Đang tải... (xem toàn văn)
Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm Ứng dụng LC MS để khảo sát dược động học của glycyl funtumin ở động vật thí nghiệm
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI oOo PHẠM NHƯ QUỲNH ữ^G DỤNG LC - MS ĐỂ k h ả o s á t DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA • • • GLYCYL PUNTUMIN ở ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM • • • KHOÁ LUẬN TỐT HGh S Í^ Ư Ợ C s ĩ k h ó a 2000 - 2005 Giáo viên hướng dẫn:^ ĩhiíESf1<íguyễn Quốc Bình 2. Ths. Nguyễn Đình Tuấn Nơi thực hiện: Bộ môn Hoá Sinh, Bộ môn Dược Lực Trường ĐH Dược Ha Nội Phòng giám định hoá pháp lý Viện Khoa Học Hình Sự Thời gian thực hiện: Tháng 2 đến 5 năm 2005 HÀ NỘI, THÁNG 5-2005 •ĩnưÃ -ầS ): h i ũ ì m M ề l e ă n t tU t æJiL bàụ. tẩ LầỊiẨỊ. b iỉí Ổ4^ sâu sẨíi lới: ÇîS^. QlụuíỊỈMt. Qjuốa (Bưih Çîhs. QlxỊuụỀn^ ^inlt ^uLOLtt^ Qílhữnụ. nẮỊUồl tliầụ. đ ă tận. tình kưỔitiỊ. dẫn ^ giújfL đẵ ear ihựít hiỀễt ÚỈL hjơăit thùnh Luătz Ịtùự ¿jttL æitL e/i£UL Uloj^l eỏMtL €Ỉ4^ ấỉAe tliầụ. cA eỉutẨỊ. eúíí eoM. Ixà, kụ. thuậl úien. trmiạ. ímfL tnồềt^ 'JôéiL n^ưđe, J¿í¿a^ Çît^'èitxj. ^ a i kú<i nyưđe, 'Tôi Qlội. Ốtn. æiit ehăễt thủềih eủin. ốn. eÓM, eáễ^ lứ^ kụ. íluíâl aỉỀn. tạ i phồng, ^iăiễv đỉnh háiL pháp. Líị <UiềM. DCÍ^úit kúe, hình ẴẨjt (Bà eồềzạ. an. đ ă hxiêitxỊ. ílẫết^ hẶ tnỷ kụ. Ihuut úỉt t€i(% mại đỉềrt klejt tliuÛJt. Iđi eko^ eML lỉun. lốt đề. tà i itàụ ^ u ế ỉ eù n g .^ ejit^ æ/#t el^ A t^ euMWL Ổ4t^ (B cư i ^ i c u n líiềxv^ eă a fth ô ttjg . !ư uz^ e ă e Im Ịtiờĩtí^ồểig. ^ ạ i hoe n)ưé<í '7ŨĨL Qlội đũ txm i^nũí ítieju kiej^ thuâiL Lợi ejn. trsníj. thồi íjiojiL kạa ÜÁ thu'e hiện. kháiL Luận, tạ i ù^ưằnxẬ '7ùỉt Qlộiy tkánẨẬ. 5/2005. Sinh aiỀn. ^ h ụ i^ QUu¿ Qjuí/jzh Mục lục Lời cảm ơn Mục lục Chú giải chữ viết tắt Đặt vấn đề 1 Phần I: Tổng quan 3 I. Dược động học 3 1. Khái niệm 3 2. Các thông số Dược động học cơ bản 3 2.1. Diện tích dưới đường cong (AUC) 3 2.2. Thể tích phân bố (Vd) 6 2.3. Hệ số thanh thải (Cl) 6 2.4. Thời gian bán thải (Tjỵ 2 ) 8 3. Mối quan hệ giữa các thông số Dược động học 9 4. Các mô hình nghiên cứu Dược động học 10 II. Sắc ký lỏng hiệu năng cao ghép khối phổ (HPLC - MS) 11 1. Giới thiệu nguyên tắc cấu tạo của hệ thống HPLC 11 2. Một số đại lượng đặc trưng của HPLC 13 2.1. Thời gian lưu giữ 13 2.2. Thể tích lưu 14 2.3. Số đĩa và chiều cao của đĩa trong cột sắc ký 14 2.4. Khả năng phân giải 15 2.5. Quá trình cột và sự mở rộng giải pic Phương trình Van - Deemter 15 3. Một số trang thiết bị trong kỹ thuật HPLC 16 3.1. Cột tách sắc ký 16 3.2. Các loại detector 17 III. Tổng quan về Glycyl Funtumin 22 Phần II: Thực nghiệm và kết quả 25 I. Hóa chất, dụng cụ, thiết bị và phương pháp nghiên cứu 25 1. Hóa chất 25 2. Dụng cụ 25 3. Động vật thí nghiệm 26 4. Phương pháp nghiên cứu 26 4.1. Thẩm định phương pháp 26 4.2. Bố trí thí nghiệm và lấy mẫu 28 4.3. Xây dựng đường cong Dược động học 28 4.4. Phương pháp xử lý số liệu 32 II. Thực nghiệm và kết quả 32 