VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  TRẦN VĂN TIẾN NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG CÂY CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA L.) CHẤT LƯỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC Hà Nội, Tháng 9-2013 VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM VIỆN SINH THÁI VÀ TÀI NGUYÊN SINH VẬT  TRẦN VĂN TIẾN NGHIÊN CỨU NHÂN NHANH GIỐNG CÂY CHÙM NGÂY (MORINGA OLEIFERA L.) CHẤT LƯỢNG CAO BẰNG KỸ THUẬT NUÔI CẤY MÔ NGÀNH: SINH HỌC THỰC NGHIỆM MÃ NGÀNH: 60 42 01 14 LUẬN VĂN THẠC SỸ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC TS. HÀ VĂN HUÂN Hà Nội, Tháng 9-2013 LỜI CẢM ƠN Để hoàn thiện đề tài luận văn này, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sự giúp đỡ nhiệt tình của thầy (cô) và anh (chị) công tác tại Viện CNSH Lâm nghiệp - Trường Đại học Lâm nghiệp. Với tấm lòng biết ơn sâu sắc tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình tới Thầy giáo hướng dẫn tôi Tiến sĩ Hà Văn Huân đã tận tình hướng dẫn, giúp đỡ tôi trong suốt quá trình hoàn thành luận văn. Tôi xin bày tỏ lòng cảm ơn tới TS. Vũ Thị Thơm, khoa Y Dược, Đại học Quốc gia Hà Nội đã tạo điều kiện giúp đỡ tôi trong quá trình thực hiện đề tài. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành của mình tới các Thầy, Cô tại Viện sinh thái Tài nguyên Sinh vật – Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam. Đặc biệt là Thạc sỹ Phạm Thị Đỗ Loan đã tạo điều kiện cho tôi học tập và nghiên cứu trong thời gian học tại Viện. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn tới các thầy cô trong Hội đồng chấm luận văn tốt nghiệp Thạc sỹ đã dành thời gian đọc và góp ý cho luận văn này. Cuối cùng, tôi xin bày tỏ lòng biết ơn đến tất cả bạn bè đồng nghiệp và người thân đã động viên, giúp đỡ tôi có được luận văn này. Hà Nội, tháng 9 năm 2013 Tác giả Trần Văn Tiến LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan rằng đây là công trình nghiên cứu của tôi, có sự hỗ trợ từ giáo viên hướng dẫn là TS. Hà Văn Huân. Các nội dung nghiên cứu và kết quả trong đề tài này là trung thực và chưa từng được ai công bố trong bất cứ công trình nghiên cứu nào trước đây. Những số liệu trong các bảng biểu phục vụ cho việc phân tích, nhận xét, đánh giá được chính tác giả thu thập từ các nguồn khác nhau có ghi trong phần tài liệu tham khảo. Ngoài ra, đề tài còn sử dụng một số nhận xét, đánh giá cũng như số liệu của các tác giả, cơ quan tổ chức khác và cũng được thể hiện trong phần tài liệu tham khảo. Nếu phát hiện có bất kỳ sự gian lận nào tôi xin hoàn toàn chịu trách nhiệm trước Hội đồng, cũng như kết quả luận văn của mình. Hà Nội, tháng 09 năm 2013 Tác giả Trần Văn Tiến MỤC LỤC MỞ ĐẦU 1 Mục tiêu của đề tài 2 Nội dung của đề tài 2 CHƯƠNG 1: TỔNG QUAN VẤN ĐỀ NGHIÊN CỨU 3 1.1. Giới thiệu về cây Chùm Ngây 3 1.1.1. Vị trí và phân loại 3 1.1.2. Đặc điểm sinh thái học 3 1.1.3. Giá trị sử dụng của cây Chùm Ngây 5 1.1.3.1. Giá tr dinh d ngị ưỡ 6 1.1.3.2. Giá tr d c h cị ượ ọ 7 1.2. Thực trạng gieo trồng và sử dụng cây Chùm Ngây 8 1.2.2. Ở Việt Nam 9 1.3. Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Chùm Ngây 9 1.3.1. Trên thế giới 9 1.3.2. Ở Việt Nam 10 1.4. Tổng quan về nuôi cấy mô tế bào 11 1.4.1. Cơ sở của phương pháp nuôi cấy mô – tế bào 11 1.4.2. Quy trình nhân giống in vitro 12 1.4.3. Các điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro 13 1.4.3.1. Môi tr ng nuôi c yườ ấ 13 1.4.3.2. V t li u nuôi c yậ ệ ấ 17 1.4.3.3. i u ki n vô trùngĐ ề ệ 17 1.5. Một số thành tựu về nhân giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô-tế bào ở Việt Nam. 17 CHƯƠNG 2 20 ĐỐI TƯỢNG – VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu 20 2.2.1. Phương pháp luận 20 2.2.2. Phương pháp thực nghiệm 21 2.2.2.1. Thí nghi m 1: nh h ng c a lo i hóa ch t v th i gian kh ệ Ả ưở ủ ạ ấ à ờ ử trùng n kh n ng t o m u s ch in vitrođế ả ă ạ ẫ ạ 21 2.2.2.2. Thí nghi m 2: nh h ng c a môi tr ng dinh d ng n kh ệ Ả ưở ủ ườ ưỡ đế ả n ng tái sinh ch i Chùm Ngây in vitroă ồ 22 2.2.2.3. Thí nghi m 3: nh h ng c a BAP n kh n ng tái sinh ch i ệ Ả ưở ủ đế ả ă ồ Chùm Ngây in vitro 23 2.2.2.4. Thí nghi m 4: nh h ng t h p c a BAP v Kinetin n kh ệ Ả ưở ổ ợ ủ à đế ả n ng tái sinh ch i chùm Ngây in vitroă ồ 24 2.2.2.5. Thi nghiêm 5: nh h ng c a môi tr ng dinh d ng n kh ́ ̣ Ả ưở ủ ườ ưỡ đế ả n ng ra r c a ch i Chùm Ngây in vitro ă ễ ủ ồ 25 2.2.2.6. Thí nghi m 6: nh h ng c a IBA n kh n ng ra r c a ch iệ Ả ưở ủ đế ả ă ễ ủ ồ 25 2.2.2.7. Thí nghi m 7: nh h ng c a giá th n t l s ng c a cây ệ Ả ưở ủ ể đế ỷ ệ ố ủ Chùm Ngây in vitro v n mở ườ ươ 26 2.2.3. Các chỉ tiêu theo dõi và thu thập 27 2.2.3.1. Chỉ tiêu thu thập: 27 2.2.3.2. Phương pháp xử lý số liệu: Số liệu được xử lý bằng chương trình Excel 27 Dùng phương pháp phân tích số liệu bằng phần mềm Microsoft Excel 2007, các bước tiến hành như sau: mở bảng tính Excel → Data → Data analysis → Anova single factoc hoặc Anova two factoc with replication → chọn vùng dự liệu phân tích, vùng xuất dữ liệu và độ tin cậy 0.05→ nhấn Ok 27 CHƯƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 28 3.1. Xác định công thức khử trùng thích hợp cho tạo mẫu sạch in vitro 28 3.2. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro 29 3.3. Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro 31 3.4. Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng nhân nhanh chồi 33 3.5. Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của chồi 36 3.6. Ảnh hưởng của nông độ IBA đến khả năng ra rễ của chồi 38 3.7. Ảnh hưởng của giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro ở vườn ươm 40 Hình 3.8. Cây chùm Ngây mô trồng ở Vườn ươm trên giá thể GT4 42 CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 43 4.1. Kết luận 43 4.2. Kiến nghị 43 TÀI LIỆU THAM KHẢO 44 PHỤ LỤC 46 Danh mục bảng Bảng 2.1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro 22 Bảng 2.