Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 36 (2015): 1-11 PHÂN LẬP VÀ TUYỂN CHỌN MỘT SỐ DÒNG NẤM BẢN ĐỊA PHÂN HỦY MỘT SỐ VẬT LIỆU HỮU CƠ TỪ NỀN ĐẤT THÂM CANH LÚA TẠI XÃ PHONG HÒA, HUYỆN LAI VUNG, TỈNH ĐỒNG THÁP Võ Thị Ngọc Cẩm1, Nguyễn Thị Kiều Oanh1, Đỗ Hoàng Sang1, Nguyễn Thị Tố Quyên1, Đỗ Thị Xuân1, Dương Minh Viễn1 Nguyễn Khởi Nghĩa1 Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ Thông tin chung: Ngày nhận: 15/12/2014 Ngày chấp nhận: 26/02/2015 Title: Isolation and identification of some native organic agricultural waste decomposing fungi from intensive rice cultivation soil at Phong Hoa village, Lai Vung district, Dong Thap Province Từ khóa: Phân lập, nấm, phân hủy, vật liệu hữu đất canh tác lúa Keywords: Isolation, fungi, decomposition, organic agricultural wastes and rice cultivation soil ABSTRACT Aim of this study was to isolate native fungal strains from an intensive rice cultivation soil sample at Phong Hoa village, Lai Vung district, Dong Thap province to quickly decompose organic wastes Soil sample was collected from the rice farm with historical rice cultivation of more than 30 years The Bushnell Haas Medium (BHM) media contaning carboxymethyl cellulose (CMC)/lignin as the only carbon source was used to isolate and purify fungi The comercial fungal strain of Can Tho University, Trichoderma sp., was chosen as a positive control The results showed that 17 fungal with a high potential of decomposition of organic agricultural wastes were isolated and purified Results of the decomposition experiments for six organic materials under the stelile condition after 30 incubation days revealed that different fungi had different decomposing capacities, with the highest capacity being found in the PH-C5 strain for both rice straw and spent coffee ground at a rate of 47,6% and 48,1%, respectively Sugarcane bagasse and coconut peat were highly degraded by the PH-L3 strain with a decomposing rate of 46,9% and 37,2%, respectively while sawdust and rice husk degradation was highest by the PH-L4 (32,9%) and the PH-L6 (50,9%) Trichoderma sp showed lowest decomposition capacity for six selected organic materials under both sterile and non-sterile conditions as compared to PH-C5, PH-L3, PHL4 and PH-L6 strain Basing on the results of ITS region sequences, these four candidates were genetically identified as Aspergillus fumigatus (PH-C5), Penicillium janthinellum (PH-L3), Aspergillus fumigatus (PH-L4) and Rhizomucor variabilis (PH-L6) TÓM TẮT Mục tiêu nghiên cứu nhằm phân lập tuyển chọn số dòng nấm địa từ đất thâm canh lúa xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp phân hủy nhanh vật liệu hữu từ nông nghiệp Mẫu đất thu từ đất canh tác lúa 30 năm Môi trường Bushnell Haas Medium (BHM) bổ sung carboxymethyl cellulose (CMC)/lignin nguồn carbon sử dụng để phân lập tách ròng nấm Dòng nấm Trichoderma sp (sản phẩm Đại học Cần Thơ) chọn đối chứng dương Kết cho thấy tổng cộng 17 dịng nấm có tiềm phân hủy vật liệu hữu từ đất lúa phân lập Kết phân hủy sáu vật liệu hữu điều kiện tiệt trùng cho thấy dòng nấm PH-C5 phân hủy cao so với dòng khác với vật liệu rơm (47,6%) bã cà phê (48,1%) Tương tự, dòng nấm PH-L3 phân hủy cao dòng khác với vật liệu xác mía mụn dừa, 46,9% 37,2% trọng lượng khơ sau 30 ngày thí nghiệm Trong đó, dịng nấm PH-L4 PH-L6 có phần trăm phân hủy 32,9% (mùn cưa) 