BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------- ---------- TRẦN VŨ HẰNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TRONG BẢO TỒN NGUỒN GEN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ NỘI, 2015 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ NÔNG NGHIỆP VÀ PTNT HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM ---------- ---------- TRẦN VŨ HẰNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TRONG BẢO TỒN NGUỒN GEN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ SỐ : 60.62.01.10 NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS.TS. VŨ VĂN LIẾT HÀ NỘI, 2015 LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu tôi. Số liệu kết nghiên cứu trung thực chưa sử dụng luận văn, luận án nào. Tôi xin cam đoan giúp đỡ cho việc thực luận văn cám ơn thông tin trích dẫn luận văn rõ nguồn gốc. Hà Nội, ngày …. tháng …. năm … Học viên thực Trần Vũ Hằng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page i LỜI CẢM ƠN Để hoàn thành luận văn tốt nghiệp cố gắng nỗ lực thân có bảo tận tình thầy cô giáo động viên giúp đỡ tổ chức tập thể, gia đình, bạn bè. Lời đầu tiên, xin bày tỏ lòng kính trọng lòng biết ơn sâu sắc đến toàn thể gia đình thầy giáo GS.TS Vũ Văn Liết, cô giáo PGS.TS Hà Thị Thuý – giảng viên khoa Nông học, Học viện Nông nghiệp Việt Nam tận tình hướng dẫn, đóng góp ý kiến quý báu, động viên giúp đỡ suốt trình làm luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới thầy, cô giáo khoa Nông học thầy cô giáo Học viện Nông nghiệp Việt Nam trang bị cho nhiều kiến thức, kỹ để hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Tôi xin chân thành cảm ơn cán bộ, công nhân viên Phòng Thí nghiệm trọng điểm Quốc gia công nghệ tế bào thực vật - VIện Di truyên Nông nghiệp tạo điều kiện sở vật chất, chia sẻ nhiều kinh nghiệm quý báu để thực hoàn thành tốt đề tài tốt nghiệp giao. Cuối xin bày tỏ lòng cảm ơn sâu sắc tới toàn thể gia đình, bạn bè động viên tạo điều kiện cho để hoàn thành luận văn tốt nghiệp mình. Một lần xin chân thành cảm ơn! Ngày . tháng . năm . Tác giả luận văn Trần Vũ Hằng Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page ii MỤC LỤC Lời cam đoan i Lời cảm ơn ii Mục lục iii Danh mục viết tắt . v Danh mục bảng . vi Danh mục biểu đồ . ix MỞ ĐẦU . 1.1 Đặt vấn đề 1.2 Mục đích yêu cầu . 1.2.1 Mục đích . 1.2.2 Yêu cầu 1.3 Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài . 1.3.1 Ý nghĩa khoa học . 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn Chương 1: TỔNG QUAN TÀI LIỆU . 1.1 Giới thiệu chung nguồn gen thực vật . 1.1.1 Vai trò giá trị nguồn gen thực vật 1.2 Phương pháp bảo tồn nguồn gen thực vật . 1.2.1 Bảo tồn nội vi (in-situ): 1.2.2 Bảo tồn ngoại vi (ex-situ): . 1.2.3 Bảo tồn in-vitro 1.3 Tình hình nghiên cứu bảo tồn gen thực vật . 12 1.3.1 Tình hình nghiên cứu bảo tồn gen thực vật Thế giới 12 1.3.2 Tình hình nghiên cứu bảo tồn gen thực vật Việt Nam 13 1.3.3 Bảo tồn nguồn gen cam quýt in vitro 25 Chương 2: ĐỐI TƯỢNG, VẬT LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU . 28 2.1. Vật liệu nghiên cứu . 28 2.2 Nội dung nghiên cứu 29 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iii 2.3 Phương pháp nghiên cứu 29 2.3.1 Thu thập khử trùng vật liệu nuôi cấy in vitro 29 2.3.2 Thí nghiệm xác định môi trường phù hợp tạo chồi in vitro . 