Bộ giáo dục đào tạo - Bộ quốc phòng Học viện quân y phạm quang tập nghiên cứu thay đổi hệ thống enzym cytochrom- p450 ngời tiếp xúc nghề nghiệp với trinitrotoluen tác dụng naturenztrên động vật thực nghiệm Luận án tiến sĩ y học Hà nội 2010 Bộ giáo dục đào tạo - Bộ quốc phòng Học viện quân y phạm quang tập nghiên cứu thay đổi hệ thống enzym cytochrom- p450 ngời tiếp xúc nghề nghiệp với trinitrotoluen tác dụng naturenztrên động vật thực nghiệm Chuyên ngành : Sức khoẻ nghề nghiệp Mã số : 62.72.73.05 Luận án tiến sĩ y học Hớng dẫn khoa học: PGS. TS. Nguyễn Liễu PGS. TS. Nguyễn Thị Ngọc Dao Hà nội 2010 Lời cam đoan Tôi xin cam đoan công trình nghiên cứu riêng tôi. Các số liệu, kết nêu luận án trung thực cha đợc công bố công trình khác. Tác giả luận án Phạm Quang Tập Lời cảm ơn Sau năm học tập nghiên cứu Học viện Quân y, đến công trình luận án đ đợc hoàn thành. Để có đợc kết xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến PGS.TS Nguyễn Liễu, PGS.TS Nguyễn Thị Ngọc Dao, ngời thày đ trực tiếp hớng dẫn, giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập hòan thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Ban Giám đốc Học viện Quân y, Đảng uỷ Ban giám đốc Bệnh viện TƯQĐ 108, Phòng sau Đại học HVQY đ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn kính trọng tới thày hội đồng chấm luận án đ giành nhiều thời gian công sức bảo, giúp đỡ trình hoàn thiện luận văn này. Để hoàn thành công trình luận án này, xin chân thành cám ơn toàn thể cán bộ, nhân viên khoa A6, nơi công tác đ tạo điều kiện tận tình giúp đỡ suốt trình học tập hoàn thành luận án. Tôi xin chân thành cảm ơn Phòng Enzym Viện Công nghệ sinh học Viện Khoa học Việt nam, Ban giám đốc nhà máy Z121- TCCNQP, Thày, Cô toàn thể cán nhân viên Bộ môn, Khoa AM7 Bệnh viện quân y 103HVQY, Khoa Bệnh nghề nghiệp Viện VSPD Quân đội đ tạo điều kiện thuận lợi cho suốt trình học tập hoàn thành luận án. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến bạn bè, đồng nghiệp đ giúp đỡ, động viên suốt trình học tập hoàn thành luận án. Cuối xin bày tỏ lòng biết ơn cha mẹ đ sinh thành, dạy dỗ, nuôi dỡng tôi, vợ, đ động viên, giúp đỡ suốt trình học tập hoàn thành luận án. Xin trân trọng cảm ơn. Phạm Quang Tập Mục lục Trang Trang phụ bìa Lời cam đoan Mục lục Những chữ viết tắt luận án Danh mục bảng Danh mục biểu đồ Danh mục sơ đồ Danh mục ảnh Đặt vấn đề Chơng 1. Tổng quan 1.1. Những vấn đề chung chất nổ TNT 1.1.1. Đặc tính lý, hóa độc tính TNT 1.1.2. Đờng xâm nhập vào thể TNT 1.1.3. Phân bố, chuyển hóa thải trừ TNT thể 1.1.4. Tác hại TNT thể 1.2.5. TNT khả sinh gốc tự 12 1.2. Hệ thống enzym cytochrom P450 14 1.2.1. Cấu trúc 15 1.2.2. Phân bố 16 1.2.3. Cơ chế hoạt động 17 1.2.4. Các thành phần