Đang tải... (xem toàn văn)
Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao
BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Dược HÀ NỘI %Ị^ %Ị^ TRẦN THI HẰNG / ặ ? '\ X # / 6 J . o f 7 í ^ Mĩ HƯ^VÌỆN:; lr ,T c f,.í'/ NGHIÊN CỨU XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CARBAMAZEPIN TRONG HUYẾT TƯƠNG BANG SẮC KÝ LỎNG HIỆU NÃNG CAO (KHOÁ LUẬN TỐT NGHIỆP DUỢC sĩ KHOÁ 2000-2005) Người hướng dẫn Nơi thực hiện : ThS. Nguyễn Thị Kiều Anh ThS. Trần Nguyên Hà : Bộ môn Hoá phân tích Thời gian thực hiện : 10/2004-5/2005 HÀ NỘI 5/2005 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao”, chúng tôi đã nhận được sự giúp đỡ quý báu của các thầy cô giáo và các cán bộ bộ môn Hoá phân tích trường đại học Dược Hà Nội. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành và sâu sắc tới Thạc sĩ Nguyễn Thị Kiều Anh, người đã trực tiếp hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện khoá luận này. Tồi cũng xin chân thành cảm ơn Thạc sĩ Trần Nguyên Hà, các thầy cô giáo, các cán bộ trong bộ môn Hoá Phân Tích đã tạo điều kiện, thời gian, và kinh phí giúp tôi hoàn thành khoá luận này. Và cuối cùng tôi xin gửi lời cảm ơn tới tất cả các thầy cô giáo, cán bộ các bộ môn và các phòng ban trong nhà trường đã giảng dạy và tạo điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt quá trình học tập tại trường Đại học Dược Hà Nội. Hà Nội ngày 20 tháng 5 năm 2005. Sinh viên: Trần Thị Hằng. M ục lục Trang Đặt vấn đề 1 Phần 1. Tổng quan 2 1.1. Tổng quan về Carbamazepin 2 1.2. Tổng quan về HPLC 4 1.2.1. Khái niệm cơ bản 4 1.2.2. Sắc ký pha liên kết 5 1.2.3. Một sô'thông số đặc trưng của HPLC 6 1.2.4. Cách tính kết quả trong phương pháp HPLC 6 1.3. Một số nghiên cứu định lượng CAR bằng HPLC 7 1.4. Vài nét về thẩm định phưoỉng pháp phân tích dược 10 chất trong dịch sinh học ì A .ì. Khái niệm 10 1.4.2. Tính chọn lọc 10 1.4.3. Giới hạn định lượng ( Limit of quantỉtation : LOQ) 10 1.4.4. Khoảng nồng độ tuyến tính 11 lA.S.Đ ộđúng 11 1.4.6. Độ chính xác 11 1.4.7. Độ ổn định 12 Phần 2. Máy móc - dụng cụ, hoá chất, súc vật thí nghiệm 13 và phương pháp nghiên cứu 2.1. Máy móc - dụng cụ 13 2.2. Qiất chuẩn và chế phẩm thử 13 2.3. Hoáchất 13 2.4. Súc vật thí nghiệm 14 2.5. Nội dung và phương pháp nghiên cứu 14 2.5.1. Khảo sát và tìm điều kiện để chiết CAR từ huyết tương 14 2.5.2. Định lượng CAR trong HT bằng HPLC 16 2.53. Thẩm định phương pháp phân tích 16 2.5.4. Định lượng CAR trong HT thỏ uống viên nén Tegretol 200mg 17 Phần 3. Kết quả thực nghiệm và bàn luận 19 3.1. Xây dựng phương pháp định lượng CAR trong HT 19 3.1.1. Khảo sát điều kiện sắc kỷ 19 3.1.2.Thẩm định phương pháp phân tích 21 3.2. Phân tích CAR trong HT thỏ sau khi uống viên nén Tegretol 200mg 27 3.3. Bàn luận 27 Phần 4. Kết luận và đề xuất 30 4.1. Kết luận 30 4.2. Đề xuất 31 Tài liệu tham khảo 32 Phụ lục 35 Phụ lục 1. Phổ hấp thụ u v của CAR và PHE 35 Phụ lục 2. SK đồ khảo sát khoảng nồng độ tuyến tính của CAR trong HT 36 Phụ lục 3. Đường chuẩn