Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC ) Nghiên cứu định lượng tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao ( HPLC )
BỘ YTẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI «A# *£# •£# «1# #J% #J% #J% #1% #Ị% #J% rj% rj% rj% #J% #J% VC THỊ THÃNG LONG NGHIÊN CỨU ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN NGUYÊN LIỆU BẰNG PHƯƠNG PHÁP SẮC KÝ LỎNG HIỆU NĂNG CAO (HPLC) (KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP Dược sĩ KHÓA 2 0 0 2 - 2007) Người hướng dẫn: PGS. TS. Trần Đức Hậu Th.s. Trần Thị Lan Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa dược Trường Đại học Dược Hà Nội Thời gian thực hiện: Tháng 8/2006 - 3/2007 HÀ NỘI - 2007 *■ £ Ờ Z @ c  M Ơ Q l OW/Vfe h ỉí, ehfr tòi hày, tẢ Imtíị tuêí Ổ4L &ău ếắa txà ehún thành nhâí tẩi những, MỊẨỈỈti thầy, đã tận tình ehl bả&f hưồềtụ dẫn, ạỉúfL ĩtđ tối haàễt thành Uhjổ€L luận nàự: Q&. Q'wut <ĩ)ứ£ /Jôậuf @hủ nhiêm hă MjML 'TCócl dư&n. <£. &V4WL & h i Ẩ U íi ỉ l ỉô u j ổ n jg ,f í ị i ủ n q , o i ềể L t ó I t í ổ n 3 K ếífl i L ư đ n . £7í5/ eủềiự, deiềi ạửi Lòi eúm ổn, chảtL thành lởi eổia tlĩầiẬ eàf eáễí hà eiĩa hà niMi 'SôẩcL dưđ& đă giúp, đẵý động, úỉeti tồi ỉiíìitti thành khjẩ€L luận ễtàự Obưt itư&a eảnt (Ui &ự ạúfL đẵ eủa eúa thầy, eA, eún eún bẠ ễễtâềi '3ŨOÚ phản tíefaf '3ôẩcL oA &đ. @juối ứiẩềtí/ driềt eâễễi (Ui ạla đình, bạtt l%è đă tuồn, giúp, đđý đ&ng, mèn, Ulúeh lí tồi tvMUẶ t h à i ạiait qua . Sinh ữiỀết: (JJủ & h i ^ d ỉh ă n ụ , j£f)nụ MỤC LỤC Nội dung Trang Danh mục các chữ viết tắt. Danh mục các bảng số liệu. Danh mục các hình vẽ. ĐẶT VẤN ĐỂ 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN. 2 1.1. Tổng quan về tobramycin. 2 1.2. Một số phương pháp định lượng tobramycin. 4 1.2.1. Định lượng tobramycin bằng phương pháp vi sinh. 4 1.2.2. Định lượng tobramycin bằng phương pháp HPLC. 5 1.3. Tổng quan về HPLC. 8 1.3.1. Nguyên tắc. 8 1.3.2. Cơ sở lý thuyết. 9 1.3.3. Nguyên tắc cấu tạo hệ thống HPLC. 9 1.3.4. Các thông số đặc trưng của quá trình sắc ký. 11 1.3.5. Cơ sở lý thuyết của việc lựa chọn điều kiện sắc ký. 13 1.3.6. Cách đánh giá pic. 15 1.3.7. ứng dụng của HPLC 15 PHẦN 2: ĐỐI TƯỢNG, THIÊT BỊ, HÓA CHẤT, NỘI DUNG 17 VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN cứ u. 2.1. Đối tượng. 17 2.2. Thiết bị dụng cụ hóa chất. 17 2.3. Nội dung và phương pháp nghiên cứu. 18 2.3.1. Nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật. 18 2.3.2. Đánh giá phương pháp vừa xây dựng về các mặt. 18 2.3.3. Một số công thức tính toán trong xử lý thông kê kết quả. 18 PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KÊT QUẢ. 20 3.1. Xây dựng quy trình kỹ thuật để định lượng tobramycin 20 bằng phương pháp HPLC. 3.1.1. Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký. 20 3.1.2. Khảo sát để lựa chọn điều kiện sắc ký. 20 3.1.3. Thử tính thích hợp của hệ thống. 24 3.1 .4. Xây dựng phương pháp định lượng. 