Đang tải... (xem toàn văn)
Tóm tắt nội dung luận án Đề tài “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” đã được thực hiện nhằm phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để ứng dụng sản xuất phân sinh học bón cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên trong tương lai. Năm trăm chín mươi ba dòng vi khuẩn được phân lập từ cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. Trong 3 loại môi trường phân lập, các dòng vi khuẩn có màu sắc khác nhau: vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục và trắng trong. Hình dạng khuẩn lạc chủ yếu là tròn, bìa nguyên và nhô, hầu hết các dòng vi khuẩn có tế bào dạng hình que, Gram âm. Bằng kỹ thuật PCR với cặp mồi p515FPL và p13B đã xác định được 556 dòng vi khuẩn là nội sinh cây lúa. Các dòng vi khuẩn này được nuôi trong môi trường Burk không đạm, môi trường NBRIP hoặc trên môi trường phân lập và xác định khả năng cố định đạm, hòa tan lân khó tan bằng phương pháp so màu. Kết quả cho thấy có 533 dòng có khả năng cố định đạm, trong số đó 457 dòng có khả năng hòa tan lân khó tan và tổng hợp IAA. Chín mươi dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm khá cao được định danh bằng kỹ thuật PCR và xác định mối quan hệ di truyền với 90 dòng vi khuẩn có trong ngân hàng gen. Dựa vào trình tự gen 16S rDNA có mức tương đồng 97% trở lên cho thấy các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa phân lập được có sự đa dạng về loài. Bao gồm 5 nhóm: Alphaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 1,11%), Betaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 11,11%), Gammaproteobacteria (chiếm tỉ lệ 53,33%), Bacteroidetes (chiếm tỉ lệ 6,67%) và Bacilli (chiếm 27,78%). Trong số 90 dòng vi khuẩn có hoạt tính sinh học cao đã chọn được 22 dòng vi khuẩn có khả năng cung cấp đạm và hòa tan lân khó tan cung cấp cho cây lúa được trồng trong ống nghiệm. Kết quả khảo sát khả năng cố định đạm và hòa tan lân cung cấp cho cây lúa được trồng trong điều kiện nhà lưới thì có 822 dòng vi khuẩn có khả năng giúp giảm lượng phân đạm vô cơ cung cấp từ 25% – 75% N (tương đương với 30 kg N – 90 kg Nha) và 48 dòng khảo sát có khả năng làm giảm lượng lân vô cơ cung cấp là 50% P (tương đương với 40 kg P2O5ha) cho cây lúa. Trong thí nghiệm ngoài đồng tại 2 địa điểm khác nhau trên nền đất thịt pha cát tại tỉnh Phú Yên đã tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (tương đương 60 kg Nha) cho cây lúa và 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan thành dễ tan để đáp ứng nhu cầu sinh trưởng và phát triển cho cây lúa và đã tiết kiệm được 50% lượng phân lân vô cơ (tương đương 40 kg P2O5ha) nhưng vẫn đảm bảo về năng suất, cải thiện chất lượng gạo. Kết quả bổ sung kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 lên cây lúa trồng ở 2 địa điểm khác nhau tại Phú Yên đều cho hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan cao hơn khi bổ sung riêng rẽ từng dòng cho cây lúa. Sự kết hợp 2 dòng SHL70 và TAL4 giúp giảm 50% N (tương đương 60 kg Nha) và 50% P (tương đương 40 kg P2O5ha) trong sản xuất lúa mà vẫn đảm bảo được năng suất lúa tốt. Ứng dụng 2 dòng vi khuẩn này trong sản xuất lúa có thể là một trong những giải pháp để hạn chế việc sử dụng phân bón hóa học trong sản xuất nông nghiệp, góp phần bảo vệ môi trường và xây dựng nền nông nghiệp phát triển bền vững. Từ khóa: Cố định đạm, hòa tan lân, lúa cao sản, Phú Yên, tổng hợp IAA, vi khuẩn nội sinh. 2. Những kết quả mới của luận án Đề tài đã phân lập và khảo sát các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên, đồng thời các dòng vi khuẩn nội sinh này được nhận diện bằng kỹ thuật PCR. Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại dựa vào đoạn gen 16S rDNA đã định danh, xác định mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn đã phân lập và phân tích sự đa dạng về loài của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên ở mức độ nucleotide. Tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (60 kg Nha) cho cây lúa và 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan từ các thí nghiệm in vitro, nhà lưới và ngoài đồng. 3. Các ứng dụng khả năng ứng dụng trong thực tiễn, các vấn đề cần tiếp tục nghiên cứu: Sử dụng các dòng vi khuẩn có đặc tính tốt (2 dòng vi khuẩn có khả năng cố định đạm và 2 dòng vi khuẩn có khả năng hòa tan phân lân khó tan thành lân dễ tan cung cấp cho cây lúa) để cho việc nghiên cứu và sản xuất phân vi sinh dùng trong sản xuất lúa tại Phú Yên. Kết quả đề tài cũng góp phần làm giảm lượng phân bón hóa học, giảm giá thành sản xuất, tăng thu nhập, bảo vệ độ phì đất trong sản xuất lúa và giảm sự ô nhiễm môi trường. Kết quả nghiên cứu của đề tài có thể là tài liệu tham khảo và là cơ sở khoa học cho các nghiên cứu tiếp theo, cũng như bổ sung giáo trình giảng dạy tại Đại học Phú Yên và toàn quốc. Tiếp tục nghiên cứu đánh giá hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với Azospirillum amazonense), dòng TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) trên cây lúa trồng ở nhiều địa bàn khác nhau ở tỉnh Phú Yên.
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO TRƢỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ VĂN THỊ PHƢƠNG NHƢ PHÂN LẬP VÀ KHẢO SÁT CÁC ĐẶC TÍNH CỦA VI KHUẨN NỘI SINH TRONG CÂY LÚA TRỒNG TRÊN ĐẤT Ở TỈNH PHÚ YÊN TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ Chuyên ngành: Vi sinh vật học Mã số: 62 42 01 07 Cần Thơ, 2015 Công trình được hoàn thành tại Trường Đại học Cần Thơ. Ngƣời hƣớng dẫn GS. TS Cao Ngọc Điệp Phản biện 1: Phản biện 2: Luận án sẽ được bảo vệ trước Hội đồng chấm luận án cấp trường tại: ……………………………………………………………………… Vào lúc: giờ ngày tháng năm Có thể tìm hiểu luận án tại thƣ viện Trung tâm học liệu - Đại học Cần Thơ Thư viện Quốc gia Việt Nam 1 CHƢƠNG 1. GIỚI THIỆU 1.1. Đặt vấn đề Lúa gạo là nguồn lương thực chủ yếu trong khẩu phần dinh dưỡng cho hơn 40% dân số thế giới. Năng suất cũng như sản lượng lúa tùy thuộc vào khí hậu, loại đất, độ ẩm và nguồn dinh dưỡng. Cây lúa cần nhiều chất dinh dưỡng khác nhau, chủ yếu là đạm, lân và kali. Vì vậy, để đáp ứng nhu cầu dinh dưỡng cho cây lúa, nông dân phải sử dụng một lượng lớn phân bón hóa học, chủ yếu là phân đạm, lân và kali. Tuy nhiên hiệu suất sử dụng phân bón chỉ khoảng 35 - 40%, còn lại 60 - 65% lượng phân bón bị mất đi. Trong số lượng phân bón cây trồng không sử dụng được, một phần bị rửa trôi theo nước và gây ô nhiễm nguồn nước ngầm, một phần bị bay hơi do tác động của nhiệt độ hay quá trình phản nitrate hóa gây ô nhiễm không khí (Nguyễn Đức Khiển, 2002). Trước sức ép của vấn đề an ninh lương thực, người dân luôn đặt ra mục đích phải thu nhiều sản phẩm. Song do ý thức và trình độ canh tác chưa cao nên tình trạng lạm dụng phân bón hóa học đã xảy ra khá phổ biến. Kết quả điều tra của Sở Nông