LỜI MỞ ĐẦU Listeria monocytogenes là một loại vi khuẩn tồn tại phổ biến trong trong tự nhiên, được biết tới như tác nhân gây bệnh thực phẩm, có khả năng xâm nhập, sống sót và nhân lên trong tế bào có hay không có khả năng thực bào. L. monocytogenes gây bệnh listeriosis trên nhiều đối tượng khác nhau gồm người già, trẻ em, phụ nữ mang thai và người suy giảm miễn dịch gây hậu quả nghiêm trọng. L. monocytogenes với nhiều loại độc tố đa dạng, có khả năng nhận biết thụ thể chuyên biệt trên màng, để tiếp cận cũng như phá vỡ màng tế bào. Protein listeriolysin O (LLO) là loại độc tố có khả năng nhận diện cholesterol và hình thành cấu trúc lỗ trên màng phospholipid, giúp vi khuẩn thoát khỏi các bóng không bào vào tế bào tế chất. Nhờ đặc tính này mà LLO được nghiên cứu ứng dụng cho việc hỗ trợ vận chuyển các tác chất (phân tử thuốc, kháng nguyên- kháng thể, plasmid DNA, antisense oligonucleotide,…) vào bên trong tế bào mục tiêu. Tuy nhiên, hiện nay đa phần các nghiên cứu tập trung sử dụng LLO dạng tự nhiên của L. monocytogenes. Các phân tử dạng tự nhiên có đặc điểm nhạy cảm với pH của môi trường. Hoạt tính của LLO giảm nhanh ở điều kiệp pH trung tính. Do đó, việc ứng dụng LLO còn nhiều mặt hạn chế khi phải đối mặt với điều kiện pH môi trường không đồng nhất trong invivo. Khi sử dụng dạng LLO này đòi hỏi phải có nhiều chất hỗ trợ đi kèm để bảo vệ chúng không bị ảnh hưởng bởi pH. LLO được ứng dụng nhiều trong hỗ trợ liposome vận chuyển tác chất. Nhưng khi liposome dung hợp với màng tế bào và bị thực bào, các enzyme phân hủy trong không bào sẽ phân cắt tác chất trước khi LLO kịp phá vỡ không bào. Điều này làm giảm hiệu quả tác động của tác chất, cho thấy ứng dụng đặc điểm hoạt động ở pH acid của LLO còn nhiều hạn chế. Để khắc phục khó khăn cũng như mở rộng hơn nữa hướng ứng dụng của LLO trong y học, LLO dạng đột biến điểm thay thế glutamate247 thành Methionine và Aspartate320 thành lysine (LLO E247M/D320K ) hoạt động không phụ thuộc pH bước đầu được nghiên cứu ứng dụng. Nhờ hoạt tính ổn định trong khoảng pH rộng, LLO đột biến hoạt động tốt trong nhiều điều kiên pH khác nhau bên trong tế bào. Nhờ vậy, LLO dạng đột biến có khả năng hỗ trợ tốt hơn trong việc giải phóng tác chất và làm đơn giản hơn cho việc thiết kế cấu trúc liposome. LLO dạng đột biến vẫn còn là hướng mới có nhiều tiềm năng ứng dụng, nhưng đến nay các nghiên cứu vẫn còn hạn chế. Để tiến hành nghiên cứu sâu hơn về ứng dụng của LLO, chúng tối tiến hành biểu hiện và tinh chế thu nhận để bước đầu đánh giá đặc tính sinh hóa quan trọng của dạng đột biến này. Chủng B. subtilis được chúng tôi chọn làm chủng biểu hiện vì có nhiều ưu điểm nổi trội như là vi khuẩn an toàn, sinh trưởng mạnh, môi trường nuôi cấy đơn giản, có khả năng sản xuất protein dưới dạng tiết, có hệ thống vector biểu hiện để nâng cao hiệu suất. Nguồn protein thu nhận sẽ tiến hành thử nghiệm đặc tính sinh hóa quan trọng để xác định hoạt tính của protein. Đề tài được thực hiện tại Trung tâm Khoa học và Công nghệ Sinh học – Trường Đại học Khoa học Tự nhiên – Đại học Quốc gia Thành phố Hồ Chí Minh với các nội dung sau: - Lên men chủng B. subtilis 1012 mang vector pHT387 cho phép biểu hiện protein dung hợp LysSN-6xHis-TEVsite-LLO E247M/D320K trong hệ thống lên men 5 lít - Tinh chế thu nhận protein LLO E247M/D320K tinh sạch. - Tiến hành thử nghiệm hoạt tính của protein đã thu nhận trên tế bào hồng cầu. Phần 1 TỔNG QUAN 1.1. Vi Khuẩn Listeria monocytogenes 1.1.1. Đặc điểm chung Listeria monocytogenes được mô tả lần đầu tiên vào năm 1926 bởi Murray và cộng sự [24]. L. monocytogenes thuộc chi Listeria, là vi khuẩn Gram dương, kị khí tùy ý, nó phân bố rộng rãi trong đất, nước bề mặt và cũng được tìm thấy trong thức ăn ủ chua, nước thải, sữa, phân người và động vật [45], 278. Vi khuẩn có khả năng di chuyển theo hình thức bơi đẩy nhờ vào tiêm mao, di chuyển tốt ở nhiệt độ khoảng 20- 25 0 C, nhưng giảm di động đáng kể ở 37 0 C [26]. Đầu những năm 1980, L. monocytogenes được công nhận là vi khuẩn gây bệnh thực phẩm, đối tượng có nguy cơ bị nhiễm vi khuẩn này cao gồm người già, trẻ em, người suy giảm miễn dịch và đặc biệt nguy hiểm cho phụ nữ mang thai. Ở trẻ em, L. monocytogenes là lí do phổ biến thứ 3 gây ra bệnh viêm màng não do vi khuẩn, đứng sau Escherichia Coli và Streptococcus Agalactiae [35]. Ở người, tỉ lệ nhiễm L. monocytogenes trong cộng đồng không cao (7/1000000 người), tuy nhiên tỉ lệ tử vong rất cao (30% số ca bị nhiễm) [31]. L. monocytogenes phát triển ở khoảng nhiệt độ -0.4 0 C - 50 0 C, có thể tiếp tục nhân chậm ở nhiệt độ thấp, trong thực phẩm bảo quản lạnh và có khả năng tồn tại trong điều kiện có tính axid hoặc mặn [10][9]. Do vậy, L. monocytigenes là lí do đe dọa sức khỏe cộng đồng và ảnh hưởng rất lớn tới nền kinh tế. 1.1.2. Quá trình xâm nhiễm nội bào L. monocytogenes là tác nhân gây bệnh nội bào, có khả năng phát triển và nhân rộng trong bào tương của tế bào vật chủ. Vi khuẩn có khả năng vượt trội để qua mặt ba rào cản của cơ thể: hàng rào biểu mô ruột, hàng rào máu não và hàng rào nhau thai. L. monocytogenes xâm nhiễm vào tế bào bằng cách phá vỡ các bóng không bào, thoát ra tế bào chất, nhân lên và xâm nhiễm từ tế bào này sang tế bào khác. (Hình 1.1) : Quá trình lây nhiễm của Listeria monocytogenes [28]. L. monocytogenes nhận diện và bám vào tế bào chủ nhờ vào sự tương tác giữa các protein bề mặt ( InlA và InlB) với thụ thể trên màng sinh chất của tế bào vật chủ. Thụ thể bám dính của InlA là E-caherin, còn InlB thì liên kết với tyrosine kinase Met, cả hai tương tác này đều thúc đẩy quá trình “ubiquitin hóa”, huy động protein clathrin tập trung, mở kênh protiein này, thuận lợi cho vi khuẩn xâm nhập vào tế bào [28]. Với các tế bào không có khả năng thực bào, vi khuẩn sẽ cảm ứng cơ chế “zipper” để vào bên trong tế bào chủ. Ngay khi tấn công tế bào chủ, L. monocytogenes bị bao lấy bởi màng tế bào, hình thành bóng không bào. Nếu không có cơ chế thoát khỏi bóng không bào, vi khuẩn được chuyển vào lizosome, nơi nó sẽ bị tiêu thực. Tuy