26 3.1.5. Định lượng tobramycin nguyên liệu bằng 27 phương pháp mói xây dựng. 3.2. Đánh giá phương pháp định lượng. 28 3.2.1. Tính chính xác. 28 3.2.2. Tính tuyến tính. 29 3.2.3. Tính đúng. 30 3.2.4. Tính đặc hiệu. 32 3.3. Bàn luận và kết quả. 34 PHẦN 4: KẾT LUẬN ĐỂ x u ấ t 36 4.1. Kết luận. 36 4.2. Đề xuất. 36 TÀI LIỆU THAM KHẢO DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT CTCPDP DĐVN III HPLC KTCL NXB PA PTL TW VKN : Công ty cổ phần dược phẩm. : Dược điển Việt Nam III. : Sắc ký lỏng hiệu năng cao. (High performance liquid chromatography). : Kiểm tra chất lượng. : Nhà xuất bản. : Tinh khiết phân tích. : Phân tử lượng. : Trung ương. : Viện kiểm nghiệm. DANH MỤC CÁC BẢNG s ố LIỆU Trang Bảng 3.1 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của nhiệt độ phản ứng 22 Bảng 3.2 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của thời gian đun cách thủy 22 Bảng 3.3 Kết quả khảo sát ảnh hưởng của lượng thuốc thử 23 Bảng 3.4 Kết quả khảo sát tính thích hợp của hệ thống HPLC 25 Bảng 3.5 Kết quả định lượng tobramycin nguyên liệu 28 Bảng 3.6 Cách pha các dung dịch để khảo sát khoảng tuyến tính 29 Bảng 3.7 Kết quả khảo sát tính tuyến tính 29 Bảng 3.8 Kết quả đánh giá tính đúng của phương pháp 31 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình 1.1 Sơ đồ khối tổng quát hệ thống HPLC 10 Hình 1.2 Sắc ký đồ của 2 chất và các thông số đặc trưng 11 Hình 3.1 Phổ hấp thụ của dẫn chất tạo bởi tobramycin vói thuốc thử X 21 Hình 3.2 Đồ thị biểu diễn sự phụ thuộc giữa nồng độ và diện tích 30 pic của dẫn chất tobramycin Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn phương trình hồi quy tuyến tính về mối 31 tương quan giữa lượng cân và lượng hoạt chất tìm lại Hình 3.4 Sắc ký đồ mẫu trắng 33 Hình 3.5 Sắc ký đồ của dẫn chất tạo bởi Tobramycin với thuốc thử X 33 ĐẶT VÂN ĐỂ • Lịch sử ngành kháng sinh được hình thành từ khi Alexander Fleming tình cờ tìm ra Penicillin vào năm 1929. Qua một quá trình phát triển lâu dài cùng với những thành tựu lớn lao trong cuộc đấu tranh phòng chống bệnh tật, kháng sinh đã trở thành một trong những nhóm thuốc quan trọng nhất của y học hiện đại. Tobramycin là một kháng sinh thuộc nhóm aminoglycosid, có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr(-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr(+) hiếu khí, hiện đang được sử dụng rộng rãi và có mặt trên thị trường dược phẩm với những dạng bào chế khác nhau: thuốc nhỏ mắt, thuốc tiêm Việc xác định hàm lượng của Tobramycin trong các chế phẩm là rất cần thiết. Cũng như những kháng sinh khác trong nhóm aminoglycosid, Tobramycin không hấp thụ quang ở vùng tử ngoại - khả kiến, vì vậy phương pháp định lượng phổ biến vẫn là phương pháp vi sinh vật. Phương pháp này mất nhiều thời gian và độ chính xác không cao. Dược điển Anh áp dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao với detector ampe kế, thêm môi trường kiềm sau cột còn