khác 19 1.2.5. Chức 22 1.3. ảnh hởng số hóa chất, chất độc TNT lên hệ thống cytochrom P450 24 1.3.1. ảnh hởng số hóa chất, chất độc lên hệ thống cytochrom P450 24 1.3.2. ảnh hởng TNT lên hệ thống enzym cytochrom P450 30 1.4. Tác dụng chế phẩm Naturenz Chơng 2. Đối tợng phơng pháp nghiên cứu 2.1. Đối tợng nghiên cứu 2.1.1. Môi trờng lao động 35 39 39 39 2.1.2. Ngời lao động 39 2.1.3. Động vật thực nghiệm 40 2.2. Phơng pháp nghiên cứu 40 2.2.1. Thiết kết nghiên cứu 40 2.2.2. Các tiêu nghiên cứu 41 2.2.3. Chất liệu, hóa chất trang thiết bị 42 2.2.4. Phơng pháp xác định tiêu nghiên cứu 44 2.2.5. Xử lý số liệu 51 2.2.6. Vấn đề đạo đức nghiên cứu 52 2.2.7. Mô hình nghiên cứu 53 Chơng 3. Kết nghiên cứu 54 3.1. Kết nghiên cứu môi trờng lao động 54 3.2. Kết nghiên cứu ngời lao động 55 3.2.1. Đặc điểm đối tợng nghiên cứu 55 3.2.2. Kết khám lâm sàng 57 3.2.3. Kết nghiên cứu cận lâm sàng 58 3.2.4. Kết nghiên cứu hệ thống enzym cytochrom P450 65 3.3. Kết nghiên cứu tác dụng chế phẩm Naturenz động vật thực nghiệm 75 3.3.1. Đánh giá thể trạng chung động vật thực nghiệm 75 3.3.2. Kết mô bệnh học 77 3.3.3. Biến đổi số huyết học 80 3.3.4. Biến đổi số hóa sinh máu 84 3.3.5. Kết xét nghiệm hệ thống enzym cytochrom P450 tiêu liên quan 90 Chơng 4. Bàn luận 4.1. Đặc điểm môi trờng lao động công nhân 95 95 4.1.1. Vi khí hậu môi trờng lao động công nhân tiếp xúc TNT 95 4.1.2. Sự ô nhiễm TNT môi trờng lao động 96 4.2. ảnh hởng TNT lên số tiêu huyết học hóa sinh máu 98 4.2.1. ảnh hởng TNT lên số tiêu huyết học 98 4.2.2. ảnh hởng TNT lên số tiêu hóa sinh máu 100 4.3. ảnh hởng TNT lên hệ thống enzym cytochrom P450 103 enzym chống oxy hóa 4.3.1. ảnh hởng TNT lên nồng độ enzym hệ thống 103 cytochrom P450 4.3.2. ảnh hởng TNT lên hoạt độ enzym hệ thống 106 cytochrom P450 4.3.3. ảnh hởng TNT lên enzym chống oxy hóa khác 109 4.4. Tác dụng chế phẩm Naturenz động vật gây nhiễm 112 độc TNT thực nghiệm 4.4.1. Tác dụng chế phẩm Naturenz lên tế bào máu gan 113 nhiễm độc TNT 4.4.2. Tác dụng chế phẩm Naturenz lên hệ thống cytochrom 116 P450 4.4.3. Tác dụng chế phẩm Naturenz lên enzym chống oxy 118 hóa Kết luận 122 Kiến nghị 124 Danh mục công trình nghiên cứu tác giả đ công bố có liên quan đến luận án 125 Tài liệu tham khảo 126 Phần phụ lục Những chữ viết tắt luận án AH : Anilin hydroxylase. ALT : Alanin aminotransferase AST : Aspartat aminotransferase BC : Bạch cầu CPR : NADPH- P450- reductase Cyt. : Cytochrom GGT : Gamma glutamyl transferase. GLDH : Glutamat dehydrogenase GOD : Glucose oxidase Hb : Hemoglobin HC : Hồng cầu. LDH : Lactat dehydrogenase MDA : Malonyldialdehyd MDH : Malatdehydrogenase MetHb : Methemoglobin. MMFO : Microsomal Mixed Function Oxidase POD : Peroxidase SLHC : Số