Đang tải... (xem toàn văn)
Streptomyces là chi lớn nhất của ngành Actinobacteria và là một chi thuộc nhánh streptomycetaceae. Có hơn 500 loài vi khuẩn Streptomyces đã được mô tả. Giống như hầu hết các Actinobacteria khác, Streptomyces là vi khuẩn Gram dương, có bộ gen với tỉ lệ GC% cao. Vi khuẩn này được tìm thấy chủ yếu trong đất và thảm thực vật mục nát. Streptomyces sinh bào tử, tạo mùi đặc trưng, là kết quả từ sản sinh geosmin trong quá trình chuyển hóa các chất. Streptomyces được nghiên cứu rộng rãi và được biết đến nhiều nhất là chi của họ xạ khuẩn (Actinomyces). Streptomyces thường sống ở đất có vai trò là vi sinh vật phân hủy rất quan trọng. Chủng vi sinh này sản xuất hơn một nửa số thuốc kháng sinh trên thế giới và đó là sản phẩm có giá trị lớn trong lĩnh vực y tế.
TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50 XẠ KHUẨN STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 SINH XYLANASE: ĐẶC ĐIỂM SINH HỌC VÀ PHÂN LOẠI Vũ Văn Lợi, Nguyễn Văn Hiếu, Nguyễn Thị Hồng Liên, Phạm Thị Bích Hợp, Phan Thị Hồng Thảo* Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm KH & CN Việt Nam, *pthongthao@ibt.ac.vn TÓM TẮT: Xylan thành phần hemicellulose, cấu tạo từ phân tử D-xylopyranose thông qua liên kết β-1,4 chuỗi bên. Sự phân hủy xylan xylanase nghiên cứu nhiều vi sinh vật, đặc biệt nấm xạ khuẩn. Hiện nay, việc phân lập tuyển chọn chủng xạ khuẩn có khả sinh xylanase cao quan tâm tiềm ứng dụng rộng rãi chúng nhiều lĩnh vực khác nhau, đặc biệt công nghiệp giấy bột giấy. Trong nghiên cứu này, chủng CP23X9 có khả phân hủy xylan mô tả đặc điểm sinh học phân loại. Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn xanh vàng xám, có chuỗi bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử chuỗi khoảng từ 10-50. Chủng CP23X9 sinh trưởng tốt nhiều loại môi trường, điều kiện nhiệt độ, pH rộng (nhiệt độ 15-45oC; pH = 5-10) chịu nồng độ muối NaCl đến 6%. Xạ khuẩn CP23X9 có khả đồng hoá nhiều loại đường D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose Lrhamnose. Đặc biệt, chủng có khả sinh enzyme ngoại bào phong phú (ligninase, protease, amylase), có hoạt tính xylanase cao (42,7 U/ml) không sinh cellulase. Đối chiếu đặc điểm phân loại chủng với khóa phân loại xạ khuẩn ISP, khóa phân loại Bergey kết phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy, chủng CP23X9 có đặc điểm tương đồng cao (99%) với loài Streptomyces chartreusis. Hoạt tính xylanase Streptomyces chartreusis CP23X9 ứng dụng tẩy trắng bột giấy. Từ khóa: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, đặc điểm sinh học, phân loại xạ khuẩn, xylanase. MỞ ĐẦU Xylan thành phần hemicellulose, chiếm 20-35% khối lượng chất khô. Thành phần xylan bao gồm mạch cấu tạo đường D-xylopyranose thông qua liên kết β-1,4 chuỗi bên Oacetyl, α-L-arabinofuranosyl, α-D-glucuronosyl. Để thủy phân hoàn toàn xylan cần có tham gia hoạt động tổ hợp xylanase [4]. Đến nay, xylanase từ vi sinh vật quan tâm ý mạnh mẽ khả ứng dụng nhiều lĩnh vực bột giấy, thức ăn chăn nuôi, chuyển hóa lignocellulose, cồn sinh học công nghiệp đồ uống. Xylanase sinh tổng hợp nhiều loài vi sinh vật khác vi nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn (Penicillium janthinellum, Arthrobacter sp., Streptomyces cyaneus, S. albus, S. Chromofuscus S. chartreusis) [2, 5, 8]. Trong đó, xylanase từ xạ khuẩn công bố có khả chịu nhiệt, chịu kiềm hoạt tính cellulase [8]. Sử dụng xylanase tẩy trắng bột giấy giúp làm giảm lượng chlorine (Cl2) hypochlorine (ClO2) dùng trong tẩy trắng, đồng thời giảm lượng hóa chất thải môi trường. Đến nay, xylanase từ S. albus S. chromofuscus ứng dụng thành công tẩy trắng bột giấy, sử dụng xylanase từ chủng S. albus giúp độ sáng bột giấy tăng 4% xylanase từ S. chromofuscus có hiệu tẩy trắng tăng 9,1% so với không xử lý [8]. Trong này, nghiên cứu đặc điểm sinh học phân loại chủng xạ khuẩn CP23X9 sinh xylanase cao nhằm ứng dụng tẩy trắng bột giấy. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Vật liệu Các chủng xạ khuẩn vi sinh vật kiểm định: Bacillus subtilis ATCC 6633, Pseudomonas aeruginosa, Sarcina lutea, Escherichia coli PA2, Staphylococcus aureus 208P Candida albicans nhận từ sưu tập giống Phòng Công nghệ lên men, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. 45 Vu Van Loi et al. Môi trường nuôi cấy phân loại: môi trường theo ISP (International Streptomyces Project). Môi trường GI (g/l): Oat spelts xylan 5; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; KNO3 0,5; NaCl 0,5; FeSO4.H2O 0,0; pH 7,2-7,5. Môi trường Gause I (g/l): Tinh bột tan 20; K2HPO4 0,5; MgSO4.7H2O 0,5; KNO3 0,5; NaCl 0,5; FeSO4.H2O 0,01; pH 7,2-7,5. Môi trường Gause II (g/l): Glucose 10; pepton 5; cao thịt 0,5; NaCl 5; pH 7,2-7,5. Phương pháp Phương pháp xác định hoạt tính xylanase Hoạt tính xylanase xác định đo lượng đường khử giải phóng từ 0,5% (w/v) oat spelts xylan, sử dụng 3,5- Dinitrosalicylic acid (DNS) chất phản ứng [3] D-xylose làm đường chuẩn. Một đơn vị hoạt tính enzyme xylanase định nghĩa lượng enzyme cần để giải phóng 1µmol xylose từ oat spelts xylan 0,5% (w/v) điều kiện thí nghiệm [7]. Phân loại CP23X9 quan sát đặc điểm hình thái, phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA Nghiên cứu đặc điểm sinh học theo phương pháp ISP (1974) khóa phân loại Bergey [6, 12]. Màu sắc khuẩn ty chất (KTCC), khuẩn ty khí sinh (KTKS) sắc tố tan tiết môi trường đánh giá theo Shirling Gottlieb (1966) bảng màu Tresner & Backus [10, 11]. Hình dạng cuống sinh bào tử bào tử quan sát chụp ảnh kính hiển vi điện tử JSM-5000. Phân tích trình tự gen 16S rDNA DNA tổng số chủng CP23X9 tách chiết theo phương pháp Sambrook & Russell (2001) [9]. Gen mã hóa 16S rRNA chủng vi khuẩn khuếch đại phản ứng PCR từ DNA tổng số sử dụng cặp mồi GF1 (5'TAACACATGCAAGTCGAACG-3') GR1 (5’-GG(C/T)TACCTTGTTACGACTT-3’) theo chu trình nhiệt: 94oC phút, 30 chu trình (94oC 60 giây, 60oC 60 giây, 72oC 90 giây), 72oC 10 phút, giữ mẫu 4oC. Sản phẩm phản ứng PCR phân tích máy đọc trình tự ABI PRISM 3100 Avant Genetic Analyzer, xử lý phần mềm SeqAssem version 01/2005 Sequencher version 4.0.5. Mức độ tương đồng gen 16S rDNA chủng nghiên cứu so sánh với trình tự gen 16S rDNA Genbank. Mức độ tương đồng di truyền chủng xây dựng dựa phần mềm ClustalX 2.0.11. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Tuyển chọn xạ khuẩn sinh xylanase Từ mẫu mùn gỗ mục phân lập 12 chủng xạ khuẩn có khả sinh tổng hợp xylanase. Trong số đó, chủng CP23X9 sinh tổng hợp xylanase mạnh (42,70 U/ml) lựa chọn để định tên đến loài nhằm sử dụng nghiên cứu (bảng 1). Bảng 1. Hoạt tính xylanase số chủng xạ khuẩn tuyển chọn Chủng CP5X1 CP6X5 CP12X7 CP13X8 CP13X11 CP16X6 Xylanase (U/ml) 36,75 27,33 21,34 22,79 30,86 33,25 Chủng CP18X3 CP18X21 CP20X2 CP22X6 CP23X9 CP25X11 Chủng xạ khuẩn tuyển chọn có hoạt tính xylanase tương đương với hoạt tính xylanase thu nhận từ chủng xạ khuẩn số tác giả công bố giới Streptomyces chartreusis L1105 (45,16 U/ml), S. albus (32,53 U/ml), S. chromofuscus (43,01U/ml) [2, 8]. 46 Xylanase (U/ml) 34,38 23,32 36,07 25,59 42,70 24,13 Đặc điểm sinh học chủng CP23X9 Đặc điểm nuôi cấy Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn vàng xám, sinh trưởng tốt môi trường ISP13, ISP5-7, Gause I, Gause II sinh trưởng yếu TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50 môi trường ISP4 Gause I. Khuẩn ty khí sinh có màu vàng môi trường ISP1 ISP6, màu xanh ISP2-ISP5, Gause I Gause II. Trên môi trường ISP1, ISP4, ISP5, ISP6 a Gause I, khuẩn ty chất có màu vàng có màu xám ISP2, ISP3, ISP7 Gause II. Chủng CP23X9 không tạo sắc tố melanin môi trường nghiên cứu (hình 1a, 1b). b c d Hình 1. Khuẩn lạc mặt trước (a), mặt sau (b), bề mặt bào tử (c) cuống sinh bào tử (d) chủng CP23X9. Đặc điểm bào tử kính hiển vi điện tử Chủng CP23X9 nuôi môi trường ISP2 sau ngày. Quan sát kính hiển vi điện tử JSM-5000 độ phóng đại 5000 lần cho thấy, cuống sinh bào tử chủng CP23X9 có dạng xoắn (S) (hình 1d), chuỗi có khoảng 10-50 bào tử. Ở độ phóng đại 10000 lần, bề mặt bào tử dạng gai (sp) (hình 1c). Đặc điểm sinh lý sinh hóa Nghiên cứu khả đồng hóa nguồn đường tiêu quan trọng để tiến hành phân loại xạ khuẩn theo khóa phân loại Nomomura ISP (1974) [6]. Kết cho thấy chủng CP23X9 có khả đồng hoá nhiều loại đường, phát triển tốt môi trường có bổ sung D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose L-rhamnose, phát triển yếu môi trường có lactose, D-fructose saccharose không phát triển môi trường có sorbitol. Xạ khuẩn CP23X9 sinh trưởng điều kiện nhiệt độ từ 1545C, pH 5-10 chịu nồng độ muối NaCl tới 6% w/v. Dịch nuôi cấy từ chủng CP23X9 có khả ức chế số chủng vi khuẩn kiểm định Bacillus subtilis 6630, Pseudomonas aeruginosa Staphylococcus aureus 208P. Tuy nhiên, chủng lại khả ức chế Sarcina lutea, Escherichia coli PA2 nấm Candida albicans. Chủng có hệ enzyme ngoại bào phong phú ligninase, protease, amylase, không sinh tổng hợp cellulolase. Định tên đến loài chủng CP23X9 Đối chiếu đặc điểm phân loại chủng nghiên cứu theo khóa định tên loài xạ khuẩn ISP, so sánh với khóa phân loại Bergey, xác định chủng CP23X9 xếp vào nhóm xạ khuẩn Streptomyces. Tuy nhiên, để phân loại chủng CP23X9 đến loài, cần kết 47 Vu Van Loi et al. hợp kết đặc điểm sinh hóa trình tự gen 16S rDNA. Từ kết xác định trình tự cho thấy, gen 16S rDNA chủng CP23X9 có độ tương đồng cao (98-99%) với gen tương ứng số xạ khuẩn thuộc chi Streptomyces (hình 2): S. chartreusis XSD08102, S. chartreusis