1. Khảo sát và lựa chọn điều kiện chạy HPLC - MS 32 1.1. Chọn điều kiện làm việc cho HPLC 33 1.2. Chọn điều kiện làm việc cho Detector MS 33 2. Khảo sát phương pháp định lượng Glycyl Puntumin trong huyết tương chó thí nghiệm 35 2.1. Xây dựng đường chuẩn 35 2.2. Xác định tính chính xác của phương pháp 36 2.3. Hiệu suất chiết của GF trong huyết tương chó 37 3. Thiết lập các thông số Dược động học của GF trên động vật thí nghiệm 38 3.1. Sơ bộ khảo sát sự biến thiên nồng độ GF trong huyết tương theo thời gian 38 3.2. Thiết lập các thông số Dược động học GF trên chó 40 Phần III: Bàn luận và kết luận 44 Tài liệu tham khảo Phu luc CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT Aưc C1 ^Max cs EI F, SKD GF HPLC K MS RSD SD SIM TDSH T i/2 ^Max Vd Diện tích dưới đưòỉng cong Nồng độ - thời gian (Area Under the Curve) Hệ số thanh thải (Clearance) Nồng độ thuốc đạt cực đại trong huyết tương Nồng độ thuốc ở trạng thái cân bằng (^steady-state) Cộng sự lon hóa phun ion (Electrospray Ionization) Sinh khả dụng. Glycyl Funtumin Sắc ký lỏng hiệu năng cao (High - Performance Liquid Qiromatography) Hệ số tốc độ thải trừ Khối phổ (Mass Spectrum) Độ lệch chuẩn tương đối Độ lệch chuẩn Sắc ký đồ toàn ion (Total Ịon Chromatogram) Tương đương sinh học Thời gian bán thải Thời điểm thuốc đạt nồng độ tối đa trong huyết tương Thể tích phân bố (Volume of distribution) ĐẶT VÂN ĐỂ Dược động học là một phần quan trọng trong hồ sơ về một thuốc dưới cả góc độ khoa học, quản lý và nhất là sử dụng lâm sàng. Các thông số Dược động học sẽ phản ánh số phận của thuốc trong cơ thể. Thông qua hiểu biết về Dược động học người thầy thuốc sẽ có được sự lựa chọn cách thức đưa thuốc, thời gian đưa thuốc sao cho hợp lý và hiệu quả nhất. Với mục đích nâng cao chất lượng và tính an toàn của thuốc, quá trình cấp phát số đăng ký lưu hành thuốc ở trên thế giới cũng như Việt Nam ngày càng được tiến hành một cách chặt chẽ, kỹ lưỡng. Một trong những phần quan trọng trong bộ hồ sơ đăng ký là phải có thông tin về Dược động học của thuốc. Trong các chuyên mục của Dược thư cũng như những tờ rơi hướng dẫn sử dụng thuốc, phần công bố về Dược động học của thuốc luôn nhận được sự quan tâm hàng đầu của cả bác sĩ điều trị, dược sĩ lâm sàng thậm chí cả ngưòi dùng thuốc. Glycyl Puntumin (GF) là một chất điều hoà miễn dịch đã được phát triển ở Trường Đại Học Dược Hà Nội từ khoảng 30 năm nay. Hiện đang được tiến hành sản xuất thử nghiệm và thử nghiệm lâm sàng ở giai đoạn cuối. Song song với quá trình trên, cơ quan Quản lý Dược đã cấp phép cho Aslem (chế phẩm bào chế từ GF) SỐ đăng ký nghiên cứu. Tuy nhiên do hạn chế về phương pháp và thiết bị nên phần Dược động học của GF chưa từng được khảo sát. Để hoàn thiện hồ sơ về Aslem thì những hiểu biết về Dược động học của GF là đòi hỏi thiết thực và cấp thiết. Trong đề tài luận văn này, với mục đích chủ yếu là học tập phương pháp luận nghiên cứu, chúng tôi mạnh dạn đặt vấn đề sử dụng HPLC-MS, một phương pháp phân tích hiện đại, tin cậy với độ nhạy cao để khảo sát về Dược động học của GF trên động vật thực nghiệm, cụ thể: 1. Khảo sát khả năng sử dụng HPLC-MS để định lượng GF 2. Thiết lập các điều kiện thực nghiệm khi sử dụng HPLC-MS để định lượng GF 3. Thiết lập các thông số Dược động học GF trên động vật thí nghiệm PHẦN I: TỔNG QUAN I. Dược ĐỘNG HỌC . 