B ộ Y TÉ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ******* H «** * NGUYÊN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ROSIGLITAZONE TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ợ c SỸ ĐẠI HỌC KHÓA 0 - 2007) Th.s. Nguyễn Lâm Hồng T.s Phùng Thị Vinh Nai thưc hiên: Trung tâm đánh giá tương đương sinh học Người hướng dẫn: Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương Thời gian thưc hiên: Từ tháng 3/2007 đến tháng 5/2007 HÀ NÔI 5/2007 LỜI CẢM ƠN Sau ba tháng thực đề tài với nhiều nỗ lực cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận lúc xin phép bày tỏ lòng biết fn với người dạy dỗ, hướng dẫn, dìu dắt giúp đỡ suốt thời gian qua. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn chân thành sâu sắc tới T.s Phùng Thị Vinh - Giám đốc Trung tâm đánh giá tương đương sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương , Thạc sỹ Nguyễn Lâm Hồng - Giảng viên môn Hóa phân tích trường Đại học Dược Hà Nội, người trực tiếp hưómg dẫn giúp đỡ suốt trình thực đề tài. Tôi xm chân thành cảm fn Thạc sỹ Tạ Mạnh Hùng, Dược sỹ Trần Hoàng toàn thể cán Trung tâm đánh giá tưong đương sinh học - Viện kiểm nghiệm thuốc Trung ương tận tình ehỉ bảo tạo điều kiện thuận lợi cho hoàn thành khóa luận. Tôi xin gửi lời cảm om đến thầy cô giáo, cán toàn trường tận tình giảng dạy, giúp đỡ tìình học tập trường. Nhân dịp xin gửi lời cám ơn tới toàn thể bạn bè, đồng nghiệp người thân giúp đỡ động viên suốt trình học tập làm khóa luận tốt nghiệp. Một lần xin chân thành cám ơn. Hà nội ngày 19 tháng năm 2007 Sinh viên Nguyễn Xuân Thành CHÚ THÍCH CÁC CHỮ VIET TẮT RGZ Rosiglitazone PRP Propylparaben EtOH Ethanol MeOH Methanol MeCN Acetonitril IS Nội chuẩn ( Internal Standard) SKD Sinh khả dụng HPLC Sắc ký lỏng hiệu cao ( High Performance Liquid Chromatography ) LLOQ Giới hạn định lượng ( Lower Limit o f Quantification) ULOQ Giới hạn định lượng frên ( Upper Limit o f Quantification ) LQC Mau kiểm chứng nồng độ thấp ( Low Quality Control sample ) MQC Mau kiểm chứng nồng độ trung bình ( Middle Quality Control sample) QC Mau kiểm chứng ( Quality Control Sample ) sample ) HQC Mầu kiểm chứng nồng độ cao ( High Quality Control RSD Độ lệch chuẩn tương đối ( Relative Standard Deviation ) SD Độ lệch chuẩn (Standard Deviation ) TB Trung bình Danh mục hình Hình Nội dung 1.1 Sơ đồ cẩu tạo chung cho mảy SK lỏng hiệu cao 2.1 Sơ đồ bước xử lý mẫu phương pháp chiết lỏng-lỏng .2 sẳc kỷ đồ mẫu chuẩn xử lýbằngCH 2CỈ2 2.3 sẳc kỷ đồ mẫu chuẩn xử lý hỗn hợp CH¿l2:(C2Hs)20 tỷ lệ 3:7 (v/v) 2.4 Sắc đồ khảo sát phổ phát xạ 2.5 Sắc đồ khảo sát phổ kích thích .6 sẳc kỷ đồ dung dịch nội chuẩn pha động 2.7 sẳc kỷ đồ mẫu huyết tương trắng 2.8 Sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có nội chuẩn PRP (ÍR~ 7,5 phút¿ 2.9 Sắc kỷ đồ mẫu chuẩn(ÍR~ 9,5phút, nồng độ 800ng/mL) 2.10 Đường chuẩn biểu thị mổi tương quan tỷ lệ diện tích pic RGZ/PRP nồng độ RGZ huyết tương. Trang 24 24 24 25 25 26 29 29 29 31 Danh mục bảng Bảng 1.1 Nội Dung Một số cồng trình định lượng Rosiglitazone bấngHPLC 2.1 Kết xác định độ phù hợp hệ thống sắc ký 2.2 Sự phụ thuộc tỷ lệ diện tích pic chuẩn/nội chuẩn nồng độ RGZ chuẩn pha huyết tương 2.3 Kết xác định giới hạn định lượng 2.4 Kết xác định độ đủng, độ lặp lại ngày 2.5 Kết xác định độ đủng, độ lặp lại khác ngày 2.6 Kết xác định hiệu xuất chiết nội chuẩn 2.7 Kết xác định hiệu xuất chiết RGZ 2.8 Kết nghiên cứu độ ổn định mẫu sau chu kỳ đông-rã đông 2.9 Xác định độ ổn định trình xử lỷ mẫu 2.10 Độ ổn định dài ngày mẫu huyết tương Trang 13 28 30 32 33 34 35 35 36 37 38 MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐẺ PHẦN : TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan Ròsỉglỉtazone 1.1.1. Công thức hóa học 1.1.2. Tên khoa học 1.1.3. Tính chất 1.1.4. Đặc điểm dược học 1.1.5. Chỉ định điều trị 1.1.6 . Liều dùng cách dùng RGZ 1.1.7. Chống định 1.1.8. Định lượng RGZ ừong dịch sinh học 1.2. Tổng quan HPLC 1.2.1. Khái niệm sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) 1.2.2. Phân loại sắc ký lỏng hiệu cao 1.2.3. Một số thông số đặc trưng cho HPLC 1.2.4. Một số phương pháp định lượng HPLC 1.3. Thẩm định phương pháp phân tích dược chất dịch sinh học 1.3.1. khái niệm 1.3.2. Nội dung thẩm định phưomg pháp PHẦN 2: TH ựC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Điều kiện thực nghiệm, nội dung phương pháp nghiên cứu 2.1.1. Điều kiện thực nghiệm 2.1.2. Nội dung nghiên cứu 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu 2.1.4. Phương pháp xử lý số liệu 2.2. Kết nghiên cứu nhận xét 2.2.1. Kết xây dựng phương pháp định lượng 2.2.2 .Thẩm định phương pháp phân tích 2.3. Bàn luận PHẨN 3: KÉT LUẬN VÀ ĐẺ XUẤT TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC 3 3 3 4 5 10 14 14 14 16 16 16 17 17 22 22 22 28 38 41 ĐẶT VẤN ĐÈ Hiện nay, công nghiệp dược phẩm nước ta có bước phát triển mạnh mẽ. Với dược chất, nhà sản xuất nghiên cứu tạo cho sản phẩm riêng cách tạo dạng bào chế mới, có thêm thành phần mới, hàm lượng .và xuất thị trường với biệt dược mới. Do đó, thị trường dược phẩm Việt Nam lưu hành nhiều chế phẩm thuốc tác dụng điều trị giá thành chất lượng khác gây khó khăn cho bác sĩ người sử dụng việc lựa chọn thuốc. Qui định đánh giá sinh khả dụng (SKD) tương đưomg sinh học (TĐSH) cần thiết để đưa thị trường chế phẩm TĐSH dùng thay ữong điều trị lâm sàng nhằm giúp quan quản lí lựa chọn chế phẩm thuốc đạt chất lượng, hiệu an toàn điều trị. Bên cạnh đó, buộc nhà sản xuất phải không ngừng nâng cao chất lượng sản phẩm, uy tín thương hiệu mình. Để tìiực nghiên cứu đánh giá SKD TĐSH, ừong nội dung quan tì-ọng xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu phân tích định lượng thuốc ừong dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu, Quá trình phân tích thuốc dịch sinh học thưòng gặp nhiều khó khăn thuốc sau vào thể thường bị chuyển hóa thành nhiều dẫn chất khác, nồng độ thuốc mẫu thường thấp có nhiều tạp. Chính vậy, theo quy định chung phân tích thuốc ứong dịch sinh học, phưomg pháp phân tích phải thẩm định đánh giá chặt chẽ theo qui định riêng để đảm bảo kết thử nghiệm xác. Xuất phát từ thực tế trên, tiến hành nghiên cứu đề t ài ; **Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Rosiglỉtaione huyết tương sắc kỷ lỏng hiệu cao” Với mục tiêu sau: - Nghiên cứu xây dựng qui trình xử lý định lượng rosiglitazone huyết tương phương pháp sắc ký lỏng hiệu cao. - Thẩm định phương pháp phân tích xây dựng, từ đề quy trình phân tích thưòmg quy để định lượng rosiglitazone huyết tương. Chúng hy vọng kết nghiên cứu thu đề tài có giá trị thực tiễn, làm sở ứng dụng tì*ong xác định đánh giá tương đương sinh học. PHẦN : TỎNG QUAN 1.1. Tổng quan Rosỉglitazone (RGZ) : L L L Công thức hóa học [16; 18] - Công thức phân tử : C 18 H 19 N O3 S.C4 H4 O4 - Khối lượng phân tử : 473,52 (357,44 dạng base) - Công thức cấu tạo ; -COO H H . "Ịl' HÒ* CO OH 7.7.2. Tên khoa học [16] (±)-5-[[4-[2-methyl-2-pyrydinylamino) ethoxy] phenyl] methyl] -2,4thiazolidinedione, (Z)-2-butenedioate (1:1). 