DA10203, S. chartreusis HA10304, S. chartreusis DSM41255 (99%), S. flavovariabilis 1184, S. phaeoluteigriseus ISP5182, S. bobili NBRC13199, S. galilaeus JCM 4757, S. pseudovenezuelae HBUM174623 (98%). Như vậy, kết phân loại cho thấy chủng xạ khuẩn CP23X9 có đặc điểm gần gũi có độ tương đồng cao với loài Streptomyces chartreusis nên chủng xạ khuẩn đặt tên Streptomyces chartreusis CP23X9. Hình 2. Mức độ tương đồng di truyền chủng Streptomyces chartreusis CP23X9 với loài xạ khuẩn có họ hàng gần dựa vào 16S rRNA Khả sinh tổng hợp xylanase Trong năm gần đây, khả sinh tổng hợp xylanase từ chủng xạ khuẩn nhiều tác giả công bố S. cyaneus [5], S. albus, S. chromofuscus [8], Streptomyces sp. Lb24 [7], S. chartreusis [2] Streptomyces AMT-3 [40]. Theo Li et al. (2011) [2], chủng S. chartreusis L1105 sinh xylanase đạt cực đại (45,16 U/ml) sau ngày môi trường sử dụng oat spelt xylan làm nguồn cacbon. Chủng xạ khuẩn CP23X9 công bố thể khả sinh tổng hợp xylanase cao (42,70 U/ml) không sinh tổng hợp cellulose qua phân loại cho thấy loài xạ khuẩn có ý nghĩa việc ứng dụng xử lý 48 tẩy trắng bột giấy nhiều tác giả công bố. Thí dụ, sau trình ủ bột giấy với xylanase từ S. chartreusis L1105, S. Thermoviolaceus Streptomyces sp. QG-11-3 hệ số kappa (thể mức độ khử lignin) giảm 12,2; 16 23% [2]. Sử dụng xylanase từ chủng S. albus giúp độ sáng bột giấy tăng 4% so với không xử lý. Trong đó, hiệu tăng độ sáng bột giấy nhận 9,1% sử dụng xylanase từ S. chromofuscus [8]. Khả sinh tổng hợp xylanase Streptomyces chartreusis CP23X9 nghiên cứu đạt tới 42,70 U/ml cho thấy là chủng xạ khuẩn địa quí, có triển vọng xử lý tẩy trắng bột giấy. TẠP CHÍ SINH HỌC 2013, 35(3se): 45-50 KẾT LUẬN Chủng CP23X9 phân lập từ gỗ mục, sinh trưởng tốt nhiều loại môi trường, khoảng nhiệt độ pH rộng (nhiệt độ 1545oC; pH 5-10) chịu nồng độ NaCl đến 6%. Chủng CP23X9 thuộc nhóm xạ khuẩn xanh vàng xám, có chuỗi bào tử dạng xoắn, bề mặt bào tử dạng gai, số lượng bào tử chuỗi khoảng từ 10-50. Chủng có hệ enzyme ngoại bào phong phú (ligninase, protease, amylase), có hoạt tính xylanase cao (42,7 U/ml) không sinh cellulase. Đối chiếu đặc điểm phân loại chủng nghiên cứu theo khóa phân loại ISP, so sánh với khóa phân loại Bergey kết hợp với kết phân tích trình tự gen mã hóa 16S rRNA cho thấy, chủng CP23X9 thuộc loài Streptomyces chartreusis với độ tương đồng 99%. TÀI LIỆU THAM KHẢO 1. Bajai B. K., Razdan K., Sharma A., 2010. Thermoactive alkali-stable xylanase production from a newly isolated Streptomyces sp. SU9. Indian J. Chem. Technol., 17: 375-380. 2. Li X., Sun B., Zhao J., Lv Y., Song H., Li E., Zhu Y., 2011. Production and improved bleaching abilities of a thermostable xylanase from a newly isolated Streptomyces chartreusis strain. Afr J. Biotechnol., 10(64): 14132-14142. 3. Miller L., 1959. Use of dinitrosalicylic acid reagent for determination of reducing sugar. Anal. Chem., 31: 426-431. 4. Nascimento R. P., Coelho R. R. R., Marques S., Alves L., Gírio F. M., Bon E. P. S., Amaral-Collaco M. T., 2002. Production and partial characterisation of xylanase from Streptomyces sp. strain AMT-3 isolated from Brazilian cerrado soil. Enzyme Microb. Technol., 31: 549-555. 