BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SẢN XUẤT POLYSACCHARIDES NGOẠI BÀO VÀ SINH KHỐI NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum) THEO PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHÌM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU Cần Thơ, tháng 05/2014 SINH VIÊN THỰC HIỆN TRẦN VĂN QUÂN MSSV:3102773 LỚP: CNSH K36 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VIỆN NGHIÊN CỨU VÀ PHÁT TRIỂN CÔNG NGHỆ SINH HỌC LUẬN VĂN TỐT NGHIỆP ĐẠI HỌC NGÀNH CÔNG NGHỆ SINH HỌC NGHIÊN CỨU KHẢ NĂNG SẢN XUẤT POLYSACCHARIDES NGOẠI BÀO VÀ SINH KHỐI NẤM LINH CHI (Ganoderma lucidum) THEO PHƯƠNG PHÁP NUÔI CẤY CHÌM CÁN BỘ HƯỚNG DẪN TS. BÙI THỊ MINH DIỆU Cần Thơ, tháng 05/2014 SINH VIÊN THỰC HIỆN TRẦN VĂN QUÂN MSSV:3102773 LỚP: CNSH K36 PHẦN KÝ DUYỆT CÁN BỘ HƯỚNG DẪN Bùi Thị Minh Diệu SINH VIÊN THỰC HIỆN Trần Văn Quân DUYỆT CỦA HỘI ĐỒNG BẢO VỆ LUẬN VĂN ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… ………………………………………………………………………………………… Cần Thơ, ngày tháng năm 2014 CHỦ TỊCH HỘI ĐỒNG LỜI CẢM TẠ Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám Hiệu trường Đại Học Cần Thơ, Ban lãnh đạo Viện Nghiên cứu Phát triển Công nghệ Sinh học – Trường Đại Học Cần Thơ truyền thụ kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi cho học tập, nghiên cứu thực đề tài này. Xin chân thành cảm ơn TS. Bùi Thị Minh Diệu vừa cán hướng dẫn vừa cố vấn học tập tôi. Trong suốt trình học tập cô giúp đỡ, truyền thụ kiến thức, tạo điều kiện thuận lợi để hoàn thành luận văn thông qua việc hỗ trợ kinh phí, hướng dẫn phương pháp nghiên cứu khoa học quan tâm động viên suốt thời gian làm luận văn. Cảm ơn tập thể lớp Công nghệ Sinh học khóa 36, 37 bạn lớp Vi sinh vật học khóa 36 giúp đỡ trình thực luận văn, anh chị cao học khóa 18, 19 nhiệt tình chia sẻ kiến thức kinh nghiệm cho hoàn thành tốt đề tài. Ngoài ra, xin bày tỏ lòng biết ơn, sâu sắc đến gia đình, bạn bè người thân giúp đỡ vật chất lẫn tinh thần suốt trình học tập nghiên cứu thực luận văn tốt nghiệp. Kính chúc quý thầy cô tất bạn sinh viên dồi sức khỏe thành công công việc. Cần thơ, ngày 10 tháng 04 năm 2014. Trần Văn Quân Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT TÓM LƯỢC Nấm Linh chi loại dược liệu quý với tên khoa học Ganoderma lucidum. Chính tiềm dược liệu cao, khả chữa nhiều bệnh nên Linh chi sớm nuôi trồng nhân tạo chất mạc cưa chủ yếu. Mặc dù là, phương pháp nuôi trồng đơn giản thực tế suất thành phần dược tính nấm Linh chi lại phụ thuộc nhiều vào điều kiện nuôi trồng. Để giải vấn đề trên, đề tài “Nghiên cứu khả sản xuất polysaccharides ngoại bào sinh khối nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) theo phương pháp nuôi cấy chìm” thực hiện. Đề tài tập trung khảo sát năm nhân tố ảnh hưởng đến phát triển sinh khối khả tạo plysaccharides ngoại bào (Exoplysachharides - EPSs). Các nhân tố khảo sát với mức sau: Hàm lượng giống (1, 5, 10, 15 hạt), hàm lượng glucose (20 đến 60 g/l), hàm lượng rỉ đường (20 đến 60 g/l), giá trị pH 3,0 đến 7,0, thể tích nuôi cấy (10 đến 40% thể tích bình tam giác 250 ml). Các tiêu theo dõi: khối lượng sinh khối (g/l), khối lượng EPSs (g/l), hàm lượng đường tổng số (%). Kết thí nghiệm thu sau 10 ngày, hàm lượng giống chủng 10 hạt cho khối lượng sinh khối cao 11,01 (g/l) khối lượng EPSs cao 0,129 (g/l). Hàm lượng glucose thích hợp 50 (g/l), cho khối lượng sinh khối 32,5 (g/l), khối lượng EPSs cao đạt 0,213 (g/l) nồng độ glucose 60 (g/l). Khối lượng sinh khối EPSs cao 15,78 (g/l) 0,14 (g/l) nồng độ rỉ đường 60 (g/l). Khối lượng sinh khối cao 7,92 (g/l) pH 3,0 EPSs cao 0.167(g/l) pH 4,0. Ở thể tích nuôi cấy 40% bình tam giác 250ml kết cho khối lượng sinh khối EPSs cao 10,76 (g/l) 0,195 (g/l). Kết nghiên cứu xác định điều kiện nuôi cấy chìm thích hợp cho phát triển sinh khối sản sinh EPSs 10 hạt giống chủng, 50 (g/l) glucose, pH 4,0 thể tích nuôi cấy 40%. Từ khóa: EPSs, Ganoderma lucidum, lên men chìm, sinh khối Chyên ngành Công nghệ Sinh học i Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT MỤC LỤC Trang PHẦN KÝ DUYỆT . LỜI CẢM TẠ TÓM LƯỢC . i MỤC LỤC . ii DANH SÁCH BẢNG vi DANH SÁCH HÌNH vi DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT vii CHƯƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề . 