 (-*-) NT4 11.600 0.755 (-*) NT5 13.667 0.153 NT6 10.267 0.058 (-*-) NT7 10.267 0.153 (-*-) NT8 10.433 0.208 NT9 13.100 0.100 (-*-) (-*-) (-*-) (-*) (-*-) (-*-) (-*-) -+---------+---------+---------+-------8.0 9.6 11.2 12.8 Pooled StDev = 0.261 Grouping Information Using Fisher Method NT N Mean Grouping NT5 13.6667 A NT1 13.6667 A NT9 13.1000 B ĐC+ 12.8333 B C NT2 12.5667 C NT4 11.6000 D NT3 11.5333 D E NT10 11.1000 E NT8 10.4333 F NT6 10.2667 F NT7 10.2667 F ĐC- 8.1667 G Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of NT Simultaneous confidence level = 35.00% Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 Phụ lục 22: Xử lý số liệu chiều cao thân lúa (cm) lúa nghiệm thức lân giai đoạn 14 ngày One-way ANOVA: Chiều cao thân lúa versus NT Source DF SS MS F P NT 11 208.8000 18.9818 386.07 0.000 Error 24 1.1800 0.0492 Total 35 209.9800 S = 0.2217 R-Sq = 99.44% R-Sq(adj) = 99.18% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- ĐC- 13.533 0.058 ĐC+ 18.467 0.153 NT1 18.800 0.173 NT10 13.200 0.100 NT2 17.833 0.115 NT3 18.567 0.058 (*) NT4 18.467 0.153 (*) NT5 20.467 0.153 NT6 17.333 0.404 NT7 17.100 0.100 NT8 12.567 0.493 NT9 16.067 0.208 (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) (*) -+---------+---------+---------+-------12.5 15.0 Pooled StDev = 0.222 Grouping Information Using Fisher Method NT N Mean Grouping NT5 20.4667 NT1 18.8000 B NT3 18.5667 B NT4 18.4667 B ĐC+ 18.4667 B A 17.5 20.0 Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 NT2 17.8333 NT6 17.3333 D NT7 17.1000 D NT9 16.0667 ĐC- 13.5333 F NT10 13.2000 F NT8 12.5667 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 C E G Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of NT Simultaneous confidence level = 35.00% Phụ lục 23: Xử lý số liệu chiều cao thân lúa (cm) lúa nghiệm thức lân giai đoạn 21 ngày One-way ANOVA: Chiều cao thân lúa versus NT Source DF SS MS F P NT 11 141.043 12.822 17.39 0.000 Error 24 17.700 0.738 Total 35 158.743 S = 0.8588 R-Sq = 88.85% R-Sq(adj) = 83.74% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- ĐC- 15.800 0.100 (---*---) ĐC+ 21.000 0.100 NT1 18.900 0.100 NT10 16.300 0.200 NT2 20.267 0.153 NT3 19.667 0.153 NT4 21.800 2.606 NT5 21.167 0.115 NT6 17.567 1.286 NT7 18.500 0.100 NT8 16.567 0.493 (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) (---*---) Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 NT9 20.633 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 0.153 (----*---) -+---------+---------+---------+-------15.0 17.5 20.0 22.5 Pooled StDev = 0.859 Grouping Information Using Fisher Method NT N Mean Grouping NT4 21.8000 A NT5 21.1667 A B ĐC+ 21.0000 A B C NT9 20.6333 A B C NT2 20.2667 NT3 19.6667 NT1 18.9000 D E F NT7 18.5000 E F NT6 17.5667 NT8 16.5667 G H NT10 16.3000 G H ĐC- 15.8000 H B C D C D E F G Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of NT Simultaneous confidence level = 35.00% Phụ lục 24: Xử lý số liệu chiều cao thân lúa (cm) lúa nghiệm thức lân giai đoạn 28 ngày One-way ANOVA: Chiều cao thân lúa versus NT Source DF SS MS F P NT 11 190.7231 17.3385 196.90 0.000 Error 24 2.1133 0.0881 Total 35 192.8364 S = 0.2967 R-Sq = 98.90% R-Sq(adj) = 98.40% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev +---------+---------+---------+--------- Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 ĐC- 16.333 0.321 ĐC+ 21.333 0.208 NT1 23.333 0.493 NT10 18.833 0.153 NT2 23.233 0.208 NT3 22.633 0.153 NT4 23.000 0.100 NT5 23.467 0.153 NT6 19.167 0.702 NT7 19.733 0.208 NT8 18.167 0.058 NT9 21.933 0.058 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 (-*) (-*) (-*) (-*-) (-*-) (-*-) (-*-) (*-) (-*-) (-*) (-*-) (-*) +---------+---------+---------+--------16.0 18.0 20.0 22.0 Pooled StDev = 0.297 Grouping Information Using Fisher Method NT N Mean Grouping NT5 23.4667 A NT1 23.3333 A NT2 23.2333 A NT4 23.0000 A B NT3 22.6333 B NT9 21.9333 ĐC+ 21.3333 NT7 19.7333 NT6 19.1667 F NT10 18.8333 F NT8 18.1667 ĐC- 16.3333 C D E G H Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of NT Simultaneous confidence level = 35.00% Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 Phụ lục 25: Xử lý số liệu chiều dài rễ (cm) lúa nghiệm thức lân giai đoạn ngày One-way ANOVA: Chiều dài rễ versus NT Source DF SS MS F P NT 11 63,686 5,790 46,21 0,000 Error 24 3,007 0,125 Total 35 66,692 S = 0,3539 R-Sq = 95,49% R-Sq(adj) = 93,43% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev +---------+---------+---------+--------- ĐC- 5,300 0,100 (--*--) ĐC+ 9,033 0,153 NT1 10,500 0,529 NT10 8,267 0,153 NT2 10,133 0,321 NT3 10,033 0,153 NT4 8,967 0,902 NT5 10,200 0,300 NT6 9,400 0,265 NT7 9,767 0,153 NT8 8,600 0,200 NT9 8,667 0,058 (-*--) (--*-) (--*-) (-*--) (--*-) (--*--) (--*-) (--*-) (--*--) (--*-) (-*--) +---------+---------+---------+--------4,8 6,4 Pooled StDev = 0,354 Grouping Information Using Fisher Method NT N Mean Grouping NT1 10,5000 A NT5 10,2000 A B NT2 10,1333 A B NT3 10,0333 A B NT7 9,7667 B C 8,0 9,6 Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 NT6 9,4000 ĐC+ 9,0333 D E NT4 8,9667 D E NT9 8,6667 E F NT8 8,6000 E F NT10 8,2667 F ĐC- 5,3000 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 C D G Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of NT Simultaneous confidence level = 35,00% Phụ lục 26: Xử lý số liệu chiều dài rễ (cm) lúa nghiệm thức lân giai đoạn 14 ngày One-way ANOVA: Chiều dài rễ versus NT Source DF SS MS F P NT 11 136,1522 12,3775 227,34 0,000 Error 24 1,3067 0,0544 Total 35 137,4589 S = 0,2333 R-Sq = 99,05% R-Sq(adj) = 98,61% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---- ĐC- 6,567 0,252 (*) ĐC+ 12,367 0,153 NT1 14,467 0,252 NT10 12,600 0,100 NT2 14,267 0,058 NT3 12,200 0,300 NT4 11,367 0,252 NT5 13,967 0,208 NT6 11,900 0,100 (-*) NT7 11,900 0,173 (-*) (*-) (*) (*-) (*) (*) (*-) (*) Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 NT8 12,333 0,493 (*) NT9 12,400 0,100 (-*) -----+---------+---------+---------+---7,5 10,0 12,5 15,0 Pooled StDev = 0,233 Grouping Information Using Fisher Method NT N Mean Grouping NT1 14,4667 A NT2 14,2667 A B NT5 13,9667 B NT10 12,6000 C NT9 12,4000 C D ĐC+ 12,3667 C D NT8 12,3333 C D NT3 12,2000 D E NT7 11,9000 E NT6 11,9000 E NT4 11,3667 ĐC- 6,5667 F G Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons among Levels of NT Simultaneous confidence level = 35,00% Phụ lục 27: Xử lý số liệu chiều dài rễ (cm) lúa nghiệm thức lân giai đoạn 21 ngày One-way ANOVA: Chiều dài rễ versus NT Source DF SS MS F P NT 11 164,3189 14,9381 484,48 0,000 Error 24 0,7400 0,0308 Total 35 