lợng hồng cầu. TCVSCP : Tiêu chuẩn vệ sinh cho phép TNT : 2, 4, 6- Trinitrotoluen Danh mục bảng Tên bảng Bảng Trang 1.1 Sự phân bố TNT mô thể 1.2 Một số chất gây cảm ứng Cyt. P450 thờng gặp lâm sàng 29 3.1 Kết đo vi khí hậu phân xởng thuộc nhà máy Zx. 54 3.2 Nồng độ TNT phân xởng nghiên cứu thuộc nhà máy Zx. 54 3.3 Phân bố giới tính đối tợng nghiên cứu. 55 3.4 Phân bố tuổi đời đối tợng nghiên cứu. 56 3.5 Phân bố tuổi nghề đối tợng nghiên cứu. 56 3.6 Cơ cấu bệnh tật đối tợng nghiên cứu. 57 3.7 Kết xét nghiệm máu ngoại vi đối tợng nghiên cứu. 58 3.8 Tỷ lệ ngời giảm số lợng hồng cầu đối tợng nghiên cứu. 59 3.9 Liên quan số lợng hồng cầu tuổi đời, tuổi nghề đối tợng nghiên cứu. 59 3.10 Tỷ lệ ngời giảm nồng độ Hb đối tợng nghiên cứu. 61 3.11 Liên quan nồng độ Hb tuổi đời, tuổi nghề đối tợng nghiên cứu. 61 3.12 Hoạt độ AST, ALT, GGT đối tợng nghiên cứu 63 3.13 Tỷ lệ ngời tăng hoạt độ AST, ALT, GGT đối tợng nghiên cứu. 3.14 63 Liên quan hoạt độ AST, ALT, GGT tuổi đời, tuổi nghề đối tợng nghiên cứu. 64 3.15 Nồng độ ure, creatinin đối tợng nghiên cứu. 64 3.16 Nồng độ glucose, protein huyết đối tợng nghiên cứu. 65 3.17 Nồng độ cytochrom P420, P450 tổng nồng độ cytochrom (P420 + P450) huyết tơng đối tợng nghiên cứu. 65 Bảng 3.18 Tên bảng Trang Liên quan nồng độ Cyt. P420, P450 tổng Cyt. (P420 + P450) huyết tơng với tuổi đời, tuổi nghề số số huyết học. 3.19 Hoạt độ CPR anilin hydroxylase máu đối tợng nghiên cứu. 3.20 69 Hoạt độ peroxidase nồng độ nhóm SH máu đối tợng nghiên cứu. 3.22 68 Liên quan hoạt độ CPR AH máu với tuổi đời, tuổi nghề nồng độ cytochrom P420, P450 đối tợng nghiên cứu. 3.21 66 71 Liên quan hoạt độ peroxydase nồng độ nhóm -SH máu với tuổi đời, tuổi nghề nồng độ Cyt. P420, P450 đối tợng 72 nghiên cứu. 3.23 Kết đánh giá thể trạng chung. 75 3.24 Biến đổi trọng lợng thỏ lô nghiên cứu. 76 3.25 Đánh giá bề mặt mặt cắt gan. 77 3.26 Trọng lợng gan thỏ lô nghiên cứu. 78 3.27 Số lợng hồng cầu lô nghiên cứu. 80 3.28 Nồng độ Hb lô nghiên cứu. 81 3.29 Số lợng bạch cầu lô nghiên cứu. 82 3.30 Số lợng tiểu cầu lô nghiên cứu. 83 3.31 Hoạt độ AST lô nghiên cứu. 84 3.32 Hoạt độ ALT lô nghiên cứu. 85 3.33 Nồng độ ure huyết lô nghiên cứu. 86 3.34 Nồng độ creatinin huyết lô nghiên cứu. 87 3.35 Nồng độ glucose máu lô nghiên cứu. 88 3.36 Nồng độ protein máu lô nghiên cứu. 89 3.37 Nồng độ cytochrom P420, P450 tổng nồng độ cytochrom (P420 + P450) gan thỏ. 90 Bảng Tên bảng Trang 3.38 Hoạt độ CPR gan huyết tơng thỏ lô nghiên cứu. 91 3.39 Hoạt độ anilin hydroxylase gan máu thỏ lô nghiên cứu. 92 3.40 Hoạt độ peroxydase gan huyết tơng thỏ lô nghiên cứu. 93 3.41 Nồng độ nhóm -SH gan huyết tơng thỏ lô nghiên cứu. 94 Danh mục biểu đồ Biểu đồ Tên biểu đồ Trang 3.1 Liên quan số