29 2.3.3 Thí nghiệm tìm hiểu môi trường phù hợp tái sinh 31 2.3.4 Xác định điều kiện nuôi cấy chất làm chậm sinh trưởng phù hợp đưa vào bảo tồn . 32 Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 35 3.1 Thu thập khử trùng vật liệu nuôi cấy Invitro 35 3.2 Thí nghiệm xác định môi trường phù hợp tạo chồi in vitro . 39 3.2.1 Ảnh hưởng BAP đến khả nhân nhanh chồi in vitrro . 39 3.2.2 Xác định nồng độ NAA đến khả tạo rễ giống ăn có múi . 51 3.3 Xác định điều kiện nuôi cấy chất làm chậm sinh trưởng phù hợp đưa vào bảo tồn 61 3.3.1 Xác định điều kiện nuôi cấy giống ăn có múi . 61 3.3.2 Xác định hóa chất ảnh hưởng đến bảo tồn in vitrro . 70 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 92 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page iv DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT AQ Ăn CN Công nghiệp CQML Cơ quan mạng lưới NHG Ngân hàng gen NG Nguồn gen TAGS Thức ăn gia súc TNDTTV Tài nguyên di truyền thực vật TB Trung bình Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page v DANH MỤC BẢNG STT Tên bảng Trang 1.1 So sánh bảo tồn nội vi bảo tồn ngoại vi 1.2 Kết điều tra, kiểm kê, thu nhập nội nguồn gen 14 1.3 Lưu giữ nguồn gen giai đoạn 2010- 2014 . 14 1.4 Kết nhân giống nguồn gen giai đoạn 2010 – 2014 . 17 1.5 Kết đánh giá nguồn gen giai đoạn 2010-2014 18 1.6 Kêt đánh giá nguồn gen tính đến tháng 6/2014 18 1.7 Kết cập nhật sở liệu thông tin tài nguyên thực vật 19 1.8 Kết cấp phát nguồn gen . 20 3.1 Xác định chất khử trùng thời gian khử trùng . 36 3.2 Ảnh hưởng BAP đến tỷ lệ nhân chồi nhóm giống ăn có múi theo công thức 40 3.3 Ảnh hưởng BAP đến tỷ lệ nhân chồi nhóm giống ăn có múi theo công thức 42 3.4 Ảnh hưởng BAP đến tỷ lệ nhân chồi nhóm giống ăn có múi theo công thức 44 3.5 Ảnh hưởng BAP đến tỷ lệ nhân chồi nhóm giống ăn có múi theo công thức 46 3.6 Ảnh hưởng BAP đến tỷ lệ nhân chồi nhóm giống ăn có múi theo công thức 48 3.7 Ảnh hưởng BAP đến tỷ lệ nhân chồi nhóm ăn có múi theo công thức . 49 3.8 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Invitro nhóm giống ăn có múi theo công thức . 52 3.9 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Invitro nhóm giống ăn có múi theo công thức . 54 3.10 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Invitro nhóm giống ăn có múi theo công thức 55 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vi 3.11 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Invitro nhóm giống ăn có múi theo công thức 56 3.12 Ảnh hưởng NAA đến khả rễ chồi Invitro nhóm giống ăn có múi theo công thức 58 3.13 Ảnh hưởng NAA đến khả rế chồi Invitro nhóm giống ăn có múi theo công thức 59 3.14 Ảnh hưởng nhiệt độ ánh sáng đến khả nuôi cấy bảo tồn in vitrro nhóm giống ăn có múi theo công thức . 62 3.15 Ảnh hưởng nhiệt độ ánh sáng đến khả nuôi cấy bảo tồn Invitro nhóm giống ăn có múi theo công thức . 63 3.16 Ảnh hưởng nhiệt độ ánh sáng đến khả nuôi cấy bảo tổn Invitro nhóm giống ăn có múi theo công thức . 64 3.17 Ảnh hưởng nhiệt độ ánh sáng đến khả nuôi cấy bảo tồn Invitro nhóm ăn có múi theo công thức . 66 3.18 Ảnh hưởng nhiệt độ ánh sáng đến khả nuôi cấy bảo tồn Invitro nhóm ăn có múi theo công thức . 67 3.19 Động thái sinh trưởng sau xử lý môi trường ánh sáng nhiệt độ theo công thức . 