TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG -o0o - NGUYỄN THỊ ANH THƯ PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NÔNG NGHIỆP SẠCH Cần Thơ, 2014 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP VÀ SINH HỌC ỨNG DỤNG -o0o - NGUYỄN THỊ ANH THƯ PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH NÔNG NGHIỆP SẠCH MSSV: 3103370 Người hướng dẫn khoa học: TS DƯƠNG MINH VIỄN Cần Thơ, 2014 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan cơng trình nghiên cứu khoa học thân thầy hướng dẫn Các số liệu, kết trình bày luận văn trung thực chưa công bố luận văn trước Người hướng dẫn Tác giả luận văn TS Dương Minh Viễn Nguyễn Thị Anh Thư i LÝ LỊCH KHOA HỌC I LÝ LỊCH SƠ BỘ Họ tên: Nguyễn Thị Anh Thư Giới tính: Nữ Ngày, tháng, năm sinh: 11/03/1992 Nơi sinh: Sóc Trăng Quê quán: Kế Sách, Sóc Trăng Dân tộc: Kinh Địa liên lạc: xã Nhơn Mỹ, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng Di động: 0907741288 E-mail: nguyenanhthu2493@gmail.com II QUÁ TRÌNH HỌC TẬP Năm 1999-2003, học trường tiểu học Nhơn Mỹ, xã Nhơn Mỹ, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng Năm 2004-2007, học trường THCS Nhơn Mỹ, xã Nhơn Mỹ, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng Năm 2008-2010, học trường THPT Kế Sách, thị trấn Kế Sách, huyện Kế Sách, tỉnh Sóc Trăng Năm 2011-2014, học trường Đại Học Cần Thơ, đường 3/2, phường Xuân Khánh, quận Ninh Kiều, thành phố Cần Thơ Cần Thơ, ngày….tháng… năm 2014 Ký tên Nguyễn Thị Anh Thư ii LỜI CẢM TẠ Tôi xin gửi lời tri ơn sâu sắc đến gia đình người khơng ngại khó khăn, gian khổ tiếp sức, lo lắng động viên cho tơi có ngày hơm Để có kết này, xin gửi lời ghi ơn sâu sắc đến thầy Dương Minh Viễn tận tâm hướng dẫn truyền đạt cho nhiều kiến thức kinh nghiệm q báu giúp tơi hồn thành luận văn Chân thành biết ơn cô Nguyễn Đỗ Châu Giang cố vấn lớp Nông Nghiệp Sạch khóa 36 định hướng, dẫn tạo điều kiện thuận lợi cho tơi suốt khóa học Tôi xin chân thành cảm ơn quý Thầy, Cô Bộ Môn Khoa Học Đất quý Thầy, Cô Khoa Nơng nghiệp & SHƯD, nhiệt tình giảng dạy, truyền đạt cho kiến thức kinh nghiệm q báu suốt khóa học Tơi xin gửi lời biết ơn đến anh Trương Quốc Tất giúp đỡ tơi nhiều q trình thực đề tài Tôi xin cảm ơn anh, chị bạn PTN Sinh học Đất - Bộ Môn Khoa học Đất tận tình giúp đỡ, động viên hỗ trợ thời gian thực đề tài Tôi xin thân gửi lời chúc sức khỏe, thành đạt đến bạn lớp Nơng Nghiệp Sạch khóa 36, người động viên giúp đỡ suốt thời gian học tập Chúc bạn gặp nhiều may mắn thành công sống Nguyễn Thị Anh Thư iii DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1.1 Cơng thức hóa học Chlorpyrifos ethyl Hình 1.2 Một số chế phẩm chứa Chlorpyrifos ethyl sử dụng phổ biến Hình 1.3 Động thái thuốc BVTV dư tồn đất (nguồn Ross, 1989) Hình 1.4 Các sản phẩm chuyển hóa Chlorpyrifos ethyl 10 Hình 2.1 Một số địa điểm thu mẫu .16 Hình 2.2 Thu mẫu đất 18 Hình 3.1 Thống kê diện tích số hộ sử dụng thuốc trừ sâu có chứa hoạt chất Chlorpyrifos ethyl 23 Hình 3.2 So sánh liều lượng khuyến cáo với liều lượng sử dụng Chlorpyrifos ethyl thực tế nông dân 25 Hình 3.3 Khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl hệ vi khuẩn môi trường dung dịch MM sau 30 ngày nuôi cấy (n=3 độ lệch chuẩn) .27 Hình 3.4 Khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl dòng vi khuẩn môi trường dung dịch MM sau 30 ngày nuôi cấy (n=4 độ lệch chuẩn) .28 Hình 3.5 Hình dạng tế bào vi khuẩn hai dòng vi khuẩn PH C3.1 PH C4.3 quan sát kính hiển (quan sát E100) 29 Hình 3.6 Phổ điện di sản phẩm Box-PCR hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 PH_C4.3 30 iv DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 2.1 Nguồn gốc tám dòng vi khuẩn phân lập 20 Bảng 2.2 Các nghiệm thức thí nghiệm khảo sát tốc độ phân hủy Chlorpyrifos ethyl……………………………………………………………………………… 21 Bảng Một số đặc tính lý hóa mẫu đất sử dụng thí nghiệm 26 Bảng 3.2 Hình dạng khuẩn lạc hai dòng vi khuẩn vi khuẩn PH C3.1 PH C4.3 29 v TỪ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ gốc bp Base pair BVTV Bảo Vệ Thực Vật CTAB Cetyltrimethylammonium bromide ĐBSCL Đồng sông Cửu Long DEC Desethyl chlorpyrifos DNA Deoxyribonucleic acid ERIC Enterobacterial repetitive intergenic consensus HPLC High Pressure Liquid Chromatography IRU Intergenic repeat units LC50 Lethal Concentration 50 LD50 Lethal Dose 50 MM Minemal mineral medium OPCs Organophosphorus compounds PU Palindromes units REP Repetitive extra-genic palindromes TCP 3,5,6 - trichloro - - pyridinol WHO World Health Organization vi Nguyễn Thị Anh Thư, 2014 “PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG” Luận văn tốt nghiệp đại học ngành Nông Nghiệp Sạch, Khoa Nông Nghiệp & SHƯD, Trường Đại học Cần Thơ Cán hướng dẫn khoa học: Ts Dương Minh Viễn TÓM LƯỢC Đề tài “Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu gốc lân hữu Chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa số tỉnh Đồng sông Cửu Long” thực với mục tiêu: (1) Khảo sát tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl mơ hình chun canh lúa Cai Lậy - Tiền Giang Phụng Hiệp - Hậu Giang;(2)Phân lập số dịng vi khuẩn có khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl mơ hình chun canh lúa thuộc hai nhóm đất đất phù sa đất phèn Phương thức điều tra tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl vấn trực tiếp nông dân Tổng cộng 13 mẫu đất đó: mẫu Cai Lậy - Tiền Giang, mẫu Bình Tân Vĩnh Long mẫu Phụng Hiệp - Hậu Giang sử dụng để phân lập dòng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl Kết điều tra tình hình sử dụng Chlorpyrifos ethyl cho thấy, hoạt chất nông dân sử dụng để phòng trừ sâu hại đa dạng chủng loại, số lượng loại hoạt chất thay đổi theo vị trí địa lý vùng Hoạt chất Chlorpyrifos ethyl sử dụng hai địa điểm Cai Lậy - Tiền Giang, Phụng Hiệp - Hậu Giang liều lượng nông dân sử dụng cao gấp khoảng đến lần so với liều lượng khuyến cáo Kết thí nghiệm phân hủy Chlorpyrifos ethyl mơi trường khống tối thiểu lỗng 13 hệ vi sinh vật cho thấy, 2/13 hệ vi sinh vật 2/8 dòng vi khuẩn phân lập Phụng Hiệp - Hậu Giang thể phân hủy Chlorpyrifos ethyl Hai dịng vi khuẩn PH_C3.1 PH_C4.3 phân hủy 13,96% 49,72% Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm sau 30 ngày nuôi cấy Kết chạy Box-PCR từ DNA cho thấy, hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 PH_C4.3 khác mặt di truyền vii MỤC LỤC Trang LỜI CAM ĐOAN i LỜI CẢM TẠ iii DANH SÁCH HÌNH iv DANH SÁCH BẢNG v TỪ VIẾT TẮT vi TÓM LƯỢC vii MỤC LỤC viii MỞ ĐẦU CHƯƠNG LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 1.1 Tổng quan thuốc trừ sâu 1.1.1 Phân loại thuốc trừ sâu 1.1.2 Tính chất độc tính nhóm thuốc trừ sâu 1.1.2.1 Thuốc trừ sâu chlor hữu 1.1.2.2 Thuốc trừ sâu lân hữu 1.1.2.3 Thuốc trừ sâu Carbamate 1.1.2.4 Thuốc trừ sâu Pyrethroid (gốc cúc tổng hợp) 1.2 Tình hình sản xuất lúa sử dụng thuốc BVTV Việt Nam nói chung ĐBSCL nói riêng 1.3 Tác động thuốc trừ sâu đến hệ sinh thái đất 1.4 Tổng quan hoạt chất Chlorpyrifos ethyl 1.4.1 Đặc tính Chlorpyrifos ethyl 1.4.2 Tác hại Chlorpyrifos ethyl 1.4.3 Động thái Chlorpyrifos ethyl môi trường 1.4.3.1 Động thái Chlorpyrifos ethyl khơng khí 1.4.3.2 Động thái Chlorpyrifos ethyl nước viii 3.5 Khảo sát đa dạng vi khuẩn phân lập Hai dịng vi khuẩn phân hủy Chlorpyrifos ethyl trích DNA chạy BoxPCR để so sánh giống khác hai dòng vi khuẩn phân lập Kết điện di sản phẩm Box-PCR hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 PH_C4.3 cho thấy chúng khác mặt di truyền (Hình 3.6) hai dịng vi khuẩn giải trình tự định danh PH C3.1 PH C4.3 Hình 3.6 Phổ điện di sản phẩm Box-PCR hai dòng vi khuẩn PH_C3.1 PH_C4.3 30 CHƯƠNG KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 4.1 Kết luận Có nhiều loại thuốc trừ sâu sử dụng khu vực điều tra Hoạt chất Chlorpyrifos ethyl sử dụng phổ biến Cai Lậy - Tiền Giang Phụng Hiệp - Hậu Giang với 54,29% nơng dân sử dụng 40,06% diện tích trồng lúa khu vực điều tra Liều lượng sử dụng cao gấp đến lần so với liều lượng khuyến cáo Từ 13 mẫu đất mơ hình chuyên lúa thu từ hai loại đất phù sa đất phèn phân lập hệ vi khuẩn ký hiệu PH_C3.1 PH_C4.3 có khả phân hủy Chlorpyrifos ethy tương ứng từ 13,96% 49,72% sau 30 ngày ni cấy mơi trường MM có chứa Chlorpyrifos ethyl nồng độ 20 ppm nguồn carbon 4.2 Đề nghị Định danh hai dòng vi khuẩn PH C3.1 PH C4.3 Tiếp tục bố trí thí nghiệm đánh giá khả phân hủy hai dòng vi khuẩn PH C3.1 PH C4.3 vào mơi trường đất Tìm kiếm mơi trường thuận lợi cho phát triển dòng vi khuẩn nhằm hướng đến việc kích thích sinh trưởng tăng cường khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl hai 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO Agnihotri, N.P., Paney, S.Y., Jain, H.K and Srivastava, K.P., 1981 Persistence, leaching and movement of chlorfenvinphos, chlorpyrifos, disulfoton, fensulfothion, monocrotophos and tetrachlorvinphos in soil Indian Journal of Agricultural Chemistry, 24: 27-31 Andreu, V and Picó, Y., 2004 Determination of pesticide and their degradation products in soil: critical review and comparision of methods Trends in Analytical Chemistry 23 10-11 Anonymous, 2009 Environmental protection, environmental fate, http://www.al.gov.bc.ca/ pesticides/c_2.htm 28 April 2009 Anwar, S., F Liaquat, Q.M.Khan, Z.M.Kalid and S.Iqal, 2009 Biodegradation of chlorpyrifos and its hydrolysis product 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by Bacillus pumilus strain C2A1 Journal of Hazardous Materials, 168(1), pp 400-405 Castro, J., C Sanchez-Brunete, J.A Rodriguez and J.L Tadeo, 2002 Persistence of chlorpyrifos, and endosulfan in soil Bulletin of Environmental, 11(9a): 578-582 Chapman, R.A and C.R Harris, 1980 Persistence of chlorpyrifos in a mineral and organic soil J Environ Sci Health, Part B 15: 39-46 Đoàn Mạch Trường, 2012 Sản xuất xuất lúa gạo Việt Nam (giai đoạn 1990-2012) Viện lúa Đồng Bằng Sông Cửu Long Fontaine DD & Teeter D, 1987 Photodegradation of Chlorpyrifos in the Vapour Phase ABC Laboratories Dow Chemical Company Report No GH-C 1911 dated June 1987 Unpublished Gangming Xu, Wei Zheng, Yingying Li, Shenghui Wang, Jingshun