lợng hồng cầu tuổi đời. 60 3.2 Liên quan số lợng hồng cầu tuổi nghề. 60 3.3 Liên quan nồng độ Hb tuổi đời. 62 3.4 Liên quan nồng độ Hb tuổi nghề. 62 3.5 Liên quan tổng nồng độ Cyt. (P420 + P450) tuổi đời. 67 3.6 Liên quan tổng nồng độ Cyt. (P420 + P450) tuổi nghề. 68 3.7 Liên quan hoạt độ CPR tuổi nghề. 70 3.8 Liên quan hoạt độ AH tuổi nghề. 71 3.9 Liên quan hoạt độ peroxydase tuổi nghề. 73 3.10 Liên quan nồng độ nhóm -SH tuổi đời. 74 3.11 Liên quan nồng độ nhóm -SH tuổi nghề. 74 Danh mục sơ đồ Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 1.1 Chuyển hóa TNT thể. 1.2 Đờng xâm nhập, chuyển hóa thải trừ TNT. 1.3 Sự chuyển hóa tạo gốc tự trung gian TNT. 14 Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 1.4 Nhân heme dạng Fe protoporfirin IX enzym P450. 15 1.5 Mô hình hệ thống P450 màng lới nội sinh chất. 16 1.6 Cơ chế phản ứng Cyt. P450. 18 1.7 Sơ đồ vận chuyển điện tử phân tử CPR 19 1.8 Tơng tác CPR Cyt. P450 20 1.9 Các vị trí mà MMFO bị ức chế. 26 2.1 Mô hình nghiên cứu tổng quát. 53 Danh mục ảnh ảnh Tên ảnh 3.1 Bề mặt gan thỏ uống TNT uống TNT + Naturenz 3.2 Hình ảnh sng phồng thoái hóa nớc tế bào gan sát Trang khu vực tĩnh mạch trung tâm tiểu thùy 3.3 77 79 Hình ảnh tế bào gan thoái hóa nặng, giải xơ phát triển có xâm nhiễm tế bào viêm 79 đặt vấn đề Cytochrom P450 hệ thống enzym thuộc nhóm monooxygenase có hầu hết thể sống. động vật ngời, enzym có gan, tim, phổi, thận nhng tập trung chủ yếu gan, có số tế bào máu nh monocyte lymphocyte với hàm lợng nhỏ. Trong tế bào, enzym đợc gắn vào màng microsom lới nội nguyên chất, tỷ lệ enzym tồn tự nhỏ [3], [33], [47]. Trong trình sống, có nhiều yếu tố nội sinh (chuyển hóa) ngoại sinh (lý học, hóa học .) tạo gốc tự [29]. Vai trò hệ thống enzym cytochrom P450 chuyển hóa chất lạ (xenobiotic). Vì vậy, tăng hay giảm hàm lợng hoạt độ cytochrom P450 thể đáp ứng thể loại chất độc khác nhau. Tùy theo loại chất độc mà gây cảm ứng hay ức chế tổng hợp enzym cytochrom P450. Ngoài ra, thay đổi hàm lợng hoạt độ cytochrom P450 phụ thuộc vào nhiều yếu tố: cấu trúc, đặc điểm tác dụng, nồng độ liều lợng chất độc, đờng xâm nhập, thời gian xâm nhập, loài, giống tuổi thể tiếp xúc với chất độc. Do vậy, định lợng hoạt độ xúc tác hệ thống enzym có ý nghĩa lớn việc đánh giá nhiễm độc nh tổn thơng tế bào gan mức độ phân tử [11], [14], [108]. Việt Nam, TNT loại chất nổ đợc sử dụng rộng r i quốc phòng nhiều ngành kinh tế công nghiệp khác nh khai thác mỏ, xây dựng. Hiện tại, có hàng ngàn ngời trực tiếp sản xuất, bảo quản, vận chuyển, sử dụng TNT quốc phòng ngành kinh tế. TNT xâm nhập vào thể qua nhiều đờng nh da, niêm mạc, đờng hô hấp, đờng tiêu hoá. Hiện nay, nhiễm độc TNT nghề nghiệp đứng thứ ba bệnh nghề nghiệp. Các