7.7.5. Tính chất [10; 15; 16] - Là chất rắn có màu trắng đến trắng đục, có nhiệt độ nóng chảy từ Ì22°c đến 123°c. Rosiglitazone maleate dễ tan ethanol dung dịch đệm có p H ,3 . - Hệ số phân bố dầu/nước RGZ logP = 2,1 [], có khả dùng phưcmg pháp chiết lỏng - lỏng dung môi hữu để chiết tách RGZ ừong dịch sinh học. - Gía trị pKa RGZ maleate , 6,1. - RGZ có khả phát huỳnh quang tự nhiên (Em= 367nm) bị kích thích xạ Ex= 247 nm, định lượng RGZ phưomg pháp HPLC với detector huỳnh quang. 1.1.4. Đặc điểm dược học a. Dược lầm sàng [7] Rosiglitazone thuộc nhóm Thiazolidinedione chống đái tháo đường. Có tác dụng cải thiện kiểm soát đường huyết cách tăng nhạy cảm với Insulin ữong giảm lượng insulin ừong máu. K Dược động học [15; 16; 17; 18] RGZ hấp thu tốt qua đường tiêu hóa, nồng độ tối đa huyết tương đạt sau uống. SKD tuyệt đối Rosiglitazone 99%. Thức ăn không ảnh hưởng tới tổng lượng hấp thu (AUC), nhiên lại làm giảm Cmax (giảm khoảng 20% đến 28%) làm chậm Tmax (1.75 giờ). Với liều mg mg, uống xa bữa ăn, nồng độ đỉnh huyết tương trung bình đạt từ 560 650 ng/mL. Nồng độ tối đa huyết tưomg (Cmax) diện tích đưÒTig cong (AUC) RGZ tăng tỷ lệ với liều dùng cao liều điều ừỊ. Khoảng 99,8% RGZ liên kết với protein huyết tương, chủ yếu albumin. RGZ chuyển hóa rộng rãi tiết qua thận dạng không đổi. Thời gian bán thải khoảng 3-4 không phụ thuộc liều dùng.[] 1.1.5. Chỉ định điều trị [10; 16] - RGZ dùng như đơn trị liệu hỗ trợ cho chế độ ăn tập thể dục nhằm cải thiện đường huyết bệnh nhân tiểu đường typ . - RGZ dùng phối hợp với Metformin (Biệt dược Avandamet), Sulfamide hạ đường huyết, insulin chế độ ăn, tập thể dục đơn trị liệu thuốc kết kiểm soát đường huyết thích đáng bệnh nhân tiểu đường typ . 1.1.6. Liều dùng cách dùng RGZ [10; 15; 16] - Liều khởi đầu thường dùng 4mg, uống lần chia làm lần ngày. - Đối với bệnh nhân đáp ứng sau 12 tuần điều trị, tăng liều lên mg uống lần chia làm lần ngày. - Có thể uống thức ăn không. 7.7.7. Chổng định [10; 16] - Sử dụng cho bệnh nhân có tiền sử mẫn với RGZ. - Nhiễm toan ceton hay tiền hôn mê bệnh nhân tiểu đường. 1.1.8. Định lượng RGZ dịch sinh học Để định lượng thuốc dịch sinh học (máu, huyết tương, nước tiểu) thường sử dụng phương pháp phân tích hoá lý (điện di mao quản, sắc ký khí, sắc ký lỏng .). Đối với số hoạt chất có tác dụng dược lý đặc hiệu định lượng phương pháp vi sinh (một số chất kháng sinh/Tcháng khuẩn) phương pháp miễn dịch đặc hiệu. So với phương pháp vi sinh, miễn dịch; phương pháp phân tích hoá lý có phạm vi ứng dụng rộng thường cho kết ổn định dễ ưiển khai hơn, sắc ký lỏng hiệu cao (HPLC) thường sử dụng ứong nghiên cứu SKD TĐSH. Hiện phương pháp HPLC áp dụng để định lượng RGZ chế phẩm hay dịch sinh học. 1.2. Tổng quan HPLC: [1; 3; 5] 1.2.1. Khải niệm sắc kỷ lỏng hiệu cao (HPLC) Sắc ký lỏng hiệu cao hay sắc ký lỏng cao áp kỹ thuật dùng để phân tách định lượng thành phần hỗn hợp dựa ữên lực khác chất với hai pha tiếp xúc không hòa lẫn vào -pha động pha tĩnh. Khi dung dịch hỗn hợp chất cần phân tích tiêm vào cột sắc ký, chúng hấp phụ liên kết với pha tĩnh tuỳ thuộc chất hạt nhồi chất cần phân tích. Khi bơm dung môi pha động qua cột tùy thuộc vào lực chất với pha, chúng di chuyển qua cột với vận tốc khác dẫn đến phân tách chất. Các chấi sau khỏi cột phát detector chuyển qua phận xử lý kết [6 ]. Thứ tự hiệu ứình tách định tổng hợp lực tirong tác : Chất phân tích Pha động Sơ đồ nguyên tắc chung cho mảy SK lỏng hiệu cao :[1] Gồm phận chính: - Chuẩn bị mẫu nội chuẩn pha pha động có nồng độ tương tự, xử lý mẫu tiến hành phân tích làm với mẫu ữên, xác định diện tích pic PRP. So sánh diện tích pic PRP mẫu, tính tỷ lệ thu hồi PRP. Kết frình bày bảng .6 . Bảne .6 : Kết xác định hiệu xuất chiết nội chuẩn Stt Mẩu trắng + IS (mV.s) 3110422 2965414 3065468 2872766 T.Bình SD RSD (%) Mẩu chuẩn (mV.s) Hiệu suất