Nghiệp và PTNT Phú Yên trong năm 2012 cho thấy, chi phí mà nông dân mua phân bón để sản xuất lúa lên đến 6.000.000 đồng/ha/vụ, chi phí này > 50% tổng chi phí trong sản xuất lúa. Điều này đã tác động bất lợi đến chi phí sản xuất, đến môi trường dẫn đến kết quả sản xuất không mang lại hiệu quả kinh tế cao và chưa có nền sản xuất bền vững. Để khắc phục những tác động bất lợi này thì việc sử dụng phân bón sinh học trong quá trình sản xuất nói chung và sản xuất lúa nói riêng thật sự rất có ý nghĩa. Trong khi đó vi khuẩn nội sinh có nhiều đặc tính tốt, có vai trò quan trọng đối với cây trồng và được ứng dụng trong sản xuất phân vi sinh. Vì vậy, việc nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh có ích trong sản xuất phân bón vi sinh phục vụ cho sản xuất nông nghiệp rất có ý nghĩa và cần thiết. Hơn nữa, hiện nay ở tỉnh Phú Yên chưa có một công trình nghiên cứu nào về vi khuẩn nội sinh trong cây lúa. Chính vì vậy đề tài: “Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên” đã được thưc hiện. 1.2. Mục tiêu Phân lập và tuyển chọn được các dòng vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên có đặc tính cố định đạm, hòa tan lân, sinh tổng hợp IAA cao để ứng dụng sản xuất phân vi sinh bón cho cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. 1.3 Những điểm mới và ý nghĩa thực tiễn của luận án Đề tài đã phân lập và khảo sát các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên, đồng thời các dòng vi khuẩn nội sinh này được nhận diện bằng kỹ thuật PCR. 2 Ứng dụng các kỹ thuật sinh học phân tử hiện đại dựa vào đoạn gen 16S rDNA để định danh, xác định mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn đã phân lập và phân tích sự đa dạng về loài của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên ở mức độ nucleotide. Tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70 (tương đồng 98% với loài Azospirillum amazonense) và dòng PHL87 (tương đồng 99% Burkholderia kururiensis) có khả năng cung cấp 50% lượng đạm sinh học (60 kg N/ha) cho cây lúa, 2 dòng vi khuẩn TAL1 (tương đồng 99% loài Pseudomonas putida) và TAL4 (tương đồng 99% với loài Bacillus subtilis) có khả năng hòa tan lân khó tan từ các thí nghiệm in vitro, nhà lưới và ngoài đồng. Kết quả nghiên cứu mang lại nhiều triển vọng cho việc ứng dụng 2 dòng vi khuẩn nội sinh này trong sản xuất phân vi sinh dùng cho sản xuất lúa tại Phú Yên. CHƢƠNG 2. TỔNG QUAN TÀI LIỆU Trong phần tổng quan tài liệu, luận án đã nêu và phân tích những vấn đề liên quan đến tác động của phân bón trong sản xuất lúa. Tổng quan về các đặc tính của vi khuẩn nội sinh và tình hình nghiên cứu, ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất nông nghiệp, với các nội dung chính như sau: - Tổng quan về tình hình sản xuất lúa ở Phú Yên. - Hiện trạng sử dụng phân bón ở Việt Nam và Phú Yên. - Tổng quan về vi khuẩn nội sinh, đặc tính và vai trò của vi khuẩn nội sinh. - Tình hình nghiên cứu và ứng dụng vi khuẩn nội sinh trong sản xuất phân vi sinh. CHƢƠNG 3. PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 3.1 Vật liệu + Mẫu lúa thu từ 7 huyện và thành phố Tuy Hòa tỉnh Phú Yên từ tháng 8/2011 đến 8/2012, giống lúa Ma Lâm 213 đang được trồng phổ biến ở tỉnh Phú Yên. + Môi trường phân lập vi khuẩn: môi trường LGI (Cavalcante và Döbereiner, 1988), môi trường Nfb (Krieg và Döbereiner, 1984) và môi trường RMR (Elbeltagy et al., 2001). + Môi trường Burk không đạm (Park et al., 2005), môi trường NBRIP (Nautiyal, 1999), thuốc thử Salkowsky đo IAA (Glickmann và Desseaux, 1995), môi trường dinh dưỡng khoáng Yoshida (Yoshida, 1978) 3.2. Phƣơng pháp 3.2.1 Phân lập Xử lý mẫu và phân lập vi khuẩn nội sinh theo qui trình của Barraquio et al., (1997). Quan sát hình thái, đo kích thước khuẩn lạc, quan sát tế bào, nhuộm Gram và trữ mẫu (Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2009). 3 3.2.2. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR Phản ứng PCR khuếch đại vùng 16S rDNA được thực hiện với cặp mồi p515FPL và p13B được thiết kế (Zinniel et al., 2002), cặp mồi: mồi 1: p515FPL 5’-GTGCCAGCAGCCGCGGTAA- 3’, mồi 2: p13B 5’- AGGCCCGGGAACGTATTCAC-3’. 3.2.3. Khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa - Đo hàm lượng NH 4 + bằng phương pháp so màu ở bước sóng 640 nm (OD 640 nm ) trên quang phổ kế (Page et al., 1982). - Đo lượng P 2 O 5 bằng phương pháp so màu ở bước sóng 880 nm trên quang phổ kế (Murphy và Riley, 1962). - Đo hàm lượng IAA bằng phương pháp so màu ở bước sóng 530 nm (Patten và Glick, 2002). 3.2.4. Nhận diện và xây dựng mối quan hệ di truyền của các dòng vi khuẩn nội sinh Phản ứng PCR với cặp mồi p515FPL và p13B, chọn các sản phẩm PCR có vạch DNA trên điện di tương đồng 900 bp, tiến hành tinh sạch bằng kit Invitrogen và gửi giải trình tự tại công ty MACROGEN (Hàn quốc). Sử dụng chương trình BLAST nucleotid và BioEdit so sánh trình tự các đoạn DNA của các dòng vi khuẩn được phân lập với trình tự DNA của bộ gen ở các loài vi khuẩn có trong ngân hàng gen (NCBI). Trên cơ sở này xây dựng quan hệ tương quan di truyền về cấu trúc gen 16S rDNA giữa các dòng vi khuẩn được phân lập với các dòng vi khuẩn được chọn từ dữ liệu NCBI bằng phần mềm MEGA 6.0 (Tamura et al., 2011) và xây dựng, phân tích sơ đồ mối quan hệ di truyền dạng Maximum Likelihood. Sự đa dạng của các trình tự nucleotide cũng được phân tích bằng phần mềm DNASP 5.10 (Rozas et al., 2003). 3.2.5. Đo lƣợng Acethylen bị khử Đo lượng ARA (Acetylene Reduction Assay) hình thành khi vi khuẩn được nuôi trong môi trường Burk lỏng không đạm và hàm lượng ARA hình thành khi vi khuẩn được bổ sung vào hạt lúa và trồng lúa vào môi trường Burk không đạm có bổ sung 0,8% agar bằng máy sắc khí theo (Somasegaran và Hoben, 1985), (Elbeltagy et al., 2001). Mẫu được đo ARA tại phòng thí nghiệm Chuyên sâu (Trường Đại học Cần Thơ). Nhận diện gen nifH của 22 dòng vi khuẩn có hoạt tính nitrogenase cao bằng cách thực hiện các phản ứng PCR với cặp mồi PolF 5’ TGCGAYCCSAARGCBGACTC 3’ và PolR 5’ ATCGCCATCATYTCRCCGGA 3’ để khuếch đại gen nif theo quy trình của Poly et al. (2001). 3.2.6. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm 4 Hạt lúa nảy mầm bổ sung vi khuẩn được trồng trên môi trường dinh dưỡng khoáng Yoshida. Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, với 24 nghiệm thức (NT). Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. - Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm của vi khuẩn được bố trí như sau: NT1 (Đối chứng âm): môi trường Yoshida không bổ sung đạm và không vi khuẩn. NT2 (Đối chứng dương): môi trường Yoshida có bổ sung đạm và không vi khuẩn. NT3 đến NT24: môi trường Yoshida không bổ sung đạm và lần lượt bổ sung các dòng vi khuẩn. - Thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan của vi khuẩn. NT1 (Đối chứng âm): môi trường Yoshida không có 10 mg/l NaH 2 PO 4 .2H 2 O bổ sung 20 mg/l Ca 3 (PO 4 ) 2 và không vi khuẩn. NT2 (Đối chứng dương): môi trường Yoshida có 10 mg/l NaH 2 PO 4 .2H 2 O bổ sung 20 mg/l Ca 3 (PO 4 ) 2 và không vi khuẩn. NT3 đến NT24: môi trường Yoshida không có 10 mg/l NaH 2 PO 4 .2H 2 O bổ sung 20 mg/l Ca 3 (PO 4 ) 2 và lần lượt bổ sung các dòng vi khuẩn. Cây lúa được thu sau 28 ngày trồng để đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây và trọng lượng khô cả cây. 3.2.7. Khảo sát đặc tính sinh lý, sinh hóa của các dòng vi khuẩn Phản ứng catalase, khả năng sinh trưởng của các dòng vi khuẩn trên các nguồn đường khác nhau (D-glucose, Sucrose, Maltose, Manitol, Fructose) và nguồn chitin. Khả năng sinh trưởng trên môi trường nước trích khoai tây (BMS). 3.2.8. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện nhà lƣới Hạt lúa đã được bổ sung vi khuẩn và trồng trong chậu theo các nghiệm thức. Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại với 45 nghiệm thức (Bảng 3.1. Thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên, 4 lần lặp lại với 25 nghiệm thức (Bảng 3.1). Bảng 3.1. Các nghiệm thức trong thí nghiệm khảo sát đạm và lân Thí nghiệm khảo sát đạm Thí nghiệm khảo sát lân TT Nghiệm N Dòng Nghiệm P 2 O 5 Dòng thức (Kg/ha) vi khuẩn thức (Kg/ha) vi khuẩn 1 0N-0VK 0 0VK 0P 2 O 5 -0VK 0 0VK 2 0N-VK1… 0 VK1… 0P 2 O 5 -VK1… 0 VK1…. 3 0N-VK8 0 VK8 0P 2 O 5 -VK4 0 VK4 4 30N-0VK 30 0VK 20P 2 O 5 -0VK 20 0VK 5 5 30N-VK1… 30 VK1… 20P 2 O 5 -VK1… 20 VK1… 6 30N-VK8 30 VK8 20P 2 O 5 -VK4 20 VK4 7 60N-0VK 60 0VK 40P 2 O 5 -0VK 40 0VK 8 60N-VK1… 60 VK1… 40P 2 O 5 -VK1… 40 VK1… 9 60N-VK8 60 VK8 40P 2 O 5 -VK4 40 VK4 10 90N-0VK 90 0VK 60P 2 O 5 -0VK 60 0VK 11 90N-VK1… 90 VK1… 60P 2 O 5 -VK1… 60 VK1…. 12 90N-VK8 90 VK8 60P 2 O 5 -VK4 60 VK4 13 120N-0VK 120 0VK 80P 2 O 5 -0VK 80 0VK 14 120N-VK1… 120 VK1… 80P 2 O 5 -VK1… 80 VK1…. 15 120N-VK8 120 VK8 80P 2 O 5 -VK4 80 VK4 Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan khi kết hợp 2 dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng trong chậu (Bảng 3.2). Cây lúa ở giai đoạn 48 ngày được đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây, số chồi/bụi, chiều dài rễ, trọng lượng khô của rễ và thân. Giai đoạn thu hoạch xác định các chỉ tiêu về chiều cao cây, số bông/bụi, chiều dài bông, số hạt chắc/bông, tỷ lệ hạt lép/bông, trọng lượng 1000 hạt, trọng lượng rơm và năng suất. Bảng 3.2. Các nghiệm thức trong thí nghiệm tổ hợp 2 dòng vi khuẩn TT Nghiệm thức N-P 2 O 5 (Kg/ha) Dòng vi khuẩn 1 0N0P 2 O 5 -0VK 0N0P 2 O 5 0VK 2 0N0P 2 O 5 -VK1 0N0P 2 O 5 VK1 3 0N0P 2 O 5 -VK2 0N0P 2 O 5 VK2 4 0N0P 2 O 5 -VK1+VK2 0N0P 2 O 5 VK1+VK2 5 60N40P 2 O 5 -0VK 60N40P 2 O 5 0VK 6 60N40P 2 O 5 -VK1 60N40P 2 O 5 VK1 7 60N40P 2 O 5 -VK2 60N40P 2 O 5 VK2 8 60N40P 2 O 5 -VK1+VK2 60N40P 2 O 5 VK1+VK2 9 120N80P 2 O 5 -0VK 120N80P 2 O 5 0VK 10 120N80P 2 O 5 -VK1 120N80P 2 O 5 VK1 11 120P80P 2 O 5 -VK2 120N80P 2 O 5 VK2 12 120N80P 2 O 5 -VK1+VK2 120N80P 2 O 5 VK1+VK2 3.2.9. Khảo sát hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của các dòng vi khuẩn trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng + Chuẩn bị đất: đất được cày xới, san bằng mặt và làm sạch cỏ dại. Đắp bờ phân ô, mỗi ô có diện tích 20 m 2 . Chuẩn bị mạ: hạt lúa được ngâm trong nước sạch trong 24 giờ và ủ 36 giờ trước khi đem gieo mạ. Chuẩn bị dịch 6 vi khuẩn: nuôi vi khuẩn trên môi trường Burk lỏng không đạm, mỗi dòng 20 lít với mật số vi khuẩn 10 8 tế bào/ml. + Thí nghiệm khảo sát hiệu quả cố định đạm: thí nghiệm bố trí theo thể thức có lô phụ. Lô chính là phân đạm với 5 mức độ: 0 kg N, 30 kg N, 60 kg N, 90 kg N và 120 kg N/ha và lô phụ là vi khuẩn (gồm 2 dòng vi khuẩn và đối chứng), lặp lại 4 lần (4 khối). + Thí nghiệm khảo sát hiệu quả hòa tan lân khó tan: thí nghiệm bố trí theo thể thức có lô phụ. Lô chính (phân Lân) gồm 3 mức độ phân lân (0 kg, 40 kg, và 80 kg P 2 O 5 /ha). Lô phụ (Vi khuẩn) gồm: 0 VK, dòng VK1, dòng VK2. + Thí nghiệm tổ hợp 2 dòng vi khuẩn: thí nghiệm bố trí theo thể thức có lô phụ. Lô chính (phân N - P 2 O 5 ) với 3 mức độ: 0N-0P 2 O 5 kg, 60N- 40P 2 O 5 kg và 120N-80P 2 O 5 kg/ha và lô phụ (vi khuẩn) gồm dòng VK1, VK2, VK1+VK2 và đối chứng, lặp lại 4 lần (4 khối). + Cấy lúa: mạ 21 ngày tuổi, ở lô có bổ sung vi khuẩn: rễ lúa được ngâm trong dịch vi khuẩn (riêng biệt cho từng dòng) trong 6 giờ, nghiệm thức đối chứng (ngâm trong nước). Mạ được cấy theo khoảng cách 15 x 15 cm, 2 tép/bụi. Mỗi nhóm công nhân (3 người) chỉ cấy cho 1 dòng vi khuẩn riêng biệt. + Chăm sóc, bón phân và đánh giá các chỉ tiêu về chiều cao cây, số bông/bụi, số bông/m 2 , chiều dài bông, số hạt chắc/bông, tỷ lệ hạt lép/bông, trọng lượng 1000 hạt, trọng lượng rơm, năng suất thực tế của lúa. Hàm lượng N trong gạo và rơm phân tích bằng phương pháp Micro-Kjeldahl, phân tích hàm lượng P trong gạo và rơm (thực hiện ở phòng Phân tích Đất, BM. Khoa học Đất - Khoa Nông Nghiệp - Đại học Cần Thơ). 3.3. Xử lý số liệu: Bằng chương trình Excel, phần mềm MEGA 6.0, BioEDit, DNASP 5.10 và thống kê số liệu bằng phần mềm Minitab 16, MSTATC. CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Phân lập và đặc điểm sinh học của vi khuẩn nội sinh cây lúa 4.1.1. Kết quả phân lập vi khuẩn Tổng cộng có 593 dòng vi khuẩn phân lập được từ thân và rễ của 119 mẫu lúa thu được ở 7 huyện và thành phố Tuy Hòa trên 3 loại môi trường nuôi cấy LGI, Nfb và RMR. Số dòng vi khuẩn phân lập từ rễ là 372 dòng chiếm tỷ lệ 62,73%, số dòng vi khuẩn phân lập từ thân là 221 dòng chiếm tỷ lệ 37,27%. Khi nuôi cấy trong điều kiện môi trường bán đặc, sau 48 giờ vi khuẩn phát triển thành vòng pellicle cách bề mặt môi trường 2 - 5 mm (Hình 4.1). 7 Vòng pellicle A B C 1 2 3 4 5 6 LGI Nfb RMR Hình 4.1. Vòng pellicle xuất hiện trên các môi trƣờng nuôi cấy 1, 3, 5: Môi trường không có vi khuẩn, 2,4,6: Môi trường có vi khuẩn 4.1.2. Đặc điểm khuẩn lạc và tế bào của các dòng vi khuẩn Khuẩn lạc có nhiều màu sắc khác nhau sau 24 giờ nuôi cấy trên 3 loại môi trường. Khuẩn lạc có màu vàng nhạt, vàng đậm, trắng đục hoặc trắng trong (Hình 4.2). Hình dạng khuẩn lạc đa số là dạng tròn, bìa nguyên và nhô cao với 530/593 khuẩn lạc, có 55/593 khuẩn lạc dạng không đều, bìa cưa, lài và 8/593 khuẩn lạc có dạng tròn, nguyên, lài trên môi trường Nfb. Sau 48 giờ đường kính của 593 khuẩn lạc dao động từ 1 - 3 mm. TAL22 SHL73 TAN8 TAN14 TAN5 TAMa11 PHM95 TAM13 Hình 4.2. Hình dạng khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn phân lập môi trƣờng LGI (A), Nfb (B) và RMR (C) - Hình dạng tế bào của các dòng vi khuẩn được phân lập trên 3 loại môi trường đa số có dạng hình que ngắn, một số ít vi khuẩn dạng que dài và một ít vi khuẩn có dạng hình cầu (Hình 4.3). Đa số các dòng vi khuẩn đều có khả năng chuyển động, Gram âm. vòng pellicle 8 M 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 900 bp 500 bp 1000 bp 1500 bp bpbp TAMa1 TAN18 Hình 4.3. Hình tế bào vi khuẩn chụp dƣới kính hiển vi điện tử (SEM) độ phóng đại 14.000 lần 4.2. Nhận diện vi khuẩn nội sinh bằng kỹ thuật PCR Kết quả có 556/593 dòng vi khuẩn cho sản phẩm nhân bản DNA ở vị trí 900 bp so với thang chuẩn chiếm tỷ lệ 93,76% (Hình 4.4). Như vậy 556 dòng vi khuẩn này là các dòng vi khuẩn nội sinh (Zinniel et al., 2002). Hình 4.4. Kết quả điện di sản phẩm PCR đƣợc nhân lên từ DNA của các dòng vi khuẩn với 2 mồi p515FPL và p13B trên gel agarose 1,5% M: thang chuẩn 100bp, 1-15: lần lượt là các dòng vi khuẩn nội sinh TALa14, TAL1, TAL4, TAL5, TAL22, TAL30, SHL70, PHL87, PHL103, PHL105, DHL105, TANa5, PHN85, TAMa9, TAM18 và 16: đối chứng âm (không vi khuẩn). 4.3. Đặc tính của vi khuẩn nội sinh cây lúa 4.3.1. Khảo sát khả năng tổng hợp NH 4 + của các dòng vi khuẩn Có 533/556 dòng vi khuẩn phát triển mạnh trên môi trường Burk đặc không đạm được nuôi cấy trên môi trường Burk lỏng không đạm và khảo sát hàm lượng NH 4 + tạo ra sau 2, 4, 6 và 8 ngày. Kết quả khảo sát hàm lượng NH 4 + được ghi nhận ở Hình 4.5. Hàm lượng NH 4 + biến động theo thời gian với 8 trường hợp khác nhau. Kết quả của sự biến thiên này là do tốc độ phát triển của các dòng vi khuẩn không giống nhau, những dòng vi khuẩn có tốc độ phát triển nhanh nên chỉ sau 2 ngày nuôi cấy hàm lượng NH 4 + đạt cao nhất như dòng THL103 (7,26 mg/l), TANa8 (6,88 mg/l),… Đa số các dòng vi khuẩn phân lập được 305/533 dòng có lượng hàm lượng NH 4 + đạt mức cao nhất vào ngày thứ 4. Có 137/533 dòng vi khuẩn phát triển chậm hơn hàm lượng NH 4 + đạt mức cao nhất vào ngày thứ 6 và một số dòng vi khuẩn phát triển rất chậm thì hàm lượng NH 4 + tăng theo thời gian. Ngoài ra một số dòng vi khuẩn có hàm lượng NH 4 + được tạo ra cao nhất vào ngày 2 sau đó giảm vào ngày 4 và tăng lại ngày 6 hoặc ngày 8. Những dòng vi khuẩn này có lẽ rất nhạy (0,432x1,28 4 (0,628x0,98 9 [...]... (Burkholderia vietnamiensis) 4.8 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong điều kiện nhà lƣới 4.8.1 Ảnh hƣởng của 8 dòng vi khuẩn và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trƣởng và phát của cây lúa trồng trong điều kiện nhà lƣới Kết quả khảo sát các chỉ tiêu sinh trưởng của cây lúa ở giai đoạn 48 ngày cho thấy hầu hết các nghiệm thức ở cùng một mức phân đạm và bổ... 2(6): 324-333 6 Văn Thị Phương Như và Cao Ngọc Điệp, 2012 Phân lập và nhận diện vi diện vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên Đề tài cấp trường 2012 Đại học Cần Thơ TNCS 2012-31 7 Văn Thị Phương Như và Cao Ngọc Điệp, 2014 Đánh giá khả năng cố định đạm, hòa tan lân và tổng hợp IAA của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên Đề tài cấp trường 2013 Đại học... sung vi khuẩn có chiều cao cây, số chồi/bụi, chiều dài, trọng lượng khô của rễ và trọng lượng khô của cây cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với các nghiệm thức không bổ sung vi khuẩn Tất cả 8 dòng vi khuẩn đều tác động hữu hiệu đối với cây lúa trong suốt thời gian sinh trưởng và phát triển Kết quả khảo sát các sinh tiêu chỉ sinh trưởng của cây lúa ở giai đoạn 48 ngày cho thấy, ở các. .. dòng vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng trong ống nghiệm 4.6.1 Hiệu quả cố định đạm của các dòng vi khuẩn Chiều cao cây lúa giữa các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn ít có sự biến động Tất cả các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn đều có chiều cao cây cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 1% so với đối chứng 14 âm Trong khi đó trọng lượng khô của cây lúa ở hầu hết các nghiệm thức có bổ sung vi khuẩn. .. trồng trên đất thịt pha cát ở thành phố Tuy Hòa, tỉnh Phú Yên Tạp chí Nông nghiệp và Phát triển Nông thôn, 23(1): 65-72 4 Văn Thị Phương Như và Cao Ngọc Điệp, 2013 Phân lập và đặc tính vi khuẩn nội sinh cây lúa (Oryza sativa L.) trồng trên đất của tỉnh Phú Yên, Vi t Nam Báo cáo khoa học Hội nghị công nghệ sinh học toàn quốc 2013; Quyển 2: Công nghệ sinh học vi sinh, công nghệ sinh học thực vật; Vi n công... Hai dòng vi khuẩn này tiếp tục được khảo sát khả năng hòa tan lân ở điều kiện ngoài đồng 17 4.9 Hiệu quả cố định đạm và hòa tan lân khó tan của vi khuẩn nội sinh trên cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phƣờng phú Thạnh, Tuy Hòa 4.9.1 Hiệu quả của 2 dòng vi khuẩn SHL70, PHL87 và phân đạm hóa học lên đặc tính sinh trƣởng và phát triển của cây lúa trồng ở điều kiện ngoài đồng tại phƣờng phú Thạnh,... vậy, trong số 8 dòng vi khuẩn được khảo sát khả năng cố định đạm thì 2 dòng vi khuẩn SHL70 và PHL87 cho hiệu quả cao hơn và khác biệt có ý nghĩa thống kê so với các dòng còn lại Vì vậy, 2 dòng này tiếp tục được khảo sát khả năng cố định đạm ở điều kiện ngoài đồng 4.8.2 Ảnh hƣởng của 4 dòng vi khuẩn và phân lân hóa học lên đặc tính sinh trƣởng và phát của cây lúa trồng ở nhà lƣới Tất cả 4 dòng vi khuẩn. .. F (Phân x Vi khuẩn) F (Phân) CV% (Phân) F (Vi khuẩn) CV% (Vi khuẩn) * Trong cùng một cột, các số liệu có chữ số theo sau giống nhau khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức độ ý nghĩa 1% (**), 23 CHƢƠNG 5 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 5.1 Kết luận - Đề tài đã phân lập được 593 dòng vi khuẩn từ thân và rễ của 119 mẫu lúa, có 221 dòng vi khuẩn được phân lập từ thân và 372 dòng vi khuẩn có nguồn gốc từ rễ Khuẩn. .. và Burkholderia kururiensis lên sự sinh trưởng và năng suất của lúa cao sản (Giống lúa Ma Lâm 213) trồng trên đất thịt pha cát ở thành phố Tuy Hòa, tỉnh Phú Yên Tạp chí khoa học trường Đại học Cần Thơ, 33b: 85-96 3 Văn Thị Phương Như và Cao Ngọc Điệp, 2014 Ảnh hưởng của vi khuẩn Pseudomonas putida và Bacillus subtilis đến sinh trưởng và năng suất của giống lúa cao sản (Giống lúa Ma Lâm 213) trồng trên. .. Đông Hòa Mặc dù điều kiện khí hậu và đặc tính của đất trồng lúa ở 2 huyện này là khác nhau Điều này cho thấy cả hai dòng vi khuẩn SHL70 và TAL4 có thể ứng dụng rộng rãi vào vi c trồng lúa ở các môi trường đất khác nhau nhưng vẫn cho hiệu quả cao Bảng 4.6 Hiệu quả kết hợp 2 dòng vi khuẩn SHL70, TAL4 và phân đạm, lân hóa học lên các thành phần năng suất của cây lúa trồng ở huyện Đông Hòa Nghiệm thức Số . nội sinh trong cây lúa. Chính vì vậy đề tài: Phân lập và khảo sát các đặc tính của vi khuẩn nội sinh trong cây lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên đã được thưc hiện. 1.2. Mục tiêu Phân lập. lúa trồng trên đất ở tỉnh Phú Yên. 1.3 Những điểm mới và ý nghĩa thực tiễn của luận án Đề tài đã phân lập và khảo sát các đặc tính sinh học của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng trên. truyền của các dòng vi khuẩn đã phân lập và phân tích sự đa dạng về loài của các dòng vi khuẩn nội sinh cây lúa trồng ở tỉnh Phú Yên ở mức độ nucleotide. Tuyển chọn được 2 dòng vi khuẩn SHL70