69 3.20 Ảnh hưởng nồng độ săt 138 đến trình làm chậm sinh trưởng giống ăn có múi cần bảo tồn theo công thức 71 3.21 Ảnh hưởng nồng độ sắt 138 đến trình làm chậm sinh trưởng giống ăn có múi cần bảo tồn theo công thức 72 3.22 Ảnh hưởng nồng độ sắt 138 đến trình làm chậm sinh trưởng giống ăn có múi cần bảo tồn theo công thức 74 3.23 Ảnh hưởng nồng độ sắt 138 đến trình làm chậm sinh trưởng giống ăn có múi cần bảo tồn theo công thức 76 3.24 Ảnh hưởng nồng độ sắt 138 đến trình làm chậm sinh trưởng giống ăn có múi cần bảo tồn theo công thức 77 3.25 Ảnh hưởng nồng độ sắt 138 đến trình làm chậm sinh trưởng giống ăn có múi cần bảo tồn theo công thức 79 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page vii 3.26 Động thái sinh trưởng sau xử lý qua môi trường sắt 138 80 3.27: Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức 82 3.28 Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức 84 3.29 Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức 85 3.30 Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bào tồn Invitro ăn có múi theo công thức 87 3.31 Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức 88 3.32 Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức 89 3.33 Động thái sinh trưởng sau xử lý qua môi trường có dung dịch ABA 91 Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page viii Biểu đồ 3.4. Ảnh hưởng nồng độ sắt 138 đến trình làm chậm sinh trưởng giống ăn có múi Từ thí nghiệm cho thấy tỷ lệ sống giống cao nông độ sắt 138 khác nhau. Tuy nhiên giống chủ yếu phát triển ổn định nồng độ sắt 138 (200mg/l) xanh rễ khỏe phát triển ổn định. Dựa vào lý thuyết, nồng độ tăng lên mức cao hiên tượng héo, rụng đi, rễ hóa nâu, chết phát triển không ổn định. Bảng 3.26. Động thái sinh trưởng sau xử lý qua môi trường sắt 138 Thời gian tháng tháng Công Công Công Công Công Công thức thức thức thức thức thức Cây phát triển tốt 31,2 37,4 21,3 12,5 21,3 Cây chết 41,0 38,1 18,6 51,6 63,9 Cây giữ nguyên 27,8 34,5 70,1 36,9 14,8 Cây phát triển tốt 30,1 42,3 19,0 23,9 17,6 Cây chết 52,3 40,2 25,3 23,9 72,3 Điều kiện xem xét Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 80 Cây giữ nguyên 17,6 17,5 65,7 59,2 10,1 Sau tiến hành theo dõi động thái sinh trưởng mẫu giống xử lý qua môi trường có dung dịch sắt 138 cho thấy: Công thức nồng độ sắt 138 200mg/lít công thức tốt cho bảo tồn Invitro với tỷ lệ giữ nguyên 65,7%. CT1 CT2 CT3 CT4 CT5 Hình 3.3. Một số hình ảnh biểu ổn định phát triển giống qua nồng độ sắt 138 3.3.2.2. Xác định nồng độ ABA đến trình làm chậm sinh trưởng lên giống ăn có múi. ABA chất điều hòa sinh trưởng làm ức chế tế bào mô phát triển. Ở số có tượng rụng phun ABA với nồng độ cao lên trước thu hoạch. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 81 Bảng 3.27. Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức Giống Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB cây/bình (cm) Số TB Số rễ TB Chất cây/bình cây/bình lượng G1 56,5 3,5 4,0 4,5 ++ G2 52,5 3,5 4,0 5,5 +++ G3 45,8 3,9 4,5 4,5 ++ G4 48,5 4,2 3,8 4,0 ++ G5 47,5 4,5 3,7 4,5 +++ G6 55,0 4,0 3,2 4,5 ++ G7 54,2 3,5 4,0 5,0 +++ G8 56,3 4,1 3,6 4,5 ++ G9 56,5 4,5 4,0 4,5 +++ G10 57,7 4,3 4,5 4,0 ++ G11 56,5 4,3 3,8 4,1 ++ G12 52,5 3,8 3,5 4,1 ++ G13 46,6 3,5 3,2 4,0 ++ G14 50,3 4,1 3,0 3,8 ++ G15 33,5 4,3 3,3 4,0 +++ G16 44,2 3,9 3,2 3,5 ++ G17 55,3 4,1 3,0 5,0 ++ G18 42,6 4,5 3,5 3,7 ++ G19 31,5 4,5 4,5 4,5 +++ G20 43,2 3,8 3,7 4,0 ++ CV % 4.4 4.5 4.4 4.5 Ghi chú: ++ Cây bị héo, rụng, rễ hoá nâu, phát triển không ổn định, nhiều