chiết (%) 5617945 5622254 5614679 5635673 77,5 73,8 76,4 71,4 74,8 2,75 3,7 cao (>70%), độ lặp lại phưomg pháp chiết tốt ( RSD < 5% ). Vậỵ quy trình xử lý mẫu huyết tương chọn tíiích hợp để chiết tách PRP. + Hiệu suất chiết RGZ: - Chuẩn bị mẫu LQC, HQC có nồng độ 80 800 ng/mL. Xử lý mẫu tiến hành phân tích theo quy trình chọn. Xác định nồng độ RGZ có ữong mẫu theo đưòmg chuẩn. - Chuẩn bị mẫu chuẩn RGZ pha ữong pha động có nồng độ tưong ứng với mẫu LQC HQC tiến hành định lượng ừong điều kiện sắc ký ừên. -►Xác định tỷ lệ thu hồi cách so sánh kết lượng RGZ mẫu QC có qua chiết tách - với mẫu chuẩn pha tì*ong pha động (không qua chiết tách). Kết xác định hiệu suất chiết RGZ ữình bày bảng 2.7. Bảns 2.7: Kết xác định hiệu xuất chiết RGZ Stt T.Bình SD RSD(%) _K. 'TT' ^A 4*1 Mâu LQC (80 nj^ml) Mâu HQC (800 ng/ml) Hiệu RGZ/HT RGZ/PĐ Hiệu RGZ/HT RGZ/PĐ suấỉ (ng/iriL) (ng/iĩiL) (ng/mL) (ng/iĩiL) suất (%) m 70,9 79,9 670,8 800,0 ,2 80,0 697,5 800,1 «5,3 «7.2 66,9 80,0 665,1 800,1 83,6 83.1 65,4 80,1 680,5 800,1 81,6 61,7 80,1 77jữ 655,4 800,1 83,3 84,2 4,34 ,0 5,2 ■1 • /\ í /V t *1 phương pháp cho hiệu suất chiết cao (83 - 84 %); độ lặp lại tốt (RSD < 10%) hiệu suất chiết nồng độ chênh lệch không 15%. Do phương pháp xử lý mẫu phù hợp để chiết tách RGZ tò huyết tưomg. * Độ ổn định RGZ huyết tương + Độ ổn định sau chu kỳ đông - rã đông: Pha mẫu LQC HQC mục 2.1.3. Tiện hành xử lý mẫu, sắc ký theo điều kiện lựa chọn. Xác định nồng độ RGZ mẫu từ đường chuẩn tiến hành song song ngày. Kết nồng độ RGZ mẫu LQC, HQC sau chu kỳ rã đông mẫu tiến hành phân tích sau rã đông trình bày bảng .8 . stt Kết định lưọìig RGZ (ng/mL) Mẩu LQC Mẩu HQC Nồng Nồng Thổng kê Thống kê độ 70,9 độ 670,8 TB = 678,5 ,2 697,5 SD = 14,19 Phân tích (ban đâu) 66,9 665,1 65,4 680,5 68,7 6 ,1 660,1 TB = 673,6 Sau chu kỳ 71,2 SD = 4,77 678,5 SD = , đông - rã đông 64,1 lẵÊm m ẵ 0,539 684,9 p= 60,5 670,7 Bảns 2.8: Kêt nghiên cứu độ ôn định mâu sau chu kỳ đông-rã đông TB = SD = 67,9 2,33 Kết p > 0,05 cho thấy mẫu huyết tương ổn định qua chu kỳ đông - rã đông. + Độ ổn định thời gian phần tích: So sánh nồng độ RGZ ừong mẫu LQC, HQC xử lý mẫu theo qui trình lựa chọn sau để tan chảy hoàn toàn nhiệt độ phòng mẫu LQC, HQC có nồng độ tiến hành xử lý mẫu sau để tan chảy nhiệt độ phòng giờ. Kết nghiên cứu sau: Bảns 2.9: Xác định độ ổn định trình xử lỷ mẫu Giai đoạn stt Mẩu đưực xử lý Mẩu đưực xử lý sau giừ đê tan chảy nhiệt độ phòng Kêt định iư^rng RGZ ng/mL) Mĩâu HQC ^ẫu LQC Nồng Nồng Thong kê Thống kê độ độ 70,9 TB = 670,8 TB = 678,5 68,2 SD = 2,33 697,5 SD = 14,19 66,9 665,1 65,4 680,5 69,4 TB = 68,7 675,2 TB = 679,1 67,9 SD = 2,09 684,9 SD = 6,75 71,2 ^mễmm 671,5 0,904 66,3 684,6 => Kết bảng 2.9 cho thấy, nồng độ RGZ ừong mẫu LQC HQC xử lý mẫu tìieo qui trình so với nồng độ RGZ có frong mẫu xử lý mẫu sau để tan chảy nhiệt độ phòng khác ý nghĩa thống kê > 0,05). + Độ ổn định dài ngày: Xác định nồng độ RGZ có ữong mẫu ứiời điểm sau pha sau 7đến 21 ngày bảo quản mẫu - °c, theo phương pháp phân tích xây dụng. Kết đánh giá trình bày bảng . . >=>Kết nghiên cứu cho thấy, nồng độ RGZ mẫu bảo quản điều kiện -20 °c vòng 7, 14 21 ngày so với nồng độ RGZ mẫu pha khác biệt ý nghĩa thống kê (P > 0,05). Như RGZ ổn định huyết tưong ữong vòng ngày điều kiện bảo quản - °c. Giai đoạn Stt ivĩẫu ban đầu 70,9 ,2 Sau 14 ngày Sau ngày Bảìi2 66,9 65,4 66,7 68,9 62,7 70,1 67,5 69,4 64,2 63,7 2.1\0: Độ Kêt định lượng RGZ (ng/mL) Mẩu LQC MẫuHQC TB= 67,9 670,8 TB= SD= 2,33 697,5 SD= 665,1 680,5 TB=:; 67,1 675,1 TB= SD= 3,25 679,1 SD= p= p= 0,720 6 ,8 681,2 TB-:: 6 , 679,1 TB= SD= 2,72 672,9 SD= p= 0,392 