1.1. Mục tiêu đề tài CHƯƠNG 2. LƯỢC KHẢO TÀI LIỆU 2.1. Sơ lược nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) . 2.1.1. Khái quát chung 2.1.2. Phân loại . 2.1.3. Đặc điểm hình thái chu trình sống nấm Linh chi a. Đặc điểm hình thái nấm Linh chi . b. Chu trình sống nấm Linh chi . 2.1.4. Thành phần hóa học dược tính a. Ganoderma polysaccharides (GLPs) b. Ganoderic Acid. c. Ganoderma Adenosine. d. Alcaloid 2.1.5. Quy trình nuôi trồng Linh chi a. Một số phương pháp nuôi trồng phổ biến. . b. Giới thiệu phương pháp nuôi cấy chìm. 2.2. Tình hình nghiên cứu nước. . 2.3. Tình hình nghiên cứu nước 11 CHƯƠNG 3. PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 12 3.1.Phương tiện nghiên cứu . 12 3.1.1. Thời gian địa điểm . 12 Chyên ngành Công nghệ Sinh học ii Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 3.1.2. Dụng cụ, thiết bị . 12 3.1.3. Nguyên liệu 12 3.1.4. Hóa chất 12 3.2. Phương pháp nghiên cứu 12 3.2.1. Quy trình nuôi chung cấy chìm nấm Linh chi thu nhận polysaccharides ngoại bào sinh khối. . 12 3.2.2. Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng giống đến phát triển sinh khối Linh chi hàm lượng polysaccharides ngoại bào. . 13 3.2.3. Khảo sát ảnh hưởng hàm lượng Glucose đến phát triển sinh khối Linh chi hàm lượng polysaccharides ngoại bào. . 14 3.2.4. Khảo sát ảnh hưởng nồng độ rỉ đường đến phát triển sinh khối hàm lượng polysaccharides ngoại bào. . 15 3.2.5. Khảo sát ảnh hưởng pH đến phát triển sinh khối hàm lượng polysaccharides ngoại bào. . 16 3.2.6. Khảo sát ảnh hưởng thể tích nuôi cấy đến phát triển sinh khối hàm lượng polysaccharides ngoại bào. . 16 3.2.6. Phương pháp xác định tiêu 17 3.2.7. Phương pháp xử lý số liệu . 20 CHƯƠNG IV. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 21 5.1. Ảnh hưởng lượng giống đến phát triển sinh khối hàm lượng polysaccharides ngoại bào. 21 5.2. Ảnh hưởng hàm lượng Glucose đến phát triển sinh khối hàm lượng polysaccharides ngoại bào. 22 5.3 Ảnh hưởng nồng độ rỉ đường đến phát triển sinh khối hàm lượng polysaccharides ngoại bào. 24 5.4. Ảnh hưởng pH đến phát triển sinh khối hàm lượng polysaccharides ngoại bào. . 26 5.5. Ảnh hưởng thể tích nuôi cấy đến phát triển sinh khối hàm lượng polysaccharides ngoại bào. 28 V. KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ 31 5.1. Kết luận . 31 Chyên ngành Công nghệ Sinh học iii Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT 5.2. Đề nghị . 31 TÀI LIỆU THAM KHẢO 32 PHỤ LỤC 36 Phụ lục 1. Các hình ảnh thiết bị thí nghiệm. Phụ lục 2. Thành phần môi trường nuôi cấy. Phụ lục 3. Kết thí nghiệm. . Phụ lục 4. Kết xử lý thống kê thí nghiệm hàm lượng giống . Chyên ngành Công nghệ Sinh học iv Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH BẢNG Trang Bảng 1. Thành phần Triterpens Polysaccharides sản phẩm nấm Linh chi thị trường Trung Quốc (Chang and Buswell, 2008 ). Bảng 2. Thành phần đường chuẩn glucose. . 19 Bảng 3. Môi trường nuôi cấy Raper dạng dung dịch (Lê Duy Thắng Trần Văn Minh, 1996) PL2 Bảng 4. Khối lượng sinh khối, thí nghiệm hàm lượng giống. PL3 Bảng 5. Khối lượng EPSs, ảnh hưởng hàm lượng giống. PL3 Bảng 6. Kết đo OD 490nm, ảnh hưởng hàm lượng giống. PL3 Bảng 7. Giá trị hàm lượng đường tổng số, ảnh hưởng hàm lượng giống. . PL3 Bảng 8. Khối lượng sinh khối, ảnh hưởng glucose. . PL3 Bảng 9. Khối lượng EPSs, ảnh hưởng glucose PL3 Bảng 10. Kết đo OD, ảnh hưởng hàm lượng glucose. . PL3 Bảng 11. Hàm lượng đường tổng số, ảnh hưởng glucose PL3 Bảng 12. Khối lượng sinh khối, ảnh hưởng rỉ đường. PL3 Bảng 13. Khối lượng EPSs, ảnh hưởng rỉ đường. PL3 Bảng 14. Giá trị OD, ảnh hưởng rỉ đường. PL3 Bảng 15. Giá trị đường tổng số, ảnh hưởng rỉ đường. . PL3 Bảng 16. Khối lượng sinh khối, ảnh hưởng pH. PL3 Bảng 17. Khối lượng EPSs, ảnh hưởng pH. PL3 Bảng 18. Giá trị OD, ảnh hưởng pH. . PL3 Bảng 