Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƢỜNG ĐẠI HỌC KHOA HỌC  THIẾT KẾ ẬU XANH LUẬN VĂN THẠC SĨ CÔNG NGHỆ SINH HỌC Thái Nguyên – 2011 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan đây là công trình nghiên cứu của riêng tôi. Các số liệu, kết quả nghiên cứu trong luận văn là trung thực và chƣa từng có ai công bố trong bất kỳ một công trình nào khác. Tác giả Võ Thị Minh Hòa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới PGS.TS. Nguyễn Vũ Thanh Thanh, Khoa Khoa học Sự sống, trƣờng Đại học Khoa học - Đại học Thái Nguyên và TS. Lê Văn Sơn, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, là những ngƣời đã tận tình hƣớng dẫn, chỉ bảo, dìu dắt và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian tôi thực hiện và hoàn thành luận văn này. Tôi xin đƣợc bày tỏ lòng biết ơn chân thành tới GS.TS. Lê Trần Bình, PGS.TS. Chu Hoàng Hà, Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học, là những ngƣời đã tạo điều kiện và đóng góp những ý kiến quý báu cho tôi trong suốt thời gian thự . Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới CN. Hoàng Hà, Phòng Công nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ Sinh học đã tận tình giúp đỡ tôi hoàn thành luận văn tốt nghiệp này. Trong thời gian thực tập nghiên cứu, tôi cũng đã nhận đƣợc sự hỗ trợ nhiệt tình và những ý kiến đóng góp bổ ích của các cô chú, các anh chị và các bạn trong Phòng Công nghệ Tế bào Thực vật, Viện Công nghệ Sinh học. Tôi xin chân thành cảm ơn sự giúp đỡ quý báu đó. Tôi xin cảm ơn chân thành các thầy cô giáo trong khoa Khoa học sự sống- trƣờng Đại học Khoa học-Đại học Thái Nguyên đã hƣớng dẫn, truyền đạt kiến thức cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Tôi cũng vô cùng cảm ơn những tình cảm tốt đẹp của những ngƣời thân trong gia đình, đồng nghiệp và bạn bè đã luôn giúp đỡ, động viên và khích lệ tôi trong suốt thời gian học tập, nghiên cứu. , ngày 06 tháng 10 năm 2011 Học viên Võ Thị Minh Hòa Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1. Lý do chọn đề tài 2. Mục tiêu nghiên cứu 3. Nội dung nghiên cứu 4. Ý nghĩa khoa học của đề tài Chƣơng 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1. …………… 1.1.2.2. T 1.2. HẠN VÀ CƠ SỞ PHÂN TỬ CỦA TÍNH CHỊU HẠN 1.2.1. đối với cây trồng …………………. 1.2.2. Cơ sở hóa sinh và sinh học phân tử của tính chịu hạn 1.3. GEN VÀ PROTEIN LTP (Lipid Transfer Protein) 1.3.1. Gen LTP ………………………………………………………… 1.3.2. Protein (LTP) …………………………………… 1.4. KỸ THUẬT CHUYỂN GEN THÔNG QUA A.tumefaciens ……. 1.4.1. Vi khuẩn A. tumefaciens và hiện tƣợng biến nạp gen vào thực vật 1.4.2. 1.4.3. Các …… Trang i ii iii iv 1 1 2 2 3 4 4 4 6 6 8 10 10 11 15 15 17 18 18 19 20 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1.4.4. Thành tựu chuyển gen ở thực vật ……………………………… Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. V ………………………………… 2.2. P …………………………………… 2.2.1. ……………………………………… 2.2.2. ……………………… 2.2.3. en LTP ……………………… 2.2.4. ………………………… A. tumefaciens CV58C1 A. tumefaciens CV58C1 Chƣơng 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. PHÂN LẬP GEN LTP …………………………………………… 3.1.1. Thiết kế mồi …………………………………………………… 3.1.2. Tách RNA tổng số tổng hợp cDNA … 3.1.3. Kết quả PCR LTP ………………………………… 3.1.4. 