1. Khái niệm: Dược động học của một thuốc là một khái niệm để phản ánh số phận của thuốc trong cơ thể, bao gồm các quá trình hấp thu, phân bố, chuyển hoá và thải trừ. Các quá trình này được biểu thị thông qua những thông số Dược động học, trong đó có 4 thông số cơ bản, có nhiều ý nghĩa trong thực hành lâm sàng là: diện tích dưới đường cong nồng độ-thời gian (AƯC), thể tích phân bố (Vd), hệ số thanh thải (Cl) và thời gian bán thải hay nửa đòi sinh học (Ti/ 2 ) [14, 30]. Thông qua các thông số Dược động học người thầy thuốc lâm sàng có thể quyết định liều lượng cần đưa vào cơ thể của mỗi thuốc, khoảng cách giữa các lần đưa thuốc hoặc hiệu chỉnh lại liều lượng trong các trường hợp bệnh nhân có những bất thường về sinh lý, bệnh lý. Đối với ngành dược, các thông số này là những gợi ý tốt cho việc lựa chọn dạng bào chế và cải tiến dạng bào chế để tạo được những dạng thuốc có các thông số Dược động học mong muốn[14]. 2. Các thông số Dược động học cơ bản 2.1. Diện tích dưới đường cong (AUC - Area Under the Curve) Diện tích dưới đường cong (AUC - của đồ thị biểu diễn sự biến thiên của nồng độ thuốc trong máu theo thời gian) biểu thị tượng trưng cho lượng thuốc vào được vòng tuần hoàn ở dạng còn hoạt tính sau một thời gian t và được tính bằng mg.h.l ^ hoặc ịxg.h.mỉ'J [14, 18, 24]. Giả sử toàn bộ lượng thuốc đưa vào cơ thể đều vào được vòng tuần hoàn chung ở dạng còn hoạt tính và sẽ phát huy tác dụng dược lý thì trị số AUCỔ cho phép đánh giá được chất lương của dạng bào chế. Hình 1: Diện tích dưới đường cong (AUC) Có nhiều cách để tính AUC, có thể tính theo phương pháp tích phân trên máy tích phân (AUC = fc.dt ) hay tính toán đơn giản theo quy tắc hình thang. đ Ngoài ra giá trị AUC cũng có thể tính được thông qua hệ số thanh thải theo công thức sau: _ F*D AUCổ= ° C1 Trong đó : Dq là liều dùng, Cl là hệ số thanh thải, F là sinh khả dụng Công thức ở trên cũng cho thấy mối liên hệ giữa trị số AUC vói sinh khả dụng của thuốc (F), tức là mức độ và tốc độ hấp thu của dược chất từ dạng bào chế vào vòng tuần hoàn chung của cơ thể ở dạng còn hoạt tính. Trị số F là đại lượng biểu thị trực tiếp tính hiệu quả của một dạng bào chế. Nếu thuốc được đưa qua đường tĩnh mạch (I.V) thì F = 1. Ngược lại khi thuốc được đưa vào cơ thể bằng các con đường khác thì luôn có một lượng nhất định bị tổn hao khi hấp thu vào máu hoặc bị mất hoạt tính khi qua gan, do đó F luôn < 1. Đối với sinh khả dụng một thuốc người ta phân chia thành SKD tuyệt đối và SKD tương đối [14, 18, 24]. • SKD tuyệt đ ối: được tính bằng tỷ số tổng lượng dược chất được hấp thu vào đại tuần hoàn từ dạng bào chế của nó và