19. Đường tổng số, ảnh hưởng pH. PL3 Bảng 20. Khối lượng sinh khối, thể tích nuôi cấy. . PL3 Bảng 21. Khối lượng EPSs, thể tích nuôi cấy. . PL3 Bảng 22. Giá trị OD, thể tích nuôi cấy. . PL3 Bảng 23. Hàm lượng đường tổng số, thể tích nuôi cấy. . PL3 Chyên ngành Công nghệ Sinh học v Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT DANH SÁCH HÌNH Trang Hình 1. Chu trình sống nấm Linh chi (Nguyễn Lân Dũng, 2002). Hình 2. Sơ đồ quy trình trồng Linh chi Đà Lạt (Lê Xuân Thám, 1996 ). . Hình 3. Nuôi cấy chìm sinh khối Linh chi. Hình 4. Quy trình nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi. 13 Hình 5. Quy trình thu nhận sinh khối Linh chi. 17 Hình 6. Quy trình thu nhận EPSs thô. 18 Hình 7. Ảnh hưởng hàm lượng giống đến khối lượng sinh khối. 21 Hình 8. Ảnh hưởng hàm lượng giống đến khối lượng EPSs. . 22 Hình 9. Ảnh hưởng nồng độ glucose đến khối lượng sinh khối. 23 Hình 10. Ảnh hưởng nồng độ glucose đến khối lượng EPSs. 24 Hình 11. Ảnh hưởng hàm lượng rỉ đường đến khối lượng sinh khối . 25 Hình 12. Ảnh hưởng hàm lượng rỉ đường đến khối lượng EPSs. . 26 Hình 13. Ảnh hưởng giá trị pH đến khối lượng sinh khối. . 27 Hình 14. Ảnh hưởng giá trị pH đến khối lượng EPSs. . 28 Hình 15. Ảnh hưởng thể tích nuôi cấy đến khối sinh khối . . 29 Hình 16. Ảnh hưởng thể tích nuôi cấy đến khối lượng EPSs. 29 Hình 16. Một số thiết bị sử dụng thực đề tài. . PL1 Hình17. Một số hình ảnh thí nghiệm trình thực đề tài . PL1 Hình 18. Phương trình đường chuẩn glucose, ảnh hưởng hàm lượng giống. . PL3 Hình 19. Phương trình đường chuẩn glucose, ảnh hưởng nồng độ glucose. PL3 Hình 20. Phương trình đường chuẩn glucose, ảnh hưởng nồng độ rỉ đường. . PL3 Hình 21. Phương trình đường chuẩn glucose, ảnh hưởng giá trị pH. . PL3 Hình 22. Phương trình đường chuẩn glucose,ảnh hưởng thể tich nuôi cấy. . PL3 Chyên ngành Công nghệ Sinh học vi Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT NT1-1 0.161 6.44 NT1-2 0.141 5.64 NT1-3 0.165 6.60 NT2-1 NT2-2 0.363 0.315 7.26 6.30 NT2-3 0.322 6.44 NT3-1 0.616 8.21 NT3-2 0.644 8.58 NT3-3 0.617 8.22 NT4-1 1.055 10.55 NT4-2 1.071 10.71 NT4-3 1.103 11.03 C 6.22 C 6.66 B 8.33 A 10.76 3.5.2. Khối lượng EPSs Bảng 21. Khối lượng EPSs, thể tích nuôi cấy NGHIỆM THỨC NT1-1 NT1-2 NT1-3 NT2-1 NT2-2 NT2-3 NT3-1 NT3-2 NT3-3 NT4-1 NT4-2 NT4-3 KHỐI LƯỢNG EPSs THÔ (g/l) 0.728 0.632 0.600 0.974 0.980 0.840 1.150 1.100 1.082 1.250 1.609 1.945 KHỐI LƯỢNG EPSs (g/l) 0.089 0.077 0.073 0.119 0.119 0.102 0.140 0.134 0.132 0.152 0.196 0.237 EPSs TB(g/l) C 0.079 BC 0.113 B 0.135 A 0.195 3.5.3. Giá trị OD đường chuẩn Bảng 22. Giá trị OD, thể tích nuôi cấy Ống nghiệm Giá trị OD 490nm OD-OD mẫu nước (Mẫu nước ) 0.102 0.208 0.106 0.383 0.281 0.583 0.581 0.848 0.746 1.001 0.899 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT y = .1 9 x - .0 4 R2 = 0.9842 .8 Ốn g n g h iệ m .6 .4 .2 - .2 Giá t r ị OD n m Hình 22. Phương trình đường chuẩn glucose,ảnh hưởng thể tich nuôi c . Giá trị R2 = 0.9842 >0.95, nên phương trình có độ tin cậy cao. 3.5.4. Đường tổng số Bảng 23. Hàm lượng đường tổng số, thể tích nuôi cấy NGHIỆM THỨC GIÁ TRỊ OD 490nm HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG SỐ % HÀM LƯỢNG ĐƯỜNG TỔNG SỐ NT1 0.417 2.4 12.01 NT2 0.46 2.62 13.13 NT3 0.404 2.33 11.67 NT4 0.415 2.39 11.96 TB 0.424 2.43 12.19 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT Phụ lục 4. Kết xử lý thống kê Minitab 16 4.1. Kết xử lý thống kê thí nghiệm hàm lượng giống 4.1.1. One-way ANOVA: NT1, NT2, NT3, NT4 SINH KHỐI, HÀM LƯỢNG GIỐNG Source DF SS MS F P Factor 69.584 23.195 69.84 0.000 Error 2.657 0.332 Total 11 72.241 S = 0.5763 R-Sq = 96.32% R-Sq(adj) = 94.94% Level NT1 NT2 NT3 NT4 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev --------+---------+---------+---------+5.153 0.569 (---*---) 8.747 0.473 (---*---) 11.013 0.503 (---*---) 5.540 0.727 (---*---) --------+---------+---------+---------+6.0 8.0 10.0 12.0 Pooled StDev = 0.576 Grouping Information Using Fisher Method N NT3 NT2 NT4 NT1 3 3 Mean Grouping 11.0133 A 8.7467 B 