nhiên, L. monocytogenes có khả năng đặc biệt riêng của nó, các bóng không bào đang bao bọc vi khuẩn bị ly giải bởi độc tố do vi khuẩn tiết ra, tạo điều kiện cho vi khuẩn phóng thích ra tế bào chất. Các độc tố thiết yếu cho L. monocytogenes thực hiện tính năng này là listeiolysin O (LLO) và hai phospholipase (PlcA and PlcB) [28]. LLO là độc tố có khả năng hình thành lỗ trên màng tế bào ở điều kiện pH thấp và có sự hiện diện của cholesteron màng. Bên trong tế bào chủ, vi khuẩn nhân lớn số lượng, chúng bị bao lấy bởi các sợi actin rất ngắn. Vi khuẩn sắp xếp lại các sợi actin để hình thành dạng phân cực “comet’s tail” kéo dài từ một đầu của vi khuẩn. Đuôi “comet’s tail” này giúp vi khuẩn di động theo chiều ngược với đuôi, đầu không có đuôi actin sẽ lao ra ngoài màng, tạo ra những chỗ lồi xâm lấn sang các tế bào chủ bên cạnh, cảm ứng cơ chế thực bào của tế bào lân cận này [41]. Vận tốc nhu động trung bình từ 10-15 mm/phút. Sau khi bị thực bào vào tế bào kế cận, vi khuẩn lúc này đang bị bao bọc bởi 2 lớp màng (một màng của tế bào chủ cũ và một màng của tế bào chủ mới, tạo thành lớp màng kép). Ngay sau đó, với độc tố LLO và phospholipage của mình, nó nhanh chóng phá vỡ lớp màng kép này và thoát ra ngoài, thực hiện một chu trình xâm nhiễm mới. 1.2. Protein Listeriolysin O (LLO) 1.2.1. Nguồn gốc LLO là thành viên trong họ Cholesterol-dependent cytolysins, một họ lớn trong nhóm β-PFTs. Nhóm β-PFTs là nhóm nhỏ được phân ra từ nhóm pore-forming toxins (PFTs), một nhóm độc tố phổ biến nhất ở vi khuẩn. 1.2.1.1. Pore-forming toxins (PFTs) Pore-forming toxins (PFTs) là những protein gây độc phổ biến nhất ở vi khuẩn (25-30% độc tố tế bào vi khuẩn). PFTs là nhóm lớn nhất của các protein độc lực, có mặt hầu hết trong các tác nhân gây bệnh quan trọng, bao gồm Streptococcus pneumonia, Streptococci nhóm A và B, Staphylococcus aureus, Escherichia coli và Mycobacterium tuberculosis [19]. Nhóm độc tố PFTs được vi khuẩn tiết ra dưới dạng monomer, nhận biết các receptor chuyên biệt trên màng tế bào chủ để tiếp cận và hình thành lỗ trên màng. Khi hình thành lỗ, tùy loại độc tố PFTs mà kích thước lỗ to nhỏ khác nhau, lỗ nhỏ có kích thước 0,5-5 nm, lỗ lớn 20-100 nm . Dựa vào cấu trúc thứ cấp khi xâm nhập vào màng tế bào chủ, PFTs phân thành 2 dạng chính: β-barrel (α-PFTs) và α-helical (β-PFTs). Đa số các độc tố vi khuẩn là thuộc nhóm β-PFTs. Các α-PFTs hình thành lỗ nhờ vào cấu trúc xoắn α. Một ví dụ cho độc tố nhóm α-PFT là Colicin A (ClyA) (Hình 1.2A, 1.2B). ClyA thuộc nhóm colicin, một kháng sinh do Ecoli tiết ra. Các gấp β là cấu trúc chủ yếu giúp β-PFTs hình thành lỗ trên màng. Đại diện cho nhóm β-PFTs là α-hemilysin (Hình 1.2C, 1.2D), độc tố làm tan tế bào hồng cầu, có nguồn gốc từ Staphylococcus aureus. : Mô hình cấu trúc của nhóm α-PFTs và β-PFTs [8]. (A) Cấu trúc monomer của ClyA (α-PFTs), (B) Dạng dodecamerric của ClyA. (C) Cấu trúc monomer của α- hemolysin (β-PFTs), (D) dạng heptameric của β-PFTs. 1.2.1.2. Β-pore-forming toxins (β-PFTs) Β-PFTs đến nay là