bị chết; +++ Cây phát triển ổn định, xanh, rễ tốt Công thức thí nghiệm điều kiện: ½ MS + 10g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + ppm ABA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 82 Thí nghiệm không sử dụng ABA cho thấy tỷ lệ sống trung bình 20 mẫu giống 49,34%. Mẫu có tỷ lệ sống cao mẫu G10 với tỷ lệ sống 57,7%. Mẫu có tỷ lệ sống thấp mẫu G19 tỷ lệ sống đạt 31,5%. Chiều cao trung bình mẫu thí nghiệm đạt 4,04 cm. Mẫu có chiều cao trung bình cây/bình cao mẫu G5, G9, G18, G19 với chiều cao trung bình 4,5cm. Mẫu có chiều cao trung bình cây/bình thấp mẫu G1, G2, G7, G13 với chiều cao trung bình 3,5cm. Số trung bình 20 mẫu giống thí nghiệm 3,7 lá. Mẫu có số trung bình lớn mẫu G3, G10, G19 với số trung bình 4,5 lá. Mẫu có số trung bình thấp mẫu G14, G17 với số trung bình lá. Chất lượng không cao, phát triển không ổn định. Công thức thí nghiệm điều kiện: ½ MS + 10g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 20 ppm ABA. Khi môi trường thí nghiệm có thêm ABA tỷ lệ sống tăng lên thành 55,38%. Trong mẫu có tỷ lệ sống cao mẫu G7 với tỷ lệ sống 69,5%. Mẫu có tỷ lệ sống thấp mẫu G3, G16 với tỷ lệ sống đạt 47,5%. Chiểu cao trung bình 20 mẫu giống thí nghiệm đạt 4,05 cm. Số trung bình cây/bình 3,69 lá. Chất lượng tốt môi trưởng ABA, chủ yếu khoẻ, xanh, rễ có nhiều lông tơ, phát triển ổn định. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 83 Bảng 3.28. Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức Giống Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB cây/bình (cm) Số TB Số rễ TB Chất cây/bình cây/bình lượng G1 52,2 4,0 4,5 4,5 ++ G2 55,9 3,5 4,0 5,5 +++ G3 47,5 3,5 4,5 4,5 +++ G4 52,4 4,0 3,7 4,0 ++ G5 55,6 4,5 3,5 4,5 ++ G6 63,4 4,6 3,5 5,0 +++ G7 69,5 4,2 4,0 5,0 +++ G8 50,4 5,0 3,5 4,5 ++ G9 59,8 4,0 3,5 4,5 +++ G10 59,6 3,5 4,0 3,5 ++ G11 53,4 5,0 4,0 4,5 +++ G12 54,5 3,0 3,5 3,0 ++ G13 57,9 4,0 4,0 5,0 +++ G14 55,5 4,2 3,5 3,5 ++ G15 54,4 5,0 4,0 4,0 ++ G16 52,2 3,5 3,5 4,5 +++ G17 47,5 3,0 3,0 3,0 ++ G18 56,1 4,5 3,0 4,0 ++ G19 55,3 4,0 3,0 4,5 +++ G20 54,5 4,0 3,5 4,5 +++ CV % 4.6 4.3 4.5 4.3 Ghi chú: ++ Cây bị héo, rụng, rễ hoá nâu, phát triển không ổn định, nhiều bị chết; +++ Cây phát triển ổn định, xanh, rễ tốt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 84 Bảng 3.29. Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức Giống Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB cây/bình (cm) Số TB Số rễ TB Chất cây/bình cây/bình lượng G1 67,5 3,8 4,0 4,5 +++ G2 75,5 3,5 4,0 5,5 +++ G3 68,9 4,2 4,5 4,5 +++ G4 64,5 4,3 3,5 4,0 ++ G5 69,4 4,5 3,5 4,5 +++ G6 65,5 3,0 4,5 4,5 +++ G7 76,4 4,5 3,5 5,0 +++ G8 70,7 4,0 4,5 4,5 +++ G9 65,4 3,5 4,0 4,5 +++ G10 78,3 4,2 3,5 4,0 +++ G11 67,6 3,5 3,0 4,3 +++ G12 70,4 4,1 3,5 4,0 ++ G13 69,5 3,5 3,0 4,2 +++ G14 62,5 4,0 3,5 3,5 ++ G15 69,5 4,0 4,5 4,2 +++ G16 62,3 4,2 4,0 3,5 ++ G17 74,3 4,2 3,5 3,5 ++ G18 78,6 4,0 4,5 4,0 +++ G19 79,4 3,8 3,0 4,2 +++ G20 62,5 4,0 3,0 4,2 +++ CV % 4.2 4.2 4.2 4.5 Ghi chú: ++ Cây bị héo, rụng, rễ hoá nâu, phát triển không ổn định, nhiều bị chết; +++ Cây phát triển ổn định, xanh, rễ tốt Công thức thực điều kiện môi trường: ½ MS + 10g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 40 ppm ABA. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 85 Thí nghiệm cho thấy, là môi trường lý tưởng cho sinh trưởng phát triển, có tỷ lệ sống cao thí nghiệm đạt 69,94%. Mẫu có tỷ lệ sống cao mẫu G19 với tỷ lệ sống 79,4%. Mẫu có tỷ lệ sống thấp mẫu G15 đạt 62,3%. Chiều cao trung bình mẫu thí nghiệm 3,94cm. Số trung bình đạt 3,75cm, có mẫu có số trung bình cây/bình lá, lại mẫu có số lớn lá. Số rễ trung bình cây/bình 4,26 rễ, có mẫu có số rễ rễ. Kết nhận từ thí nghiệm cho thấy chất lượng tốt, phát triển ổn định rễ có nhiều lông tơ. Thí nghiệm thí nghiệm điều kiện: ½ MS + 10g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 50 ppm ABA. Khi tăng nồng độ ABA lên thành 50 ppm cho thấy tỷ lệ sống cao lên mà tỷ lệ sống giảm mạnh. Tỷ lệ sống thí nghiệm đạt 33,06%. Mẫu có tỷ lệ sống cao mẫu G1 với tỷ lệ 49,4%. Mẫu có tỷ lệ sống thấp mẫu G9 đạt 23,4% tỷ lệ sống. Chiều cao trung bình mẫu thí nghiệm đạt 3,49 cm thí nghiệm có chiều cao trung bình mẫu giống thấp thí nghiệm. Mẫu có chiều cao trung bình cây/bình thấp mẫu G4, G9,G19, G20 với chiều cao trung bình đạt cm. Mẫu G10 mẫu có chiều cao trung bình cây/bình cao nhất, đạt 4,5cm. Chất lượng thí nghiệm không cao, phát triển không ổn định rễ hoá nâu, bị rụng nhiều. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 86 Bảng 3.30. Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bào tồn Invitro ăn có múi theo công thức Giống Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB cây/bình (cm) Số TB Số rễ TB Chất cây/bình cây/bình lượng G1 49,4 3,5 3,0 4,5 ++ G2 26,7 3,5 3,0 5,5 +++ G3 25,4 3,0 3,0 4,5 ++ G4 26,2 3,0 3,0 4,0 ++ G5 37,5 4,2 2,0 4,5 ++ G6 35,3 3,0 2,5 4,5 ++ G7 34,4 3,5 3,5 4,0 ++ G8 30,5 3,1 2,0 4,5 +++ G9 23,4 3,0 2,0 4,5 ++ G10 26,4 4,5 2,0 4,0 ++ G11 35,1 3,2 2,5 4,2 ++ G12 37,4 3,2 2,5 4,5 +++ G13 34,2 3,5 2,5 3,0 ++ G14 32,0 3,8 1,5 3,5 ++ G15 36,1 4,3 2,0 3,0 ++ G16 32,4 3,7 1,5 4,5 ++ G17 34,8 4,3 2,2 4,0 ++ G18 32,1 3,5 2,0 4,5 +++ G19 36,8 3,0 1,0 3,0 ++ G20 35,1 3,0 2,0 4,2 ++ CV % 4.5 4.4 4.7 4.6 Ghi chú: ++ Cây bị héo, rụng, rễ hoá nâu, phát triển không ổn định, nhiều bị chết; +++ Cây phát triển ổn định, xanh, rễ tốt Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 87 Bảng 3.31. Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức Giống Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB cây/bình (cm) Số TB Số rễ TB Chất cây/bình cây/bình lượng G1 20 3,5 1,5 4,5 + G2 1,2 3,5 1,0 5,5 ++ G3 10,5 4,0 2,0 4,5 ++ G4 12,5 4,0 1,5 4,0 + G5 12,4 4,0 1,0 4,5 + G6 1,6 4,0 1,5 4,5 ++ G7 7,9 4,0 2,0 5,0 + G8 10,2 4,0 1,0 4,5 + G9 8.5 4,0 1,0 4,5 ++ G10 13,6 4,0 1,0 4,0 + G11 16,3 4,0 1,4 4,0 + G12 16,8 4,0 1,5 4,0 + G13 9,7 4,0 1,0 4,0 + G14 8,9 4,0 1,0 4,0 ++ G15 13,5 4,0 1,5 4,0 ++ G16 23,5 4,0 0,5 4,0 + G17 19,5 4,0 1,5 4,0 + G18 21,5 4,0 1,5 4,0 + G19 10,5 4,0 1,5 4,0 ++ G20 17,5 4,0 1,5 4,0 + CV % 4.3 4.6 4.6 4.4 Ghi chú: + Rễ bị hoá nâu, rụng chết; ++ Cây bị héo, rụng, rễ hoá nâu, phát triển không ổn định, nhiều chết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 88 Bảng 3.32. Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi theo công thức Giống Tỷ lệ sống (%) Chiều cao TB cây/bình (cm) Số TB Số rễ TB Chất cây/bình cây/bình lượng G1 3,5 4,5 + G2 3,5 5,5 + G3 4,0 4,5 + G4 4,5 4,0 + G5 4,0 4,5 + G6 4,2 4,0 + G7 3,5 4,0 + G8 4,0 4,5 + G9 4,5 4,5 + G10 4,5 4,0 + G11 3,5 4,2 + G12 4,2 4,2 + G13 3,8 4,3 + G14 3,5 4,0 + G15 3,0 4,0 + G16 4,0 4,1 + G17 3,5 4,2 + G18 4,5 4,2 + G19 4,5 4,0 + G20 4,0 4,0 + CV % 4.1 4.1 Ghi chú:+ Rễ bị hoá nâu, rụng chết Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 89 Công thức thí nghiệm điều kiện: ½ MS + 10g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 60 ppm ABA. Công thức có 12,81% số sống được, qua cho thấy chất lượng không tốt, bị héo, rụng sau bị chết. Công thức công thức thực môi trường: ½ MS + 10g đường Sacharose/l + 6g Agar/l + 70 ppm ABA. Khi tăng nông độ ABA lên thành 70ppm 20 mẫu giống thí nghiệm chết, rụng hết, rễ bị hoá nâu. Biểu đồ 3.5. Ảnh hưởng ABA đến khả làm chậm sinh trưởng bảo tồn Invitro ăn có múi Từ thí nghiệm kết qủa cho thấy với nồng độ từ (0 – 40ppm) có tỷ lệ sống cao, khỏe, xanh, rễ khỏe, phát triển ổn định. Khi nồng độ tăng dần lên 70ppm có tượng héo, rụng, rễ hóa nâu, chết, phát triển không ổn định. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 90 Bảng 3.33. Động thái sinh trưởng sau xử lý qua môi trường có dung dịch ABA Thời Công Công Công Công Công Công thức thức thức thức thức thức Cây phát triển tốt 28,5 31,2 26,3 20,3 11,2 Cây chết 37,2 37,5 23,7 41,3 60,3 Cây giữ nguyên 44,3 31,3 60,0 38,4 28,5 Cây phát triển tốt 21,2 38,7 21,5 24,7 12,5 Cây chết 43,5 40,1 22,7 50,3 71,3 Cây giữ nguyên 35,3 21,2 56,8 26,0 26,2 Điều kiện xem xét gian tháng tháng Qua bảng 3.33 cho thấy công thức với nồng độ ABA 40ppm cho kết tốt nhất. Biểu đồ 3.6. Động thái sinh trưởng thời gian tháng mẫu giống xử lý môi trường có ABA Biểu đồ số 3.6 cho thấy công thức công thức có nhiều giữ nguyên trạng sau tháng theo dõi. Tuy nhiên để xét đến tỷ lệ giữ nguyên trạng thái tốt công thức đảm bảo khả giữ nguyên trạng thái thời gian trung hạn thực bảo tồn Invitro. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 91 Kết từ chạy phần mềm Irristat cho thấy CV thí nghiệm 4,8%. Khi so sánh mức CV cho thấy thí nghiệm chấp nhận. Hình .4: Một số hình ảnh biểu ổn định phát triển giống qua nồng độ ABA Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 92 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ Kêt luận Hiện việc bảo tồn nguồn gen đặc biệt quan tâm, chưa mang lại hiệu mong muốn, số giống đứng trước nguy tuyệt chủng. Bởi tiến hành thí nghiệm nhằm tìm môi trường bảo tồn lý tưởng cho 20 mẫu giống loại ăn có múi. Chúng rút số kết luận sau: Để xác định môi trường tốt cho bảo tồn nguồn gen tiến hành 32 thí nghiệm, xác định chất khử trùng, thời gian khử trừng, môi trường phù hợp tạo chồi Invitro, ảnh hưởng dung dịch BAP, NAA, ABA, nhiệt độ, ánh sáng nồng độ sắt 138 đến khả tạo rễ, khả nuôi cấy trinh làm chậm sinh trưởng 20 mẫu giống ăn có múi. Từ thí nhiệm xác đinh môi trường phù hợp cho nuôi cấy bảo tồn phương pháp Invitro 20 mẫu giống thí nghiệm: - Chất khử trùng: dung dịch HgCl2 0,1%; thời gian khử trùng: 10 phút - Môi trường phù hợp tạo chồi Invitro: + Xác định nồng độ BAP tốt cho khả nhân nhanh chồi Invitro: MS + 30 g đường sacharose/l + 6g/l Agar + 1mg BAP/l + Xác định nồng độ NAA tốt cho khả tạp rễ Invitro: MS +30 g đường sacharose/l + 6g/l Agar + 1mg BAP/l +3mg NAA/l. - Xác định điều kiện nuôi cấy chất làm chậm sinh trưởng phù hợp đưa vào bảo tồn giống cần bảo tồn: + Xác định nhiệt độ ánh sáng tốt cho khả nuôi cấy bảo tồn Invitro: Ánh sáng tối + Nhiệt độ 150C + Xác định nồng độ sắt 138 tốt cho trình làm chậm sinh trưởng: ½ MS + 10g/l đường Sacharose + 6g/l Agar + 200mg/l sắt 138. + Xác định nồng độ ABA tốt cho trình làm chậm sinh trưởng lên giống ăn có múi: ½ MS + 10g/l đường Sacharose + 6g/l Agar + 40ppm ABA. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 93 Kiến nghị Đề nghị đưa vào ứng dụng bảo tồn in vitrro giống ăn có múi viêt Nam. Nhằm bảo tồn giống quý, giống bệnh. Tạo nguồn gen phong phú, phục vụ cho việc nhân giống ăn có múi Việt Nam. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 94 TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Võ Văn Chi (1997). Từ điển Cây thuốc Việt nam. 2. Phạm Hoàng Hộ (1991 - 1993). Cây cỏ Việt nam, I - III, Montreal, Canada. 3. Lã Tuấn Nghĩa ,Hoàng Thị Huệ (2013). Ứng dụng công nghệ sinh học bảo tồn thực vật nông nghiệp Việt Nam. 4. Vũ Văn Liết (2009). Giáo trình quỹ gen bảo tồn quỹ gen. 5. Vũ Đăng Toàn Cộng (2014). Kết bào tồn tài nguyên thực vật giai đoạn 20102014. 6. Đỗ Năng Vịnh (2008). Cây ăn có múi, Công nghệ sinh học. 7. Marin M.L. and N. Duran-Vila (1991). Conservation of Citrus Germplasm in Vitro.J. amer.soc.hort.sci.116(4):740-746. 8. Withers L. A (1998). Engelmann F. In vitro conservation of plant genetic resources. In: Altman A. (ed) Biotechnology in agriculture. Marcel Dekker, New York, pp 57–88. 11. Van Le B., Thanh Ha N., Anh Hong L.T. and Tran Thanh Van K. (1999). High frequency shoot regeneration from trifoliate orange (Poncirus trifoliata L. Raf.) using the thin cell layer method. Comptes Rendus Acad Sci Paris, Life Sciences 322:11056-11111. 12. Murashige. T and D.P. H. Tucker (1996). Growth factor requirements of citrus tissue cullture, Proc. 1ST Int. Citrus symp. 3, 1155 -1161Starrantino. A and F. Russo.1980. Seedling from undeveloped ovules of ripe fruit of polyembryonic citrus cultivars. Horst. Science.15. 296- 297. 13. Hull, R. (2004). Plant Virology. 4th Ed. Reed Elsevier India Pvt. Ltd. 1001p . 14. Murashige T. and Skoog F. (1962); “A revised medium for rapid growth and bioassays with tabacco tissue cultures”. Physiol. Plant, 15: 473 -497. Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 95 [...]... Mục đích Nghiên cứu kỹ thuật nuôi cấy in vitro để bảo tồn nguồn gen cây ăn quả có múi ở Việt Nam nhằm bảo tồn đa dạng nguồn tài nguyên di truyền phục vụ chọn tạo giống và sản xuất cây ăn quả có múi ở Việt Nam 1.2.2 Yêu cầu - Xác định vật liệu đưa vào nuôi cấy bảo tồn phù hợp nhất đối với nguồn gen cây ăn quả có múi đang có ở Viện Di truyền Nông nghiệp - Xác định môi trường nuôi cấy phù hợp với cam... trì nguồn gen quý, nhưng hiệu quả chưa cao, chưa đồng bộ Bên cạnh đó pháp luật về bảo tồn chưa phát huy tác dụng, còn gây nhiều lúng túng cho các cơ quan nghiên cứu, làm công tác bảo tồn Xuất phát từ những lí do trên, chúng tôi tiến hành nghiên cứu: Ứng dụng kỹ thuật nuôi cấy mô trong bảo tồn nguồn gen cây ăn quả có múi ở Việt Nam ” Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp... trồng hạt phản ứng với làm khô và cây cây nhân giống vô tính của vùng nhiệt đới và ôn đới (Carlos Alberto Cruz-Cruz et al, 2013) Bảo tồn nguồn gen cây ăn quả có múi cần có sự tiếp cận tổng hợp bảo tồn In situ và Ex situ, để duy trì nguồn vật liệu di truyền sạch bệnh, bảo tồn in vivo với nguồn gen cây ăn quả có múi rất khó khăn vì nó dễ tái nhiễm Một số loài trong nguồn tài nguyên di truyền cây họ cam quýt,... gồm các giống cây trồng vật nuôi, giống cải tiến, giống địa phương 1.3 Phương pháp bảo tồn nguồn gen thực vật Có nhiều