165,0589 S = 0,1756 R-Sq = 99,55% R-Sq(adj) = 99,35% Individual 95% CIs For Mean Based on Luận văn tốt nghiệp đại học 2013 Chuyên ngành Cử nhân Sinh học khóa 36 Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------- ĐC- 7,367 0,153 *) ĐC+ 13,800 0,100 NT1 16,500 0,100 NT10 13,300 0,173 NT2 15,433 0,058 NT3 13,000 0,100 (*) NT4 13,100 0,173 *) NT5 15,367 0,153 NT6 13,367 0,153 *) NT7 13,267 0,306 (*) NT8 13,500 0,300 NT9 14,067 0,153 (*) (*) (*) (*) *) (*) (*) -+---------+---------+---------+-------7,5 10,0 12,5 15,0 Pooled StDev = 0,176 Grouping Information Using Fisher Method NT N Mean Grouping NT1 16,5000 NT2 15,4333 B NT5 15,3667 B NT9 14,0667 C ĐC+ 13,8000 C NT8 13,5000 D NT6 13,3667 D E NT10 13,3000 D E NT7 13,2667 D E F NT4 nhiên, mẫu bắp siêu mua từ siêu thị mẫu đu đủ mua từ chợ Cần Thơ để kiểm tra diện 35S promoter. Kết PCR cho thấy có giống đậu nành ST4 không khuếch đại band 200bp mẫu đậu nành HL203 bắp có band 200bp. Kết cho thấy giống đậu nành HL203 bắp GM. Tiếp tục kiểm tra mẫu DNA khác cam, bưởi, chuối, đu đủ, nguyệt quế, cẩm thạch . xuất band 200bp mẫu ngoại trừ mẫu nguyệt quế sản phẩm 200bp. Mặc dù giống trồng tự nhiên hoang dại Việt Nam cho sản phẩm PCR 200bp giống trồng GM. Từ kết nhận thấy cặp mồi 35S chuyên biệt lúa thuốc để nhận diện chúng có phải trồng GM hay không. Nhưng dùng mồi 35S trồng khác chuối, cam, bưởi không hiệu tính đến thời điểm chưa có công bố nói GM đối tượng này. Riêng ba đối tượng bắp, đậu nành đu đủ thí nghiệm chưa có đủ nguồn giống tự nhiên hay hoang dại làm đối chứng nên kết PCR cho thấy có diện 35S promoter chưa có đủ sở để kết luận có phải trồng GM hay không? 4.3 Kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi CryIA(b) Từ kết thí nghiệm chuyên biệt mồi 35S, có hai đối tượng bắp, đậu nành chưa đủ sở để kết luận. Nên thí nghiệm đánh giá tính chuyên biệt cặp mồi CryIA(b) thực hiện. Được biết cặp mồi CryIA(b) sử dụng để phát gen Bt kháng sâu đục thân phần lớn bắp, đậu nành chuyển gen có chưa gen này. Cặp mồi khuếch đại đoạn DNA có kích thước khoảng 184bp điện di gel 2%. Kết PCR với thành phần phản ứng Bảng nhiệt độ bắt cặp 580C cho thấy giống đậu nành không xuất band 184bp giống bắp xuất band khoảng 184bp. Với kết kết luận giống bắp siêu có khả lớn bắp chuyển gen (Hình 13) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 35 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT M 200bp 184bp Hình 13: Kết PCR với cặp mồi CryIA(b) Giếng M: thang chuẩn 100bp; giếng 1: đậu nành ST4; giếng 2: đậu nành CM60; giếng 3: đậu nành HL203; giếng 4-6: bắp; giếng 7: nước. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 36 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT CHƯƠNG 5. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 5.1. Kết luận Trong trình khảo sát tính chuyên biệt cặp mồi dùng để phát GM (cặp mồi CryIA(b)) cặp mồi thiết kế nghiên cứu phản ứng PCR nhiều đối tượng khác như: lúa, thuốc lá, đậu nành, bắp, đậu xanh, . Phân tích sản phẩm PCR gel agarose, nhận thấy: Cặp mồi Pmi thiết kế không hiệu việc nhận diện GM. Cặp mồi Pmi thiết kế đặc hiệu với thuốc lá, cam sành: thuốc chuyển gen khuếch đại band 850bp thuốc tự nhiên không khuếch đại band này. Và không đặc hiệu với đối tượng nghiên cứu khác. Cặp mồi 35S có tính đặc hiệu cao lúa thuốc lá, có