50,9% (vỏ trấu) cao so với dòng khác Khả phân hủy vật liệu hữu từ nơng nghiệp bốn dịng nấm cao so với Trichoderma sp hai điều kiện tiệt trùng khơng tiệt trùng Kết giải mã trình tự đoạn gene ITS định danh cho thấy chúng có thứ tự tên loài: Aspergillus fumigatus (PH-C5), Penicillium janthinellum (PH-L3), Aspergillus fumigatus (PH-L4) Rhizomucor variabilis (PH-L6) Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 36 (2015): 1-11 dạng phân hữu vi sinh giúp cải tạo chất lượng dinh dưỡng đất cách nhanh chóng, hiệu giúp tăng suất trồng Điều có nghĩa chất dinh dưỡng phế phẩm nông nghiệp tái sử dụng đồng thời giúp giảm lượng rác hữu thải môi trường bên ngồi Vì vậy, nghiên cứu thực nhằm mục tiêu: Phân lập tuyển chọn số dịng nấm địa có khả phân hủy nhanh số vật liệu hữu từ đất thâm canh lúa xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp GIỚI THIỆU Đồng sông Cửu Long (ĐBSCL) vùng trọng điểm cho lúa nông nghiệp, hàng năm sản lượng nông nghiệp sản lượng nông sản xuất gia tăng đáng kể Tuy nhiên, ĐBSCL phải đối mặt với vấn đề xử lý giải phế phẩm nông nghiệp sau thu hoạch Chỉ riêng lượng rơm vỏ trấu hàng năm có khoảng gần chục triệu thải trình thu hoạch chế biến gạo, bên cạnh đó, phế phẩm nơng nghiệp khác như: mùn cưa, mụn dừa, xác mía,… chiếm lượng lớn tổng lượng phế phẩm nông nghiệp tập trung quan tâm để xử lý PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP 2.1 Mẫu đất nguồn vật liệu hữu Mẫu đất dùng cho phân lập nấm có tiềm phân hủy vật liệu hữu thu từ đất thâm canh lúa 30 năm xã Phong Hòa, huyện Lai Vung, tỉnh Đồng Tháp Dùng khoan lấy mẫu với độ sâu 0-20 cm, lấy điểm ruộng lúa, sau mẫu trộn thành mẫu đại diện Mẫu đất đem phơi nhiệt độ phịng thí nghiệm, sau nghiền qua rây 0,2 mm Một lượng mẫu đất (300 g) sau xử lý đem phân tích tiêu hóa lý học đất như: Sa cấu đất (cát, thịt sét), pH, chất hữu cơ, N tổng số, P tổng số K tổng số Với phế phẩm giàu cellulose, hemicellulose lignin này, lượng sử dụng để đun nấu, dùng làm giá thể trồng nấm, làm thức ăn cho gia súc, nhiên hiệu mang lại chưa cao chi phí thu gom vận chuyển phế phẩm nơng nghiệp tương đối cao so với giá trị sử dụng chúng nên phần lớn xử lý theo phương pháp truyền thống đốt bỏ thải trực tiếp mơi trường bên ngồi Điều khơng làm tăng thêm gánh nặng mơi trường mà cịn làm lãng phí nguồn sinh khối, cần phải thực nghiêm ngặt tiêu chuẩn việc thải chất thải vào môi trường Tuy nhiên, việc phân hủy cellulose lignin phương pháp vật lý hóa học phức tạp, tốn gây độc hại cho mơi trường Trong đó, việc xử lý chất thải hữu chứa cellulose lignin công nghệ vi sinh biện pháp hiệu quả, thân thiện với môi trường sinh thái sức khỏe người dân Sáu vật liệu hữu dùng cho thí nghiệm gồm: rơm, xác mía, mụn dừa, mùn cưa, bã cà phê vỏ trấu phế phẩm nơng nghiệp thu thập cho bố trí thí nghiệm Rơm xác mía cắt thành đoạn ngắn khoảng cm Tất vật liệu hữu thí nghiệm rửa với nước vòi lần, sau rửa lại lần với nước cất, trải mỏng để khơ điều kiện phịng thí nghiệm Sau đó, hiệu chỉnh đến 80% ẩm độ vật liệu thí nghiệm (Hình 1) Một số đặc tính hóa học vật liệu hữu sử dụng thí nghiệm phân tích bao gồm: C tổng số, N tổng số, P tổng số K tổng số Để rút ngắn thời gian phân hủy vật liệu hữu chứa cellulose lignin khó phân hủy thời gian compost vi sinh vật gồm: nấm, vi khuẩn, xạ khuẩn… thường bổ sung, đặc biệt nấm Kết thu cuối compost hoai mục, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 