xây dựng trên nền HT trắng của thỏ 39 Phụ lục 4. SK đồ mẫu HT thỏ sau khi uống thuốc 2 giờ 39 CHÚ GIẢI CHỮ VIẾT TẮT AcOH : Acid acetic CAR ; Carbamazepin. CAR-E: Carbamazepin-10,ll-epoxid • Nồng độ thuốc tối đa trong huyết tưcmg. : Nồng độ thuốc tối thiểu trong huyết tương. EtOH : Ethanol. HPLC : Sắc kí lỏng hiệu năng cao. (High perfomance liquid chromatography) HT : Huyết tương IS : Internal standard (chất chuẩn nội) MeCN : Acetonitril. MeOH : Methanol. |Lig : microgam. PHE : Phenobarbital. RSD : Độ lệch chuẩn tương đối. s : Độ lệch chuẩn SK : Sắc ký STT : Số thứ tự TB : Trung bình TE : Triethylamin ĐẶT VẤN ĐỂ Động kinh là một bệnh phổ biến trên thế giới, tỉ lệ mắc bệnh động kinh chiếm 0,2-5% dân số, phân bố ở cả hai giới và tất cả các lứa tuổi. Trẻ em có tỉ lệ mắc bệnh cao, trong đó loại động kinh lành tính tự phát chiếm khoảng 50%, loại này đáp ứng tốt với các điều trị bằng thuốc. Ngày nay, thuốc đặc trị có thể kiểm soát 70% cơn động kinh. Tuy nhiên, điều trị không tuân thủ đúng các nguyên tắc có thể dẫn đến tác hại nghiêm trọng, ảnh hưởng trực tiếp tới sức khoẻ và tính mạng của người bệnh. Carbamazepin là một dẫn xuất của iminostiben, được xem là một trong những thuốc cơ bản hàng đầu để điều trị động kinh, đặc biệt là động kinh cục bộ và động kinh thể co cứng giật rung. Cũng như các thuốc chữa động kinh, khoảng điều trị của Carbamazepin hẹp, cơ chế tác dụng phức tạp, nhiều tưcmg tác, tương kỵ và hay gặp trường hợp ngộ độc thuốc. Hơn nữa trong thực tế điều trị, tính cá thể thưòfng thể hiện rất rõ và phức tạp, các bệnh nhân khác nhau có đáp ứng khác nhau với thuốc. Vì vậy, phải theo dõi sát sao trong suốt quá trình điều trị. Để đạt được kết quả tốt nhất, tránh được những tai biến có thể xảy ra khi dùng thuốc và tìm cho mỗi bệnh nhân một phác đồ điều trị phù hợp, cần phải tiến hành theo dõi thường xuyên nồng độ thuốc trong máu bệnh nhân. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài “Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao” với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương . - ứng dụng phương pháp phân tích xây dựng được để định lượng Carbamazepin trong huyết tương thỏ sau khi uống viên nén chứa 200mg Carbamazepin. PHẦN 1. TỔNG QUAN 1.1. Tổng quan về Carbamazepin (CAR) Ll.LC ôngthức[7] C15H12N2O; M = 236,3 1.1.2. Tên khoa học [7] 5-H-dibenz [b,f] azepin 5-carboxamid 1.1.3. Tính chất 17],[14] Bột kết tinh màu trắng. Không tan trong nước, ít tan trong cồn và aceton, tan trong methylen clorid. Nhiệt độ nóng chảy : 187-193° c 1.1.4. Dựơc động học [2], [15] Thuốc hấp thu chậm qua đưcmg tiêu hoá, phân bố khắp cơ thể. Thuốc đạt nồng độ tối đa trong máu sau 4-8 giờ. Nồng độ tối đa sau khi dùng liều duy nhất 400 mg (viên nén) khoảng 4,5 |J,g/ml. Nồng độ tác dụng trong huyết tương khoảng 4-12 )Lig/ml. CAR liên kết với protein huyết tương khoảng 70-80%, CAR chuyển hoá qua gan bằng phản ứng hydroxyl hóa và liên hợp, hoạt chất chuyển hoá là Carbamazepin-10,11-epoxid. Thời gian