5.5400 C 5.1533 C Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 82.43% NT1 subtracted from: Lower Center Upper ---------+---------+---------+---------+ NT2 2.5083 3.5933 4.6784 (--*--) NT3 4.7750 5.8600 6.9450 (--*--) NT4 -0.6984 0.3867 1.4717 (--*--) ---------+---------+---------+---------+ -3.5 0.0 3.5 7.0 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT NT2 subtracted from: Lower Center Upper ---------+---------+---------+---------+ NT3 1.1816 2.2667 3.3517 (--*---) NT4 -4.2917 -3.2067 -2.1216 (--*--) ---------+---------+---------+---------+ -3.5 0.0 3.5 7.0 NT3 subtracted from: Lower Center Upper ---------+---------+---------+---------+ NT4 -6.5584 -5.4733 -4.3883 (--*--) ---------+---------+---------+---------+ -3.5 0.0 3.5 7.0 4.1.2. One-way ANOVA: NT1, NT2, NT3, NT4 EPSs, HÀM LƯỢNG GIỐNG Source DF SS MS F P Factor 0.006723 0.002241 11.56 0.003 Error 0.001551 0.000194 Total 11 0.008274 S = 0.01392 R-Sq = 81.26% R-Sq(adj) = 74.23% Level NT1 NT2 NT3 NT4 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---0.12900 0.01277 (-----*-----) 0.09067 0.01401 (-----*-----) 0.06500 0.01493 (------*-----) 0.08000 0.01389 (------*-----) -----+---------+---------+---------+---0.060 0.090 0.120 0.150 Pooled StDev = 0.01392 Grouping Information Using Fisher Method N NT1 NT2 NT4 NT3 3 3 Mean Grouping 0.12900 A 0.09067 B 0.08000 B 0.06500 B Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT Simultaneous confidence level = 82.43% NT1 subtracted from: Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+-----NT2 -0.06455 -0.03833 -0.01212 (-----*------) NT3 -0.09021 -0.06400 -0.03779 (------*------) NT4 -0.07521 -0.04900 -0.02279 (------*-----) ---+---------+---------+---------+------0.080 -0.040 0.000 0.040 NT2 subtracted from: Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+-----NT3 -0.05188 -0.02567 0.00055 (------*-----) NT4 -0.03688 -0.01067 0.01555 (-----*------) ---+---------+---------+---------+------0.080 -0.040 0.000 0.040 NT3 subtracted from: Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+-----NT4 -0.01121 0.01500 0.04121 (------*-----) ---+---------+---------+---------+------0.080 -0.040 0.000 0.040 4.2. Kết xử lý thống kê thí nghiệm hàm lượng glucose 4.2.1. One-way ANOVA: NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 ,SINH KHỐI HÀM LƯỢNG GLUCOSE Source DF SS MS F P Factor 849.93 212.48 36.04 0.000 Error 10 58.95 5.90 Total 14 908.89 S = 2.428 R-Sq = 93.51% R-Sq(adj) = 90.92% Level NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------10.393 1.025 (---*---) 19.247 1.496 (---*---) 23.853 1.253 (---*---) 32.540 1.535 (---*---) 27.367 4.718 (---*---) -+---------+---------+---------+-------8.0 16.0 24.0 32.0 Pooled StDev = 2.428 Grouping Information Using Fisher Method N Mean Grouping Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 NT4 NT5 NT3 NT2 NT1 3 3 Trường ĐHCT 32.540 A 27.367 B 23.853 B 19.247 C 10.393 D Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 75.51% NT1 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT2 4.436 8.853 13.271 (--*---) NT3 9.043 13.460 17.877 (--*---) NT4 17.729 22.147 26.564 (--*---) NT5 12.556 16.973 21.391 (---*---) -----+---------+---------+---------+----12 12 24 NT2 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT3 0.189 4.607 9.024 (---*---) NT4 8.876 13.293 17.711 (---*---) NT5 3.703 8.120 12.537 (---*--) -----+---------+---------+---------+----12 12 24 NT3 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT4 4.269 8.687 13.104 (--*---) NT5 -0.904 3.513 7.931 (---*---) -----+---------+---------+---------+----12 12 24 NT4 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT5 -9.591 -5.173 -0.756 (---*--) -----+---------+---------+---------+----12 12 24 4.2.2. One-way ANOVA: NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 ,EPSs HÀM LƯỢNG GLUCOSE Source DF SS MS F P Factor 0.0547669 0.0136917 728.28 0.000 Error 10 0.0001880 0.0000188 Total 14 0.0549549 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT S = 