684,6 679.1 ốn đinh dài ngày mâu huyết 678,5 14,19 675,6 6,36 0,719 678,9 4,78 0,954 tương 2.3. BÀN LUẬN 2.3.1. phương pháp x lỷ mẫu Để phân tích RGZ có nồng độ thấp mẫu huyết tương NTN có thành phần phức tạp, tỷ lệ tạp chất lớn phương pháp HPLC mẫu huyết tưong phải xử lý kỹ thuật thích hợp. Xử lý mẫu giúp loại bỏ nhiều thành phần tạp chất có mẫu, tạo thuận lợi cho trình phân tách, định lượng RGZ phương pháp HPLC. Tham khảo số công trình định lượng RGZ ứong huyết tương [11; 14; 17; 19] tiến hành nghiên cứu xây dựng phưomg pháp xử lý mẫu định lượng RGZ ừong huyết tương. - So với phương pháp SPE, sử dụng hệ thống ASTED, số tác giả [11; 14; 15; 19], phương pháp chiết RGZ sử dụng luận văn: chiết lỏng lỏng với hỗn hợp dung môi CH2 CI2 : (C2 ĨỈ ) tỷ lệ 30:70 (v/v) cho hiệu xuất chiết cao ( 80%) khoảng nồng độ thấp (80 ng/iĩiL), nồng độ tìiing bình (160 ng/ĩĩiL) nồng độ cao (800 ng/niL). Quy trình chiết không phức tạp, dễ dàng thực điều kiện nhiều phòng thí nghiệm không đòi hỏi trang thiết bị đặc biệt; dễ dàng triển khai mang lại hiệu kinh tế cao klii số lượng mẫu nghiên cứu tương đối lớn. - So với phương pháp tủa protein dung môi phương pháp xử lý mẫu sử dụng nghiên cứu cho dịch chiết tùih khiết hơn, kiểm soát tốt lượng dung môi cho vào lượng dung môi thoát phương pháp cho kết xác hơn. 2.3.2. phương pháp phân tích Phương pháp định lượng RGZ ừong dịch sinh học HPLC đă công bố ừong nhiều tài liệu [11], [14], [17], [19]. Tuy nhiên, tài liệu đề cập đến vấn đề tìiẩm định phương pháp phân tích thẩm định vài tiêu. Phương pháp HPLC định lượng RGZ huyết tương sử dụng nghiên cứu thẩm định theo tiêu FDA bao gồm; túứi chọn lọc - đặc hiệu, đường chuẩn - khoảng tuyến tính, độ xác, độ đúng, giới hạn định lượng, hiệu suất chiết độ ổn định mẫu. - Với điều kiện sắc ký không phức tạp, dễ dàng tìiển khai phòng thí nghiệm Việt Nam, hoạt chất RGZ chất chuẩn nội PRP phân tách hoàn toàn khỏi thành phần tạp có mẫu huyết tưomg với tìiời gian triển khai sắc ký 9,5 phút, thấp nhiều so với công trình nghiên cứu công bố (>12 phút). Do tiết kiệm nhiều thời gian chi phí, đặc biệt điều kiện hạn hẹp thiết bị đại tài chính. - Trong phương pháp nghiên cứu đề tài lựa chọn chuẩn nội Propyl paraben vừa có phát xạ huynh quang gần với RGZ đồng thời có cực đại hấp thụ tử ngoại gần với Metformin nên sử dụng frong định lượng hoạt chất chế phẩm phối hợp có mặt rộng rãi thị trường - AVANDAMET. - Phương pháp đề tài có giới hạn định lượng thấp (LLOQ = 40 ng/mL, sấp xỉ /2 phép phân tich. giá trị Cmax). Đạt yêu cầu giới hạn định lượng - So với phương pháp công bố, phương pháp nghiên cứu đề tài thẩm định đạt yêu cầu tiêu vể thẩm định phưong pháp phân tích dược chất dịch sinh học: KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT A.Kết iuân Qua trình thực đề tài “nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Rosiglitazone huyết tưong sắc ký lỏng hiệu cao” rút số kết luận sau: t/ => mặt nhận thức: - Biết cách triển khai nghiên cứu khíia^học: tra cứu, tìm hiểu tài liệu; bố ừí tiến hành thực nghiệm; xử lý kết báo cáo kết quả. - Nắm rõ sở lý thuyết cách tiến hành phưong pháp phân tích thuốc ừong dịch sinh học sắc ký lỏng hiệu cao. - Bước đầu tiếp cận với kiến thức tiên tiến ngành kiểm nghiệm thuốc ừên giới. thực nghiệm: ►Xây dựng phưomg pháp định lượng RGZ ừong huyết tưomg với đỉều kiện sau ♦ Ouv trình xử Iv mẫu: > Lấy ImL huyết tương (mẫu trắng/chuẩn/thử) cho vào ống ly tâm. > Thêm SO^iL dung dịch Propylparaben 250 ^ig/mL (nội chuẩn). > 1,0 lĩiL NaOH 0,05M. Lắc xoáy 30 giây. > Thêm lĩiL hỗn hợp dung môi Dicloromethan ;Diethylether tỷ lệ 30/70 (v/v). Lắc 10 