sản phẩm chuyển hoá TNT thể gây tổn thơng đa dạng cho quan: gan, tế bào máu, quan tạo máu, thần kinh, mắt, da, đờng tiêu hoá nhiều rối loạn chuyển hoá khác [25], [26], [27], [40]. Tuy nhiên, chế gây tổn thơng thể TNT đến có quan điểm cha thống nhất. Một số tác giả cho TNT sản phẩm chuyển hoá chất oxy hoá chứa nhóm NO2, có khả làm phát sinh gốc tự do. Các gốc tự có khả oxy hoá cao liên kết đồng hoá trị với protein phân tử nhỏ tế bào gan điều kiện a khí với tham gia hệ thống enzym cytochrom P450 gây tổn thơng cho thể. Để hạn chế ngăn chặn tác động độc hại gốc tự do, ngời ta phải sử dụng chất chống oxy hóa làm bất hoạt gốc tự do, bảo vệ thể. Cũng từ chế ngời ta sử dụng hợp chất có chứa nhóm -SH tự (Cystein, N-acetyl- cystein ) để giảm số lợng liên kết đồng hoá trị nhằm hạn chế mức độ tổn thơng tế bào gan. Gần đây, Viện Công nghệ Sinh học đ nghiên cứu bào chế đợc chế phẩm sinh học Natuzenz, có tác dụng chống oxy hóa, hạn chế tác động gốc tự đặc biệt trờng hợp nhiễm độc. Xuất phát từ sở trên, đề tài đợc tiến hành với mục tiêu: 1. Xác định thay đổi hệ thống enzym cytochrom P450 mối liên quan với tuổi đời, tuổi nghề, số tiêu huyết học, hóa sinh ngời tiếp xúc nghề nghiệp với TNT. 2. Đánh giá thay đổi hệ thống enzym cytochrom P450 tác dụng Naturenz động vật gây nhiễm độc TNT thực nghiệm bán mạn tính. [...]... trong những trờng hợp nhiễm độc Xuất phát từ những cơ sở tr n, đề t i đợc ti n h nh với các mục tiêu: 1 Xác định sự thay đổi của hệ thống enzym cytochrom P450 v mối li n quan với tuổi đời, tuổi nghề, một số chỉ tiêu huyết học, hóa sinh ở ngời tiếp xúc nghề nghiệp với TNT 2 Đánh giá sự thay đổi của hệ thống enzym cytochrom P450 v tác dụng của Naturenz tr n động vật gây nhiễm độc TNT thực nghiệm b n m n. .. chế tổng hợp enzym các cytochrom P450 Ngo i ra, sự thay đổi h m lợng v hoạt độ của cytochrom P450 c n phụ thuộc v o nhiều yếu tố: cấu trúc, đặc điểm tác dụng, n ng độ v liều lợng chất độc, đờng xâm nhập, thời gian xâm nhập, lo i, giống v tuổi của cơ thể tiếp xúc với chất độc Do vậy, định lợng hoạt độ xúc tác của hệ thống enzym n y có ý nghĩa l n trong việc đánh giá sự nhiễm độc cũng nh t n thơng của. .. có sự xâm nhiễm của các tế b o viêm 79 1 đặt v n đề Cytochrom P450 l hệ thống enzym thuộc nhóm monooxygenase có trong hầu hết các cơ thể sống ở động vật v ngời, enzym n y có ở gan, tim, phổi, th n nhng tập trung chủ yếu ở gan, ngo i ra c n có ở một số tế b o máu nh monocyte v lymphocyte với h m lợng nhỏ Trong tế b o, enzym n y đợc g n v o m ng microsom của lới n i nguy n chất, tỷ lệ enzym t n tại tự... gan ở mức độ ph n tử [11], [14], [108] ở Việt Nam, TNT l loại chất n đợc sử dụng khá rộng r i trong quốc phòng v trong nhiều ng nh kinh tế công nghiệp