0.004336 R-Sq = 99.66% R-Sq(adj) = 99.52% Level NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev --+---------+---------+---------+------0.04467 0.00058 (*) 0.10133 0.00306 (*) 0.16200 0.00624 (*-) 0.18200 0.00624 (*-) 0.21367 0.00252 (*) --+---------+---------+---------+------0.050 0.100 0.150 0.200 Pooled StDev = 0.00434 Grouping Information Using Fisher Method N NT5 NT4 NT3 NT2 NT1 Mean Grouping 0.21367 A 0.18200 B 0.16200 C 0.10133 D 0.04467 E Means that not share a letter are significantly different Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 75.51% NT1 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT2 0.04878 0.05667 0.06455 (*) NT3 0.10945 0.11733 0.12522 (*) NT4 0.12945 0.13733 0.14522 (*) NT5 0.16111 0.16900 0.17689 (*) -----+---------+---------+---------+----0.080 0.000 0.080 0.160 NT2 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT3 0.05278 0.06067 0.06855 (*) NT4 0.07278 0.08067 0.08855 (*) NT5 0.10445 0.11233 0.12022 (*) -----+---------+---------+---------+----0.080 0.000 0.080 0.160 NT3 subtracted from: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT4 0.01211 0.02000 0.02789 (* NT5 0.04378 0.05167 0.05955 (*) -----+---------+---------+---------+----0.080 0.000 0.080 0.160 NT4 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT5 0.02378 0.03167 0.03955 (*) -----+---------+---------+---------+----0.080 0.000 0.080 0.160 4.3. Kết xử lý thống kê thí nghiệm hàm lượng rỉ đường. 4.3.1. One-way ANOVA: ĐC, NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 , SINH KHỐI RỈ ĐƯỜNG Source DF SS MS F P Factor 225.575 45.115 136.93 0.000 Error 18 5.930 0.329 Total 23 231.505 S = 0.5740 R-Sq = 97.44% R-Sq(adj) = 96.73% Level ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev --+---------+---------+---------+------12.080 0.492 (-*-) 6.045 0.482 (-*-) 9.355 0.525 (-*-) 11.790 0.523 (-*-) 12.995 0.744 (-*-) 15.915 0.632 (-*-) --+---------+---------+---------+------6.0 9.0 12.0 15.0 Pooled StDev = 0.574 Grouping Information Using Fisher Method N Mean Grouping NT5 15.915 A NT4 12.995 B ĐC 12.080 C NT3 11.790 C NT2 9.355 D NT1 6.045 E Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 67.02% ĐC subtracted from: Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+NT1 -6.888 -6.035 -5.182 (*) NT2 -3.578 -2.725 -1.872 (*-) NT3 -1.143 -0.290 0.563 (-*) NT4 0.062 0.915 1.768 (-*) NT5 2.982 3.835 4.688 (*-) --------+---------+---------+---------+-6.0 0.0 6.0 12.0 NT1 subtracted from: Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+NT2 2.457 3.310 4.163 (-*) NT3 4.892 5.745 6.598 (-*) NT4 6.097 6.950 7.803 (-*) NT5 9.017 9.870 10.723 (*-) --------+---------+---------+---------+-6.0 0.0 6.0 12.0 NT2 subtracted from: Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+NT3 1.582 2.435 3.288 (*) NT4 2.787 3.640 4.493 (*) NT5 5.707 6.560 7.413 (*) --------+---------+---------+---------+-6.0 0.0 6.0 12.0 NT3 subtracted from: Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+NT4 0.352 1.205 2.058 (*) NT5 3.272 4.125 4.978 (-*) --------+---------+---------+---------+-6.0 0.0 6.0 12.0 NT4 subtracted from: Lower Center Upper --------+---------+---------+---------+NT5 2.067 2.920 3.773 (-*) --------+---------+---------+---------+-6.0 0.0 6.0 12.0 4.3.2. One-way ANOVA: ĐC, NT1, NT2, NT3, NT4, NT5 , EPSs RỈ ĐƯỜNG Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT Source DF SS MS F P Factor 0.024397 0.004879 25.38 0.000 Error 12 0.002307 0.000192 Total 17 0.026704 S = 0.01387 R-Sq = 91.36% R-Sq(adj) = 87.76% Level ĐC NT1 NT2 NT3 NT4 NT5 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev ---+---------+---------+---------+-----0.04667 0.01041 (----*----) 0.04300 0.01473 (----*----) 0.06233 0.01405 (----*----) 0.10567 0.01050 (----*----) 0.11433 0.01986 (----*----) 0.14067 0.01124 (----*----) ---+---------+---------+---------+-----0.035 0.070 0.105 0.140 Pooled StDev = 0.01387 Grouping Information Using Fisher Method N Mean Grouping NT5 0.14067 A NT4 0.11433 B NT3 0.10567 B NT2 0.06233 