phút. > Ly tâm 4000 vòng/phút ưong 10 phút. > Lấy 5mL dịch nổi, bốc khí Nitơ nhiệt độ, thu cắn > Hòa tan cắn ImL pha động, lắc xoáy phút, lọc qua giấy lọc 0,45 ^m, dung dịch thu đem tiêm sắc ký. * Điều kiên sấc kv: > Gột Gemini C18, Ịim, 250 X mm. Nhiệt độ cột 40°c > Pha động: MeCN - Đệm Natri Acetat (lOmM, pH5) tỷ lệ 45 : 55 (v/v) > Tốc độ dòng 1,25 mL/phút. > Thể tích tiêm 10 nL. > Nội chuẩn Propylparaben (nồng độ =12,5 ng/mL) > Detector RF: Ex = 247nm, Em = 367nm (sens. = medium; gain X 4). ► Phương pháp thẩm định theo hướng dẫn dược điển Mỹ: đặc hiệu - chọn lọc với RGZ, giới hạn định lượng 40 ng/iĩiL, khoảng nồng độ tuyến tính tìr 40 - 1600 ng/ĩĩiL, độ xấp xỉ 100% , .đáp ứng yêu cầu phưomg pháp phân tích dùng sinh học. B. Đề xuất - Do điều kiện thời gian kinh phí hạn hẹp nên nghiên cứu dừng lại mức nghiên cứu in vivo cho chế phẩm chứa RGZ đơn thành phần mà chưa tiến hành nghiên cứu in vitro hay chế phẩm phối hợp RGZ chế phẩm Avandamet. Vì đề nghị tiếp tục tiến hành nghiên cứu hoàn chỉnh hom cho phương pháp xây dựng, để đưa kết nghiên cứu vào ứng dụng thực tế lâm sàng đánh giá SKD, TĐSH công tác đảm bảo chất lượng thuốc. TÀI LIỆU THAM KHẢO . Trần Tử An, Thái Nguyễn Hùng Thu (2006), Hỏa phân tích II, trường Đại học Dược Hà Nội, ữang 85 - 91, 125 - 147, 331 -337. 2. Nguyễn Thị Kiều Anh (2004), Thảm định phương pháp phân tích sinh học ứng dụng nghiên cứu sinh khả dụng dược động học, chuyên đề sâu nghiên cứu sinh, ừang 12-23 3. Dược điển Việt Nam III (2002), PL 84 - 85, PL 78. 4. Trần Thị Hằng (2005), nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin huyết tương sắc ký lỏng hiệu cao, luận văn tốt nghiệp Dược sỹ khóa 2000 - 2005. 5. Phạm Gia Huệ, Trần Tử An (1998^, Hỏa phân tích II trường Đại học Dược Hà Nội, ừang 55-84. . Tạ Mạnh Hùng (2006), Nghiên cứu đảnh giá tương đương sinh học viên nang cefaclor Stada ® 250 sản xuất Việt Nam^ luận văn Thạc sỹ Dược học, ứang 11-13, 23-27 30-50. 7. Chu Thị Quỳnh Lan (2006), Tổng quan hóa sinh bệnh tiểu đường thuốc điều trị, luận văn tốt nghiệp Dược sỹ khóa 2001 - 2006, trang 51 - 54. . Trần Thị Minh Nghĩa (2006), Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Aminazin huyết tương sắc kỷ lỏng hiệu cao, luận văn tốt nghiệp Dược sỹ khóa 2001 - 2006. 9. Phùng Thị Vinh (2005), Nghiên cứu phương pháp chiết xuất định lượng Norfloxacin dịch sinh học, báo cáo kết nghiên cứu đề tài cấp bộ. 10.American Society Health - System Pharmacist (2002), APIFS Drug Information, Vol III, p. 3070 - 3071. 11.Ann-Marie Muxlow, Susan Fowles, Paul Russell (2000), “Automated high - performance liquid chromatography method for the determination of rosiglitazone in human plasma”. Journal o f Chromatography B, 12.British 752, p. 77 - 84. . Pharmacopoeia 2005, Volum 1& 2. IS.European Pharmacopoeia Fourth edition (2002), Volum 1& 2. 14.J. He, Y.F. Hu, L.F. Doan, Z.R. Tan, L.S. Wang, D. Wang, W. Zang, Z. Li, J. Li, J. Liu, .(2006), “Sensitivive and selective liquid chromatography - mass spectrometry method for the quantification rosiglitazone in human plasma”, Journal o f Pharmaceutical and Biomedical Analysis 43, p. 580 - 585. 15.Jennifer M. Malinowski, PharmD\ and Scott Bolesta, PharmD^ (2000), “Rosiglitazone in the Treatment of Type Diabetes Mellitus: A Critical Review”, Clinical Therapeutics, N” 10, Vol.22, p.ll51 1162. 16.Martindal (2005), The comlete drug reference Thirty - fourth Edition, p. 345 - 346. 17.Matthew W. Hruska, Reginald F. Frye (2004), “ Simplified method for determination of rosiglitazone in human plasma”. Journal o f Chromatography B, N®803, p. 317 - 320. 18.Merk Index (2001), Vol II, p. 1484. 