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro 23 Bảng 2.3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm 23 Ngây in vitro 23 Bảng 2.4: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi chùm Ngây in vitro 25 Bảng 2.5: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ 25 Bảng 2.6: Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi 26 Bảng 2.7: Ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro trồng ở vườn ươm 27 Bảng 3.1: Ảnh hưởng của loại hóa chất và thời gian khử trùng đến khả năng tạo mẫu sạch in vitro 28 Bảng 3.2: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây in vitro 30 Bảng 3.3: Ảnh hưởng của BAP đến khả năng tái sinh chồi Chùm Ngây 31 in vitro 31 Bảng 3.4: Ảnh hưởng tổ hợp của BAP và Kinetin đến khả năng tái sinh chồi chùm Ngây in vitro 33 Bảng 3.5: Ảnh hưởng của môi trường dinh dưỡng đến khả năng ra rễ của chồi Chùm Ngây in vitro 36 Bảng 3.6. Ảnh hưởng của IBA đến khả năng ra rễ của chồi 39 Bảng 3.7. Ảnh hưởng của loại giá thể đến tỷ lệ sống của cây Chùm Ngây in vitro trồng ở vườn ươm 41 Danh mục hình ảnh Hình 1.1: Cây Chùm Ngây [33] 5 Hình 1.2: So sánh giá trị dinh dưỡng trong lá cây Chùm Ngây 7 Hình 2.1. Hạt cây Chùm Ngây 20 Hình 3.1. Hạt Chùm Ngây nảy mầm trên môi trường MS 29 Hình 3.2: Chồi Chùm Ngây trên môi trường CT1 (A) và môi trường CT2 (B) 33 Hình 3.3: Chồi Chùm Ngây trên môi trường CT7 sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B) nuôi cấy 35 Hình 3.4: Rễ Chùm Ngây trên môi trường CR6 sau 1 tuần (A) và sau 2 tuần (B) 37 Hình 3.5: Cây Chùm Ngây in vitro hoàn chỉnh 38 Hình 3.6. Rễ Chùm Ngây trên môi trường TN2 sau 1 tuần (A) và sau 2 tuần (B) 40 Hình 3.7. Cây Chùm Ngây in vitro hoàn chỉnh 40 Danh mục từ viết tắt WHO : World Health Organization FAO : Food and Agriculture Organization DNA : Deoxyribonucleic acid ĐHST : Điều hòa sinh trưởng MT : Môi trường IAA : Indol acetic acid IBA : Indol butyric acid NAA : 1-Naphthalene acetic acid 2.4-D : 2,4-Dichlorophenoxyacetic acid BAP : 6-Benzylaminopurine MS : Murashige and Skoog medium WPM : Woody Plant Medium B5 : Gamborg Medium N6 : Chu medium CT : Công thức CTTN : Công thức thí nghiệm CTMT : Công thức môi trường CR : Công thức môi trường ra rễ GT : Công thức giá thể đưa cây ra vườn ươm TDZ : Thidiaruzone TB : Trung bình 1 MỞ ĐẦU Chùm Ngây có tên khoa học là Moringa oleifera L., là một loài cây đa tác dụng, nên còn gọi là cây “Thần Diệu” (Miracle Tree), cây “Độ Sinh” (Tree of Life). Cây Chùm Ngây có xuất xứ từ vùng Nam Á, phổ biến ở cả Châu Á và Châu Phi. Giá trị sử dụng của cây Chùm Ngây được chia làm hai nhóm chính: (1) sử dụng làm thuốc chữa bệnh, (2) sử dụng làm nguồn lương thực giàu chất dinh dưỡng. Tổ chức Y tế thế giới (WHO) và tổ chức nông lương thế giới (FAO) đã khuyến cáo, sử dụng loài cây này là giải pháp ưu việt cho các bà mẹ thiếu sữa, trẻ em suy dinh dưỡng và là giải pháp lương thực cho “thế giới thứ ba” nên cây Chùm Ngây được trồng và nghiên cứu ở nhiều Quốc gia trên thế giới. Các bộ phận của cây Chùm Ngây, như: lá, hoa, thân, vỏ, bộ rễ chứa nhiều khoáng chất quan trọng, rất giàu chất đạm, Vitamin C, beta-caroten, acid amin và một hỗn hợp gồm các chất rất hiếm trong hệ thực vật, như: zeatin, quercetin, alpha- sitosterol, caffeoylquinic acid, kaempferol,… Trong cây Chùm Ngây có hơn 90 chất dinh dưỡng tổng hợp và các chất khoáng đa dạng không kém các sản phẩm