Zhang, Yanchun Yan, 2008 Biodegradation of chlorpyrifos and 3,5,6-trichloro-2-pyridinol by a newly isolated Paracoccus sp strain TRP International biodeterioration and biodegradation, volume 62, Issue 1, p 51–56 10 Gilani, S T S., Ageen, M., Shah, H., Raza, S., 2010 Chlorpyrifos degradation in soil and its effect on soil microorganisms The Journal of Animal & Plant Sciences 99-102 11 Havens PL, Kieatiwong S & Shepler K, 1992 The Photochemical Degradation of Chlorpyrifos on Soil by Natural Sunlight PTRL Project No 254W Dow Chemical Company Study ID 90075 dated 21 September 1992 Unpublished 32 12 Hayward, S.J., T Gouin, F Wania, 2010 Levels and seasonal variability of pesticides in the rural atmosphere of Southern Ontario J Agric Food Chem., 58: 1077-1084 13 Howard, P.H, 1991 Handbook of environmental fate and exposure data for organic chemicals: Pesticides Lewis publishers Chelsea, MI 14 Hồ Thị Thùy Dương, 2002 Sinh học phân tử NXB Giáo dục, TP Hồ Chí Minh 15 Ihrmark, K; Inga, T.M; Bưdeker, K.C.M; Hanna, F; Ariana, K; Jessica, S; Ylva, S; Jan S; Mikael, B.D; Karina, E.C; Björn, D.L, 2012 New primers to amplify the fungal ITS2 region – evaluation by 454-sequencing of artificial and natural communities Article first published online: 27 JUL 2012.DOI: 10.1111/j.15746941.2012.01437.x 16 Keouth, T., J Versaalovic and R Lupski, 2008 Differential sudsequece conservation of interspersed repetitive Streptococcus pneumonia Box elements in diverse bacteria Genome Res 408-18 17 Kerle EA, Jenkins JJ and Vogue PA, 2007 Understanding pesticide persistence and mobility for groundwater and surface water protection Oregon State Univ Extension Service, EM8561-E 18 Kishi, M., N Hirschhorn, M Qjajadisastra, L N Satterlee, S Strowman and R Dilts, 1995 Relationship of pesticide spraying ti signs ang symptoms in Indonesian farmers Scand J Work Environ Health 21, 124-33 19 Lê Huy Bá, 2008 Độc chất môi trường NXB Khoa học Kỹ thuật, Hà Nội 20 Lê Minh Uy (Trung tâm Y tế dự phịng tỉnh An Giang), 2009 Hóa chất trừ sâu sức khỏe Bài tham luận Hội thảo “Nâng cao ý thức cộng đồng việc sử dụng thuốc BVTV theo hướng an toàn” Tổ chức Châu Thành, An Giang, ngày 16/04/2009 21 Lê Văn Khoa, 2010 Ô nhiễm môi trường đất biện pháp xử lý, Nxb Nhà xuất Giáo Dục & Đào Tạo, tr.104-114 22 Linde, C.D, 1994 Physico-chemical properties and environmental fate of pesticides Environmental hazards assessment program California, Environmental Protection Agency, Department of Pesticide Regulation, Environmental Monitoring and Pest Management Branch, EH94-03 http://www.cdpr.ca.gov/docs/emon/pubs/ehapreps/eh9403.pdf 33 23 Lyman, W., W Reehl and D Rosenblatt, 1990 Handbook of Chemical property estimation methods, environmental behavior of organic solvents American Chemical Society 24 Mallick BK, Banerji A, Shakil NA, Sethunathan NN, 1999 Bacterial degradation of chlorpyrifos in pure culture and in soil Bull Environ Contam Toxicol 62(13) :4855 25 Mauldin, Richard E.; Primus, Thomas M.; Buettgenbach, Theresa A.; Johnston, John J.; and Linz, G.M., 2006 A Simple HPLC Method for the Determination of Chlorpyrifos in Black Oil Sunflower Seeds USDA National Wildlife Research Center - Staff Publications Paper 424 26 McEwen, F and G Stephenson, 1979 The use and significance of pesticides in the environment John Wiley