19.Pedersen .R.S, Brosen .K,Nielsen .F(2005), “HPLC Method for Determination of Rosiglitazone in Plasma”, Chromatographia, N° 62, p.197-201. 20.The 2022 . United States Pharmacopoeia 26 (2003), Volum 1& 2, p.2016 - 21.U.S Department of Health and Human Services, Food and Drug Administration, Center for Drug evaluation and Reseach (2001), Guidance fo r Intrustry - Bioanalytical Method Validation. PHỤ LỤC Admin 1600 Acquired by Sample Name Sample ID V ail# Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed 16 50 uL Rosi14.lcd Rosiglitazone 3.1cm Rosiglitazone.Icb Default.lcr 5/5/2007 12:47:02 PM 5/21/2007 9:55:18 AM C:\LabSolutions\HUNG\Data\rosiglitasone\FLUORESCENCE\05-05-2007\Rosi14.lcd mV 0.0 7.5 5.0 2.5 10.0 D et.ACh1/247nm -367nm Grouping Results Detector A Group# Total Group Nam e Cone. Area Height Acquired by Sample Name Sample ID Vail# Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed Admin 800 15 50 uL RosilS.Icd Rosiglitazone 3.1cm Rosiglitazone.Icb Default.lcr 5/5/2007 12:35:33 PM 5/21/2007 9:51:34 AM C:\LabSolutions\HUNG\Data\rosiglitasone\FLUORESCENCE\05-05-2007\Rosi13.lcd mV 500 IDet.A Chi 400- 300 200 100 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 D et.ACh1/247nm -367nm Grouping Results Detector A Group# Group Nam e Totall_______ Cone. ! Area Height II i-f --- i - . . . 5/21/2007 09:41:58 /1 ==== Shimadzu LCsolution Analysis Report ==== Acquired by Sample Name Sample ID V ail# Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed Admin 160 13 50 uL R o sill.Icd Rosiglitazone 3.1cm Rosiglitazone.Icb Default.lcr 5/5/2007 12:12:34 PM 5/21/2007 9:41:06 AM C:\LabSolutions\HUNG\Data\rosiglitasone\FLUORESCENCE\05-05-2007\Rosi11.lcd mV IDet.A Chi 250- 200 - 150 100-^ o N q: 50- 0.0 2!5~ 5.0 7.5 10.0 D et.ACh1/247nm -367nm Quantitative Results Detector A ID# RGZ PRP Name Ret. Time 9.655 7.503 Area 1137121 4315642 Height 46103 231063 Resolution 4.054 0.000 C:\LabSolutions\HUNG\Data\rosiglitasone\Method 2\Chuan3.lcd Admin Blank HT Trang Acquired by Sample Name Sample ID V ail# Injection Volume Data File Name Method File Name Batch File Name Report File Name Data Acquired Data Processed 20 uL ChuanS.Icd RosiglitazoneS Default.lcr 5/10/2006 12:31:15 PM 5/10/2006 12:41:17 PM C:\LabSolutions\HUNG\Data\rosiglitasone\Method 2\Chuan3.lcd mV 10 - IDet.A Chi -5 - -10 0.0 7.5 5.0 2.5 Det.A Ch1/247nm - 367nm Grouping Results Detector A Group# Total Group Nam e Cone. Area Height [...]... tích khác 2.1.2 Nội dung nghiên cứu Xây dựng phương pháp định lượng rosiglitazone trong huyết tương bằng HPLC: - Qui ừình chiết tách RGZ; Khảo sát trên các mẫu tự tạo để lựa chọn phương pháp xử lý mẫu thích hợp dựa ừên các nguyên lý chiết - Lựa chọn điều kiện sắc ký, xây dựng phương pháp phân tích đảm bảo phân tách RGZ khỏi thành phần tạp trong huyết tương, cho phép xác định lượng lượng RGZ có ứong mẫu... thiết bị chiết pha rắn - Phương pháp S : Quy trình xử lý mẫu bằng chiết lỏng - lỏng, chương trình chạy sắc ký đơn giản, phương pháp sử dụng detector huỳnh quang cho giới hạn định lượng 100 - 1000 ng/mL Tuy vậy, thông tin về phương pháp không đầy đủ và các phương pháp này cũng mới chỉ thẩm định một vài chỉ tiêu chưa đáp ứng qui định của FDA - Phương pháp 4: Giá trị LOD của phưong pháp khoảng 3 - 1 0 0... với điều kiện trang thiết bị và khả năng kinh phí của nhiều phòng thí nghiệm trong cả nước 1.3 Thẩm định phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học L3.1 Khái niệm [2; 6] Thẩm định một phương pháp phân tích dược chất trong dịch sinh học là quá trình xác định bằng nghiên cứu trong phòng thí