từ động vật. Đặc biệt, trong lá Chùm Ngây rất giàu dinh dưỡng, hàm lượng Vitamin C cao hơn 7 lần so với vitamin C trong quả cam, hàm lượng Vitamin A cao hơn 4 lần so với vitamin A trong củ cà rốt, hàm lượng Canxi cao hơn 4 lần so với Canxi trong sữa. Giá trị làm thuốc của cây Chùm Ngây đã được khoa học chứng minh là có khả năng chống viêm, kháng khối u, đặc biệt là những khối u ở vùng bụng (Harwell et al., 1967-1971), kháng nấm gây bệnh (Chuang et al., 2007), trị bệnh tiểu đường, bảo vệ gan, chống nhiễm xạ (Rao et al., 2001), kích thích hoạt động của tim và hệ tuần hoàn, làm giảm lượng cholesterol trong máu (Mehta et al., 2003). Ngoài ra, Chùm Ngây còn được sử dụng làm mỹ phẩm cao cấp, nước uống dinh dưỡng và làm nguyên liệu tinh cho công nghiệp thực phẩm, dược phẩm, hóa chất. Đến nay, đã có nhiều công trình nghiên cứu về thành phần hóa học, giá trị dinh dưỡng, giá trị dược liệu của Chùm Ngây. Tuy nhiên, các nghiên cứu về kỹ thuật nhân, chọn tạo giống Chùm Ngây còn rất hạn chế. Hiện nay, Chùm Ngây chủ yếu được nhân giống bằng hạt hoặc giâm cành. Do hạt chùm Ngây chứa hàm lượng dầu cao nên rất khó bảo quản, khả năng nẩy mầm của hạt bị giảm nhanh chóng theo thời gian bảo quản, dẫn đến tỷ lệ hạt nảy mầm thấp, hiệu quả nhân giống không cao, chất lượng giống không đảm bảo và phụ thuộc vào mùa vụ. Nhằm tạo ra nguồn giống chất lượng cao với số [...]... Mục tiêu chung: Góp phần xây dựng quy trình kỹ thuật nhân nhanh giống cây Chùm Ngây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô, đạt hiệu quả nhân giống cao Mục tiêu cụ thể: - Xác định được các công thức môi trường, điều kiện nuôi cấy thích hợp cho từng giai đoạn trong quy trình nhân giống cây Chùm Ngây bằng kỹ thuật nuôi cấy mô; - Đưa được cây Chùm Ngây từ điều kiện in vitro ra trồng ở điều kiện tự nhiên (Vườn ươm) ... đầu), những ngày sau chế độ chăm sóc như cây hom hoặc cây ươm từ hạt ngoài vườn ươm [3], [1], [8], [12] 1.4.3 Các điều kiện cần thiết của nuôi cấy in vitro 1.4.3.1 Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy bao gồm hai loại: Môi trường hoá học và môi trường vật lý, chúng quyết định đến sự thành bại của quy trình nhân giống in vitro Môi trường nuôi cấy Môi trường nuôi cấy MT MT Hóa học Hóa học Nhóm Nhóm Nhóm... PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tượng, vật liệu nghiên cứu - Đối tượng: Bộ phận của Cây Chùm Ngây (Moringa oleifera L.); - Vật liệu: Hạt cây Chùm Ngây chín thu hoạch do Công ty TNHH Lê Hoàng, Thành phố Hồ Chí Minh cung cấp Hạt được sử dụng để tạo cây mầm in vitro, sau đó sử dụng các bộ phận sinh dưỡng của cây mầm in vitro làm vật liệu nhân giống Hình 2.1 Hạt cây Chùm Ngây 2.2 Phương pháp nghiên cứu 2.2.1... mức độ nuôi cấy thành công khác nhau, vật liệu nuôi cấy càng non thì khả năng nuôi cấy thành công càng cao Khi chọn vật liệu nuôi cấy cần chú ý đến mùa vụ lấy vật liệu, kích thước vật liệu, tuổi cây mẹ, vị trí lấy vật liệu trên cây mẹ và dòng cây mẹ [13] 1.4.3.3 Điều kiện vô trùng Đây là điều kiện cơ bản đầu tiên quyết định đến sự thành bại của quá trình nuôi cấy in vitro Do môi trường nuôi