B ộ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI • • • • NGUYỄN THỊ LAN NGHIÊN CỨU XÂY DựNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CEFUROXIM TRONG HUYÉT TƯƠNG BẰNG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (KHÓA LUẬN TÓT NGHIỆP D ư ợ c SỸ KHÓA 2002 % 'X ^ W 'Y Người hướng dẫn: PGS. TS. TRẦN TỬ TS. PHÙNG THỊ VINH " Nơi thực hiện: TRƯNG TÂM ĐÁNH GIÁ TƯƠNG ĐƯƠNG SINH HỌC - VIỆN KIÉM NGHIỆM THUỐC TRƯNG ƯƠNG Thời gian thực hiện: 03/2007 - 05/2007 HÀ NỘI 05 / 2007 LỜI CẢM ƠN Tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới các thầy cô và toàn thể cán bộ, nhân viên trong trường Đại học Dược Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt thời gian học tập và nghiên cứu. Đe hoàn thành luận văn này tôi xin chân thành bày tỏ lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Trần Tử An đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài và hoàn thành luận văn này. Tôi xin tỏ lòng biêt ơn chân thành tới ban giám đốc Viện kiểm nghiệm thuốc trung ương, TS. Phùng Thị Vinh - Giám đốc trung tâm đánh giá tương đương sinh học Viện kiểm nghiệm thuốc và toàn thể cán bộ nhân viên trung tâm đã tận tình hướng dẫn, quan tâm tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong suốt quá trình thực hiện đề tài để hoàn thành luận văn này. Tôi xin tỏ lòng biết ơn tới những người thân trong gia đình, toàn thể bạn bè động viên giúp đỡ tôi trong quá trình học tập và nghiên cứu. Một lần nữa tôi xin chân thành cảm ơn! Hà Nội, ngày 10 tháng 5 năm 2007 Nguyễn Thị Lan ĐẶT VẤN Đ Ê 1 PHẦN 1: TỎNG QUAN 3 1.1: ĐẠI CƯƠNG VỀ CEFUROXIM 3 1.1.1: Cấu trúc hóa h ọc 3 1.1.2: Tính chất vật lý 3 1.1.3: Tác dụng dược lý 3 1.1.4: Dược động học 4 1.2: YÊU CẦU CỦA PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG THUỐC TRONG HUYẾT TƯƠNG 5 1.2.1: Yêu cầu chung 5 1.2.2: Các chỉ tiêu cần thẩm định 5 1.2.3: Các phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc 8 trong huyết tương 8 1.3: ĐỊNH LƯỢNG CEFUROXIM TRONG HUYẾT TƯƠNG BẰNG HPLC 11 1.3.1: Chương trình H PLC 11 1.3.2: Nhận xét và lựa chọn: 15 PHẦN 2: THựC NGHIỆM VÀ KÉT QUẢ 16 2.1: NGUYÊN - VẬT LIỆU DÙNG TRONG NGHIÊN c ứ u 16 2.1.1: Nguyên liệu, hóa chất, dung m ôi 16 2.1.2: Dụng cụ thiết bị 16 2.1.3: Đối tượng nghiên cứu trong xây dựng và thấm định phương pháp phân tích 17 2.2: KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 17 2.2.1: Nghiên cứu, xây dựng qui trình kỹ thuật 17 2.2.2. Thẩm định phương pháp phân tích 19 2.3. BÀN LUẬN 30 PHẦN 3: KÉT LUẬN VÀ ĐÈ XUẤT 32 3.1. KẾT LUẬN 32 3.2. ĐỀ XUẤT 33 MỤC LỤC DANH MỤC BẢNG, s ơ ĐỒ Sơ đồ 1: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết pha rắn 9 Sơ đồ 2: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp chiết lỏng-lỏng 10 Sơ đồ 3: Các bước xử lý mẫu bằng phương pháp tạo tủa 11 Bảng 1: Chương trình HPLC định lượng cefuroxim acetyl trong huyết tương 14 Bảng 2: Sự phụ thuộc giữa tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội và nồng độ Cefuroxim chuẩn pha trong huyết tương 24 Bảng 3: Ket quả xác định giới hạn định lượng dưới 26 Bảng 4: Ket quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại trong ngày 27 Bảng 5: Kết quả khảo sát độ đúng, độ lặp lại giữa các ngày 28 Bảng 6 : Kết quả khảo sát độ ổn định của Cefuroxim trong huyết tương 29 DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng 20 Hình 2: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có chuẩn nội Acetanilid . 