Press, New York 27 Nguyen Khoi Nghia, 2007 Degradation of aged creosote diesel contaminated soils by phytoremediation or biostimulation (nutrients) Master thesis in Soil Science, SLU Uppsala 2007 75 28 Nguyễn Thị Lan Hương, 2013 Khảo sát lưu tồn phân hủy sinh học Chlopyrifos Ethyl mơ hình canh tác rau màu số huyện thuộc ĐBSCL Luận văn thạc sĩ ngành Sinh thái học Đại học Cần Thơ 29 Nguyễn Thị Phi Oanh, 2011 Phân lập khảo sát khả phân hủy nông dược vi sinh vật số tỉnh Đồng sông Cửu Long Đề tài nghiên cứu khoa học cấp Bộ Trường Đại học Cần Thơ 30 Nguyễn Trần Oánh, 2007 Giáo trình Sử dụng Thuốc Bảo vệ Thực Vật Trường Đại học Nông nghiệp Hà Nội 31 Pike, K.S and L.W Getzin, 1981 Persistence and movement of chlorpyrifos in sprinkler- irrigated soiol J Econ Entomol 74: 385-388 32 Pimental, D., H Acqay and M Biltonen, 1992 Enviromenttal and economics costs of pesticide use Bioscience 42, 750-60 33 Phạm Thành Nhơn, 2005 Đánh giá lưu tồn thuốc Bảo vệ thực vật kim loại nặng môi trường đất nước ngầm tỉnh Trà Vinh Luận văn Thạc sĩ Trường Đại học Cần Thơ 34 Racke KD, Coats JR, 1990 Pesticides in soil microbial ecosystems Am Chem Soc Symp Ser 426:1-12 34 35 Racke KD, Steele KP, Yoder RN, Dick WA & Avidov E, 1996 Factors Affecting the Hydrolytic Degradation of Chlorpyrifos in Soil J Agric Food Chem, 44: 1582-1592 36 Rani, M.S., Lakshmi, K V., Devi, P S., Madhuri, R J., Aruna, S., Jyothi, K., Narasimha, G., and Venkateswarlu, K, 2008 Isolation and characterization of a chlorpyrifos degrading bacterium from agricultural soil and its growth reponse African Journal of Microbiology Research 26-31 37 Ranjan, K B and Malik, A, 2008 Utilization of Chlorpyrifos as a sole source of cacbon by bacteria isolated from wastewater Irrigated Agriculture Soil in an Industrial Area of Western Uttar Pradesh, India Reseach Journal of Microbiology 3, 293-307 38 Rosenstock, L., M Keifer, E Daninell, R McConnell, K Claypoole, 1991 Chronic central nervous system effects of acute organophosphate pesticide intoxication Lancet 338, 223-27 39 Shahida Akhtar, Syeda Talat Shaheen Gilani and Nusrat Hasan, 2004 Persistence of Chlorpyrifos and Fenpropathrin alone and in combination with fertilizer in soil and their effect on soil microbes Pak J Bot 36, 863-870 40 Singh, B.K., Walker, A and Wright, D.J, 2002 Degradation of chlorpyrifos, fenamiphos and chlorothalonil alone and in combination and their effect on soil microbial activity Environmental Toxicology and Chemitry, 21 41 Singh, B.K., Walker, A., Morgan, J.A.W and Wright, D.J, 2003 Effect of soil pH on the biodegradation of chlorpyriphos and isolation of a chlorpyriphos-degrading bacterium Applied and Evironmental Microbiology, 69 42 Singh, B.K., Walker, A., Morgan, J.A.W and Wright, D.J, 2004 Biodegradation of chlorpyrifos by Enterobacter strain B-14 and its use in bioremediation of contaminated Soils Applied and Environmental Microbiology, 70: 4855-4863 43 Smith M.D., Hartnett D.C and Rice C.W, 2000 Effects of long-term fungicide applications on microbial properties in tallgrass prairie soil Soil Biol Biochem, 32, 935-946 44 Sở NN & PTNT An Giang, 2009 Báo cáo kết chuyển giao tiến kỹ thuật lúa giai đoạn 2005-2008 kế hoạch 2009-1010 35 45 Tagatz ME, Gregory NR, Plaia GR, 1982 Effects of chlorpyrifos on field-and laboratory-devel- oped estuarine