C ĐC 0.04667 C NT1 0.04300 C Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 68.63% ĐC subtracted from: Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+-NT1 -0.02833 -0.00367 0.02100 (--*---) NT2 -0.00900 0.01567 0.04033 (--*---) NT3 0.03433 0.05900 0.08367 (--*---) NT4 0.04300 0.06767 0.09233 (---*--) NT5 0.06933 0.09400 0.11867 (--*---) -------+---------+---------+---------+--0.070 0.000 0.070 0.140 NT1 subtracted from: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+-NT2 -0.00533 0.01933 0.04400 (---*--) NT3 0.03800 0.06267 0.08733 (---*--) NT4 0.04667 0.07133 0.09600 (--*---) NT5 0.07300 0.09767 0.12233 (---*--) -------+---------+---------+---------+--0.070 0.000 0.070 0.140 NT2 subtracted from: Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+-NT3 0.01867 0.04333 0.06800 (--*---) NT4 0.02733 0.05200 0.07667 (--*---) NT5 0.05367 0.07833 0.10300 (--*---) -------+---------+---------+---------+--0.070 0.000 0.070 0.140 NT3 subtracted from: Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+-NT4 -0.01600 0.00867 0.03333 (--*---) NT5 0.01033 0.03500 0.05967 (---*---) -------+---------+---------+---------+--0.070 0.000 0.070 0.140 NT4 subtracted from: Lower Center Upper -------+---------+---------+---------+-NT5 0.00167 0.02633 0.05100 (---*--) -------+---------+---------+---------+--0.070 0.000 0.070 0.140 4.4. Kết xử lý thống kê thí nghiệm pH. 4.4.1. One-way ANOVA: pH3, pH4, pH5, pH6, pH7 SINH KHỐI pH. Source DF SS MS F P Factor 20.100 5.025 17.69 0.000 Error 10 2.840 0.284 Total 14 22.940 S = 0.5329 R-Sq = 87.62% R-Sq(adj) = 82.67% Level pH3 pH4 pH5 pH6 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev -----+---------+---------+---------+---6.3400 0.2600 (-----*-----) 7.9200 0.5381 (-----*-----) 4.9467 0.5308 (----*-----) 4.8733 0.4474 (-----*----) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT pH7 5.2133 0.7622 (----*-----) -----+---------+---------+---------+---4.8 6.0 7.2 8.4 Pooled StDev = 0.5329 Grouping Information Using Fisher Method N pH4 pH3 pH7 pH5 pH6 Mean Grouping 7.9200 A 6.3400 B 5.2133 C 4.9467 C 4.8733 C Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 75.51% pH3 subtracted from: Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+--pH4 0.6105 1.5800 2.5495 (---*---) pH5 -2.3629 -1.3933 -0.4238 (--*---) pH6 -2.4362 -1.4667 -0.4971 (---*---) pH7 -2.0962 -1.1267 -0.1571 (--*---) ------+---------+---------+---------+---2.5 0.0 2.5 5.0 pH4 subtracted from: Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+--pH5 -3.9429 -2.9733 -2.0038 (---*---) pH6 -4.0162 -3.0467 -2.0771 (---*---) pH7 -3.6762 -2.7067 -1.7371 (---*---) ------+---------+---------+---------+---2.5 0.0 2.5 5.0 pH5 subtracted from: Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+--pH6 -1.0429 -0.0733 0.8962 (---*---) pH7 -0.7029 0.2667 1.2362 (---*---) ------+---------+---------+---------+---2.5 0.0 2.5 5.0 pH6 subtracted from: Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+--pH7 -0.6295 0.3400 1.3095 (---*---) ------+---------+---------+---------+---2.5 0.0 2.5 5.0 4.4.2. One-way ANOVA: pH 3, pH4, pH5, pH6, pH7 ,EPSs pH. Source DF SS MS F P Factor 0.018052 0.004513 14.04 0.000 Error 10 0.003213 0.000321 Total 14 0.021265 S = 0.01793 R-Sq = 84.89% R-Sq(adj) = 78.84% Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev Level N Mean StDev -+---------+---------+---------+-------pH 3 0.16733 0.01834 (-----*-----) pH4 0.10233 0.01415 (-----*----) pH5 0.11167 0.02380 (-----*-----) pH6 0.06067 0.00907 (-----*-----) pH7 0.09333 0.02053 (----*-----) -+---------+---------+---------+-------0.040 0.080 0.120 0.160 Pooled StDev = 0.01793 Grouping Information Using Fisher Method N Mean Grouping pH 3 0.16733 A pH5 0.11167 B pH4 0.10233 B pH7 0.09333 B pH6 0.06067 C Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 75.51% pH subtracted from: Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+-----pH4 -0.09761 -0.06500 -0.03239 (----*-----) pH5 -0.08828 -0.05567 -0.02305 (-----*----) pH6 -0.13928 -0.10667 -0.07405 (----*-----) pH7 -0.10661 -0.07400 -0.04139 (-----*----) ---+---------+---------+---------+-----Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 -0.120 -0.060 0.000 Trường ĐHCT 0.060 pH4 subtracted from: Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+-----pH5 -0.02328 0.00933 0.04195 (-----*----) pH6 -0.07428 -0.04167 -0.00905 (----*----) pH7 -0.04161 -0.00900 0.02361 (-----*----) ---+---------+---------+---------+------0.120 -0.060 0.000 0.060 pH5 subtracted from: Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+-----pH6 -0.08361 -0.05100 -0.01839 (----*-----) pH7 -0.05095 -0.01833 0.01428 (----*----) ---+---------+---------+---------+------0.120 -0.060 0.000 0.060 pH6 subtracted from: Lower Center Upper ---+---------+---------+---------+-----pH7 0.00005 0.03267 0.06528 (----*-----) ---+---------+---------+---------+------0.120 -0.060 0.000 0.060 4.5. Kết xử lý thống kê thí nghiệm thể tích nuôi cấy. 4.5.1. One-way ANOVA: NT1, NT2, NT3, NT4 , KHỐI LƯỢNG SINH KHỐI Source DF SS MS F P Factor 38.016 12.672 79.49 0.000 Error 1.275 0.159 Total 11 39.291 S = 0.3993 R-Sq = 96.75% R-Sq(adj) = 95.54% Level NT1 NT2 NT3 NT4 Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev --+---------+---------+---------+------6.227 0.514 (---*--) 6.667 0.519 (--*---) 8.337 0.211 (---*--) 10.763 0.244 (---*--) --+---------+---------+---------+------6.0 7.5 9.0 10.5 Pooled StDev = 0.399 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Trường ĐHCT Grouping Information Using Fisher Method N NT4 NT3 NT2 NT1 3 3 Mean Grouping 10.7633 A 8.3367 B 6.6667 C 6.2267 C Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 82.43% NT1 subtracted from: Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+--NT2 -0.3117 0.4400 1.1917 (-*--) NT3 1.3583 2.1100 2.8617 (-*--) NT4 3.7849 4.5367 5.2884 (-*--) ------+---------+---------+---------+---3.0 0.0 3.0 6.0 NT2 subtracted from: Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+--NT3 0.9183 1.6700 2.4217 (--*-) NT4 3.3449 4.0967 4.8484 (--*-) ------+---------+---------+---------+---3.0 0.0 3.0 6.0 NT3 subtracted from: Lower Center Upper ------+---------+---------+---------+--NT4 1.6749 2.4267 3.1784 (-*--) ------+---------+---------+---------+---3.0 0.0 3.0 6.0 4.5.2. One-way ANOVA: NT1, NT2, NT3, NT4 EPSs, THỂ TÍCH Source DF SS MS F P Factor 0.021186 0.007062 14.19 0.001 Error 0.003980 0.000498 Total 11 0.025166 S = 0.02230 R-Sq = 84.18% R-Sq(adj) = 78.25% Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 -2014 Level NT1 NT2 NT3 NT4 Trường ĐHCT Individual 95% CIs For Mean Based on Pooled StDev N Mean StDev +---------+---------+---------+--------0.07967 0.00833 (-----*-----) 0.11333 0.00981 (-----*-----) 0.13533 0.00416 (-----*-----) 0.19500 0.04251 (-----*-----) +---------+---------+---------+--------0.050 0.100 0.150 0.200 Pooled StDev = 0.02230 Grouping Information Using Fisher Method N NT4 NT3 NT2 NT1 3 3 Mean Grouping 0.19500 A 0.13533 B 0.11333 B C 0.07967 C Means that not share a letter are significantly different. Fisher 95% Individual Confidence Intervals All Pairwise Comparisons Simultaneous confidence level = 82.43% NT1 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT2 -0.00833 0.03367 0.07566 (----*----) NT3 0.01367 0.05567 0.09766 (----*----) NT4 0.07334 0.11533 0.15733 (----*-----) -----+---------+---------+---------+----0.080 0.000 0.080 0.160 NT2 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT3 -0.02000 0.02200 0.06400 (----*----) NT4 0.03967 0.08167 0.12366 (----*----) -----+---------+---------+---------+----0.080 0.000 0.080 0.160 NT3 subtracted from: Lower Center Upper -----+---------+---------+---------+---NT4 0.01767 0.05967 0.10166 (----*-----) -----+---------+---------+---------+----0.080 0.000 0.080 0.160 Chuyên ngành Công nghệ Sinh học Viện NC PT Công Nghệ Sinh học [...]