21 Hình 3: sắc ký đồ mẫu huyết tương trắng có pha chuẩn nội và chuẩn Cefuroxim (nồng độ 5 Ị4,g/mL) 21 Hình 4: sắc ký đồ huyết tương trước khi uống thuốc 22 Hình 5: sắc ký đồ huyết tương người sau khi uống viên Haginat 250 mg 1,5 giờ 22 Hình 6. Thông tin của pic Cefuroxim của mẫu chuẩn tự tạo pha trong huyết tương 23 Hình 7: Đường biểu diễn sự phụ thuộc của tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội theo nồng độ Cefuroxim chuẩn pha trong huyết tương 25 BẢNG VIỂT TẮT ACE Acetanilid CFX Cefuroxim HPLC High Performance Liquid Chromatography - Sac ký lỏng hiệu năng cao LLOQ Giới hạn định lượng dưới MeCN Acetonitril MeOH Methanol RSD Độ lệch chuẩn tương đối SD Độ lệch chuẩn SKD Sinh khả dụng TB Trung bình TĐSH Tương đương sinh học ĐẶT VẤN ĐÈ Song song với sự phát triển của khoa học kỹ thuật và ngành công nghệ dược phẩm, lĩnh vực phân tích phục vụ cho công tác đảm bảo chất lượng thuốc cũng không ngừng lớn mạnh. Nhu cầu về nghiên cứu sinh khả dụng (SKD), tương đương sinh học (TĐSH) cũng như tương đương điều trị ở Việt Nam ngày một tăng thêm. Ket quả đánh giá SKD và TĐSH giúp các nhà sản xuất lựa chọn được công thức, kỹ thuật bào chế tối ưu tạo ra các sản phẩm thuốc chất lượng tốt, giúp các bác sỹ có thêm cơ sở để chọn thuốc thay thế hay hiệu chỉnh liều dùng cho phù hợp với từng bệnh nhân. Để thực hiện được các nghiên cứu đánh giá SKD và TĐSH, một trong những nội dung quan trọng là xây dựng qui trình kỹ thuật chiết tách, xử lý mẫu và phân tích định lượng thuốc trong dịch sinh học ( máu, huyết tương, nước tiểu, ). Qúa trình phân tích thuốc trong dịch sinh học thường gặp nhiều khó khăn do khi thuốc sau khi vào cơ thể thường bị chuyển hóa tạo thành nhiều dẫn chất khác nhau, hơn nữa nồng độ thuốc trong các dịch sinh học thường rất thấp, môi trường dịch sinh học phức tạp. Chính vì vậy, phương pháp phân tích phải được thẩm định rất chặt chẽ theo những qui định riêng để đảm bảo kết quả thực nghiệm đúng và chính xác. Hiện nay ở Việt Nam chưa có văn bản chính thức đánh giá tác dụng sinh học đối với các chế phẩm sản xuất trong nước, trong hồ sơ đăng ký thuốc chưa có yêu cầu cung cấp kết quả nghiên cứu về TĐSH. Để ngành dược Việt Nam phát triển và hội nhập với các nước trên thế giới việc triển khai nghiên cứu TĐSH của thuốc có ý nghĩa về mặt khoa học và thực tế quản lý thuốc ở nước ta hiện nay nhằm nâng cao hiệu quả điều trị và khả năng cạnh tranh. Trước nhu cầu đó chúng tôi lựa chọn đề tài: 1 “ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng cefuroxim trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” Đe tài nhằm giải quyết các mục tiêu: ❖ Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng cefuroxim trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao. ♦> ứng dụng được phương pháp đã xây dựng để định lượng cefuroxim trong huyết tương người phục vụ cho nghiên cứu dược động học và đánh giá tương đương sinh học của chế phấm. Chúng tôi hy vọng rằng kết quả nghiên cứu này sẽ có giá trị thực tiễn cao, góp phần vào việc thúc đẩy ứng dụng sắc ký lỏng hiệu năng cao để định lượng các chất trong dịch sinh học nhằm phục vụ cho đánh giá tương đương sinh học của thuốc. 