benthic communities J Toxicol Environ Health 10:411–421 46 Tomlin, C (ed.), 2000 The pesticide manual British Crop Protection Council and The Royal Soc of Chem., Cambridge 47 Trần Quang Hùng, 1999 Thuốc bảo vệ thực vật NXB Nông nghiệp, Hà Nội 48 Trung tâm Tin học Thống kê, 2012 Báo cáo kết thực kế hoạch tháng năm 2012 ngành nông nghiệp phát triển nông thôn Bộ Nông Nghiệp PTNT, Hà Nội 49 US EPA, 1989 Registration Standard (Second Round Review) for the Reregistration of Pesticide Products Containing Chlorpyrifos Office of Pesticide Programs, US EPA, Washington, DC 50 WHO, 1990 Public health impact of pesticides used in agriculture 51 Yang Chao, Na Liu, Xinmin Guo and Chuanling Qiao, 2006 Cloning of mpd gene from a chlorpyrifos-degrading bacterium and use of this strain in bioremediation of contaminated soil FEMS Microbialogical Review 265, 118-125 52 Zahm, M H W and A Blair, 1997 Pesticides and cancer In: Occupational medicine: State of the Art Reviews, M Keifer (ed.) Vol 12: Pesticides Hanley and Belfus, Inc., Philadelphia, 269-89 36 PHỤ CHƯƠNG I CÁC PHƯƠNG TIỆN VÀ QUY TRÌNH THÍ NGHIỆM Phụ chương 1: Phiếu điều tra tình hình sử dụng thuốc BVTV TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ Mã số phiếu: ………… KHOA NÔNG NGHIỆP & SHƯD BỘ MÔN KHOA HỌC ĐẤT PHIẾU ĐIỀU TRA HIỆN TRẠNG SỬ DỤNG THUỐC BVTV TRÊN LÚA Thông tin chung Tên người điều tra: Ngày điều tra:……/……./20…… Tên nông dân:……………………………… Nam , Nữ , Tuổi:…… Trình độ học vấn:……/12 Địa chỉ: Ấp:………… Xã:…………… Huyện…………… Tỉnh:…………… Diện tich trồng:……………….m2 Thời gian canh tác:……………năm Loại đất: Phù sa  Sét  Cát  Thịt  Nhiễm phèn  Từ tháng …………… đến tháng………… Kỹ thuật canh tác Giống:……………………… Thời gian sinh trưởng:…………………… ngày Kỹ thuật làm đất: Bón vơi: Có  Khơng  Liều lượng:……………… kg/1000m2 Xử lý thuốc: Có  Không  Làm đất: Chuẩn bị đất: Cày  Phơi đất: Có  Xới Khơng  Có  Khơng   Thời gian phơi:…………… ngày Kỹ thuật tưới: Tự chảy  Bơm động Có làm vụ khơng? Có   Nguồn nước tưới tiêu:…… Khơng  Nếu có  Thời gian nghỉ vụ:………… ngày Đất có ngập nước thời gian nghỉ hai vụ? i Có   Khơng Lý ngập: Mưa, lũ  Chủ động xã lũ  Thời gian rút nước vụ:……………… ngày Thời điểm xuống giống suất: Thời điểm thực (tháng) 10 11 12 Thời vụ Năng suất Phân bón (bao gồm phân hóa học & hữu cơ, hữu vi sinh) Lần Loại phân NSKS Lần Lần Lần Lần Liều Liều Liều Liều Liều NSKS NSKS NSKS NSKS lượng lượng lượng lượng lượng Sâu, bệnh : Điều tra riêng lẻ cho vụ ĐX, HT, TĐ Loại dịch hại STT (Sâu, bệnh, cỏ dại, ốc, chuột) Tên thuốc Liều lượng/công Nồng độ ĐÔNG XUÂN HÈ THU ii Thời điểm phun, rãi thuốc Ghi THU ĐÔNG Chi phí sản xuất Chi phí (1.000 đồng) Mùa vụ Tổng chi phí/ Cơng Giống Thuốc Phân bón Ngày cơng lao động Doanh thu/công Khác (bơm nước, cắt cỏ, thu hoạch) Đông xuân Hè thu Thu đông Thông tin khác liên quan đến việc sử dụng thuốc BVTV nông dân: Tình hình sử dụng thuốc BVTV (loại thuốc, lượng thuốc sử dụng) 20 năm trở lại (quan tâm nhiều đến 10 năm cuối, ý đến loại thuốc gốc chlor) ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Người điều tra Phụ chương 2: Môi trường nuôi cấy Dung dịch đệm phosphate ( Phostphate buffer) dùng để trích vi khuẩn từ đất: 23,99 gram NaH2PO4 15,59 gram Na2HPO4 pha lít nước khử khống Mơi trường Tryptose Soybean Agar (TSA): 30 gram Tryptone Soya Broth (TSB), 15 gram Agar pha lít nước khử khống Mơi trường