bán thải khoảng từ 10-20 giờ. Thải trừ qua nước tiểu 72% và qua phân 28%, chủ yếu dưới dạng đã chuyển hoá. 1.1.5. Tác dụng [9], [13], [15] Thuốc có tác dụng trên động kinh cục bộ (đơn giản hoặc phức tạp) có hoặc không kèm cơn động kinh toàn thể hóa thứ phát, cơn co cứng toàn thể và hỗn hợp các loại động kinh trên. Thuốc có tác dụng hướng tâm thần: tác động tới các triệu chứng lo âu trầm cảm, làm giảm kích thích, hung hăng. CAR còn có tác dụng hướng thần kinh: ngăn ngừa cơn đau dây thần kinh số V cấp tính tự phát, hạ thấp ngưỡng co giật và làm giảm các triệu chứng trong hội chứng cai nghiện rượu. l.L6.C hỉđ ịnhl7 ],l2],[17] - Đơn trị liệu cho bệnh nhân động kinh. - Điều trị hưng cảm và phòng cơn hưng trầm cảm. - Dùng trong hội chứng cai nghiện rượu - Qiữa đau dây thần kinh số V. 1.1.7. Chống chỉ định [2], [17] - Quá mẫn cảm với CAR và các thuốc có cấu trúc tương tự. - Bloc nhĩ thất. - Tiền sử bị giảm sản tuỷ và rối loạn chuyển hoá porphyrin cấp tính từng đợt. - Phụ nữ có thai, đặc biệt 3 tháng đầu. - Glôcôm 1.1.8. Liều dùng và cách dùng [2], [17] - Liều dùng: Người lớn: 200-400 mg X 2-3 lần/ngày. Trẻ em: 10-20 mg/kg cân nặng hàng ngày. - Cách dùng: Uống trong, sau hoặc giữa các bữa ăn. Loại viên giải phóng chậm phải nuốt khi uống, không được nhai. 1.1.9. Các dạng bào chế[7], [2], [13], /22/ - Viên nén 100; 200; 400 mg - Viên nhai 100 mg - Viên bao giải phóng chậm 200 mg - Hỗn dịch uống 100 mg/5ml - Viên nang 300 mg 1.1.10. Các phương pháp định lượng Đinh lương nguyên liêu: + Phương pháp 1110], [15], [22] Dung dịch thử và dung dịch chuẩn được pha trong dung môi hỗn hợp MeOHiHj 0(1:1) và đem tiêm sắc ký riêng biệt trong cùng điều kiện. ĐKSK: Cột CN (25 X 4,6 mm; 10 ịim) Bước sóng: 235 nm Lưu lượng dòng: 2 ml/phút Tính toán hàm lượng theo phương pháp so sánh với dung dịch chuẩn. + Phương pháp 2 [14] Trong cấu trúc của CAR có các dây nối đôi nên có khả năng hấp thụ bức xạ tử ngoại. Dựa vào đặc tính này người ta định lượng CAR bằng phưcmg pháp đo quang. Nguyên liệu CAR được hoà tan và pha loãng trong dung môi EtOH 95% và đem đo độ hấp thụ u v à bước sóng cực đại = 285 nm. Tính toán hàm lượng theo A(l%;lcm) = 490 . Đinh lương chế phám r 141 Chế phẩm được hòa tan bằng EtOH 95%, lọc để thu được dung dịch trong và đem đo độ hấp thụ u v tương tự như đối với định lượng nguyên liệu CAR. Tính toán hàm lượng so với hàm lượng CAR dựa vào A(l%;lcm). 1.2. Tổng quan về HPLC 1.2.1. Khái niệm cơ bản [5], [4] + Sắc ký lỏng hiệu năng cao HPLC hay còn gọi là sắc ký lỏng cao áp ra đời vào cuối những năm 60. Đó là một phương pháp hoá lý dùng để tách các chất dựa vào ái lực khác nhau của các chất với hai pha luôn tiếp xúc và không đồng tan với nhau, một pha động và một pha tĩnh. Pha động là chất lỏng chảy qua cột với một tốc độ nhất định, pha tĩnh chứa trong cột là một chất rắn đã được phân chia dưới dạng tiểu phân hoặc một chất lỏng phủ lên một chất mang rắn hay một chất mang đã được biến đổi bằng liẽn kết hoá học với các nhóm