nghiệm những đặc điểm đặc trưng của phương pháp để đảm bảo phương pháp đó đạt yêu cầu với các ứng dụng... ổn định: Dùng phưomg pháp hai - test t một phía (two one side texts) để so sánh nồng độ chất cần xác định độ ổn định ở các thời điểm khác nhau khác nhau có ý nghĩa thống kê hay không 2.2 KÉT QUẢ NGHIÊN c ứ u VÀ NHẶN XÉT 2.2 L Kết quả xây dựng phương pháp định lượng A Khảo sát phương pháp chiết tách RGZ trong huyết tương Chuẩn bị các mẫu chuẩn RGZ ừong huyết tương và mẫu huyết tương trắng như mục 2.3.1... chứng tỏ phưong pháp có độ nhạy rất cao, nhưng xử lý mẫu sử dụng thiết bị động ASTED ( hệ thống làm giàu mẫu tự động) không phù hợp với điều kiện kỹ thuật phòng thí nghiệm ở nước ta Trên cơ sở tham khảo các phương pháp định lượng đã được công bố, chúng tôi dự kiến xây dựng phương pháp định lượng RGZ trong huyết tương với detector huỳnh quang có độ đúng, độ chính xác, phù hợp ừong nghiên cứu đánh giá SKD... rộng đáy pic đo ở nửa chiều cao pic của chất A và B - a là độ chọn lọc, N là số đĩa Iv thuyết 1.2.4 Một sổ phương pháp định lượng bằng HPLC: [1; 3; 4; 5] Tất cả các phưong pháp địnli lưọfng bằng sắc ký đều dựa trên ngiiyên tắc; Diện tích pic và chiều cao của pic tỷ lệ thuận với nồng độ của chất phân tích ♦ P hưm s pháp dùns chuẩn nsoai:: - Đây là phưong pháp định lượng cơ bản trong đó cả 2 mẫu thử và... nhiên phương pháp phổ khối {mass spectrum) là một phưomg pháp mới với thiết bị hiện đại và đắt tiền mà hiện nay có rất ít phòng tìií nghiệm ở Việt Nam có thiết bị này - Phương pháp 2\ Được sử dụng để định lượng RGZ trong huyết tưong Tuy nhiên, qui trình xử lý mẫu bằng SPE tương đối phức tạp và chi phí cao Trong điều kiện các phòng thí nghiệm ở nước ta hiện nay, việc áp dụng phương pháp này trong thực... lý thuyết của cột là: ( H là chiều cao đĩa lý thuyết) H Nếu N càng cao thì hiệu lực cột càng lớn Yêu cầu cụ thể về số đĩa lý thuyết sẽ được quy định trong tìmg phép phân tích Trong thực tế N nằm trong khoảng 2500 đến 5500 là vừa đủ Số đĩa lý thuyết được tính toán từ số liệu thu được ừong điều kiện đẳng nhiệt bằng biểu thức; hoặc N = 16 2h Trong đó : - W i/2h là chiều rộng của pic đo ở nửa chiều cao. .. điều kiện xử lý, chiết tách RGZ tìr huyết tương bằng các phương pháp như chiết lỏng - lỏng, chiết pha rắn, tủa protein: - Với phương pháp chiết pha rắn : đây là một kỹ thuật chiết cho độ tinh khiết của dịch chiết cao và hiệu xuất khá tốt Tuy nhiên quy trình xử lý mẫu phức tạp đòi hỏi phải có trình độ chuyên môn cao và phải có kinh nghiệm chọn cột, mặt khác giá thành cao nên không phù hợp với điều kiện... bước sóng kích thích là Ex= 247 nm, và bước = sóng phát xạ là Em = 367 nm Khảo sát điều kiện sắc ký: Xử lý các mẫu huyết tương trắng, chuẩn bằng phương pháp xử lý mẫu đã lựa chọn ở trên Dung dịch sau khi lọc qua màng 0,45 fjm dùng để tiến hành sắc ký tì-ên hệ thống sắc ký HPLC - SHIMADRU với các điều kiện sắc ký khác nhau như: + Cột: khảo sát trên 2 loại cột Gemini C18 (250 X 4 mm, 5|ịm) và cột LiChrospher . tôi tiến hành nghiên cứu đề tài; * *Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Rosiglỉtaione trong huyết tương bằng sắc kỷ lỏng hiệu năng cao Với các mục tiêu sau: - Nghiên cứu xây dựng qui trình. định lượng rosiglitazone trong huyết tương bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao. - Thẩm định phương pháp phân tích đã xây dựng, từ đó đề ra quy trình phân tích thưòmg quy để định lượng rosiglitazone. DƯỢC HÀ NỘI ******* H« ** * NGUYÊN XUÂN THÀNH NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG ROSIGLITAZONE TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ược SỸ ĐẠI HỌC KHÓA