dược điển Mỹ cũng sử dụng phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao nhưng tạo dẫn xuất trước cột. Nhìn chung cả hai phương pháp này đều rất phức tạp, dùng trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền. Xuất phát từ yêu cầu thực tế của phòng thí nghiệm, chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu và xây dựng một quy trình định lượng Tobramycin bằng phương pháp HPLC đơn giản, dễ thực hiện và kinh phí thấp hơn. Trong khóa luận này, chúng tôi đã tiến hành đề tài: " Nghiên cứu định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp HPLC M với mục tiêu sau: 1. Xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp HPLC. 2. Đánh giá phương pháp mới xây dựng với các chỉ tiêu của một phương pháp định lượng. 1 PHẦN 1: TỔNG QUAN 1.1 TỔNG QUAN VỂ TOBRAMYCIN 1.1.1 Công thức cấu tạo C1 8 H3 7 N5 0 9 PTL: 467.5 Tên khoa học: 4-0-(3-Amino-deoxy-a-D-glucopyranosyl)-2-deoxy-6-0-(2,6- diamino-2,3,6-trideoxy-a-D-ribo-hexopyranosyl)-L-streptamine. [16] 1.1.2 Tính chất lý hóa Bột màu trắng hoặc trắng ngà. Dễ tan trong nước, rất khó tan trong ethanol, thực tế không tan trong cloroform và ether. Góc quay cực riêng [a] D 2 0 : +138° đến +148°. [6 ] 1.1.3 Nguồn gốc Chiết xuất từ môi trường nuôi cấy Streptomyces tenebrarius, có thể bán tổng hợp từ kanamycin B. [6 ] 1.1.4 Dược động học Aminoglycosid là cation nên hầu như không hấp thu qua ruột. Tiêm bắp hấp thu tốt, đôi khi tiêm tĩnh mạch. ít gắn vói protein huyết tương. Do tính có 2 cực nên khó đi vào các mô kể cả não. Đạt nồng độ cao trong vỏ thận. Dùng cho phụ nữ mang thai, thuốc tích lũy trong thai gây độc cho cả mẹ và con. Đào thải chủ yếu qua thận, nên giảm liều khi suy thận, thường dựa vào creatinin huyết thanh để tránh độc tính. Hiện nay dùng chế độ một liều cao và duy nhất trong ngày cho thấy hiệu quả hơn và ít độc tính hơn dùng liều nhỏ và nhiều lần trong ngày như trước đây. Trừ các ca nặng (nhiễm Pseu. aeruginosa ò người giảm neutrophile và các ca suy thận (cần khoảng cách liều dài hơn 24 giờ). Thời gian bán thải của Tobramycin: 2 -5 giờ. [5] 1.1.5 Tác dụng và cơ chế tác dụng Tobramycin là một kháng sinh nhóm aminoglycosid có tác dụng trên nhiều vi khuẩn Gr(-) hiếu khí và một số vi khuẩn Gr(+) hiếu khí. Thuốc không có tác dụng với Chlamydia, nấm, virus và đa số các vi khuẩn yếm khí. Tobramycin rất giống Gentamycin về tính chất vi sinh học và độc tính: chúng có cùng nửa đời thải trừ, nồng độ đỉnh trong huyết thanh, ít liên kết với protein, thể tích phân bố và sự bài tiết chủ yếu qua lọc ở cầu thận. Điểm quan trọng nhất của Tobramycin là có hoạt tính đối vói phần lớn các chủng Pseudomonas aeruginosa mạnh hơn cả Gentamycin. Cơ chế tác dụng: Tobramycin ức chế sự tổng hợp protein ở các vi khuẩn nhậy cảm bằng cách gắn không thuận nghịch vói các tiểu phân 30S của ribosom. [2], [9] 1.1.6 Chỉ định Được chỉ định trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng đe dọa tói tính mạng đặc biệt với các bệnh mà nguyên nhân chưa rõ ràng hoặc bị nhiễm khuẩn huyết do vi khuẩn Gr(-). Trong điều tri các bệnh nhiễm khuẩn nặng, Tobramycin được phối hợp vói một kháng sinh nhóm beta-lactam. Trong các bệnh nhiễm khuẩn nặng toàn thân do Pseudomonas spp. gây ra, Tobramycin có thể dùng phối hợp vói một kháng sinh nhóm beta-lactam chống Pseudomonas. 