cấy rất... hành nuôi cấy phải lựa chọn được môi trường thích hợp cho sự sinh trưởng và phát triển tối ưu ở từng giai đoạn của quá trình nuôi cấy và với từng đối tượng nuôi cấy cụ thể: * Môi trường hoá học: Cung cấp các chất dinh dưỡng cơ bản cần thiết cho sự sinh trưởng và phân hoá của mô trong suốt quá trình nuôi cấy in vitro Thành phần của môi trường hoá học thay đổi theo loài cây, bộ phận cây, mục đích nuôi cấy, ... loài cây này, mới chỉ có mô t vài cá nhân quan tâm có trồng thử ở quy mô nhỏ và phải đặt mua hạt giống từ các tỉnh phía Nam Chính vì vậy, chúng tôi thực hiện nghiên cứu nhân giống in vitro loài cây Chùm Ngây với mục đích tạo ra một số lượng cây lớn phục vụ gây trồng và phát triển loài cây này ở các tỉnh phía Bắc 1.3 Tình hình nghiên cứu nhân giống cây Chùm Ngây Chùm Ngây được... chồi Chùm Ngây in vitro Khi đã tạo được mẫu sạch in vitro, tiến hành cắt chồi của cây mầm in vitro cấy chuyển sang môi trường tái sinh chồi (môi trường dinh dưỡng tốt nhất ở thí nghiệm 2 có bổ sung BAP với các nồng độ khác nhau) Những nghiên cứu trước đây đã chỉ ra rằng sử dụng BAP ở nồng độ từ 0,1 – 5 mg/l có ảnh hưởng rõ rệt đến khả năng bật chồi của mẫu cấy Đối với cây Chùm Ngây, chúng tôi nghiên cứu. .. của mô Nếu thiếu Fe quá trình phân chia của tế bào bị rối loạn, thiếu Bo mô nuôi cấy phát triển mô sẹo rất nhanh, nhưng có hiệu suất tái sinh thấp Hàm lượng của các nguyên tố đa lượng và các nguyên tố vi lượng phụ thuộc vào từng môi trường nuôi cấy và từng đối tượng nuôi cấy - Nguồn cacbon Mặc dù mẫu cấy vẫn có khả năng quang hợp, nhưng rất yếu, vì vậy buộc phải bổ sung nguồn cacbon để mẫu nuôi cấy. .. giống Môi trường dinh dưỡng cung cấp các chất dinh dưỡng cần thiết cho sự tăng trưởng, phát triển và phân hóa của các mô trong suốt quá trình nuôi cấy Vì vậy, việc nghiên cứu để xác định được môi trường dinh dưỡng phù hợp với từng đối tượng cây trồng ở từng giai đoạn cụ thể trong quy trình nuôi cấy là việc rất cần thiết, để đạt được hiệu quả nuôi cấy cao nhất Trong thí nghiệm này, sử dụng chồi của cây. .. hoặc các bộ phận khác của cây Mục đích của giai đoạn này là tạo ra nguồn vật liệu sạch để đưa vào nuôi cấy ở các giai đoạn tiếp theo - Giai đoạn tái sinh mẫu nuôi cấy: Mục tiêu để tạo ra các chồi mới từ mô nuôi cấy, về nguyên tắc thì tất cả các bộ phận của cây như thân, rễ, lá, hoa đều có khả năng nuôi cấy để tái sinh thành cây Tuy nhiên, một số các yếu tố như tuổi sinh lý của mô, thời điểm thu mẫu, . Chùm Ngây nảy mầm trên môi trường MS 29 Hình 3.2: Chồi Chùm Ngây trên môi trường CT1 (A) và môi trường CT2 (B) 33 Hình 3.3: Chồi Chùm Ngây trên môi trường CT7 sau 1 tuần (A) và 2 tuần (B) nuôi. của cây Chùm Ngây in vitro trồng ở vườn ươm 41 Danh mục hình ảnh Hình 1.1: Cây Chùm Ngây [33] 5 Hình 1.2: So sánh giá trị dinh dưỡng trong lá cây Chùm Ngây 7 Hình 2.1. Hạt cây Chùm Ngây 20 Hình. giống cây trồng bằng phương pháp nuôi cấy mô- tế bào ở Việt Nam. 17 CHƯƠNG 2 20 ĐỐI TƯỢNG – VẬT LIỆU - PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 20 2.1. Đối tượng, vật liệu nghiên cứu 20 2.2. Phương pháp nghiên cứu