sản phẩm khuếch đại 200bp lúa thuốc chuyển gen, giống tự nhiên band này. Với đậu nành, bắp, chưa có nguồn gen làm đối chứng, nên kết luận hai giống có khả chuyển gen. Cặp mồi CryIA(b) đặc hiệu bắp, không đặc hiệu với đối tượng khác: lúa, thuốc lá, đậu nành, đu đủ, cam, bưởi… Cặp mồi khuếch đại band 184 bp bắp, nhiên không xuất band đậu nành đối tượng khác. Như kết luận bắp siêu có khả lớn giống GM 5.2. Đề nghị Bổ sung nguồn giống tự nhiên hai đối tượng đậu nành, bắp để có đủ sở nhận diện có phải GM hay không. Tiếp tục tối ưu điều kiện phản ứng PCR với cặp mồi CryIA(b), khảo sát nhiệt độ gắn mồi thành phần hóa chất trình thực phản ứng PCR Nên tiến hành khảo sát số cặp mồi khác thường dùng để phát GM để kiểm tra tính đặc hiệu cặp mồi đó. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 37 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Lê Trần Bình, Nguyễn Đình Thi. 2008. Cơ sở Công nghệ Sinh học tập – Công nghệ gen. Nxb giáo dục Nguyễn Đức Lượng, 2001. Công nghệ Sinh học. Đại học Quốc gia TP. Hồ Chí Minh. Trần Nhân Dũng, Nguyễn Thị Pha, Đỗ Tấn Khang. 2012. Công nghệ di truyền. Nxb Đại học Cần Thơ. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ. 2006. Giáo trình công nghệ chuyển gene. Nxb Huế. Trần Quốc Dung, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Thị Lệ.2010. Công nghệ chuyển gen. Nxb Huế. Trần Thị Lệ, Nguyễn Hoàng Lộc, Trần Quốc Dung. 2006. Công nghệ gen nông nghiệp. Nxb Nông nghiệp. Trần Thị Tuyết Linh .2009. Cây trồng biến đổi gen. Thông tin KH&CN Trà Vinh, số 2/2009. Tiếng Anh Ahmed FE (2002). Detection of genetically modified organisms in foods. Trends Biotechnol. 20: pp215-223. Battraw MJ, Hall TC. 1990. Histochemical analysis of CAMV 35S promoterbeta-glucuronidase gene expression in transgenic rice plant. Plant Mol Biol. 1990 Oct;15(4):527-38. Benfey PN, Chua NH. 1989. Regulated genes in transgentic plant. Science. 1989 Apr 14;244(4901):174-81. Blowers AD, Bogorad L, Shark KB, Sanford JC. Studies on Chlamydomonas chloroplast transformation: foreign DNA can be stably maintained in the chromosome. Plant Cell. 1989 Jan;1(1):123-32. Boynton J.E., N.W Gillham., E.H Harris., J.P Hosler., A.M Johnson, A.R. Jones, B.L. Randolph - Anderson, D. Robertson, T.M. Klein, K.B Shark and Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 38 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Sanford J.C , 1988. Chloroplast transformation in Chlamydomonas with high velocity microprojectiles. Science 240: 1534 – 1538. Clive James, 2012. 2012 ISAAA Report on Global Status of Biotech /GM crops. Dale P.J, 1992. Spread of engineered genes to wild relatives. Plant Physiol 100, pp. 13-15. Daniell H, 1999. Environment friendly approaches to genetic engineering. In Vitro Cell D v. Biol. Plant 35, pp. 361-368. David M, Hillis, Craig Moritz, Barbara K, Mabl. Molecular systematics (Second edition). Dekeyser R, Claes B, Marichal M, Van Montagu M, caplan A,1989. Evaluation of selectable markers for rice transformation. Plant Physiol. May; 90(1): 217 - 23 Horsch RB, Rogers SG, Fraley RT. 1985. Transgenic plants Ingebrecht IL et at. Plant cell. 1989. Different 3’ end regions strongly influence the level of gene expression plant cell’s. Jefferson RA, Kavanagh TA, Bevan MW. GUS fusions: beta-glucuronidase as a sensitive and versatile gene fusion marker in higher plants. EMBO J. 1987 Dec 20;6(13):3901-7. Jeschke JM, Keesing F, Ostfeld RS, 2013. Novel organisms: comparing invasive species, GMOs, and emerging pathogens. Ambio. 