... thì mới thu được năng suất theo ý muốn Vì vậy, luận văn Nghiên cứu khả năng sản xuất polysaccharides ngoại bào và sinh khối nấm Linh chi (Ganoderma lucidum) theo phương pháp nuôi cấy chìm được thực hiện 1.1 Mục tiêu đề tài Xác định điều kiện nuôi cấy chìm phù hợp để sản xuất polysaccarides ngoại bào và sinh khối từ nấm Linh chi Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 2 Viện NC và PT Công Nghệ Sinh học Luận... Giống cấp 2 Phân vào bình tam giác 250ml Sinh khối và dịch chứa EPSs Lọc Dịch chứa polysaccharides ngoại bào Tủa Ethanol 96 Sấy Polysaccharides ngoại bào thô Sấy Sinh khối Linh chi Polysaccharides ngoại bào thô Hình 4 Quy trình nuôi cấy sinh khối nấm Linh chi 3.2.2 Khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng giống đến sự phát triển của sinh khối Linh chi và hàm lượng polysaccharides ngoại bào Theo Kume et al (1997),... (2006), đã nghiên cứu ảnh hưởng của pH đến khả năng tạo sinh khối, polysaccharide ngoại bào và nội bào và ligninolytic enzyme bởi Ganoderma lucidum tại các giá trị pH khác nhau sau 7 và 14 ngày sau khi nuôi cấy. Khối lượng sinh khối tối đa đã được ghi nhận ở pH 4,5 và 5,0; polysaccharides ngoại bào tối đa ở pH 7,0 và 3,0; và khối lượng của polysaccharides trong tế bào cao nhất ở pH 7,0 và 5,5 Theo J Habijani... là 12 bình và thể tích nuôi cấy theo từng nghiệm thức  Các chỉ tiêu theo dõi: + Khối lượng sinh khối Linh chi + Khối lượng polysachharides ngoại bào + Đường tổng số của polysaccharides ngoại bào 3.2.6 Phương pháp xác định các chỉ tiêu  Phương pháp thu nhận và xác định khối lượng sinh khối sợi (Yang et al., 2004) Sinh khối Linh chi Lọc qua giấy lọc Sấy ở 50oC trong 48 giờ Sinh khối Linh chi Hình 5... quả thể sang nuôi cấy và thu nhận sinh khối Linh chi cùng các dược chất (Exopolysaccharides, Ganoderic acid) dưới dạng nuôi cấy chìm Phương pháp này có nhiều ưu thế hơn về mặt thời gian, năng suất và chất lượng Phương pháp nuôi cấy chìm sinh khối Linh chi mới được nghiên cứu gần đây nên chỉ phát triển ở một số quốc gia như Trung quốc, Brazil, Hàn Quốc, Nhật Bản Ở Việt Nam, phương pháp này còn khá mới,... giống Linh chi cấp 2 trên cơ chất hạt phủ đầy khuẩn ty nấm Linh chi theo từng nghiệm thức, trong tủ cấy vô trùng + Nuôi lắc 150 rpm trên máy lắc trong 10 ngày (Hsieh et al 2006), ở nhiệt độ phòng 30ºC + Thu sinh khối và polysaccharides ngoại bào  Các chỉ tiêu theo dõi: + Khối lượng sinh khối Linh chi + Khối lượng polysachharides ngoại bào + Đường tổng số của polysaccharides ngoại bào 3.2.3 Khảo sát... Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 3 Viện NC và PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Loài: Ganoderma lucidum (Karsten,1881) 2.1.3 Đặc điểm hình thái và chu trình sống của nấm Linh chi (Ganodermalucidum ) a Đặc điểm hình thái nấm Linh chi Nấm Linh chi là một trong những loài nấm phá gỗ, đặc biệt trên các cây thuộc họ đậu Nấm xuất hiện nhiều vào mùa mưa, trên thân... cuối thế kỉ XX và cho kết quả rất to lớn đối với công nghệ vi sinh Năng suất sinh khối Linh chi thu được lên tới 4,2% theo Kim et al (2006), trong khi năng suất quả thể nấm Linh chi chỉ đạt 2% theo Lê Đình Hoài Vũ et al (2008) Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 8 Viện NC và PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT Hình 3 Nuôi cấy chìm sinh khối Linh chi Ưu điểm của... lượng Hằng năm sản lượng Linh chi được tiêu thụ rất lớn khoảng 4.900 – 5.000 tấn vào năm 2002 và có hơn 100 sản phẩm từ nấm Linh chi được tìm thấy trên thị trường (Tim et al., 2004) Do đó, việc chuyển hướng nghiên cứu nhằm sản xuất một lượng lớn sinh khối nấm Linh chi với các thành phần dược tính cao, ổn định là một vấn đề vô cùng cần thiết Xuất phát từ yêu cầu trên, đã có một số nghiên cứu ra đời với... của hệ sợi nấm Khi sợi nấm sinh trưởng thì pH của môi trường giảm xuống và ngược lại Chuyên ngành Công nghệ Sinh học 11 Viện NC và PT Công Nghệ Sinh học Luận văn tốt nghiệp Đại học khóa 36 - 2014 Trường ĐHCT CHƯƠNG 3 PHƯƠNG TIỆN PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 .Phương tiện nghiên cứu 3.1.1 Thời gian và địa điểm Từ tháng 1/2014-5/2014, tại phòng thí nghiệm Sinh học Phân tử Thực vật - Viện Nghiên cứu và Phát