5. Ninawe S., Kapoor M., Kuhad R. C., 2008. Purification and characterization of extracellular xylanase from Streptomyces cyaneus SN32. Bioresour. Technol., 99: 1252-1258. 6. Nomomura H., 1974. Key for classification and identification of 458 species of the Streptomyces included in ISP. J. Ferment. Technol., 52(2): 78-92. 7. Rawashded R., Saadoun I., Mahasneh A., 2005. Effect of cultural conditions on xylanase production by Streptomyces sp. (strain Ib 24D) and its potential to utilize tomato pomace. Afr. J. Biotechnol., 4(3): 251-255. 8. Rifaat H. M., Nagieb Z. A., Ahmed Y. M., 2005. Production of xylanase by Streptomyces species and their bleaching effect on rice straw pulp. Appl. Ecol. Environ. Res., 4(1): 151-160. 9. Sambrook J., Russell D. W., 2001. Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed. Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York. 10. Shirling E. B., Gottlieb D., 1966. Cooperative description of type culture of Streptomyces species. Int. J. Sys. Bacteriol., 19(4): 391-512. 11. Shirling E. B., Gottlieb D., 1966. Methods for characterisation of Streptomyces species. Int. J. Sys. Bacteriol., 16(3): 313-340. 12. Wilkins W., 1989. Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology. Vol. 2, Vol. 3, Vol. 4. Publisher Springer-Verlag, New York. 49 Vu Van Loi et al. STREPTOMYCES CHARTREUSIS CP23X9 PRODUCING XYLANASE: BIOLOGICAL CHARACTERISTICS AND CLASSIFICATION Vu Van Loi, Nguyen Van Hieu, Nguyen Thi Hong Lien, Pham Thi Bich Hop, Phan Thi Hong Thao Institute of Biotechnology, VAST SUMMARY Xylan is the major component of hemicellulose that makes up for plant cell. It is constructed by 1,4-βlinked-D-xylopyranosyl units with several side-groups. Xylan can be degraded by xylanase from microorganisms such as fungi, bacteria and actinomyces. Enzyme xylanase is widely applied in industry, such as textile, paper and pulp, and food production. In this study, an Actinomyces strain CP23X9 producing xylanase was characterized and identified. The results showed that strain CP23X9 can grow well on different media with a wide range of temperature between 15-45oC; pH 5-10, and salinity of 0-6%. On the agar plate, the strain has blue aerial mycelia and pale yellow vegetative mycelia. The mature spore chains appeared spirals, moderately long, bearing 10 to 50 spores each; the spore surface spiny. The strain utilized carbon sources such as D-glucose, D-xylose, D-mannitol, L-arabinose L-rhamnose. Strain CP23X9 capable of extracellular enzymes producing, such as ligninase, protease, amylase and with high xylanase activity (42.7 U/ml). Based on the biological characteristics and phylogenetic analysis of 16S rDNA, it can be concluded that strain CP23X9 is close to Streptomyces chartreusis (99%), hence identified as Streptomyces chartreusis CP23X9. The xylanase activity of Streptomyces chartreusis CP23X9 will be used in improved bleaching abilities in future Keywords: Streptomyces chartreusis, 16S rDNA, Actinomyces classification, biological characteristics, xylanase. Ngày nhận bài: 30-6-2013 50