từ dạng tiêm động mạch hay tữih mạch. SKDj„yetđô'i = — *100% tuyẹtđOi A ĩỊr _ *r) ^thủ Nếu liều của 2 chế phẩm như nhau và trọng lượng người thử thuốc bằng nhau th ì: ATTP * 100% • SKD tương đ ối: Với những thuốc không dùng đường tiêm tĩnh mạch ta dùng khái niệm SKD tương đối. SKD tương đối của 1 chế phẩm (thử) so với 1 chế phẩm khác lấy làm chuẩn (dạng bào chế được coi là có khả năng hấp thu tốt hoặc chế phẩm đã được công nhận về hiệu lực tác dụng) là tỷ lệ dạng hoạt tính của chế phẩm thử vào đại tuần hoàn so với chế phẩm chuẩn vào đại tuần hoàn. SKD^g«, = ^ ^ * 1 0 0 % ^chuẩn Để so sánh SKD của 2 dạng thuốc hoặc 2 biệt dược cân dùng khái niệm KSD tương đối. Nhưng SKD tương đối chỉ cho phép so sánh mức độ hấp thu mà chưa xét đến tốc đố hấp thu của chúng. Vì thế cần phải đưa ra khái niệm tương đương sinh học (TOSH). Hai chế phẩm được coi là TDSH nếu mức độ và tốc độ hấp thu vào tuần hoàn chung của các dược chất là gần như nhau trên cùng đối tượng và điều kiện thử. Để đánh giá TĐSH ngoài AUC còn phải đánh giá các đại lượng [18]. Hai thuốc A và B là TOSH nếu: [...]... nghiên cứu Dược động học. [20, 30] Pharmacokinetic là khái niệm để chỉ động học về hấp thu, phân bố, chuyển hoá và thải trừ của một chất Khác với dược lực, Dược động học nghiên cứu về cách thức mà cơ thể sống sử dụng để điểu khiển các chất ngoại lai (xenobiotic) chứ không phải nghiên cứu tác động của thuốc lên cơ thể sống Dược động học dựa trên đường cong nồng độ của thuốc hoặc sản phẩm chuyển hóa của chúng... những dữ liệu động học có liên quan khác Những thông số về Dược động học và mối tương quan giữa chúng được thể hiện dưới dạng biểu thức toán học Mối liên hệ toán học được thiết lập dựa trên dữ liệu động học liên quan thu được trên mô hình nghiên cứu phù hợp gọi là mô hình Dược động học (pharmacokinetic model) Hiện có ba mô hình thông dụng được áp dụng phổ biến cho nghiên cứu về Dược động học của một hợp... bởi phương trình Van Deemter sau đây: H'= — + - + Cphađộng ^ + Cphadô„g« u u Chiều cao H của đĩa biểu thị cho sự mở rộng dải và các yếu tố ảnh hưởng đến sự mở Nó là hàm số của các quá trình nhiệt động học và động học ttong cột E)ó là : - Những tính chất không điều hoà của dòng, dẫn đến xáo trộn đối lưu - Sự khuếch tán dọc và ngang trong pha động - Mức độ giới hạn cân bằng của chất tan giữa pha động. .. thể là độc lập với nhau và thời gian tồn tại của một phân tử thuốc trong cơ thể được xem như một biến ngẫu nhiên Trong nghiên cứu này chúng tôi sử dụng mô hình nghiên cứu không vách^ngăn để khảo sát Dược động học của GF ^ II SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO GHÉP KHÔI PHỔ (HPLC -MS) 1 Giới thiệu nguyên tác cấu tạo của hệ thống HPLC: Sắc ký lớp mỏng hiệu năng cao (HPLC) còn gọi là sắc ký lỏng cao áp, sắc ký lỏng... yêu cầu vì nồng độ GF lớn, đủ giới hạn để phát hiện Tuy nhiên khi chuyển sang định lượng hàm lượng trong máu thì không đáp ứng được yêu cầu vì giói hạn của phương pháp không cho phép phát hiện