3 Trong bệnh viêm nội tâm mạc do Streptococcus faecalis hoặc alpha - Streptococcus gây ra có thể dùng Tobramycin phối hợp vói ampicilin hoặc benzilpenicilin nhưng phải tiêm riêng rẽ. [2 ] 1.1.7 Chống chỉ định Với người có tiền sử dị ứng vói các kháng sinh loại aminoglycosid, người nghe kém và người có bệnh thận. [2 ] 1.1.8 Dạng bào chế và liều lượng Tobramycin sulphat: dung dịch tiêm 40 mg/ml (người lớn), 10 mg/ml (trẻ em) IM, IV. Bột pha tiêm 30 - 40 mg/lọ. Lọ 5 ml 0,3 % để nhỏ mắt. Tuýp 3,5 g mỡ tra mắt 0,3 %. Dạng thuốc hít qua đường miệng bằng máy khi dùng để điều trị nhiễm P. aeruginosa đường hô hấp ở bệnh nhân bị xơ nang hóa. [9] 1.2 MỘT SỐ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN 1.2.1 Định lưọng Tobramycin bằng phương pháp vi sinh 1.2.1.1 Phương pháp 1 [13] - Chủng vi khuẩn: Bacillus subtilis CMCC(B)63501. - Dung dịch đệm phosphat pH 7,8 ± 0,1 Dikali hydrophosphat : 5,59 g Kali dihydrophosphat : 0,41 g Môi trường định lượng: Pepton 5,0 g Cao thịt 3,0 g Dikali hydrophosphat 3,0 g Thạch 15,0 - 20,0 g Nước cất 1 0 0 0 ml pH sau khi tiệt trùng 7,8 ± 0,2 - Chuẩn bị dung dịch chuẩn và thử sau đó tiến hành thử và tính kết quả theo [15] 4 [...]... đối: E(% ^ = tt a (n- 1) Xâvix ^ ) - Khoảng tin cậy X (2 . 4) Vn 19 ± taSx 1 0 0 (2 . 5) (2 . 6) PHẦN 3: THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 XÂY DỤNG QUY TRÌNH KỸ THUẬT ĐỂ ĐỊNH LƯỢNG TOBRAMYCIN BANG PHƯƠNG PHÁP HPLC 3.1.1 Nguyên tắc lựa chọn điều kiện sắc ký Chọn phương pháp sắc ký: Tobramycin là chất hữu cơ phân cực, tan nhiều trong nước Vì vậy để phân tích và định lượng tốt, chúng tôi chọn phương pháp sắc ký lỏng hiệu. .. định lượng chất trong hỗn hợp và xác định giới hạn tạp chất Các phương pháp định lượng bằng sắc ký đều dựa trên nguyên tắc: nồng độ của một chất tỷ lệ với chiều cao hoặc diện tích pic của nó Một số phương pháp định lượng hay áp dụng trong HPLC: > Phương pháp chuẩn ngoại (external Standard method) Đây là phương pháp định lượng cơ bản trong đó cả hai mẫu chuẩn và mẫu thử đều được tiến hành sắc ký trong... các phương pháp định lượng nêu trên, chúng tôi nhận thấy: - Định lượng bằng phương pháp vi sinh: Mất nhiều thòi gian và có độ chính xác không cao - Định lượng bằng phương pháp HPLC: Tiến hành phức tạp, đòi hỏi có trang thiết bị và thuốc thử đắt tiền Vì vậy vói các trang thiết bị sẵn có ở phòng thí nghiệm chúng tôi đặt vấn đề nghiên cứu xây dựng một quy trình định lượng Tobramycin bằng phương pháp HPLC. .. PA - Methanol dùng cho HPLC (Merck) 17 - Nước cất