2013 Sep;42(5):541-8. doi: 10.1007/s13280-013-0387-5. Epub 2013 Mar 3. Kramkowska M, 2013. Benefits and risks associated with genetically modified food products. Ann Agric Environ Med. 2013;20(3):413-9. Malik V.S and Saroha M.K, 1999. Marker gene controversy in transgenic plants. J. Plant Biochem. Biotechnol 8, pp. 1-13. Miles J.S and Guest J.R, 1984. Nucleotide sequence and transcriptional star point of the phosphomannose isomerase gene (mana) of Escherichia coli. Gene 32, pp. 41-48. Pego V. P. , Weisbeek P. J.,Smeekens S. C .M. , 1999. Mannose inhibits Arabidopsis germination via a hexokinase-mediated step. Plant physiol 199, pp. 1017-1023. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 39 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT R. H. Phipps and J. R. Park, 2002. Environmental Benefits of Genetically Modified Crops: Global and European Perspectives on Their Ability to Reduce Pesticide Use. Journal of Animal and Feed Sciences, 2002. Vol.11, pages 1-18. Tengel C., Schuβler P., Setzke E., Balles J. and Sprenger-Hauβels M. (2001) PCR-based detection of genetically modified soybean and maize in raw and highly processed foodstuffs, BioTechniques 31, 426–429 Tepfer, M; Gaubert, S; leroux-Coyau, M; Prince, S; Houdebine, LM, 2004. Transient expression in mammalian cells of transgenes transcriped from the Cauliflower mosaic virus 35S promoter. Environ Biosafety Res (2): 917.PMID 15612506 Van Maris AJ, Winkler AA, Kuyper M, de Laat WT, van Dijken JP, Pronk JT. Development of efficient xylose fermentation in Saccharomyces cerevisiae: xylose isomerase as a key component. Adv Biochem Eng Biotechnol. 2007;108:179-204. WHO, 1993. Health aspects of marker genes in genetically modified plants. Report of a WHO workshop of the Food Safety Unit. Trang web: http://www.ncbi.nlm.nih.gov http://nongnghiep.vn, ngày 02/08/2013. http://www.isaaa.org/resources/publications/briefs/44/executivesummary, ngày 02/08/2013 http://old.voer.edu.vn/module/khoa-hoc-xa-hoi/cong-nghe-chuyen-gen-o-thucvat.html, ngày 02/08/2013. http://vndocs.docdat.com/docs/index-2391.html?page=8, ngày 02/08/2013 http://www.gmocompass.org/eng/agri_biotechnology/gmo_planting/194.docu.ht ml, ngày 02/08/2013. Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 40 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học PHỤ LỤC Phụ lục 1: Hình điện di sản phẩm PCR 10 11 12 13 14 15 16 M 200bp Hình 14: Hình điện di sản phẩm PCR chạy với cặp mồi 35S promoter 58 C, 16 mẫu Giếng 1: lúa chuyển gen; giếng 2: lúa; giếng 3: thuốc chuyển gen; giếng 4: cam sành; giếng 5:cam cười; giếng 6: cam Ari20na; giếng 7: bưởi; giếng 8: bưởi roi; giếng 9: cẩm thạch; giếng 10: chuối; giếng 11: nguyệt quế; giếng 12: đậu nành CM60; giếng 13: đậu xanh;giếng 14: đậu nành ST4; giếng 15: đậu nành HL92; giếng 16: nước cất lần; giếng M: thang chuẩn M 10 11 200bp Hình 15: Hình điện di sản phẩm PCR chạy với cặp mồi 35S promoter 580C, 11 mẫu Giếng M: thang chuẩn; giếng 2: đối chứng +; giếng 3: lúa chuyển gen; giếng 4: đậu nành CM60; giếng 5,6,7: đu