BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐAI HOC Dươc HÀ NÔI HÔ THỊ THANH HUYEN Bước ĐẦU NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC ■ . ■ ■ CỦA CÂY ĐƠN LÁ XANH (EXCOECARIA COCHINCHINENSIS LOUR. VAR. VIRIDIS MERR. EUPHORBIACEAE) (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ ĐẠI HỌC KHOÁ 1997 - 2002) Người hướng dẫn: ThS. Nguyễn Thái An TS. Trần Lưu Vân Hiền Nơi thực hiện: Bộ môn Dược học cổ truyền - Trưòìig Đại học Dược Hà Nội Phòng Đông y thực nghiệm - Viện Y học cổ truyền Viêt Nam Thời gian thực hiện: Từ 03/2002-^p^ỡT^<^^^\ •‘V’ . ^ HÀ NỘI, 05/2002 LỜI z è n Ơ N Tôi xin bà y tỏ lòng kính trọng và b iết ơn sâu sắc đến: Th§. Rguyễn Thài ãn TS. Trần Lưu Vân lịiền- Viện Y họe cổíruyền n? Rgười đã írực tiếp hướng dẫn tận tình chỉ bào tô i ỉrong quá trình làm đ ềỉà in à y. Rhân dịp n à y fôi cũng xin chân thềtnh cảm ơn: PQS. TS. Phạm Xuân ăinb- Sộ môn ĐĩịCT TS. Đỗ Rgọc Thanh- Phòng th í nghiệm trung tâm Th§. Đào Thị Vui- Bộ môn Được ¡ực Là những người đã giúp đỡ và cho những Ý hiến quý báu giúp tôi hoàn thành luận văn. Tôi cũng xin chân thành cảm ơn các thầỴ. các cô bộ môn Dược học cổ truyền, phòng Đông y thực nghiệm, phòng X ét nghiệm (Viện Y bọc cổ truyền Việt Ram), bộ môn Được liệu, bộ môn Thực v ậ t bộ môn Được lực, phòng th í nghiệm trung tâm. thư viện trường Đại học Dược J?à Rội. đã tận tình giúp đỡ chỉ bảo tô i hoàn thành luận văn này. Cuối cùng íô i muốn cám ơn íấ t cà các th ầy cô giáo đã tận tình giúp đỡ tô i trong ỉhời gìũn vừa qua. ỉĩộ ỉ, ngày 2 0 tháng 5 năm 2002 SINH VIỂN HỒ THÌ THfíNH HU¥€N i CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT AO: Hoạt tính chống oxy hoá Dd: Dung dịch HL: Hàm lượng MDA: Malonyl dialdehyd SKLM; Sắc ký lớp mỏng IB: Trung bình 'IT: Thuốc thử '1'1'KHTN & CNQG: Trung tâm khoa học tự nhiên và công nghệ quốc gia VSDT: Vệ sinh dịch tễ YHCl': Y học cổ truyền CA: Candida ablicans E.coli: Escherichia coli 0111 B4 Pseu: Pseudomonas aeruginosa Stal: Staphylococcus aureus ATCC Sta2: Staphylocoous aureus (Phân lập từ bệnh nhân) Sta3: Staphylocoous aureus (Viện vệ sinh dịch tễ cung cấp) Shi 1: Shigella dysenteria Typ 2 Shi2: Shigella flexneri Typ 3 Shb: Shigella boy di Typ 3 Sal 1; Salmonella para A Sal2: Salmonella typhimurin Sal 3: Salmonella typhi M ực LỤC Trang ĐẶT VẤN ĐỂ 1 PHẨN 1 - TỔNG QUAN 2 1.1. Đặc điểm thực v ậ t 2 1.1.1. Tên khoa học 2 1.1.2. Mô tả thực vật 2 1.2. Thành phần hoá học 3 1.3. Công dụng 4 1.4. Trồng trọ t 4 1.5. Thu hái và chế biến 5 PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 6 2.1. Nguyên vật liệu và phương pháp thực nghiệm 6 2.1.1. Nguyên vật liệu 6 2.1.2. Phương pháp nghiên cứu . 