nhóm được nghiên cứu nhiều nhất của PFTs. Một số đột tố trong nhóm này gồm có Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), perforin, α- hemolysin, aerolysin, pseudomonas aeruginosa cytotoxin. Các β-PFTs được tiết ra ở dạng monomer hòa tan, có cấu trúc tinh thể dạng hình nấm gồm 3 phần: nắp, vành và domain gốc (Hình 1.2D). Các mũ có đường kính khoảng 100Å, giàu phiến β xếp thành β-sandwich, cùng với phần vành tạo nên cốt lõi cho protein. Các gốc được xây dựng từ 14 phiến β-barrel của 7 β-hairpins, mỗi β-hairpin hình thành từ một monomer đơn, đặc trưng bởi các phần phân cực và không phân cực xen kẽ nhau. Vùng giàu aromatic nằm giữa domain vành và domain gốc hình thành vị trí bám cho α-hemolysin. [25] 1.2.1.3. Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs) CDCs là một trong những độc tố phổ biến rộng rãi nhất được biết đến, trong đó có chứa hơn 20 độc tố hình thành lỗ [7]. Các gen độc tố hoặc các sản phẩm của gen đã được xác định có trong nhiều loài từ năm chi khác nhau của vi khuẩn gram dương. Bao gồm: Clostridium, Bacillus, Streptococcus, Listeria, và gần đây nhất là Arcanobacterium [43]. Streptolysin O (SLO), pneumolysin (PLY) và perfringolysin O (PLO) là 3 cấu trúc chính của CDCs, mức tương đồng về cấc trúc của 3 độc tố khoảng 40 - 70% trình tự CDCs [11][27]. Các độc tố CDCs được tiết ra ở dạng monomer tan trong nước, kích thước từ 50 - 70 kDa [30]. Độc tố thuộc họ CDCs có 2 đặc trưng hoạt động: phụ thuộc sự có mặt của cholesterol trên màng, nhận diện cholesterol như một recepter và hình thành lỗ có kích thước rất lớn trên màng tế bào nhân thực. Nhận diện và bám vào màng, độc tố tập hợp hình thành phức hợp homo-oligomeric dạng vòng cung hoặc tròn lên đến 50 monome trên bề mặt, sau đó chèn vào màng tạo thành lỗ chịu trách nhiệm ly giải tế bào với đường kính lên tới 300 Å [30]. 1.2.2. Đặc điểm cấu trúc của LLO Năm 1987, Geoffroy và cộng sự cung cấp những bằng chứng rõ ràng đầu tiên về một loại hemolysin tiết ra từ L. monocytogenes giống với streptolysin O (SLO-được tiết ra bởi Streptococcus pyogenes), thuộc họ Cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), đặt tên là listeriolysin O (LLO) [5]. Protein LLO được mã hóa bởi gen hemolysin, hly, dưới sự điều tiết của PrfA, nhân tố điều hòa phiên mã chính cho các gen độc lực trong Listeria. Gen hly và PrfA cùng 4 độc tố khác (plcA, mpl, actA, và plcB) liên kết trong một nhiễm sắc thể 9 kb, gọi là cụm gen LIPI-1, gen hly mã hóa cho LLO nằm ở vị trí trung tâm trong locus này [14]. LLO được hình thành từ chuỗi peptide dài 529 amino acid, với kích thước khoảng 58.6 kDa. : Sơ đồ gene hly mã hóa cho LLO và cấu trúc monomer của LLO [7]. (a) Sơ đồ thể hiện gene hly mã hóa cho LLO của Listeria; (b) Mô hình cấu trúc một monomer của LLO dựa trên cấu trúc tinh thể của PFO, intermedilysin, và suilysin (tham khảo từ Protein DataBank PDB1PFO, PDB1S3R và PDB3HVN). Cấu trúc LLO và phân tích X-ray đã được thực hiện gần đây nhưng chưa xác định được cấu trúc chi tiết của protein