đủ; giếng 8: thuốc chuyển gen, giếng 9,10,11: đu đủ; giếng 12: nước cất lần) 10 11 12 13 14 15 M 200bp Khoảng 184bp Hình 16: Kết PCR với cặp mồi Cry 570C Giếng 1: đối chứng (+); giếng 2: lúa chứa GMO; giếng 3:lúa: giếng 4: Thuốc lá; giếng 5: thuốc chứa GMO; giếng 6: cam sành; giếng 7: cam cười; giếng 8: bưởi roi; giếng 9: cẩm thạch; giếng 10: chuối; giếng 11: nguyệt quế; giếng 12: đậu nành HL203; giếng 13: đậu nành ST4; giếng 14: đậu xanh; giếng 15: nước cất khử trùng lần( đối chứng (-); giếng M: Thang chuẩn M 10 11 12 13 200bp Hình 17: Kết PCR với cặp mồi Cry 60oC Giếng 1: đối chứng (+); giếng 2: lúa chứa GMO; giếng 3:lúa: giếng 4: Thuốc lá; giếng M: Thang chuẩn; giếng 5: thuốc chứa GMO; giếng 6: cam sành; giếng 7: cam cười; giếng 8: bưởi roi; giếng 9: cẩm thạch; giếng 10: chuối; giếng 11: nguyệt quế; giếng 12: đậu nành HL203; giếng 13:nước cất khử trùng lần( đối chứng (-); Phụ lục 2: Kết kiểm tra GM đối tượng nghiên cứu Mẫu DNA STT Nguồn gốc Kết phân tích Pmi Pmi 35S Cry Lúa chuyển gen Viện CNSH- ĐHCT - + + - Lúa Taipei 309 Viện CNSH- ĐHCT - + + - Lúa Nipponbare Viện CNSH- ĐHCT - + - - Thuốc chuyển gen Viện CNSH- ĐHCT - + + - Thuốc Viện CNSH- ĐHCT - - - - Cam sành Viện CNSH- ĐHCT - - + - Cam cười Viện CNSH- ĐHCT - + + - Cam ari 20na Viện CNSH- ĐHCT - + + - Bưởi roi Viện CNSH- ĐHCT - + + - 10 Cẩm thạch Viện CNSH- ĐHCT - + + - 11 Chuối Viện CNSH- ĐHCT - + + - 12 Nguyệt quế Viện CNSH- ĐHCT - + - - 13 Đậu nành HL203 Viện CNSH- ĐHCT - + + - 14 Đậu nành ST4 Viện CNSH- ĐHCT - + - - 15 Đậu xanh Viện CNSH- ĐHCT - + - - 16 Đu đủ Chợ Cần Thơ - + + - 17 Bắp Siêu thị Vinatex Cần Thơ - + + + (Trong đó: +: có sản phẩm khuếch đại -: sản phẩm khuếch đại) Phụ lục 3: Hình thiết bị Hình 15: Máy microwave Hình 16: Máy PCR Hình 17: Máy chụp hình gel Hình 18: Bể điện di BIO-RAD UV 2000. [...]... tự DNA bằng PCR Xuất phát từ những vấn đề nêu trên đề tài Đánh giá tính chuyên biệt của các cặp mồi trong nhận diện thực vật chuyển đổi gen được thực hiện là cần thiết và cấp bách Mục tiêu đề tài: Sử dụng mồi chuyên biệt từ nghiên cứu trước và thiết kế cặp mồi chuyên biệt để khảo sát sự hiện diện của cây trồng GM ở Việt Nam bằng kỹ thuật PCR Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC & PT Công nghệ... vật biến đổi gen (GMO) 2.1.1 Khái niệm Sinh vật biến đổi gen (Genetically Modified Organism - GMO) là sinh vật mà vật liệu di truyền bị thay đổi theo ý muốn của con người, được tạo ra bằng công nghệ chuyển nạp gen, bao gồm nhiều đối tượng: vi khuẩn, nấm, thực vật, động vật GMO là nguốn gốc của thực phẩm biến đổi gen, được sử dụng trong nghiên cứu khoa học và nhiều ứng dụng khác Thực vật biến đổi gen. .. cho chuyển gen ở thực vật Các điều kiện cần thiết cho việc chuyển gen vào thực vật là yếu tố mang gen cần chuyển (vector), gen cần chuyển, đoạn khởi động (promoter) và đoạn kết thúc (terminator) Vector cần có: Một đoạn khởi đầu tái bản, một gen chỉ thị chọn lọc để thao tác trong E.coli và một gen chỉ thị khác được khống chế bởi một promoter mạnh của thực vật để phục vụ cho việc chọn lọc ở thực vật. .. hệ gen (genome )của một sinh vật được gọi là quá trình biến nạp (transformation) Ngoài ra cũng có thể có những sinh vật được tạo ra do quá trình lan truyền của gen trong tự nhiên Tuy nhiên, khi nói đến GMO người ta thường đề cập đến