nồng độ thuốc trong máu Chính vì vậy trong một thời gian dài phần Dược động học của GF chưa được khảo sát Gần đây chúng tôi tham khảo thấy rằng nhiều tác giả sử dụng HPLC -MS để định lượng các chất có bản chất steroid... định lượng các chất có bản chất steroid trong máu [29], đây chính là hướng gợi ý để chúng tôi sử dụng HPLC -MS nhằm khảo sát Dược động học của GF PHẦN I I : THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ I HÓA CHẤT, DỤNG cụ, THIẾT BỊ VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU: 1 Hóa chất - Methanol (Merck, KGaA, 64271 Darmstadt) - Acetonitril (Merck, KGaA, 64271 Darmstadt) - Cloroform (Merck) - Acid Focmic (Merck) - Nước cất hái lần đã qua cột... miễn dịch của Glycyl Funtumin đã được chứng minh qua một số thử nghiệm sinh học tiến hành ở trong và ngoài nước [6, 8, 17, 19, 27, 28, 31] Aslem đã được nghiên cứu về tác dụng kích thích miễn dịch trên thử nghiệm Jeme Cunningham [6, 20], đánh giá khả năng kích thích miễn dịch tế bào trên test phục hồi tạo Rosette E bị ức chế bỏi Theophyline [6, 17], tác dụng hoạt hoá đại thực bào và ảnh hưởng lên chức... số đăng ký nghiên cứu và đã được Bộ Y Tế đưa vào danh mục thuốc thiết yếu.Tuy nhiên trong bộ hồ sơ của thuốc Aslem vẫn còn thiếu thông tin về Dược động học Do đó việc bổ xung những dữ liệu về Dược động học của GF là một đòi hỏi cấp thiết Khi nghiên cứu về Dược động học đòi hỏi phải có phương pháp đủ nhạy để định lượng nồng độ thuốc trong máu Trước đây, GF vẫn được định lượng bằng phưoỉng pháp đo quang... xung quanh thời điểm 4 đến 6 điểm ở pha thải trừ Mẫu máu được xử lý Định lưọíng nồng độ GF trong huyết tương chó bằng phương pháp HPLCMS với điều kiện phù hợp mà chúng tôi đã khảo sát 4.3 Xây dựng đường cong Dược động học di! Phương pháp chiết GF trong huyết tương chó: Hình 6 : Sơ đồ quy trình chiết GF trong huyết tương chó b/Chọn điều kiện chạy HPLC -MS *Cột sắc ký: Khảo sát khả năng tách và định lượng... và quan trọng bậc nhất trong các phòng thí nghiệm hiện đại HPLC có nguyên tắc hoạt động tương tự sắc ký lỏng cột nhồi cổ điển, tuy nhiên ở HPLC quá trình tách chất xảy ra nhanh hơn và tốt hơn [1, 25] Các bộ phận cơ bản của một thiết bị HPLC được mô tả trong hình 2 Bơm mẫu Hình 2 : Sơ đồ hệ thống HPLC đơn giản Với các thiết bị HPLC hiện đại những bộ phận cơ bản của máy như bơm cao áp, bộ bơm mẫu, bộ . BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI oOo PHẠM NHƯ QUỲNH ữ^G DỤNG LC - MS ĐỂ k h ả o s á t DƯỢC ĐỘNG HỌC CỦA • • • GLYCYL PUNTUMIN ở ĐỘNG VẬT THÍ NGHIỆM • • • KHOÁ LUẬN TỐT HGh. động vật thực nghiệm, cụ thể: 1. Khảo sát khả năng sử dụng HPLC -MS để định lượng GF 2. Thiết lập các điều kiện thực nghiệm khi sử dụng HPLC -MS để định lượng GF 3. Thiết lập các thông số Dược động. sử dụng mô hình nghiên cứu không vách ngăn để khảo sát Dược động học của GF. ^ ^ - - II. SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO GHÉP KHÔI PHỔ (HPLC -MS) . 1. Giới thiệu nguyên tác cấu tạo của hệ thống HPLC: Sắc