36 (2015): 1-11 Hình 1: Sáu vật liệu hữu gồm: rơm, xác mía, mụn dừa, mùn cưa, bã cà phê vỏ trấu chứa cellulose lignin dùng thí nghiệm 2.3 Đánh giá khả phân hủy số vật liệu hữu từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose lignin điều kiện tiệt trùng 17 dòng nấm phân lập 2.2 Phân lập số dịng nấm có tiềm phân hủy nhanh vật liệu hữu chứa cellulose lignin Cân g đất (trọng lượng khơ kiệt) vào bình tam giác 100 mL tiệt trùng chứa 25 mL môi trường Bushnell Haas Medium (BHM) bổ sung CMC lignin nguồn carbon cho nấm sinh trưởng phát triển Cơng thức mơi trường BHM lít sau: g CMC lignin, 0,2 g MgSO4 x7H2O, 1g K2HPO4, 1g KH2PO4, 1g NH4NO3, 0,05g FeCl3x6H2O 0,02g CaCl2 Môi trường BHM tiệt trùng 20 phút 121oC nồi hấp tiệt trùng Sau tiệt trùng, Nystatin với nồng độ 30 mg mL-1 cho vào môi trường dùng để phân lập nấm nhằm ngăn cản phát triển vi khuẩn Mẫu nuôi cấy đặt máy lắc với tốc độ 100 vòng/phút điều kiện nhiệt độ phịng thí nghiệm tối Sau quan sát thấy nấm phát triển tốt, tiến hành hút mL môi trường nuôi cấy chứa nấm vào bình tam giác tiệt trùng chứa 24 mL môi trường BHM tiếp tục lắc máy lắc Tồn qui trình làm giàu mật số nấm có khả phân hủy cellulose lignin môi trường lỏng lặp lại lần Sau lần nuôi cấy liên tục, 0,1 mL môi trường nuôi cấy chứa nấm với nồng độ pha loãng khác (hệ số pha loãng 10) trải lên bề mặt môi trường agar BHM chứa CMC lignin để tách ròng khuẩn lạc nấm phát triển bề mặt mơi trường ni cấy Qui trình tách ròng tinh dòng nấm thực liên tục lần cấy chuyền môi trường agar BHM Hình thái sinh lý khuẩn lạc hình thái tế bào dịng nấm phân lập xác định sau tinh Thí nghiệm thực nhằm đánh giá khả phân hủy số vật liệu hữu chứa cellulose lignin điều kiện tiệt trùng 17 dòng nấm phân lập đồng thời so sánh khả phân hủy số vật liệu hữu 17 dòng nấm phân lập với dòng nấm Trichoderma sp (sản phẩm thương mại Đại học Cần Thơ) làm dòng nấm tham khảo đối chứng dương Qui trình thực sau: Cân 16 g, g, g, g, 17 g, 18 g (trọng lượng khô) vật liệu hữu gồm: mía, mụn dừa, rơm, vỏ trấu, mùn cưa bã cà phê cho vào đĩa petri thủy tinh (Lưu ý: vật liệu rửa với nước cất hiệu chỉnh ẩm độ 80%) Sau đó, đĩa petri chứa vật liệu hữu tiệt trùng lần nồi hấp tiệt trùng nhiệt độ 121oC 20 phút Sau đó, đặt khối agar Malt Extract (đường kính mm) chứa sợi nấm phát triển tốt vào đĩa petri vị trí góc trung tâm đĩa, dán parafilm bên ngồi tránh nhiễm mẫu Nghiệm thức đối chứng thực tương tự nghiệm thức khác, nhiên, khơng có dòng nấm chủng vào vật liệu hữu Thí nghiệm bố trí với lần lặp lại cho dòng nấm thử nghiệm vật liệu kéo dài 30 ngày Sau 30 ngày nuôi cấy, đĩa Petri chứa mẫu vật liệu hữu thí nghiệm sấy nhiệt độ 105ºC trong tủ sấy, sau đem cân để xác định trọng lượng khô vật liệu hữu giảm Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 36 (2015): 1-11 1FF/ITS4 (Do Thi Xuan, 2012) nhắm vào vùng ITS cho phản ứng PCR Thành phần phản ứng PCR bao gồm (thể tích/1 phản ứng): µL Dream taq buffer (5x); 0,5 µL mồi xi ITS 1F (10 µM); 0,5 µL mồi ngược ITS (10 µM); 10 µL DNA tinh pha lỗng 50 lần; 5,625 µL nước (khơng chứa DNA); 0,5 µL dNTP (10 mM); 2,75 µL MgCl2 (25 mM) 0,125 µL Dream taq (5 U/µL) Chương trình nhiệt phản ứng PCR gồm: Bước 1: 94oC phút; Bước 2: 35 chu kì, gồm: 94oC 30 giây; 55oC 30 giây 72oC 30 giây, Bước 3: 72oC phút Kiểm tra sản phẩm PCR gel agarose trước giải trình tự đoạn gen Kết giải trình tự đoạn gen