hữu cơ. Quá trình SK xảy ra theo cơ chế: hấp phụ, trao đổi ion, phân bố hoặc rây phân tử. + Tuỳ thuộc vào tính chất các pha mà ta có những phương pháp SK khác nhau. Trong khoá luận này chúng tôi chỉ trình bày về sắc ký pha liên kết. 1.2.2. Sắc ký pha liên kết [4]: Trong sắc ký pha liên kết, pha tĩnh được gắn hoá học với chất mang tạo nên hcfp chất cơ siloxan: CH3 CH3 CH3 CH3 I ' I I -Si-OH + Cl-Si-R ► -Si-O -Si-R + HCl I I I I CH3 CH3 CH3 CH3 Nhóm silanol Dẫn chất Dẫn chất của silicagel clorosilan siloxan - Nếu R là một nhóm ít phân cực như Octyl (Cg), Otadecyl (Cis), hay phenyl và dung môi phân cực như MeOH, MeCN, .thì ta có SK pha đảo. - Nếu R là nhóm khá phân cực như alkylamin -(CIỈ2)-NH2 hay alkylnitril -(CH2)n-CN và dung môi ít phân cực như hexan thì ta có SK pha thuận. - Thứ tự rửa giải: Trong SK pha thuận, các chất ít phân cực ra trước. Trong SK pha đảo, các chất phân cực ra trước rồi đến các chất ít và không phân cực ra sau. Quyết định hiệu quả sự tách các chất ở đây là tổng hợp các tưofng tác: - Giữa chất tan với pha tĩnh - Giữa chất tan với pha động - Giữa pha tĩnh với pha động Tổng của ba tương tác này sẽ quyết định chất nào được rửa giải ra trước tiên khi lực lưu giữ là nhỏ nhất và ngược lại. [...]... tới mục tiêu an toàn và hiệu quả trong khám chữa bệnh Ngoài ra, có thể dựa vào phưofng pháp phân tích đã xây dựng định lượng CAR trong HT nhằm xác định các thông số dược động học cũng như đánh giá tương đương sinh học của chế phẩm CAR sản xuất ở Việt Nam Do đó, việc nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng CAR trong huyết tương bằng HPLC rất đáng quan tâm và có tính thực tế cao Phần 4 KẾT LUẬN VÀ... tiến hành lựa chọn phương pháp định lượng CAR trong HT với nồng độ thường rất thấp, chúng tôi chọn phương pháp HPLC, là phương pháp có hiệu quả cao và đang được ứng dụng rộng rãi Để xây dựng phương pháp định lượng CAR trong HT bằng HPLC, chúng tôi tiến hành khảo sát lựa chọn dung môi và điều kiện chiết tách CAR ra khỏi mẫu phân tích dựa trên các tiêu chí: hiệu suất chiết cao, khả năng loại tạp tốt,... khả năng phân tích các mẫu HT của cơ thể sống trên thực tế lâm sàng trong quá trình theo dõi điều trị, chúng tôi đã ứng dụng phương pháp phân tích xây dựng được định lượng CAR trong HT thỏ sau khi uống viên Tegretol 200mg Tính kết quả theo đường chuẩn xây dựng trong cùng ngày phân tích trên nền HT trắng của thỏ Kết quả phân tích cho thấy phương pháp SK đã xây dựng hoàn toàn có khả năng tách và định lượng. .. \:\n /íà ị% + x ử lý mẫu theo sơ đồ hình 1 và định lượng CAR trong mẫu thử bằng phương pháp HPLC theo điều kiện SK đã lựa chọn ở mục 2.5.2 Tính kết quả dựa trên đường chuẩn xây dựng trong ngày phân tích trên nền mẫu là HT trắng của thỏ Phân 3 KẾT QUẢ THựC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN 3.1 Xây dựng phương pháp định lượng CAR trong huyết tương: 3.1.1 Khảo sát và xác định điều kiện SK : - Cột SK: Qua khảo sát trên... Qua kết quả nghiên cứu thu được của khoá