phương pháp để bảo tồn và quản lý nguồn gen nói chung và nguồn gen thực vật nói riêng, trong đó thường sử dụng các phương pháp như bảo tồn nội vi, bảo tồn ngoại vi, bảo tồn invitro,… Các bước chủ yếu của bảo tồn nguồn gen thực vật Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa... dạy và ứng dụng trong kỹ thuật bảo tồn nguồn gen cây ăn quả có múi invitro 1.3.2 Ý nghĩa thực tiễn - Đề xuất phương pháp bảo tồn nguồn gen một số giống cam quýt trong điều kiện invitro Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 3 Chương 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 Giới thiệu chung về nguồn gen thực vật Nguồn gen thực vật là một tập hợp vật liệu thực vật làm cơ sở cho cải... Trang 3.1 So sánh kết quả thí nghiệm giữa các công thức thí nghiệm giống cây ăn quả có múi 50 3.2 Ảnh hưởng của NAA đến khả năng ra rễ của chồi Invitro đối với cây ăn quả có múi 60 3.3 Ảnh hưởng của ánh sáng và nhiệt độ đến khả năng nuôi cấy bảo tồn Invitro trên nhóm giống cây ăn quả có múi 68 3.4 Động thái sinh trưởng của mẫu giống sau khi xử lý trong môi trường ánh sáng... có múi phục vụ lưu giữ và khai thác sử dụng ở Việt Nam nói chung và một số vùng miền núi phía Bắc nói riêng, nơi có sự đa dạng cao nguồn gen cây có múi là cấp thiết 1.4.3 Bảo tồn nguồn gen cam quýt in vitro Nghiên cứu đánh giá tiềm năng bảo tồn nguồn gen cam quýt in vitro đã được M.L Marin nghiên cứu từ năm 1991 tại Viện Nông nghiệp Tây Ban Nha Hệ thống nuôi cây mô đước phát triển cho bảo tồn Mô nuôi. .. pháp bảo tồn in vitro đã đóng vai trò quan trọng và đã thành công ở nhiều Quốc gia (Carimi et al, 2001) Việt Nam nằm ở trung tâm phát sinh của rất nhiều giống cây ăn quả có múi (Võ Văn Chi, 1997, Phạm Hoàng Hộ, 1992), cùng với sự phân hoá của độ cao địa hình tạo nên những tiểu vùng sinh thái đa dạng, có thể phát triển được nhiều giống cây ăn quả có múi đặc sản Nguồn gen cây có múi của Việt Nam có thể... công tác bảo tồn gen còn thiếu, chưa đồng bộ Vì vậy một số cây ăn quả quý hiếm ở nước ta đang ứng trước nguy cơ bị mai một 1.4.2.2 Thành tựu đạt được trong bảo tồn nguồn gen thực vật giai đoạn 2010-2014 ở Việt Nam Kết quả cho thấy tổng số nguồn gen thu thập và nhập nội trong những năm vừa qua là 11.234 nguồn gen trong đó thu thập và nhập nội lần lượi là 11046 và 188 nguồn gen Bảng 1.2 Kết quả điều... nguồn gen Qua đó cũng có các chế độ thích hợp nhằm thu hút, đào tạo, sử dụng nguồn nhân lực có trình độ cao cho hoạt động bảo tồn nguồn gen, tăng cường thu hút nguồn đầu tư của xã hội trong việc ứng dụng khoa học kỹ thuật vào khai thác, sử dụng, bảo tồn nguồn gen Đẩy nhanh việc khai thác và phát triển các nguồn gen thành sản phẩm thương mại đối với các nguồn gen có tính trạng quý hiếm, có giá trị kinh tế . thuật nuôi cấy in vitro để bảo tồn nguồn gen cây ăn quả có múi ở Việt Nam nhằm bảo tồn đa dạng nguồn tài nguyên di truyền phục vụ chọn tạo giống và sản xuất cây ăn quả có múi ở Việt Nam. 1.2.2 VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  TRẦN VŨ HẰNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TRONG BẢO TỒN NGUỒN GEN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI Ở VIỆT NAM CHUYÊN NGÀNH : KHOA HỌC CÂY TRỒNG MÃ. HỌC VIỆN NÔNG NGHIỆP VIỆT NAM  TRẦN VŨ HẰNG ỨNG DỤNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ TRONG BẢO TỒN NGUỒN GEN CÂY ĂN QUẢ CÓ MÚI Ở VIỆT NAM LUẬN VĂN THẠC SĨ HÀ