2 PHẦN 1: TỎNG QUAN 1.1: Đại cương về cefuroxim 1.1.1: Cấu trúc hóa học H jC J , (lRS)-l-Acetoxyethyl(6R,7R)-3- carbamoyloxymethyl-7- [(Z)-2-furan-2-yl-2-methoxyiminoacetylamino]-8-oxo-5- thia-l-azabicyclo[4.2.0]oct-2-ene-2-carboxylat 1.1.2: Tỉnh chất vật lỷ [10][18][19] Bột màu trắng hoặc gần như trắng, tan trong nước, không tan trong ethanol. Rất ít tan trong benzen, cloroform. [<4 ° =+60“ pKa (trong nước) = 2.5 1.1.3: Tác dụng dược lý [3] [8] Cefiiroxim là kháng sinh bán tổng hợp phổ rộng, thuộc nhóm cephalosporin, thuốc tiêm là dạng muối natri và thuốc uống là dạng acetyl este. Cefuroxim acetyl là tiền chất của cefuroxim, chất này có rất ít hoạt tính kháng khuẩn khi chưa bị thủy phân thành cefuroxim trong cơ thể sau khi được hấp thu. Cefuroxim có hoạt tính kháng khuẩn hữu hiệu và rất đặc trưng chống nhiều tác nhân gây bệnh thông thường, kể cả chủng tiết beta - lactamase của cả vi khuan Gram dương và Gram âm. 3 1.1.4: Dược động học [3][11 ] Sau khi uống, cefuroxim acetyl được hấp thu qua đường tiêu hóa và nhanh chóng bị thủy phân ở niêm mạc ruột và trong máu để giải phóng cefuroxim vào hệ tuần hoàn, gốc acetyl được chuyển hóa thành acetaldehyd và acid acetic. Thuốc được hấp thu tốt nhất trong bữa ăn. Nồng độ đỉnh của cefuroxim trong huyết tương thay đổi tùy theo dạng viên hay dạng hỗn dịch. Nồng độ đỉnh trong huyết tương của hỗn dịch uống đạt 71% nồng độ đỉnh trong huyết tương của thuốc viên. Diện tích dưới đường cong (AUC) của hỗn dịch uống đạt 91% AƯC của thuốc viên. Do đó thuốc viên và hỗn dịch uống cefuroxim acetyl không thể thay thế nhau theo tương quan mg/mg. Ở người trưởng thành khi uống cefuroxim dạng viên nén 125mg, 250mg, 500 mg, lg ngay sau khi ăn thì đạt nồng độ đỉnh trong huyết tương sau 2 - 3 giờ lần lượt là 2,1; 4,7; 7; 13,6 |ug/mL. Sau 6 giờ giảm xuống còn 0,3; 0,7; 2,2; 3,4 |ig/mL. Muối natri được dùng theo đường tiêm bắp hoặc tiêm tĩnh mạch, ở người khỏe mạnh khi tiêm bắp liều 500mg, 750mg, lg thì sau 1 5 -6 0 phút nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt lần ỉượt 20,8 - 25,7; 26 - 34,9; 32 - 40|ug/mL. Khi tiêm tĩnh mạch liều 500mg, lg nồng độ đỉnh trong huyết tương lần lượt là 2,1 và 3,6 |Lig/mL sau 4 giờ. Khi tiêm tĩnh mạch liều 750mg nồng độ đỉnh trong huyết tương đạt 24|ig/mL sau 1 giờ tiêm và đạt 3,5|.Lg/mL sau 4 giờ tiêm. Có từ 33-50% cefuroxim trong hệ tuần hoàn liên kết với protein huyết tương. Cefuroxim phân bố rộng khắp cơ thể kể cả dịch màng phổi, đờm, xương, hoạt dịch và thủy dịch. Thể tích phân bố biểu kiến ở người lớn khỏe mạnh nằm trong khoảng từ 9,3-15,8 lít/l,73m2. Cefuroxim đi qua hàng rào máu não khi màng não bị viêm. Thuốc qua nhau thai và có bài tiết qua sữa mẹ. ở người trưởng thành nửa đời thuốc trong huyết tương từ 1,2-1,6 giờ và kéo dài ở trẻ sơ sinh và người suy thận. Cefuroxim không bị chuyển hóa và 4 [...]... Ỷ Sắc ký Sắc ký > ■ y Sơ đô 3: Các bước xử lỷ mâu băng phương pháp tạo tủa 1.3: Định lượng cefuroxim trong huyết tương bằng HPLC 1.3.1: Chương trình HPLC (9) (6) (4) Đe định lượng các chất trong dịch sinh học (huyết tương, mô, nước tiểu), thường sử dụng các phương pháp phân tích hóa lý ( điện di mao quản, sắc ký khí, sắc ký lỏng, ) Đối với một số hoạt chất có tác dụng dược lý đặc hiệu có thể định lượng. .. định lượng bằng phương pháp vi sinh ( một số chất kháng sinh/kháng khuẩn) hoặc phương pháp miễn dịch đặc hiệu So với các phương pháp vi sinh, miễn dịch; phương pháp phân tích hóa lý có phạm vi ứng dụng rộng hơn và thường cho kết quả ổn định và dễ triển khai hơn Trong các phương pháp phân tích hóa lý, sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) thường được sử dụng trong nghiên cứu SKD và TĐSH Các phương pháp thường... tượng nghiên cứu trong xây dựng và thẩm định phương pháp phân tích * Mầu trắng: Huyết tương trắng - Viện huyết học và truyền máu t* trung ương ❖ Mầu chuẩn hay mẫu thử tự tạo: Hòa tan CFX chuẩn trong huyết tương trắng với các nồng độ thích hợp ♦> Mầu thử: Huyết tương của người tình nguyện sau khi uống CFX chứng hoặc thử 2.2: KÉT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ NHẬN XÉT 2.2.1: Nghiên cứu, xây dựng qui trình kỹ thuật Xây. .. tham khảo các phương pháp định lượng trong huyết tương bằng phương pháp HPLC đã được công bố, dựa vào công thức phân tử, tính chất lý hóa học cũng như điều kiện thí nghiệm ở nước ta để tiến hành xây dựng qui trình định lượng trong huyết tương bằng HPLC Từ kết quả thực nghiệm, chúng tôi đã lựa chọn được qui trình xử lý mẫu và điều kiện sắc ký đáp ứng yêu cầu của phép phân tích có khả năng tách riêng... độ Cefuroxim trong mẫu huyết tương với tỷ lệ diện tích pic chuẩn/chuẩn nội thu được Khoảng tuyến tính này phù họp để định lượng Cefuroxim trong huyết tương Khoảng tuyến tính xác định được từ 0,26 - 10|ig/mL 2.2.23 Xác định giới hạn định lượng dưới (LLOQ) Chuẩn bị mẫu chuẩn Cefuroxim nồng độ 0,25 |ng/mL trong huyết tương có chứa chuấn nội Acetanilid Xử lý mẫu và tiêm sắc ký 25 r Bans 3: Kêt quả xác định. .. khoảng nồng độ, phương pháp cho độ đúng từ 96,6 - 102,1% và độ lặp lại khác ngày với giá trị RSD (4,614,2%), phương pháp được nghiên cứu có độ đúng, chính xác cao, đáp ứng yêu cầu đối với phương pháp dùng trong sinh học 2.2.2.5 Khảo sát độ ổn định của Cefuroxim trong huyết tương Chuẩn bị các dung dịch Cefuroxim chuẩn trong huyết tương có nồng độ khoảng 25jig/mL Một phần mẫu được xử lý và định lượng ngay... trình HPLC định lượng cefuroxim acetyl trong huyết tương 14 1.3.2: Nhận xét và lựa chọn: • • • Mục tiêu của đề tài là xây dựng qui trình định lượng cefuroxim trong huyết tương người bằng phương pháp HPLC nên các chỉ tiêu được ưu tiên lựa chọn là: ❖ Môi trường thử: Máu người ❖ Detector: Lựa chọn detector ƯV, áp dụng khi phân tích các chất có giới hạn định lượng cỡ Ịig /m L phù hợp với trường hợp cefuroxim. .. mẫu huyết tương bao gồm: + Độ ổn định sau 3 chu kỳ để đông - rã đông + Độ ổn định thời gian ngắn ở nhiệt độ phòng + Độ ổn định thời gian dài để đông lạnh trong khoảng thời gian dự định 1.2.3: Các phương pháp chiết tách thường dùng cho định lượng thuốc trong huyết tương (6) Có 3 phương pháp xử lý mẫu hay được sử dụng với các mẫu dịch sinh học: tủa protein với dung môi hữu cơ hoặc acid, chiết lỏng - lỏng. .. tiết ở ống thận Thuốc đạt nồng độ cao trong nước tiểu Sau khi tiêm, hầu hết liều sử dụng thải trừ trong vòng 24 giờ Probenecid ức chế thải trừ cefiiroxim qua ống thận làm nồng độ trong huyết tương tăng cao và kéo dài hơn Cefuroxim chỉ thải trừ qua mật với lượng rất nhỏ Nồng độ cefuroxim giảm khi bị thẩm tách 1.2: Yêu cầu của phương pháp định lượng thuốc trong huyết tương [4] [7] [20] 1.2.1: Yêu cầu... dihydrophosphat s Acetanilid > Huyết tương dùng trong nghiên cứu: huyết tương trắng mua của Viện huyết học và truyền máu trung ương Chọn các lô huyết tương không có nhiều pic lạ rải rác trong khoảng thời gian 4- 10 phút 2.1.2: Dụng cụ thiết bị Tất cả dụng cụ thiết bị đều được chuẩn hóa theo ISO/IEC 17025 - 2005 và GLP bao gồm: > Thiết bị phân tích: Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao Merck - Hitachi D - 7000: