XÁC ĐỊNH LIỀU LD 50 VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI STREPTOCOCCUS AGALACTIAE KHI SỬ DỤNG THỨC ĂN CÓ BỔ SUNG Β GLUCAN Trần Ngọc Thiên Kim (1) , Nguyễn Thị Kiều Tuyên (1) , Nguyễn Tùng Chi (2) , (1) Bộ môn Bệnh học Thủy Sản, Khoa Thủy Sản, Đại học Nông Lâm TPHCM (2) Trung tâm KNKN – sở NN PTNT Khánh Hòa 1. GIỚI THIỆU Giá trị sản xuất nông lâm nghiệp và thủy sản năm 2010 đạt 232,700 tỷ đồng, tăng 4.7% so với năm 2009. Trong đó thủy sản đạt 56,900 tỷ đồng tăng 6.1% với cá đạt 3,848.000 tấn tăng 4.8%. Nghề nuôi thủy sản nước ngọt mà đặc biệt là rô phi đỏ đã được Bộ Thủy Sản xác định là một trong những đối tượng nuôi quan trọng trong quá trình phát triển nuôi trồng thủy sản trong 10 năm trở lại đây. Việt Nam là nước trong khu vực Đông Nam Á, có khí hậu ấm áp và có đủ điều kiện để sản xuất cá rô phi hướng tới xuất khẩu. Tuy nhiên, do việc mở rộng khu vực nuôi không theo quy hoạch cùng với việc nuôi với mật độ cao làm cho nghề nuôi bị thiệt hại nhiều do dịch bệnh. Tác nhân gây bệnh trên cá rô phi nói chung và rô phi đỏ nói riêng thường là vi khuẩn, virus, hoặc protozoa trong đó đáng chú ý nhất là bệnh do vi khuẩn Streptococcus sp. Do đó việc tìm hiểu ảnh hưởng của bệnh gây ra bởi Streptococcus sp. trên cá rô phi đỏ đồng thời cải thiện sức khoẻ cá nuôi để cá có sức đề kháng tự nhiên tốt với dịch bệnh mà không cần sử dụng kháng sinh đang là một nhu cầu cấp thiết. Mục tiêu của đề tài nhằm xác định liều LD 50 và khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối với Streptococcus agalactiae khi sử dụng thức ăn có bổ sung β-glucan. Để đạt mục tiêu trên, lần lượt các nội dung sau sẽ được tiến hành - Xác định liều LD 50 (lethal dose 50) trên cá rô phi đỏ bằng vi khuẩn Streptococcus agalactiae. - Xác định khả năng miễn dịch của cá rô phi đỏ ở các khẩu phần ăn khác nhau có bổ sung β-glucan. - Thử nghiệm kháng sinh đồ trên Streptococcus agalactiae. - Thử nghiệm xác định nồng độ ức chế tối thiểu (Minimum Inhibitory Concentration MIC) trên Streptococcus agalactiae. 2. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU Đối tượng nghiên cứu - Cá rô phi đỏ cỡ cá 10 – 15 g/con. - Streptococcus agalactiae phân lập từ khu vực nuôi cá rô phi ở quận 9 TPHCM Sơ đồ bố trí thí nghiệm Phương pháp bố trí thí nghiệm Thí nghiệm 1: Xác định LD 50 - Tiến hành gây cảm nhiễm cho cá bằng phương pháp tiêm (T) và ngâm (N) với vi khuẩn Streptococcus agalactiae ở những độ pha loãng khác nhau 10 5 , 10 6 , 10 7 , 10 8 để xác định liều gây chết 50% số cá thí nghiệm. - Thí nghiệm được theo dõi trong 20 ngày, trong thời gian này cho cá ăn thức ăn viên hàm lượng đạm 30%, với tỷ lệ 2% trọng lượng thân/ngày. Bảng 1: Liều vi khuẩn gây bệnh ở các nghiệm thức trong thí nghiệm 1 Nghiệm thức Mật độ (cfu/mL) 0 1.28 x 10 3 1.28 x 10 4 1.28 x 10 5 1.28 x 10 6 Tiêm T0 TI TII TIII TIV Ngâm N0 NI NII NIII NIV Sau khi gây bệnh, theo dõi và ghi nhận các biểu hiện của cá trong bể, nếu cá chết trong vòng 24 giờ sau khi tiêm là vì cá bị sốc do tiêm. Sau 2 đến 3 ngày gây nhiễm, ghi nhận số lượng cá chết mỗi ngày ở mỗi nghiệm thức để xác định LD 50 . Quan sát và ghi nhận những biểu hiện bất thường của cá, các dấu hiệu bên ngoài và bên trong, phân lập vi khuẩn từ gan thận lách và não, định danh để xác định mức độ cảm nhiễm của cá đối với mầm bệnh. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ - Thí nghiệm gồm 4 nghiệm thức được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên (CRD), sử dụng thức ăn khác nhau, mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần. Bảng 2: Khẩu phần thức ăn ở các nghiệm thức β-glucan Protein Nghiệm thức 50% Protein 55% Protein Bổ sung β-glucan T I T III Không bổ sung β-glucan T II T IV - Cá được nuôi trong vòng 14 ngày, xác định trọng lượng cá trước và sau khi nuôi. Hàng ngày cho cá ăn 2 lần vào lúc 8 giờ sáng và 4 giờ chiều. Cho cá ăn tối đa. Sau đó tiến hành gây cảm nhiễm. Các nghiệm thức gây bệnh tiêm 0,1 mL vi khuẩn với liều LD 50 đã xác định ở thí nghiệm 1 là 7.4 x 10 4 cfu/mL. Trong quá trình tiêm có sử dụng MS222 gây mê để hạn chế cá bị sốc - Theo dõi tình trạng của cá, thu mẫu cá lờ đờ, cá chết trong thời gian 14 ngày thí nghiệm cảm nhiễm để xác định khả năng xâm nhập của vi khuẩn Streptococcus agalactiae quan sát và ghi nhận những biểu hiện bất thường của cá, các dấu hiệu bên ngoài và bên trong, phân lập để xác định mức độ cảm nhiễm của cá đối với mầm bệnh. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm kháng sinh đồ trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae - Tiến hành thử nghiệm với 15 loại kháng sinh penicilin, ampicilin, ceftriaxone, cefaclor, gentamycin, kanamycin, spectinomycin, erythromycin, tylosin, tetracyclin, doxycyclin, oxytetracyclin, norfloxacin, nitrofurantoin, rifampin Thí nghiệm 4: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của một số loại kháng sinh trên vi khuẩn Streptococcus agalacitae - Sử dụng mật độ vi khuẩn Streptococus agalactiae 1.5x10 8 cfu/mL - Tiến hành theo phươg pháp pha loãng kháng sinh trong ống nghiệm (NCCLS, 2000) Bảng 3: Phương pháp pha loãng kháng sinh Ống nghiệm 0 1 2 16 17 Môi trường BIH (mL) 2 1.95 1.95 1.95 1.95 Huyền phù vi khuẩn 0 0.05 0.05 0.05 0.05 Kháng sinh (mL) 2 2 2 2 2 mL nước cất Nồng độ kháng sinh (µg/mL) 1 1 1/2 1 1/2 15 0 Phương pháp phân tích và xử lý số liệu Xác định LD50 của Reed và Muench (1938) - Tính số cá thể chết và sống trong mỗi nhóm thí nghiệm, sau đó cộng dồn từ thấp đến cao - Tính tỷ lệ chết trên tổng của cột chết và cột sống cộng dồn. - Tính khoảng cách tương ứng giữa hai độ pha loãng có tỷ lệ chết cao hơn và thấp hơn 50% gần nhất. pd = (> 50% - 50%)/(> 50% - < 50%) LD 50 = pd x (độ pha loãng thấp hơn 50% - độ pha loãng) + độ pha loãng cao hơn 50%. Hoặc logLD 50 = [log (> 50%)] + [log (10 -1 ) x pd] = y →LD 50 = 10 y . Phương pháp xác định ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ Tỷ lệ sống của cá theo thí nghiệm(%) X(%) = (N t / N o ) x 100 Với N o : Số lượng cá đầu thí nghiệm N t : Số lượng cá sau thí nghiệm Tăng trọng W = W t – W o Với W o : Trọng lượng cá đầu thí nghiệm W t : Trọng lượng cá sau thí nghiệm Phương pháp xác định kháng sinh đồ Các số liệu đường kính vòng vô khuẩn được đo trong thí nghiệm và biện luận tính kháng, tính nhạy trung gian và tính nhạy của vi khuẩn đối với các kháng sinh thử nghiệm Phương pháp tính MIC Nồng độ tối thiểu của kháng sinh ngăn cản sự tăng trường của vi khuẩn (MIC) là tích số của nồng độ kháng sinh ban đầu với tỷ lệ pha loãng của kháng sinh ở ống trong cuối cùng trong dãy ống nghiệm. MIC = C M x 1/2 n . Trong đó: o MIC: nồng độ ức chế tối thiểu o C M : nồng độ kháng sinh ban đầu o 1/2 n : tỷ lệ pha loãng của kháng sinh ở ống trong cuối cùng trong dãy ống nghiệm. 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN Kết quả phân lập và định danh sơ bộ vi khuẩn Quá trình phân lập vi khuẩn trên cá chết và cá lờ đờ đều cho những khuẩn lạc tròn, màu trắng sữa, bóng, lồi thấp, rìa đều, tâm đậm hơn rìa. Qua định danh sơ bộ cho phản ứng oxidase (-), catalase (-). Vi khuẩn bắt màu tím, Gram dương hình cầu thành từng đôi, có khi đứng riêng lẻ (trên môi trường thạch), tạo thành chuỗi dài (trong môi trường tăng sinh). (a): Vi khuần hình cầu (môi trường thạch) (b): Vi khuẩn dạng chuỗi (môi trường tăng sinh) Hình 1: Hình thái của vi khuẩn Xác định LD 50 Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh ở phương pháp tiêm và ngâm Mặc dù trong cùng điều kiện chăm sóc, quản lý như nhau ở hai phương pháp ngâm và tiêm nhưng thời điểm phát sinh bệnh khác nhau ở mỗi nghiệm thức. Cả ba lần lặp lại thì nghiệm thức đối chứng hoàn toàn không có dấu hiệu bệnh lý. Ở nghiệm thức IV (1.28 x 10 6 cfu/mL) của cả phương pháp tiêm và ngâm thì dấu hiệu bệnh lý xuất hiện sau 21 giờ từ lúc gây cảm nhiễm. Với thời gian biểu hiện này cho thấy tính nhạy cảm của ký chủ và khả năng gây bệnh của chủng này. Bảng 4: Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh Phương pháp Thời gian cá bắt đầu xuất hiện bệnh ĐC NT I NT II NT III NT IV Tiêm - 48±0.29 c 46±0.0 c 30±1.53 b 21±0.0 a Ngâm - 49±1.26 c 46.5±0.5 c 31±1.15 b 24.3±0.88 a Ghi chú: (-) không có biểu hiện bệnh Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng ngang nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05) Đối với phương pháp tiêm và ngâm chúng tôi thấy rằng thời gian cá bắt đầu biểu hiện dấu hiệu bệnh lý ở các nghiệm thức là có sự khác biệt có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ tin cậy 95% (P < 0.05). Tỷ lệ cá chết, các dấu hiệu bệnh lý, kết quả tái phân lập - Dấu hiệu bệnh lý: Hầu hết cá bệnh đều có dấu hiệu bệnh lý giống nhau là tách đàn, bỏ ăn, bơi lờ đờ trên mặt bể, bụng trương, mắt lồi, mù mắt, xuất huyết các gốc vây, toàn thân. Khi giải phẫu thấy có hiện tượng tích dịch xoang bụng, gan nhạt màu, đôi khi xuất huyết, lách, thận và mật sưng, bóng khí phình to, não bị xuất huyết. (b) (a) Hình 3: Cá thí nghiệm bị mù mắt và trương bụng sau 4 ngày gây bệnh Hình 2: Cá thí nghiệm bị mù mắt và trương bụng sau 4 ngày gây bệnh Bảng 5: Kết quả tỷ lệ cá chết và tái phân lập Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05) Ở phương pháp ngâm và tiêm, tỷ lệ chết ở nghiệm thức đối chứng thấp hơn có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức độ tin cậy 95% (P < 0.05) so với các nghiệm thức còn lại. Cá chết ở nghiệm thức đối chứng là do một số cá đã bị xây xát trong quá trình vận chuyển cá vào các bể thí nghiệm và bị sốc do tiêm. Khi tái phân lập thì ở nghiệm thức đối chứng hoàn toàn không phân lập được vi khuẩn, ở các nghiệm thức còn lại vi khuẩn luôn được phân lập từ các thực thể thí nghiệm. Mặc dù tỷ lệ cá chết tăng dần theo mật độ vi khuẩn thí nghiệm, tuy nhiên không có sự khác biệt về tỷ lệ chết giữa hai phương pháp gây cảm nhiễm bệnh tiêm và ngâm (P>0.05). Tuy nhiên, kết quả cho thấy mật độ vi khuẩn càng cao thì tỉ lệ cá chết càng nhiều. Ở nghiệm thức có mật độ 1.28 x 10 6 cfu/mL cho tỉ lệ cá chết cao nhất, chiếm 51.67% ở phương pháp tiêm và 46.67% ở phương pháp ngâm. Liều LD50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae Trong quá trình nuôi, đến ngày thứ 10, bắt đầu xuất hiện bể có 50% số cá chết. Vi khuẩn luôn được tái phân lập từ các thực thể thí nghiệm nên thể hiện vai trò của vi khuẩn trong quá trình diễn tiến bệnh lý của cá. Bảng 6: Kết quả LD 50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae Ngày Liều (cfu/mL) (theo Reed và Muench) PP Tiêm PP Ngâm 10 - - 11 - - 12 1.22 x 10 5 - 13 9.34 x 10 4 - 14 7.3 x 10 4 1.14 x 10 5 Ghi chú: (-) không xác định được LD 50 Nghiệm thức Tỷ lệ cá chết (%) Số mẫu tái phân lập PP Tiêm PP Ngâm PP Tiêm PP Ngâm ĐC 16.67 ± 3.33 a 15 ± 2.89 a 0 0 NT I 40 ± 5.00 b 36.67 ± 1.67 b 6 6 NT II 40 ± 2.89 b 38.33 ± 1.67 b 6 6 NT III 46.67 ± 3.33 b 41.67 ±4.41 b 6 6 NT IV 51.67 ± 3.49 b 46.67 ±3.33 b 6 6 Ở phương pháp ngâm, thời gian để vi khuẩn làm chết 50% số cá thí nghiệm là 14 ngày chậm hơn phương pháp tiêm 2 ngày, đồng thời liều vi khuẩn gây chết 50% số cá thí nghiệm của phương pháp ngâm cao hơn của phương pháp tiêm trong cùng thời điểm (1.14 x 10 5 cfu/mL so với 7.3 x 10 4 cfu/mL. Phương pháp tiêm có tác dụng gây bệnh hiệu quả hơn phương pháp ngâm trong cùng điều kiện thí nghiệm, do ở phương pháp tiêm vi khuẩn được đưa trực tiếp vào cơ thể cá, trong khi đó ở phương pháp ngâm vi khuẩn được pha vào nước cần có thời gian xâm nhập vào cơ thể ký chủ, quá trình này còn phụ thuộc vào khả năng đề kháng của cá. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hưởng của β-glucan lên đáp ứng miễn dịch của cá Tăng trọng của cá thí nghiệm Tăng trọng của cá ăn khẩu phần 55% Protein cao hơn có ý nghĩa về mặt thống kê so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức 50% Protein cho sự tăng trọng của cá thấp nhất có ý nghĩa về mặt thống kê (P>0.05). Điều này cho thấy sự khác biệt hàm lượng protein tác động đến tăng trọng của cá thí nghiệm, tuy nhiên việc bổ sung β glucan ảnh hưởng không đáng kể đến tăng trọng cá thí nghiệm trong 14 ngày nuôi. Ở cá ăn khẩu phần proetin 50%, sự bổ sung β-glucan cho thấy sự tăng trọng cao hơn với khẩu phần không bổ sung β-glucan (1.11 so với 0.75). Khẩu phần thức ăn bổ sung β-glucan thương mại như EcoActiva cho thấy sự tăng trưởng rõ ràng trên cá pink snapper (Cook et al., 2001), cá Rohu (Misra et al., 2006), large yellow croaker (Ai et al., 2007). Tỷ lệ cá sống là 100% giữa các nghiệm thức. Điều này chứng tỏ việc bổ sung β glucan không ảnh hưởng đến tỷ lệ sống của cá. Bảng 7: Tăng trọng của cá thí nghiệm Chỉ tiêu Nghiệm thức 50%P + β-glucan 50%P 55%P + β-glucan 55%P T1 T2 T3 T4 Trọng lượng đầu 12.55±1.53 a 12.48±0.89 a 13.01±0.79 a 10.93±0.65 a Trọng lượng cuối 13.66±1.37 a 13.23±1.04 a 14.14±0.55 a 13.51±0.77 a Tăng trọng 1.11±0.31 ab 0.75±0.15 a 1.13±0.24 ab 2.58±0.89 b Tỷ lệ sống 100% 100% 100% 100% Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng ngang nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P>0.05) Kết quả đáp ứng miễn dịch của cá Gây cảm nhiễm bệnh cho cá nuôi thí nghiệm sau 14 ngày cho ăn β–glucan để xem khả năng đáp ứng miễn dịch của cá. Tiêm vi khuẩn Streptococcus agalactiae với mật độ 7.4.10 4 cfu/mL (đã được xác định ở thí nghiệm 1) cho 4 nghiệm thức. Thí nghiệm được theo dõi trong 14 ngày, cá chết hay hấp hối đều được ghi nhận và mổ khám bệnh tích. Các dấu hiệu ở các nghiệm thức gây bệnh chúng tôi ghi nhận được là tách đàn, bỏ ăn, bơi lội lờ đờ trên mặt bể, cá chết thường có biểu hiện bên ngoài là xuất huyết toàn thân, vây ngực, vây đuôi, một số con bị lồi mắt. Bệnh tích bên trong ghi nhận được là gan nhạt màu, thận sưng, lách sưng, tích dịch xoang bụng, có trường hợp bóng khí phình to. Sau khi mổ khám bệnh tích, các mẫu gan, thận, lách được cấy trên đĩa môi trường BHIA và định danh sơ bộ. Bảng 8: Kết quả cá chết và tái phân lập giữa các nghiệm thức Nghiệm thức % cá chết Số mẫu tái phân lập T I 65 ± 2.89 a 6 T II 81.67 ± 4.41 b 6 T III 61.67 ±7.26 a 6 T IV 76.67 ± 3.33 ab 6 Ghi chú: Những giá trị của các nghiệm thức trên cùng một hàng dọc nếu chứa những ký tự giống nhau thì sai khác không có ý nghĩa ở mức độ tin cậy 95% (P > 0.05) Ở cá ăn sử dụng khẩu phần có bổ sung β-glucan (nghiệm thức T I và T III) đều cho tỉ lệ cá chết thấp nhất có ý nghĩa thống kê (P<0.05). Điều này chứng tỏ β-glucan có tác động làm tăng khả năng đề kháng của cá với mầm bệnh. Kết quả này phù hợp với nghiên cứu của Dharmendra (2012), khẩu phần có bổ sung β-glucan cho thấy sự cải thiện về sức khỏe, và tăng trưởng ở nhiều nhóm động vật khác nhau như tôm, cá và những động vật trên cạn khác. Theo Ai và cộng sự (2007), β-glucan có khả năng tăng cường khả năng bảo vệ cho cá croaker đề kháng vi khuẩn Vibrio harveyi. Tương tự, β-glucan tăng cường sức đề kháng cho cá da trơn (Aisan catfish) với vi khuẩn Aeromonas hydrophila (Kumari and Sahoo, 2006), cá Rohu với vi khuẩn Edwardsiella tarda (Sahoo and Mukherjee, 2001). Hàm lượng protein 50 và 55% không cho thấy sự sai khác về mặt thống kê ở tỉ lệ chết (nghiệm thức T II và T IV). Kết quả này cho thấy hàm lượng đạm trong thức ăn không có tác động làm tăng khả năng đề kháng của cá với mầm bệnh. Thí nghiệm 3: Thử nghiệm kháng sinh đồ Tiến hành thử nghiệm với 15 loại kháng sinh penicillin (Pn), ampicilin (Am), ceftriaxone (Cx), cefaclor (Cr), gentamycin( Ge), kanamycin (Kn), spectinomycin (Sp), erythromycin (Er), tylosin (Ty), tetracycline (Te), doxycyclin (Dx), oxytetracyclin (Ox), norfloxacin (Nr), nitrofurantoin (Fr), rifampin (Rf) Bảng 9: Đường kính vòng vô khuẩn trung bình Kháng sinh Đường kính vòng kháng khuẩn đo được Đường kính vòng kháng khuẩn trung bình Nhận xét Lần lặp lại thứ nhất Lần lặp lại thứ hai Pn 16 15 15.5 Kháng Hình 4: Vi khuẩn phân lập từ cá bệnh cấy thuần trên đĩa thạch sau 24 giờ ủ ở 30 o C Am 22 21 21.5 Kháng Cx 23 23 23.0 Nhạy Cr 23 22 22.5 Nhạy Ge 25 24 24.5 Nhạy Kn 27 26 26.5 Nhạy Sp 19 18 18.5 Nhạy Er 21 22 21.5 Trung gian Ty 16 16 16.0 Kháng