MM (Mineral Minimal Medium): 870 mL nước khử khoáng khử trùng ướt 121oC 20 phút, nhiệt độ hạ xuống 70oC thêm vào 25 mL iii dung dịch đệm, 100 mL dung dịch muối khoáng mL dung dịch vi lượng Các dung dịch pha sau: + Dung dịch đệm (buffer solution): 35 gram Na2HPO4.2H2O, gram KH2PO4 pha lít nước cất + Dung dịch muối khoáng (mineral salt solution): 10 gram (NH4)2SO4, gram MgCl2.6H2O, gram Ca(NO3)2.4H2O pha lít nước khử khống + Dung dịch vi lượng (trace element): 273 gram NaCl, 8,2 mg MnCl2.2H2O, 1,5mg CuSO4.5H2O, 2mg ZnCl2, 0,6 mg, SnCl2.2H2O, 2mg KBr, 5,8mg BaCl2.2H2O, 470 mg FeCl2.4H2O, mg CoCl2.6H2O, mg Na2MoO4.2H2O, 0,7mg LiCl.H2O, mg H3BO3, mg KI Khử trùng màng lọc có đường kính 0,2µm trữ nhiệt độ 40C Tất môi trường trước sử dụng khử trùng ướt 1210C 20 phút Phụ chương 3: Quy trình trích DNA dung dịch CTAB Cân 0,45 gram cát mịn sạch, tiệt trùng cho vào eppendorf 1,5 mL Lấy từ 8-10 khuẩn lạc từ đĩa môi trường TSA cho vào eppendorf Cho mL CTAB 3% vào eppendorf, trộn hỗn hợp khuẩn lạc cát dung dịch CTAB Vortex eppendorf sau đem ủ 65oC 1-2 giờ, cách 15 phút lắc eppendorf để mẫu nóng Ly tâm tốc độ 13.000 vịng/phút 10 phút Chuyển 700 µL dịch bên cho sang eppendorf 1,5 mL Cho thêm 500 µL chloroform vào 700 µL dịch vừa chuyển vortex nhanh để tăng tiếp xúc mẫu chloroform Ly tâm tốc độ 13.000 vòng/phút phút Chuyển 500 µL dịch bên sang eppendorf 1,5 mL Kết tủa DNA 750 µL isopropanol lạnh, giữ lạnh 30 phút Ly tâm mẫu tốc độ 13000 vòng/phút 30 phút Loại bỏ isopropanol cẩn thận, tránh làm trôi DNA Làm DNA 200 µL ethanol lạnh Ly tâm tốc độ 6.500 vịng/phút phút Loại bỏ ethanol để khơ mẫu qua đêm iv Cho thêm 30-100 µL TE vào để trữ mẫu cho vào tủ đông -20oC Phụ chương 4: Quy trình điện di gel chứa sản phẩm phản ứng Box-PCR Bước 1: Chuẩn bị gel agarose 1,5% (Merck) Đặt khay nơi phẳng, để khuôn vào khay, đặt lược vào khuôn, kiểm tra cân khay miếng bọt khí Cân 0,15 gram agarose cho vào bình tam giác dung tích 100 mL, thêm 100 mL dung dịch TBE 1X gel 20 giếng, lắc nhẹ cho agarose tan Đặt bình tam giác vào lị vi sóng, đun chế độ phù hợp khoảng 3-4 phút cho agarose hịa tan hồn tồn, tạo thành dung dịch suốt Lấy bình tam giác khỏi lị vi sóng; đậy giấy bạc lại trành bay hơi; để nguội khoảng 500C; bổ sung L Ethidium Bromide; lắc Đổ nhẹ dung dịch vào khn chuẩn bị sẵn, tránh bọt khí, để nguội khoảng 60 phút cho gel đặt lại, lấy nhẹ lược khỏi khuôn, tránh bể giếng, lấy khuôn gel khỏi khay chuẩn bị chạy điện di Bước 2: Chạy điện di gel agarose Đặt khuôn gel vào bể điện di TBE buffer 1X cho ngập giếng Load (nạp) vào giếng L dung dịch sản phẩm Load khoảng L thang chuẩn vào giếng lại, Bật nguồn điện cho thiết bị chạy 150V 65 phút Quan sát thấy chất thị màu di chuyển đến gần cuối gel (khoảng 1-1,5 cm), tắt nguồn điện, lấy khuôn gel khỏi thiết bị điện di chuẩn bị chụp hình gel Bước 3: Chụp hình gel chạy điện di Sau chạy điện di sản phẩm phản ứng Box-PCR, quan sát kết băng DNA xuất gel hệ thống chụp hình gel Gel Logic 1.500 Imaging System Kodak để kiểm tra chất lượng q trình ly trích DNA vi khuẩn so sánh giống khác dòng vi khuẩn v Phụ chương 5: Danh sách địa điểm thu mẫu STT Tên nông dân Địa Ký hiệu hệ vi khuẩn Thầy Tư Thuận An - Bình Tân BT C_1 Nguyễn Kim Phùng Thuận An - Bình Tân BT C_2 Phạm Văn Ven Thuận An - Bình Tân BT C_3 Chú Trúc Thuận An - Bình Tân BT C_4 Bác Hai Đồ Mỹ Thành Nam - Cai Lậy CL C_1 Bác Hai (Long Khánh) Long Khánh - Cai Lậy CL C_2 Bác Ba Tài Mỹ Thành Nam - Cai Lậy CL C_3 Chú Tám Bình Phú - Cai Lậy CL C_7 Chú Đạt Hòa An - Phụng Hiệp PH C_1 10 Bác Năm Hòa An - Phụng Hiệp Ký hiệu dòng vi khuẩn PH C_2 PH C3.1 11 Kế nhà Bác Năm PH C3.2 Hòa An - Phụng Hiệp PH C_3 PH C3.3 PH C3.4 PH C4.1 PH C4.2 12 Chú Thiệp Hòa An - Phụng Hiệp PH C_4 PH C4.3 PH C4.4 13 Kế nhà Chú Thiệp Hòa An - Phụng Hiệp PH C_5 Phụ chương 6: Điều kiện canh tác khu vực lấy mẫu Huyện Bình Tân - Vĩnh Long có diện tích khoảng 152,89 km2 Đất thuộc nhóm đất phù sa trung tính chua có xuất tầng gley đốm đỏ số khu vực gần sông Hậu Thế mạnh Bình Tân sản xuất nơng nghiệp chủ yếu chuyên lúa ba vụ chuyên màu Đến đầu năm 2010, tồn huyện có 4.834 hecta trồng khoai lang đem lại lợi nhuận cao cho nông dân tạo đột phá chuyển dịch cấu kinh tế vi nông nghiệp nông thôn Một số rau màu khác bắp, dưa hấu, hẹ, đậu nành, dưa gang Huyện Cai Lậy - Tiền Giang có tổng diện tích 434,87 km2 Loại đất Cai Lậy đất phù sa có tầng gley, có đốm đỏ Địa hình Cai Lậy tương đối phẳng, độ cao trung bình từ 0,5-1,2 m so với mực nước biển chia thành hai khu vực rõ rệt Bắc Nam quốc lộ 1A Phần phía Nam đất phù sa (chiếm 53%), quanh năm có nước từ sông Tiền cung cấp Do điều kiện có đê bao chống ngập úng nên phần lớn diện tích trồng lúa vụ, vườn ăn trái phần lại thường canh tác lúa màu chuyên màu Phần phía Bắc vùng đất trũng, thấp, hàng năm có nhiều tháng bị nước ngập, lúa hai vụ phổ biến đây, phần nhỏ diện tích chuyên màu Huyện Phụng Hiệp - Hậu Giang có tổng diện tích khoảng 484,81 km2, nhóm đất canh tác chủ yếu chủ yếu đất phèn hoạt động sâu, có tầng mặt giàu chất hữu cơ, cấu trúc tốt, độ dày khoảng 25 cm Mơ hình canh tác sản xuất lúa vụ chuyên canh màu Những năm qua, ngành nông nghiệp huyện chuyển đổi cấu trồng vật nuôi, sở quy hoạch phát triển hợp lý, phù hợp với điều kiện thổ nhưỡng sinh thái vùng Các loại trồng chủ lực lúa, mía, bưởi năm roi, quýt đường, sầu riêng, măng cụt, vii PHỤ CHƯƠNG II BẢNG PHÂN TÍCH PHƯƠNG SAI CỦA CÁC SỐ LIỆU THỐNG KÊ Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl cộng động PH C_3 N ĐC 30 ngày PH C_3 Mean StDev SE Mean 3 100,02 82,36 0,89 5,03 0,51 2,90 T-Value = 5,98 P-Value = 0,004 DF = Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl cộng động PH C_4 N ĐC 30 ngày PH C_4 Mean StDev SE Mean 3 100,02 83,84 0,89 3,39 0,51 2,00 T-Value = 8,01 P-Value = 0,001 DF = Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl dòng PH C3.1 N ĐC 30 ngày PH C3.1 Mean StDev SE Mean 4 100,00 86,04 4,48 4,41 2,2 2,2 T-Value = 4,44 P-Value = 0,004 DF = Bảng Bảng phân tích phương sai khả phân hủy Chlorpyrifos ethyl dòng PH C4.3 N Mean StDev SE Mean ĐC 30 ngày 100,00 4,48 2,2 PH C4.3 50,28 9,02 4,5 T-Value = 9,88 P-Value = 0,000 DF = viii ... Health Organization vi Nguyễn Thị Anh Thư, 2014 “PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG? ?? Luận văn... -o0o - NGUYỄN THỊ ANH THƯ PHÂN LẬP VI KHUẨN PHÂN HỦY THUỐC TRỪ SÂU GỐC LÂN HỮU CƠ CHLORPYRIFOS ETHYL TỪ ĐẤT CANH TÁC LÚA TẠI MỘT SỐ TỈNH Ở ĐỒNG BẰNG SÔNG CỬU LONG LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI... dẫn khoa học: Ts Dương Minh Vi? ??n TÓM LƯỢC Đề tài ? ?Phân lập vi khuẩn phân hủy thuốc trừ sâu gốc lân hữu Chlorpyrifos ethyl từ đất canh tác lúa số tỉnh Đồng sông Cửu Long? ?? thực với mục tiêu: (1)