luận này, chúng tôi có một số kết luận sau : Về mặt nhận thức - Biết cách tiến hành nghiên cứu và hoàn thành một đề tài, biết cách tiến hành tra cứu và tìm hiểu tài liệu để tham khảo phục vụ cho quá trình thực hiện một đề tài nghiên cứu khoa học - Hiểu được cơ sở lý thuyết của phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) Về kết quả thực nghiệm: * Xây dựng được... lượng CAR trong HT trên thực tế vì kết quả phân tích không bị ảnh hưcmg bởi các chất chuyển hoá trong cơ thể sống Như vậy, chúng tôi đã xây dựng được phương pháp định lượng CAR trong HT bằng HPLC và đánh giá được phương pháp dựa trên các chỉ tiêu lý thuyết cũng như trên ứng dụng thực tế Hiện nay, việc trang bị máy móc, thiết bị cho phương pháp HPLC khá phổ biến, mặt khác việc theo dõi nồng độ CAR trong. .. giới hạn định lượng Ngoài ra, còn có những yêu cầu khác tuỳ theo loại phương pháp và đối tượng nghiên cứu Thẩm định phưofng pháp phân tích thuốc trong dịch sinh học là một quá trình nhằm chứng minh rằng phương pháp phân tích đó là đáng tin cậy và có khả năng thực hiện phân tích đối với những mẫu cần khảo sát 1.42 Tính chọn lọc: - Định nghĩa: Tính chọn lọc của một phương pháp phân tích là khả năng phân... diện tích các pic, trừ pic dung môi, thuốc thử và pic thấp hơn giới hạn phát hiện * Trong phân tích sinh dược học người ta hay sử dụng cách tính kết quả theo phương pháp chuẩn hoá nhiều điểm có dùng chất chuẩn nội 13 Một số nghiên cứu định lượng CAR bằng HPLC Bảng 1: Một số nghiên cứu định lượng CAR trong huyết tương bằng HPLC Tài Cột Pha động Spherisorb OSD-2 [2 0 ] phosphat pH 7,0 Dung môi chiết (250... thích hợp cao * Quy trình kỹ thuật phân tích CAR trong HT ở trên đã được thẩm định Kết quả cho thấy: phương pháp định lượng có khoảng nồng độ tuyến tính rộng hơn khoảng nồng độ điều trị trong HT, có tính chọn lọc tốt, độ chính xác và độ đúng cao, có thể dùng để tách và định lượng CAR trong HT với chất chuẩn nội là PHE * Đã ứng dụng được phưoíng pháp phân tích hiện đại (HPLC) để định lượng thuốc trong dịch... quả thu được khi phân tích mẫu HT thỏ uống viên nén Tegretol cho thấy phương pháp đã xây dựng có khả năng tách và định lượng CAR trong các mẫu phân tích thực, không bị ảnh hưởng bởi các chất chuyển hoá trong cơ thể sống 3.3 Bàn luận: Phương pháp HPLC là một phương pháp phân tích hiện đại với ưu điểm nổi bật là có tính chọn lọc cao, ổn định, độ chính xác và độ đúng tốt, thời gian phân tích hợp lý; đồng . 10/2004-5/2005 HÀ NỘI 5/2005 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình thực hiện đề tài Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao , chúng tôi đã nhận được. thuốc trong máu bệnh nhân. Xuất phát từ thực tế trên, chúng tôi tiến hành đề tài Nghiên cứu xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao với. cao với mục tiêu: - Xây dựng phương pháp định lượng Carbamazepin trong huyết tương . - ứng dụng phương pháp phân tích xây dựng được để định lượng Carbamazepin trong huyết tương thỏ sau khi uống