các sinh vật mang các gen của một loài khác để tạo ra một dạng mới, chưa từng tồn tại trong tự nhiên (Trần Thị Tuyết Linh, 2009) 2.1.2 Lịch sử của sinh vật biến đổi gen. .. công nghệ gen thực vật Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 20 Viện NC & PT Công nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013 Trường ĐHCT Các loài sinh vật khác nhau có sự cách ly về mặt di truyền, DNA ngoại lai sẽ bị loại bỏ ra khỏi cá thể Công nghệ DNA tái tổ hợp để biến đổi sinh vật bằng cách phân lập các gen có giá trị từ sinh vật cho, thiết kế và chuyển chúng vào bộ gen của sinh vật nhận, tạo ra... những đặc tính mong muốn Để tạo GMO cần phải phân lập các gen riêng lẻ kiểm soát các tính trạng cụ thể, nhân lên và gắn một promoter vào trước gen, đảm bảo chúng có thể hoạt động tốt trong cơ thể sinh vật nhận Các nghiên cứu chuyển gen thực vật thường sử dụng các promoter: CAMV35S, CAMV19S, NOS (Nopaline Synthase) b CAMV35S promoter CAMV - Cauliflower Mosaic Virus là một pararetrovirus của thực vật họ... bản của việc chuyển gen Khi thực hiện thí nghiệm chuyển gen cần chú ý một số vấn đề sinh học ảnh hưởng đến quá trình chuyển gen như sau:  Không phải toàn bộ tế bào đều thể hiện tính toàn năng  Các cây khác nhau có phản ứng không giống nhau với sự xâm nhập của một gen ngoại lai  Cây biến nạp chỉ có thể tái sinh từ các tế bào có khả năng tái sinh và khả năng thu nhận gen biến nạp vào genome  Mô thực. .. này dễ thực hiện, có thể chuyển gen vào nhiều loại tế bào, mô, tỉ lệ sống sót cao đã áp dụng thành công trên nhiều loại cây trồng: hành, lúa, bắp Tuy nhiên hiệu quả thấp và giá thành cao (Trần Quốc Dung et al., 2006) b Phương pháp chuyển gen gián tiếp  Chuyển gen gián tiếp nhờ Agrobacterium Agrobacterium có khả năng xâm nhiễm tế bào thực vật bằng cách chuyển một đoạn DNA của nó vào tế bào thực vật. .. văn tốt nghiệp khóa 36 - 2013  Trường ĐHCT Chuyển gen gián tiếp nhờ virus Ngoài việc sử dụng vi khuẩn, ngày nay, người ta còn sử dụng virus vào việc chuyển gen ở thực vật Thuận lợi của phương pháp này là virus dễ xâm nhập và lây lan trong cơ thể vật chủ Tuy nhiên, virus làm vectơ chuyển gen cần có các tiêu chuẩn: Hệ gen là DNA, có khả năng di chuyển qua lại các tế bào nhờ lỗ trên vách tế bào, có phổ... biến đổi gen, làm tăng tính kháng của chúng đối với đặc tính chống chịu sâu bệnh, thuốc diệt cỏ  Ảnh hưởng đến hệ sinh thái nếu trồng với quy mô lớn, đại trà: Làm mất cân bằng sinh thái ban đầu của khu vực gieo trồng  Đối với môi trường: GMO mang các yếu tố chọn lọc (gen chịu mặn hay kháng sâu bệnh…) lây lan gen chuyển vào quần thể thực vật (Jeschke et al., 2013) 2.4 Phương pháp chuyển gen vào thực vật . cặp mồi CryIA(b) 29 CHƯƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 30 4.1 Thiết kế các cặp mồi 30 4.1.1 Thiết kế cặp mồi 35S: 30 4.1.2. Thiết kế cặp mồi pmi 30 4.2 Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi đã. 44 - 2012, năm 2012 là năm thứ 17 của quá trình thương mại hóa cây chuyển gen, một kỷ lục 170 .300 .000 ha cây trồng biến đổi gen đã được phát triển trên toàn cầu vào năm 2012, với tốc độ tăng. tích đất trồng cây biến đổi gen trên toàn cầu, tiếp theo là bắp chuyển gen (37,3 triệu ha, chiếm 30% ), bông chuyển gen (15,5 triệu ha, chiếm 12%) và cải canola chuyển gen (5,9 triệu ha, chiếm