3.1.5. Kết quả xác định trình tự nucleotide 3.2. THIẾT KẾ VECTOR CHUYỂN GEN 3.2.1. Ghép nối đoạn gen LTP vào vector chuyển tiếp pRTRA7/3 3.2.2. Thiết kế vector tái tổ hợp pCB301 mang gen LTP 3.2.3. Kết quả biến nạp pCB301-LTP vào vi khuẩn A. tumefaciens 3.2.4. Kết quả kiểm tra sự có mặt của vector tái tổ hợp trong các dòng khuẩn lạc bằng colony-PCR 3.3. CHUYỂN GEN VÀ KIỂM TRA SỰ CÓ MẶT CỦA GEN LTP Ở 21 24 24 24 25 26 27 27 27 28 29 33 34 35 36 37 38 38 38 38 39 40 41 43 43 43 46 46 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CÂY THUỐC LÁ 3.3.1. Kết quả chuyển gen LTP vào cây thuốc lá 3.3.2. Kết quả kiểm tra cây thuốc lá chuyển gen bằng kỹ thuật PCR KẾT LUẬN VÀ ĐỀ NGHỊ NHỮNG CÔNG TRÌNH CÔNG BỐ CÓ LIÊN QUAN ĐẾN ĐỀ TÀI TRÌNH TỰ GEN ĐĂNG KÝ TRÊN NGÂN HÀNG GEN EMBL TÀI LIỆU THAM KHẢO 48 48 50 51 52 52 53 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ NHỮNG CHỮ VIẾT TẮT A.tumefaciens Agrobacterium tumefaciens BAP 6-Benzyl Amino Purine (Benzyladeninpurin) bp Base pair cDNA Complementary DNA cs Cộng sự DEPC Diethyl pyrocarbonat DNA Deoxyribonucleic Acid dNTP deoxynucleosit triphotphat (deoxynucleoside triphosphate) EDTA Ethylene diamine tetraacetic acid EtBr Ethiium bromide E.coli Escherichia coli Gus β-glucuronidase IBA Indole-3-Butyric Acid Kb kilo base LB Luria and Bertani MS Murashige và Skoog NAA Naphthalene Acetic Acid OD Optical density (Giá trị mật độ quang) PCR Polymerase Chaine Reaction RNA Ribonucleic Acid RNase Ribonuclease RT-PCR Reverse Transcriptase-PCR SDS Sodium dodecylsulfat TAE Tris-acetate-EDTA Taq Thermus aquaticus Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC BẢNG TRONG ĐỀ TÀI Bảng Tên các bảng Trang 2.1 25 2.2 Thành phần phản ứng PCR nhân gen LTP 29 2.3 Chu kỳ nhiệt cho phản ứng PCR nhân gen LTP 29 2.4 Thành phần phản ứng ghép nối gen LTP vào vector 31 2.5 Thành phần 34 2.6 34 3.1 Trình tự mồi nhân gen LTP 39 3.2 Kết quả chuyển gen LTP vào cây thuốc lá trên môi trƣờng chọn lọc 51 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ DANH MỤC CÁC HÌNH TRONG ĐỀ TÀI Hình Tên các hình Trang 3.1 Hình ảnh điện di kết quả PCR nhân gen LTP 41 3.2 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt plasmid pBT-LTP bằng BamHI 42 3.3 So sánh trình tự nucleotide của gen LTP ở giống đậu xanh HN2 và trình tự đã công bố AY300807 44 3.4 So sánh trình tự amino acid trong protein LTP của giống đậu xanh HN2 và AY300807 44 3.5 điện di sản phẩm PCR colony pCB301-LTP 46 3.6 Hình ảnh điện di sản phẩm cắt pCB301-LTP bằng NcoI và NotI 47 3.7 Hình ảnh khuẩn lạc sau khi biến nạp plasmid tái tổ hợp pCB301-LTP vào A. tumefaciens chủng CV58C1 48 3.8 Hình ảnh điện di sản phẩm colony-PCR bằng cặp mồi đặc hiệu 49 3.9 Quy trình chuyển gen-LTP vào cây thuốc lá K326 invitro từ mô lá thông qua vi khuẩn A. tumefaciens 50 3.10 Hình ảnh điện di PCR nhân đoạn gen LTP ở cây thuốc lá bằng cặp mồi đặc hiệu 52 Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ 1. Đậu xanh có tên khoa học Vigna radiata L.Wilczek, là cây đậu đỗ . Đậu xanh có nguồn gốc từ Ấn Độ và Trung Á, phân bổ chủ yếu ở các vùng nhiệt đới và á nhiệt đới, là cây trồng khá quen thuộc ở Châu Á và rất phổ biến ở nƣớc ta [11], [13]. Trồng đậu xanh không những cung cấp nguồn thực phẩm giàu đạm, đáp ứng nhu cầu về dinh dƣỡng của con ngƣời và vật nuôi mà còn có tác dụng cải tạo và bồi dƣỡng đất do rễ cây đậu xanh có các nốt sần chứa vi sinh vật cố định đạm sống cộng sinh [4], [5]. Những năm gần đây tình hình sản xuất, tiêu thụ và chế biến đậu xanh ở nƣớc ta đang có chiều hƣớng gia tăng do khai thác đƣợc một số ƣu điểm quan trọng của đậu xanh nhƣ: là cây trồng có giá trị kinh tế cao vì là nguồn thực phẩm có nhiều dinh dƣỡng, đa dạng trong đời sống, thích hợp với tiêu dùng trong nƣớc và xuất khẩu. Ngoài ra, đậu xanh là loại cây trồng ngắn ngày, dễ luân canh, xen canh, gối vụ và có khả năng cải tạo đất tốt [14]. Hạn hán đang là một trong những vấn đề gây ảnh hƣởng nghiêm trọng đến năng suất của cây đậu xanh. , các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng chịu hạn kém. Chính vì vậy, nghiên cứu cây đậu xanh có khả năng chịu hạn đang là một trong những đòi hỏi của thực tiễn. Cho đến nay, các nhà khoa học trên thế giới và tại Việt Nam đã đạt đƣợc những kết quả nhất định đối với việc tạo ra các giống đậu xanh mới bằng các phƣơng pháp chọn giống truyền thống nhƣ chọn dòng tế bào hay sử dụng phƣơng pháp gây đột biến thực nghiệm. Tuy nhiên, những phƣơng pháp này vẫn còn có nhƣợc điểm nhƣ thời gian chọn tạo lâu, thí nghiệm đòi hỏi lƣợng cá thể lớn… Vì vậy, áp dụng các tiến bộ của sinh học [...]... lập và xác định trình tự gen PLC3 (Phospholipase C3) có liên quan đến khả năng chịu hạn của hai giống đậu xanh KP11 và MN93 [22] Cây đậu xanh vốn là loại cây trồng chịu hạn kém do đó việc nghiên cứu về khả năng chịu hạn, cơ chế chịu hạn và phân lập gen chịu hạn của cây đậu xanh cũng đã đƣợc nhiều nhà khoa học trên thế giới quan tâm nhằm chọn tạo ra các giống đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt Liu K.H và... tiêu nghiên cứu vector mang gen LTP liên quan đến khả năng chịu hạn nhằm -T tạo cây đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt - cây mang gen LTP 3 Nội dung nghiên cứu Phân lập gen LTP từ giống đậu xanh đị Nội Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ Mỹ Đức – Hà n gen mang gen LTP Biến nạ ổ hợp vào vi khuẩn Agrobacterium tumefaciens Chuyể ) Xác định sự có mặt của gen chuyển trong cây thuốc lá bằng... bằng PCR 4 Ý nghĩa khoa học : Là cơ sở cho việc chuyển gen LTP nhằm tạo cây đậu xanh chuyển gen có khả năng chống chịu với điều kiện môi trƣờng khô hạn Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ CHƢƠNG 1 TỔNG QUAN TÀI LIỆU 1.1 VAI TRÕ VÀ TẦM QUAN TRỌNG CỦA CÂY ĐẬU XANH 1.1.1 Sơ lƣợc về cây đậu xanh Cây đậu xanh (Vigna radiata L Wilczek) là loại cây đậu ăn hạt, thân thảo V radiata thuộc... giúp cây hạn chế mất nƣớc [27] ọng cho việ Những kết quả này sẽ rất có ý nghĩa không chỉ đối với thực tế sản xuất cây đậu xanh mà còn đối với sự phát triển của công nghệ sinh học thực vật, đặc biệt là trong điều kiện tại Việt Nam Xuất phát từ cơ sở trên, chúng tôi tiến hành đề tài: Thiết kế vector chuyển gen mang gen LTP phân lập từ đậu xanh nhằm phục vụ việc tạo cây đậu xanh chuyển gen chống chịu. .. diện tích lá…[22] Theo các nhà khoa học, tính chống chịu của thực vật nói chung và của đậu xanh nói riêng rất phức tạp liên quan đến đặc điểm sinh lý hóa sinh và do nhiều gen quy định Đã có nhiều cơ chế phân tử liên quan đến tính chịu hạn của thực vật nói chung rất phức tạp liên quan đến tính chịu hạn ở thực vật đã đƣợc biết đến nhƣ: vai trò của bộ rễ: khả năng điều chỉnh áp suất thẩm thấu, abscisic... sinh học phân tử và kỹ thuật gen, các nhà khoa học đã thành công trong công việc phân lập các gen liên quan đến khả năng chống Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ chịu nhƣ gen chịu hạn, chịu muối, chịu lạnh,… và đánh giá quan hệ di truyền của một số giống đậu xanh Điêu Thị Mai Hoa, Lê Trần Bình (2005) đã nghiên cứu tính đa dạng di truyền của 57 giống đậu xanh bằng kỹ thuật RADP [6]... vào cây trồng các gen kháng sâu hại, gen kháng thuốc diệt cỏ, gen đề kháng với một số bệnh do virus, vi khuẩn và nấm gây ra ở cây trồng thì chúng ta cũng đã thành công trong việc chuyển gen chịu lạnh cho các cây lƣơng thực, thực phẩm trồng ở các nƣớc ôn đới, đặc biệt là cho thuốc lá và khoai tây, vốn là những cây ít chịu lạnh Hay việc tạo ra cây trồng có khả năng chịu hạn, chịu mặn, và cây trồng mang. .. protease, các gen điều khiển phiên mã và các gen chức năng (HSP, LEA, LTP, PLC…) [12] Vai trò của bộ rễ: khả năng nhận nƣớc của cây phụ thuộc vào bộ rễ Nhiều nghiên cứu cho thấy cây nào có bộ rễ dài, khỏe, to thì có khả năng hút Số hóa bởi Trung tâm Học liệu http://www.lrc-tnu.edu.vn/ nƣớc ở những tầng đất sâu, vì vậy cây nào có bộ rễ dài sẽ có khả năng lấy đƣợc nhiều nƣớc Ở cây đậu xanh, hình thái... thiểu mang điểm ghép gen Loại vector này rất có hiệu quả cho việc đƣa DNA lạ vào tế bào thực vật không những đối với loại cây hai lá mầm mà ở cả cây một lá mầm mà đại diện là ở lúa 1.4.2 Hệ vector nhị thể Để chuyển gen vào thực vật thông qua A tumefaciens ngƣời ta phải sử dụng một hệ thống vector chuyển gen Có hai loại vector chuyển gen đó là vector liên hợp và vector nhị thể Vector nhị thể (binary vector) ... trình tự gen LTP ở đậu xanh có liên quan đên tính chịu hạn, đặt tên Vrltpl và Vrltpl2 [39] Kim Y.J và cs (2003) đã phân lập và xác định trình tự gen PLC3 hay Chen Y J và cs (2004) đã tiến hành phân lập ba gen Hsc70 ở đậu xanh là VrHsc70 – 1, VrHsc70 – 2, VrHsc70 – 3 nhằm nghiên cứu cơ chế và chọn tạo giống đậu xanh có khả năng chịu khô hạn [32] Malgorzata G và cs (2004) đã tiến hành phân lập gen mã hóa . - T vector mang gen LTP liên quan đến khả năng chịu hạn nhằm tạo cây đậu xanh có khả năng chịu hạn tốt - cây mang gen LTP. 3. Nội dung nghiên cứu Phân lập gen LTP từ giống đậu xanh đị. tự gen PLC3 (Phospholipase C3) có liên quan đến khả năng chịu hạn của hai giống đậu xanh KP11 và MN93 [22]. Cây đậu xanh vốn là loại cây trồng chịu hạn kém do đó việc nghiên cứu về khả năng. trọng đến năng suất của cây đậu xanh. , các giống đậu xanh trồng ở Việt Nam chủ yếu là các giống có khả năng chịu hạn kém. Chính vì vậy, nghiên cứu cây đậu xanh có khả năng chịu hạn đang là một