khác nh khai thác mỏ, xây dựng Hi n tại, có h ng ng n ngời trực tiếp s n xuất, bảo qu n, v n chuy n, sử dụng TNT trong quốc phòng v các ng nh kinh tế TNT có thể xâm nhập v o cơ thể qua nhiều đờng nh da, niêm mạc, đờng hô hấp, đờng tiêu hoá Hi n nay, nhiễm... độc TNT nghề nghiệp đứng thứ ba trong các bệnh nghề 2 nghiệp Các s n phẩm chuy n hoá của TNT trong cơ thể gây t n thơng đa dạng cho các cơ quan: gan, tế b o máu, cơ quan tạo máu, th n kinh, mắt, da, đờng tiêu hoá v nhiều rối lo n chuy n hoá khác [25], [26], [27], [40] Tuy nhi n, cơ chế gây t n thơng cơ thể của TNT đ n nay v n c n có những quan điểm cha thống nhất Một số tác giả cho rằng TNT v các s n. ..Bảng T n bảng Trang 3.38 Hoạt độ CPR ở gan v huyết tơng thỏ ở các lô nghi n cứu 91 3.39 Hoạt độ anilin hydroxylase ở gan v máu thỏ ở các lô nghi n cứu 92 3.40 Hoạt độ peroxydase ở gan v huyết tơng thỏ ở các lô nghi n cứu 93 3.41 N ng độ nhóm -SH ở gan v huyết tơng thỏ ở các lô nghi n cứu 94 Danh mục các biểu đồ Biểu đồ T n biểu đồ Trang 3.1 Li n quan số lợng hồng cầu v tuổi đời 60 3.2 Li n quan số... chuy n hoá của n l những chất oxy hoá vì chứa các nhóm NO2, do đó có khả n ng l m phát sinh các gốc tự do Các gốc tự do n y có khả n ng oxy hoá cao do li n kết đồng hoá trị với những protein ph n tử nhỏ của tế b o gan trong điều ki n a khí với sự tham gia của hệ thống enzym cytochrom P450 gây ra các t n thơng cho cơ thể Để h n chế v ng n ch n tác động độc hại của các gốc tự do, ngời ta phải sử dụng. .. Li n quan n ng độ nhóm -SH v tuổi nghề 74 Danh mục các sơ đồ Sơ đồ T n sơ đồ Trang 1.1 Chuy n hóa TNT trong cơ thể 6 1.2 Đờng xâm nhập, chuy n hóa v thải trừ TNT 7 1.3 Sự chuy n hóa tạo gốc tự do trung gian của TNT 14 Sơ đồ T n sơ đồ Trang 1.4 Nh n heme ở dạng Fe protoporfirin IX của enzym P450 15 1.5 Mô hình hệ thống P450 ở m ng lới n i sinh chất 16 1.6 Cơ chế ph n ứng của Cyt P450 18 1.7 Sơ đồ v n. .. Li n quan số lợng hồng cầu v tuổi nghề 60 3.3 Li n quan n ng độ Hb v tuổi đời 62 3.4 Li n quan n ng độ Hb v tuổi nghề 62 3.5 Li n quan tổng n ng độ Cyt (P420 + P450) v tuổi đời 67 3.6 Li n quan tổng n ng độ Cyt (P420 + P450) v tuổi nghề 68 3.7 Li n quan hoạt độ CPR v tuổi nghề 70 3.8 Li n quan hoạt độ AH v tuổi nghề 71 3.9 Li n quan hoạt độ peroxydase v tuổi nghề 73 3.10 Li n quan n ng độ nhóm -SH v tuổi... dụng các chất chống oxy hóa l m bất hoạt các gốc tự do, bảo vệ cơ thể Cũng từ cơ chế n y ngời ta sử dụng những hợp chất có chứa nhóm -SH tự do (Cystein, N- acetyl- cystein ) để giảm số lợng li n kết đồng hoá trị nhằm h n chế mức độ t n thơng của tế b o gan G n đây, Vi n Công nghệ Sinh học đ nghi n cứu v b o chế đợc chế phẩm sinh học Natuzenz, có tác dụng chống oxy hóa, h n chế tác động của các gốc tự