Te 26 25 25.5 Nhạy Dx 28 28 28.0 Nhạy Ox 25 25 25.0 Nhạy Nr 28 28 28.0 Nhạy Fr 16 16 16.0 Trung gian Rf 21 21 21.0 Nhạy Kết quả thu được như sau: Vi khuẩn Streptococcus agalactiae kháng với các loại kháng sinh sau: Pn, Am, Ty. Vi khuẩn Streptococcus agalactiae nhạy với các loại kháng sinh sau: Cr, Ge, Kn, Te, Ox, Dx, Rf, Cx, Nr, Sp và ít nhạy với kháng sinh: Er và Fr. Hình 5: Vòng kháng khuẩn các kháng sinh Thí nghiệm 4: Xác định nồng độ ức chế tối thiểu MIC Từ kết quả thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp khuếch tán kháng sinh, một số loại kháng sinh cho kết quả nhạy và ít nhạy trên Streptococcus agalactiae để tiếp tục thử nghiệm kháng sinh đồ theo phương pháp pha loãng liên tiếp, nhằm xác định nồng độ tối thiểu của kháng sinh có thể ngăn cản sự tăng trưởng của vi khuẩn. Bảng 10: Kết quả thử nghiệm xác định MIC của một số kháng sinh trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae Kháng sinh Ký hiệu Kết Quả Kháng Trung gian Nhạy Cefaclor Cr 8.192 4.096 2.048 Gentamycin Ge 5.461 2.731 1.365 Kanamycin Kn 6.827 3.413 1.707 Erythromycin Er 0.512 0.256 0.128 Tetracyclin Te 4.096 2.048 1.024 Oxytetracycli n Ox 0.683 0.512 0.427 Doxycyclin Dx 4.096 2.048 1.024 Rifampin Rf 1.024 0.512 0.256 Kết quả cho thấy nồng độ ức chế tối thiểu của các loại kháng sinh trong thí nghiệm trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae là khác nhau, trong đó nồng độ của kháng sinh cefaclor là cao nhất (8.192 µg/mL), nồng độ của kháng sinh erythromycin là thấp nhất (0.512 µg/mL). Có nhiều dạng kháng thuốc như: đề kháng tự nhiên, đề kháng sinh học, đề kháng điều trị… Nhưng trong nghiên cứu này, khả năng đề kháng tự nhiên của Streptococcus agalactiae được loại trừ. Đề kháng tự nhiên được hiểu là hiện tượng mỗi loài sinh vật sẽ có khả năng không bị ức chế hoặc tiêu diệt bởi một số kháng sinh nhất định. Ví dụ như nấm, virus, nguyên sinh động vật, do trên thành tế bào không có lớp peptidoglucan nên không chịu tác động của kháng sinh β-lactam (cefalor). Khả năng đề kháng sinh học là sự đề kháng ngẫu nhiên của vi sinh vật gây bệnh đã hình thành trong quần thể vi sinh vật gây bệnh trước khi tiếp xúc với môi trường chứa chất kháng sinh. Đây là hiện tượng xảy ra không phổ biến, nguyên nhân có thể do đột biến ngẫu nhiên nhiễm sắc thể nên trong quần thể vi sinh vật gây bệnh sẽ xuất hiện một (hoặc vài tế bào) có khả năng kháng thuốc. Do đó, ở lần điều trị bệnh đầu tiên sẽ có dấu hiệu giảm nhưng sẽ bùng phát trở lại ngay sau đó vì chỉ có tế bào vi sinh vật thường bị tiêu diệt, còn các tế bào vi sinh vật kháng thuốc vẫn còn sống sót, tiếp tục sinh trưởng bù đắp cho tế bào đã bị tiêu diệt. Hậu quả là chúng làm thay đổi bản chất của vi sinh vật gây bệnh và vô hiệu hóa tác dụng điều trị của thuốc kháng sinh đó trong tất cả các lần điều trị sau này. Như vậy, với tình hình bệnh trên cá rô phi đỏ do Streptococcus sp. thì Streptococcus sp không có đề kháng sinh học với các loại kháng sinh trên. Từ đó, khả năng điều trị được cân nhắc đến. Thực tế cho thấy, khả năng đề kháng điều trị của vi sinh vật gây bệnh xuất hiện rất phổ biến sau khi tiếp xúc nhiều với một loại kháng sinh. Hiện nay, đa số người