7 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 8 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật học 8 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học 15 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 27 PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ ĐỂ XUẤT 47 TÀI LIỆU THAM KHẢO 50 ĐẬT VẤN ĐỂ Nước ta nằm trong vùng nhiệt đới gió mùa, có hệ sinh thái thực vật rất đa dạng và phong phú. Từ lâu, nhân dân ta đã biết sử dụng nhiều loại cây cỏ để phòng bệnh và chữa bệnh. Tuy nhiên có rất nhiều loại cây thuốc mófi chỉ được sử dụng theo kinh nghiệm dân gian mà chưa được nghiên cứu về thành phần hoá học và tác dụng sinh học. Cây Đơn lá xanh (Excoecarỉa cochinchỉnensis Lour. var. viridis Merr. Euphorbiaceae) mọc khá phổ biến ở nước ta, có ở các tỉnh miền bắc và miền núi, dễ trồng trọt, khai thác, chế biến sử dụng. Theo Y học cổ truyền, cây Đơn lá xanh có tác dụng trị mụn , mẩn ngứa, ỉa chảy Cây Đofn lá xanh thường được thu hái lẫn trong cây Đcfn lá đỏ và sử dụng trong các bài thuốc điều trị dị ứng Tuy đã được sử dụng trong nhân dân, nhưng cho tới nay, chưa có công trình nào trong nước nghiên cứu về thực vật, thành phần hoá học và tác dụng sinh học. Xuất phát từ tình hình thực tế trên, đồng thòd góp phần nâng cao giá trị sử dụng của dược liệu Đofn lá xanh một cách hợp lý, an toàn và có hiệu quả, chúng tôi tiến hành đề tài "Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Đơn lá xanh (Excoecaria cochinchỉnensỉs Lour. var. viridis Merr. Euphorbmceaey'. Đề tài thực hiện một số nội dung chính sau; 1/ Về thực vật: Thu hái mẫu cây, phân tích đặc điểm hình thái thực vật, xác định tên khoa học. Xác định các đặc điểm vi phẫu, đặc điểm bột thân lá để góp phần tiêu chuẩn hoá dược liệu. 2/ Về thành phần hoá học: Định tính các thành phần hoá học trong lá, xác định hàm lượng thành phần chính của cây, chiết xuất, phân lập và nhận dạng chất phân lập được. 3/ Về tác dụng sinh học: Thăm dò một số tác dụng sinh học: chống viêm cấp, giảm co thắt cơ trơn, chống oxy hoá, tác dụng kháng khuẩn. PHẦN 1 - TỔNG QUAN 1.1. Đặc điểm thực vật 1.1.1. Tên khoa học EXCOECARIA COCHINCHINENSIS LOUR. VAR. VIRIDIS MERR. EUPHORBIACEAE Theo Đỗ Tất Lợi (1999), Nguyễn Nghĩa Thìn (1996) loài Excoecaria cochinchinensis Lour, có 2 thứ, có thể phân biệt dễ dàng bằng màu sắc mặt dưới của lá. Excoecaria cochinchinensis Lour, có mặt dưói lá màu đỏ, và thứ Excoecaria cochinchinensis Lour. var. viridis có mặt dưới lá màu xanh. Tuy nhiên, theo “Trung Quốc thực vật chf’ (1997), các nhà thực vật Trung Quốc đã xếp Excoecaiia cochinchinensis Lour. var. viridis Merr. thành một loài riêng biệt là Excoecarìa formosana Hay ata. fvà có tên synonym là Excoecaria cochinchỉnensỉs Lour. var. viridis Merr.j, có tên gọi Trung Quốc là “Lục bối Quế hoa” (khác vói Đơn lá đỏ = Hồng bối Quế hoa). Loài này phân bố ở Trung Quốc, Việt nam. Hiện nay, “Lục