tinh khiết 2 lần (cất trực tiếp tại Bộ môn Hóa vồ cơ trường đại học Dược Hà Nội) dùng cho máy HPLC - Một vài hóa chất khác 2.3 NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN c ứ u 2.3.1 Nghiên cứu, xây dựng quy trình kỹ thuật - Tham khảo các phương pháp định lượng Tobramycin đã được công bố - Tham khảo các phương pháp định lượng Tobramycin bằng HPLC - Dựa vào cấu tạo... thống sắc ký Tiến hành sắc ký theo điều kiện đã chọn Ghi các giá trị diện tích pic thu được trên sắc ký đồ của mẫu thử và mẫu chuẩn tương ứng Tiến hành định lượng 5 mẫu thử và 5 mẫu chuẩn Tobramycin theo các bước ở mục 3.1.4 Kết quả định lượng được trình bày ở bảng 3.5 27 Bảng 3.5: Kết quả định lượng Tobramycin nguyên liệu Mẫu thử STT Lương cân ‘(g) Mẫu chuẩn Diện tích pic Lượng cân (mAU.min) (g) Diện... cho thấy nguyên liệu Tobramycin đem định lượng có hàm lượng là: 98,47 ± 0,42 % 3.2 ĐÁNH GIÁ PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG Chúng tôi tiến hành đánh giá phương pháp định lượng Tobramycin nguyên liệu bằng HPLC mói xây dựng với các chỉ tiêu sau: - Đánh giá tính chính xác - Đánh giá tính tuyến tính - Đánh giá tính đúng - Đánh giá tính đặc hiệu 3.2.1 Tính chính xác Nguyên tắc: Độ chính xác của phương pháp được... sắc ký lỏng hiệu năng cao pha đảo Chọn cột sắc ký: Trong phương pháp định lượng HPLC pha đảo, cột sắc ký thông dụng là Nucleosil C , C18, Với điều kiện sẵn có của phòng thí 8 nghiệm chúng tôi sử dụng cột Nucleosil (2 50 X 4 mm, 5 |um) Chọn pha động: Trong phương pháp HPLC pha đảo, pha động thông dụng nhất là acetonitril, methanol, nước hay hỗn hợp của methanol (acetonitril) với nước Do Tobramycin tan... dựng phương pháp định lượng, đánh giá tính thích hợp của hệ thống và tiến hành định lượng Tobramycin nguyên liệu 2.3.2 Đánh giá phương pháp vừa xây dựng về các mặt: - Tính chính xác - Tính tuyến tính - Tính đúng - Tính đặc hiệu 2.3.3 Một số công thức tính toán trong xử lý thống kê kết quả - Giá trị trung bình: (2 1 ) - Độ lệch chuẩn: (2 . 2) 18 Độ lệch chuẩn tương đối (RSD): s- = =xioo (2 . 3) X - Sai số... của Tobramycin cũng như điều kiện thực nghiệm ở nước ta hiện nay để xây dựng quy trình kỹ thuật định lượng Tobramycin bằng phương pháp HPLC - Bằng thực nghiệm nghiên cứu các điều kiện tiến hành để xây dựng phương pháp + Khảo sát điều kiện tạo dẫn chất của Tobramycin với thuốc thử X + Khảo sát điều sắc ký: chọn cột, pha động, bước sóng, thể tích tiêm và tốc độ dòng thích hợp để định lượng + Xây dựng phương. .. dựa trên mẫu chuẩn Tobramycin đã biết hàm lượng theo công thức sau: % X= A »X m *x P Acxm, At , Ac: là diện tích pic tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mAU.min) mt, mc: là lượng cân tương ứng của mẫu thử và mẫu chuẩn (mg) p : là hàm lượng % ghi trên nhãn của Tobramycin chuẩn 3.1.5 Định ỉượng Tobramycin nguyên liệu bằng phương pháp mới xây dựng Chuẩn bị và cho hệ thống HPLC chạy ổn định vói pha động