nuôi sử dụng nhóm β-lactamine (kháng sinh cefalor) và nhóm aminoglycoside (gồm gentamycin và kanamycin) trong việc điều trị bệnh. Chính vì vậy, chúng tôi nhận thấy rằng nồng độ ức chế tối thiểu của cefalor là cao nhất (8.192 µg/mL), kế tiếp là kanamycin (6.827 µg/mL), và gentamycin (5.461 µg/mL). Trong khi đó, các nhóm kháng sinh còn lại ít được lựa chọn trong việc trị bệnh như rifampin (có tác dụng gắn với enzyme mRNA polymerasa ngăn cản quá trình sao mã tạo thành mRNA). Vì vậy, nồng độ ức chế tối thiểu của rifampin khá thấp (1.024 µg/mL). Như vậy, kết quả của MIC đối với chủng Streptococcus agaalactiae trong phòng thí nghiệm khá phù hợp với thực tế sử dụng thuốc của người dân (Đạt and Tuyền, 2005, Uyên, 2005). Tuy nhiên, mặc dù nhóm Macrolide (kháng sinh erythromycin) là một trong những kháng sinh được người dân lựa chọn khá nhiều trong việc điều trị nhưng vẫn cho nồng độ MIC thấp (0,512 µg/mL). Điều này có thể được giải thích rằng nhóm Macrolide có tác dụng ức chế quá trình sinh tổng hợp protein, chúng gắn với tiểu phần 50S của ribosome làm ngăn cản quá trình dịch mã của các acid amin đầu tiên của chuỗi polypeptide, nên việc điều trị khá hiệu quả và khả năng kháng thuốc thấp. Tóm lại, kết quả nồng độ MIC của các loại kháng sinh đối với chủng Streptococcus agaalactiae phân lập ở khu vực Quận 9 TPHCM cho kết quả khá phù hợp với những cuộc điều tra về việc sử dụng thuốc của người dân trong việc điều trị cá rô phi đỏ. Để giải quyết tình trạng [...]... hợp với thực tế sử dụng thuốc của người dân trong việc điều trị bệnh cá rô phi đỏ do Streptococcus agalactiae gây ra Đề nghị - Cần nghiên cứu thêm liều LD50 của các loài vi khuẩn khác nhau trên cá rô phi đỏ cũng như các đối tượng khác tạo thuận lợi cho việc quản lý dịch bệnh trên cá - Tiếp tục tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của β glucan lên khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ cũng như một số đối. .. thế Việc sử dụng các chất kích thích miễn dịch sinh học như β- glucan cũng có thể được xem là một hướng đi trong việc phòng bệnh thủy sản trong tương lai 4 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ Kết luận - LD50 của vi khuẩn Streptococcus agalactiae đối với cá rô phi đỏ là 7.3 x 104cfu/mL (phương pháp tiêm) và 1.14 x 105 cfu/mL (phương pháp ngâm) - Về thử nghiệm khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ, β glucan đã... việc đáp ứng miễn dịch trên cá trong thời gian nuôi 15 ngày Do đó có thể sử dụng để tăng khả năng miễn dịch của cá trong phòng và trị bệnh - Đối với thử nghiệm kháng sinh đồ vi khuẩn Streptococcus agalactiae kháng với các loại kháng sinh : Pn, Am, Ty, nhạy với các loại kháng sinh : Cr, Ge, Kn, Te, Ox, Dx, Rf,Cx, Nr, Sp và ít nhạy với kháng sinh: Er và Fr - Về thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu của các... nhau để có cái nhìn chi tiết hơn về tác động của β glucan tạo thuận lợi trong phòng và trị bệnh - Tiến hành thử nghiệm kháng sinh đồ trên các chủng Streptococcus sp khác nhau và trên nhiều loại kháng sinh nhằm rút ra kết luận chính xác về hiệu lực các loại các sinh từ đó đề nghị cách sử dụng kháng sinh hiệu quả góp phần đảm bảo sức khoẻ cộng đồng - Nên có biện pháp hướng dẫn người nông dân sử dụng đúng... thuốc và không được sử dụng các loại kháng sinh cấm - Tiếp tục thử nghiệm nồng độ ức chế tối thiểu của các loại kháng sinh khác trên vi khuẩn Streptococcus agalactiae và các chủng vi khuẩn khác để có thể chọn lựa và sử dụng có hiệu quả kháng sinh trong phòng và điều trị bệnh TÀI LIỆU THAM KHẢO AI, Q., MAI, K., ZHANG, L., TAN, B., ZHANG, W., XU, W & LI, H (2007) Effects of dietary [beta]-1, 3 glucan. .. HAYBALL, J D (2001) The efficacy of a commercial [beta] -glucan preparation, EcoActiva(TM), on stimulating respiratory burst activity of head-kidney macrophages from pink snapper (Pagrus auratus), Sparidae Fish & Shellfish Immunology, 11, 661-672 ĐẠT, P Q & TUYỀN, C T (2005) Điều tra tình hình dịch bệnh và khảo sát đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối với Streptococcus sp Khoa Thủy Sản Hồ Chí Minh, ĐH Nông... quan và đơn giản nhất là sử dụng các loại kháng sinh mới Tuy nhiên, việc nghiên cứu và sản xuất một loại kháng sinh mới là cả một khối lượng công viêc khổng lồ, tiêu tốn thời gian và tiền bạc Nguy hiểm hơn, tình trạng lạm dụng kháng sinh ngày càng phổ biến sẽ khi n vật chủ trở nên thụ động hơn về khả năng tự đề kháng trong khi yếu tố gây bệnh trở nên nguy hiểm hơn… Chính vì vậy, định hướng sử dụng. .. Hygiene, 27, 493-497 SAHOO, P K & MUKHERJEE, S C (2001) The effect of dietary beta -glucan on immune response and disease resistance of healthy and aflatoxin B1-induced immunocompromised Labeo rohita Fish & Shellfish Immunology, 11, 683-695 UYÊN, D P (2005) Khảo sát kỹ thuật nuôi và bệnh do Streptococcus sp trên cá rô phi nuôi bè Khoa Thủy Sản Hồ Chí Minh, ĐH Nông Lâm TPHCM ABSTRACT Vietnam has several... by Streptococcus sp on red tilapia and how to improve the immune system by minimize using antibiotics is priority requirement The research has four sesions (1) Determine the LD 50 dose of red tilapia with Streptococcus agalactiae by injection and immersion method (2) Determine the immunity of red tilapia in the diets supplemented with and without β- glucan (3) Testing antibiotic on Streptococcus agalactiae. .. with Streptococcus sp were further tested to determinie the minumim inhibitory concentration (MIC) The results in experiment (1) showed that LD50 of red tilapia on Streptococcus agalctiae was 7.3x10 4 cfu/mL and 1.14 x 105cfu/mL for injection and immersion, respectively In experiment (2), the fish mortalities in the treatments supplemented with β- glucan were significantly lower than without β- glucan . tiêu của đề tài nhằm xác định liều LD 50 và khả năng đáp ứng miễn dịch của cá rô phi đỏ đối với Streptococcus agalactiae khi sử dụng thức ăn có bổ sung β- glucan. Để đạt mục tiêu trên, lần lượt các. XÁC ĐỊNH LIỀU LD 50 VÀ KHẢ NĂNG ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH CỦA CÁ RÔ PHI ĐỎ ĐỐI VỚI STREPTOCOCCUS AGALACTIAE KHI SỬ DỤNG THỨC ĂN CÓ BỔ SUNG Β GLUCAN Trần Ngọc Thiên Kim (1) ,. hành - Xác định liều LD 50 (lethal dose 50) trên cá rô phi đỏ bằng vi khuẩn Streptococcus agalactiae. - Xác định khả năng miễn dịch của cá rô phi đỏ ở các khẩu phần ăn khác nhau có bổ sung β- glucan. -