bối Quế hoa” đã bắt đầu đưọc các nhà Thực vật học và các thầy thuốc Việt nam quan tâm nghiên cứu. - Tên Việt Nam: Chưa thấy có tên, vì vậy chúng tôi tạm dịch và gọi tên cây là Đoìi lá xanh cho toàn bộ đề tài nghiên cứu. 1.1.2. Mô tả thực vật Cây bụi cao khoảng 1 m có cành nhỏ. Cành già hình trụ ưòn, cành non có bốn cạnh. Lá mọc đối hoặc mọc cách, mỏng, phiến lá hình thoi, dài, đỉnh lá nhọn, hoặc gần nhọn, gốc hơi hẹp, mép hơi răng cưa thô. Lá có hai mặt xanh, không lông, gân giữa nổi rõ. Có lá kèm hình trứng, đỉnh lá nhọn. Hoa đơn tính cùng gốc, hoa đực ở trên, hoa cái có 2-3 hoa ở dưới, hoa mọc ờ nách lá. Hoa cóó nách lá. Hoa có ba lá đài, hình tròn dài hoặc hình kim, mép có răng cưa thô, hoa đực có 3 tiền nhuỵ, hoa cái có 3 vòi nhuỵ nguyên. Ra hoa vào tháng 4-5. Công thức hoa: * cy' K3 Co A3 Gq * ? K,C„A.G@ Quả nang có ba mảnh, đưcmg kính 1 cm, hạt hình cầu màu nâu nhạt, đường kính 4 mm. Nội nhũ dầu. 1.2. Thành phần hoá học Năm 1989, các nhà khoa học Trung Quốc là Xie Jiamin và cộng sự [24] đã tiến hành nghiên cứu thành phần hoá học của rễ và thân cây Excoecaria cochinchinensis Lour. var. viridis Meư., và bước đầu đã phân lập được một số thành phần sau : TT Tên hợp chất ^ n/c Công thức hợp chất 1 Acid shikimic C7H10O5 185-187°c 0 ^ f 1 ^ O H ị OH ổH 2 ß-sitosterol Q 9H50O MW : 414,72 137-139°c CH2CH3 3 Acid tetracosanoic C24H48O2 MW : 368,02 82,5-83,5 °c TT Tên hợp chất nro ^ n/c Công thức hợp chất 4 Acid palmitic C 16 H 3 2 O 2 MW : 256,42 59-61°C 0 5 Acid stearic C18H35O2 M W : 284,47 68-70 °c c 6 Hentriacontan C 3 1H 6 4 MW ; 436,8466 62-65 °c 1.3. Công dụng - Hiện nay chưa thấy có tài liệu nào nói rõ về công dụng, tác dụng của Đơn lá xanh. - Tuy nhiên trong dân gian, Đơn lá xanh vẫn được sử dụng lẫn với Đơn lá đỏ để điều trị các trưcmg hợp: mụn nhọt, mẩn ngứa, ỉa chảy 1.4. Trồng trọt Cây Đcfn lá xanh có ở Tây Quảng Tây (Long Qiâu), Nam Quảng Đông, Đài Loan (Khai Đông), Nam Đảo, Việt Nam, Malayxia ở Việt Nam, cây mọc hoang ở nhiều nơi thuộc các tỉnh phía Bắc: Hoà Bình, Lạng Sơn, Vĩnh Phú làng hoa Ngọc Hà (Hà Nội). Cây được trồng lẫn với Đơn lá đỏ làm cảnh và làm thuốc. Trồng cây bằng cách gieo hạt và dâm cành. 1.5. Thu hái và chê biến Cây được thu hái quanh năm lẫn với Đơn lá đỏ, nhân dân thường hay hái lá, cành non vào buổi sáng sớm, mang về phơi âm can cho héo, sau đó cắt khúc 3-6 cm tiếp tục phơi ở sân dưới ánh nắng cho khô. Có khi sấy ở nhiệt độ 50°c trong 2-3 giờ. PHẦN 2 - THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 2.1. Nguyên vật liệu và phưofng pháp thực nghiệm 2.1.1. Nguyên vật liệu * Nguyên liệu nghiên cứu: Nguyên liệu nghiên cứu là lá tươi thu hái tại Hà Nội vào tháng 2/2002. Nguyên liệu được sấy khô trong tủ sấy ở 50 - 60°c, làm nhỏ dược liệu và bảo quản nơi khô ráo. * Hoá chất thí nghiệm: Các thuốc thử, dung môi hoá chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích trong Dược điển Việt Nam I và II. * Phương tiện và máy móc: - Sắc ký cột dùng chất hấp phụ là Sephadex LH-20. - SKLM dùng bản mỏng tráng sẵn Silicagen Gp254 của hãng MERCK (Đức). - Đo phổ tử ngoại trên máy UV-VIS Spectrophotometer Cary lE-Varian (Australia) tại phòng thí nghiêm trung tâm Trường Đại học Dược Hà Nội. - Đo phổ hồng ngoại trên máy FT-IR Spectrophotometer 1650-Perkin Elmer (USA) tại phòng thí nghiệm trung tâm Trường Đại học Dược Hà Nội. * Súc vật thí nghiệm: Chuột lang thuần chủng, khoẻ mạnh có trọng lượng 250 - 300 g do Viện VSDT cung cấp. Chuột nhắt trắng thuần chủng, khoẻ mạnh có trọng lượng từ 19 21 g do Viện VSDT cung cấp. [...]... Nâu nhat Màu UV366 Đỏ Xanh lơ Hồng nhạt Vàng nhạt Vàng Vàng nhạt Nâu tím Vàng nhạt Xanhnhat Nâu vàng Nâu nhat Xanhrửiat Xanh lơ Xám Xanh Xanh đen Màu ánh sáng thường Xanhnhat Vàng Màu NH3 - ánh sáng thường Nâu nhat Nâu Vàng Vàng nhạt Nâu Vàng Vàng Nâu Nâu Nâu Vàng Nâu Nâu Nâu Nâu nhat Nâu Vàng nhạt Vàng Vàng nhạt 2.2.2.3 Định lượng ílavonoỉd toàn phần trong dược liệu • Nguyên Uệu: Cây ^^Excoecaria cochinchinensis... trong cây Đơn lá xanh có phần đường là D-glucose 2.23 Nghiên cứu tác dụng sinh học 2.2.3.I Nghiên cứu tác dụng chống oxy hoá: • Nguyên liệu: Mẫu thử tác dụng chống oxy hoá là: - Dịch sắc 1:1 (Ig bột lá /Iml nước cất) - Cắn Aavonoid toàn phần • Phương pháp nghiên cứu: Xác định khả năng chống peroxy hoá lipid màng tế bào thực hiện theo phương pháp được miêu tả bởi Jadwiga Robax (Balan, 1987) và Mitso...2.1.2 Phương pháp nghiên cứu * Nghiên cứu về thực vật: - Quan sát, mô tả đặc điểm cây Đơn lá xanh bằng mắt thường và kính lúp - Thân, lá được cắt tẩy và nhuộm kép theo giáo trình Thực tập hình thái và giải phẫu thực vật [13] Quan sát dưới kính hiển vi - Soi bột trên kính hiển vi Olympus tại bộ môn Thực vật, Đại học Dược Hà Nội * Nghiên cứu về hoá học: í - Định tính các nhóm chất có... Euphorbmceae Hình 2 Đặc điểm thực vật của cây Đơn lá xanh 1 Cành mang hoa quả; 2, 3 Chùm hoa; 4,6 Hoa cái; 5 Lá kèm; 7 Lá đài; 8 Bầu bổ dọc; 9 Hoa đực - Đặc điểm vỉ phẫu thân và lá: Tiến hành cắt vi phẫu thân, lá, nhuộm kép, cố định tiêu bản trên phiến kính, quan sát, vẽ và chụp ảnh qua kính hiển v i • Cấu tạo giải phẫu lá: Gồm hai phần: - Gân lá: Lồi cả trên và dưới Biểu bì trên và biểu bì dưới gồm một hàng... hành thu hái mẫu cây vào thời điểm đang ra hoa, kết quả và có hạt giúp cho việc nhận biết mẫu cây được chính xác Với sự giúp đỡ của Tiến sỹ Thực vật học Vũ Xuân Phương (TTKHTN & CNQG), mẫu cây nghiên cứu đã được định tên khoa học có sự so sánh với các mẫu tiêu bản số 370, 371, 3860, 4045, 4068, 4094 hiện đang lưu giữ tại phòng Bảo tàng thực vật - Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh học - TTKHTN & CNQG... phản ứng trong ống nghiệm và sắc ký lớp mỏng theo các tài liệu [ 1][8 ] - Phân lập Aavonoid bằng sắc ký cột, chất hấp phụ là Sephadex [17] - Đo phổ tử ngoại và phổ hồng ngoại của chất phân lập được * Thử một số tác dụng sinh học: - Thử tác dụng chống viêm theo phương pháp gây viêm thực nghiệm của Tubaro và cộng sự tại Phòng Đông y thực nghiệm (Viện YHCT Việt Nam) - Thử tác dụng chống oxy hoá theo phương... ethanol vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch NaOH 10% thấy xuất hiện tủa đục và màu của dịch chiết vàng đậm hơn nhiều so với dịch chiết ban đầu - Phản ứng với dung dịch FeClj 5% : ƠIO 1 ml dịch chiết ethanol vào ống nghiệm, thêm vài giọt dung dịch FeClg 5% thấy xuất hiện tủa xanh đen Sơ bộ kết luận trong dịch chiết của mẫu thử có flavonoid ■ Định tính coumarin: - Phản ứng mở và đóng vòng lacton: Cho vào... Đặc điểm hình thái và đặc điểm vi học: Tên Việt Nam: Tên Trung Quốc: Đơn lá xanh Lục bối Quế hoa - Đặc điểm hình thái: Cây nhỏ, cao 0,5 - 1 m, cành già hình trụ tròn, cành non hình trụ vuông Lá mọc đối hoặc mọc cách, mỏng, phiến lá hình thoi hoặc hình thuôn dài có chiều rộng 2 - 4 cm, chiều dài 6 -1 2 cm, đỉnh lá nhọn hoặc gần nhọn, gốc hơi hẹp, mép lá hơi răng cưa thô, hai mặt lá xanh, không có lông,... Việt Nam) [20] - Thử tác dụng giảm co thắt cơ trơn theo phương pháp Magnus tại Phòng đông y thực nghiệm (Viện YHCT Việt Nam) và Bộ môn Dược lực (Đại học Dược Hà Nội) - Thử hoạt tính kháng khuẩn theo tài liệu [14] tại Khoa xét nghiệm (Viện YHCT Việt Nam) 2.2 Kết quả thực nghiệm và nhận xét 2.2.1 Nghiên cứu về thực vật học 2.2.1.1 Định tên khoa học Để định tên khoa học cho mẫu nghiên cứu, chúng tôi đã... phụ 8 12 đôi cong lên phía trên cách mép lá 2 - 3 mm thì hơi uốn khúc, hoặc tạo thành mạng lưới Lá kèm hình trứng, đỉnh lá nhọn, dài 1 mm Hoa mọc thành bông ở kẽ lá hay đầu cành, không có tràng hoa, hoa đơn tính, cùng gốc, hoa đực ở trên, hoa cái có 2 - 3 hoa ở dưới, hoa mọc ở nách lá, có chiều dài 1,5-2 mm Hoa đực có cuống hoa ngắn, đài hình trứng, chiều dài và rộng 1,5 - 1,8 mm, đỉnh đài ngắn nhọn, . nghiên cứu . 7 2.2. Kết quả thực nghiệm và nhận xét 8 2.2.1. Nghiên cứu về thực vật học 8 2.2.2. Nghiên cứu thành phần hoá học 15 2.2.3. Nghiên cứu tác dụng sinh học 27 PHẦN 3 - KẾT LUẬN VÀ. BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐAI HOC Dươc HÀ NÔI HÔ THỊ THANH HUYEN Bước ĐẦU NGHIÊN cứu THÀNH PHẦN HOÁ HỌC VÀ TÁC DỤNG SINH HỌC ■ . ■ ■ CỦA CÂY ĐƠN LÁ XANH (EXCOECARIA COCHINCHINENSIS LOUR. VAR. VIRIDIS MERR toàn và có hiệu quả, chúng tôi tiến hành đề tài " ;Bước đầu nghiên cứu thành phần hoá học và một số tác dụng sinh học của cây Đơn lá xanh (Excoecaria cochinchỉnensỉs Lour. var. viridis Merr.