nhận dạng ngân hàng gene NCBI http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi để xác định tên lồi bốn dịng nấm tuyển chọn sau thời gian ni cấy Cơng thức tính phần trăm phân hủy vật liệu hữu (%): (Khối lượng ban đầu – Khối lượng lúc sau)/Khối lượng ban đầu x 100 2.4 Đánh giá khả phân hủy số vật liệu hữu từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose lignin điều kiện không tiệt trùng dịng nấm tuyển chọn Thí nghiệm thực nhằm đánh giá khả phân hủy số vật liệu hữu từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose lignin điều kiện không tiệt trùng dòng nấm thể khả phân hủy cao vật liệu hữu thử nghiệm, đồng thời, so sánh khả phân hủy số vật liệu hữu dòng nấm tuyển chọn với dòng nấm Trichoderma sp (sản phẩm thương mại Đại học Cần Thơ) làm dòng nấm tham khảo đối chứng dương KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Đặc tính lý, hóa học mẫu đất số vật liệu hữu thí nghiệm Quy trình bố trí tiêu theo dõi thí nghiệm đánh giá khả phân hủy vật liệu hữu điều kiện không tiệt trùng thực tương tự thí nghiệm điều kiện tiệt trùng (mục 2.3), ngoại trừ vật liệu hữu không tiệt trùng Thí nghiệm bố trí với lần lặp lại cho dòng nấm, vật liệu kéo dài 30 ngày 2.5 Giải mã trình tự đoạn gene ITS dịng nấm tuyển chọn Kết phân tích đặc tính lý, hóa học đất trình bày Bảng cho thấy mẫu đất lúa có thành phần sa cấu chủ yếu thịt 49,9% sét 48,0% Giá trị pH 5,2, thành phần N, P, K tương đối thấp Tỷ lệ % chất hữu tương đối cao (5,36%) Điều chứng tỏ mẫu đất mơi trường thích hợp cho vi sinh vật sinh trưởng DNA nấm trích CTAB 3% phát triển tốt có cộng đồng nấm phân hủy (Ihrmark ctv., 2012) Sử dụng cặp mồi ITS chất hữu chứa cellulose lignin Bảng 1: Đặc tính lý hóa học mẫu đất thí nghiệm (Phịng phân tích Bộ mơn Khoa học Đất, Khoa Nơng nghiệp & Sinh học Ứng dụng, Trường Đại học Cần Thơ) Ký hiệu mẫu pH PH 5,2 Nts Pts Kts CHC (%) Cát (%) 0,27 0,072 1,21 5,36 2,10 Sa cấu Thịt (%) 49,9 Sét (%) 48,0 Ghi chú: Nts: đạm tổng số, Pts: lân tổng số, Kts: kali tổng số CHC: chất hữu Kết phân tích số đặc tính hóa học sáu vật liệu hữu dùng thí nghiệm trình bày Bảng Kết cho thấy: vật liệu hữu thí nghiệm, bã cà phê có thành phần dinh dưỡng cao thơng qua thơng số sau đây: 1) Có hàm lượng carbon tổng số cao (62,64%); 2) Hàm lượng đạm tổng số cao nhất, chiếm 2,44% 3) Hàm lượng lân tổng số cao nhất, chiếm 0,47% 4) Tỷ lệ C:N 26 Điều cho thấy bã cà phê có hàm lượng dinh dưỡng hữu dụng cao cho trồng, đặc biệt đạm lân Trong đó, vật liệu hữu cịn lại như: xác mía, vỏ trấu, mụn dừa, rơm mùn cưa chứa chủ yếu hàm lượng carbon (chiếm 40%), thành phần dinh dưỡng khác thấp Các vật liệu hữu có tỷ lệ C:N cao, dao động từ khoảng 66 – 231 Do đó, việc xử lý nhằm làm giảm tỷ lệ C:N vật liệu thông qua việc ủ compost cần thiết Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ Phần A: Khoa học Tự nhiên, Công nghệ Môi trường: 36 (2015): 1-11 BHM bổ sung lignin nguồn carbon ký hiệu: PH-L1, PH-L2, PH-L3, PH-L4, PH-L5 PH-L6 3.3 Khả phân hủy số vật liệu hữu từ phế phẩm nông nghiệp chứa cellulose lignin điều kiện tiệt trùng 17 dịng nấm phân lập 3.3.1 Xác mía Kết thí nghiệm đánh giá khả phân hủy vật liệu hữu xác mía sau 30 ngày 17 dòng nấm phân lập dòng nấm Trichoderma sp (sản phẩm Đại Học Cần Thơ) trình bày Hình Nhìn chung, tất 17 dịng nấm thử nghiệm có khả phân hủy xác mía cao, dao động từ 33,2% đến 46,9% khác biệt ý nghĩa thống kê (p