này [12]. Trình tự gen mã hóa cho LLO, ivanolysin O (ILO) và seeligerilysin O (LSO) có mức độ tương đồng cao về nucleotide (76-78%) và protein (86 – 91%). Các protein thuộc họ CDCs tương đồng 40 – 70% trình tự amino acid. Do đó, sự tương đồng cấu trúc của LLO với các protein cùng họ là giả thuyết ban đầu để thiết lập mô hình cho LLO. Năm 1997, Rossjohn và cộng sự lần đầu tiên xác định cấu trúc của PFO, một thành viên thuộc họ CDCs. Có thể dựa vào cấu trúc PFO để xác định cấu trúc tương đối của các thành viên còn lại trong họ CDCs, trong đó có LLO. Phân tử LLO có cấu trúc kéo dài phân thành 4 domain chính (D1-D4) (Hình 1.3). Các doamain D1, D2 và D3 của LLO gắn kết với nhau, còn domain D4 gần như là một đơn vị độc lập kết nối với D2 qua một glycine (G417) [13]. Domain D4 tham gia liên kết với lớp kép phospholipid của tế bào chủ qua 3 vòng kị nước (L1-L3), nằm ở vùng đáy của D4. Vùng trình tự undecapeptide ở D4 kiểm soát quá trình tái sắp xếp trong D3 cho tới khi độc tố “oligomerization”. Vùng D3 có hai xoắn α chuyển đổi thành hai phiến β chèn (TMHs) vào màng đôi lipid của tế bào chủ tạo thành oligome với 34-35 tiểu phần [3]. Vùng D1 và D2 cũng có chức năng trong việc hình thành cấu trúc oligome và cấu trúc xuyên màng. : Mô hình cấu trúc LLO mô phỏng theo cấu trúc tinh thể của PFO [37]. Các kí hiệu D1-D4 tương ứng với các vùng domain từ 1 tới 4. Trong các thành viên của họ CDCs, cặp threonine-leucine (Thr515 / Leu516) nằm trong L1 là bảo tồn, cặp amino acid này đã được chứng minh là nhân tố bám vào cholesterol và có vai trò trong hình thành lỗ ở LLO [37]. Leucine 461 cũng đã được chứng minh là yếu tố điều khiển tốc độ oligomerization của LLO [36]. 1.2.3. Chức năng của LLO Protein LLO là một dạng protein tan được tiết ra bởi L. monocytogenes, giúp vi khuẩn này trốn thoát khỏi các bóng không bào của tế bào chủ. Chèn các gen nhảy vào gen hly hay xóa bỏ gen hly khỏi L. monocytogenes, vi khuẩn vẫn bị kẹt trong bóng [...]... hệ thống biểu hiện pHT mang promoter mạnh Pgrac, có khả năng sao chép theo kiểu θ, cảm ứng bởi IPTG, cho phép biểu hiện tốt protein ngoại lai và khắc phục sự thất thoát plasmid, đã cải thiện đáng kể khó khăn Đồng thời, vector con thoi có thể được t o dòng trong E coli và biểu hiện trong B subtilis Để nâng cao hiệu quả sản xuất protein tái tổ hợp, nhiều chủng B subtilis bị đột biến bất hoạt protease đã... Ở giai o n sớm khi nhiễm Listeria, việc tăng lượng Ca2+ gây giảm khối lượng tế b o, thay đổi kích thước tế b o và làm lớp biểu mô yếu hơn [34] LLO đột biến được ủ với dòng tế b o biểu mô ruột Caco-2 để theo dõi mức Canxi nội b o Quan sát các đột biến trong vùng PPII (LLO A40W, LLOS44D, LLOS44E) và đột biến mất o n PPII, dòng Ca2+ v o tế b o tăng rõ rệt kèm theo hiện tượng tế b o co rút, trong khi... t o ra bởi các thể đột biến khác hoàn toàn với các lỗ và vòng do thể đột biến gây ra Khẳng định rằng, các thể đột biến này vẫn có thể bám v o màng và bắt đầu quá trình oligomerization nhưng không hoàn chỉnh, không t o thành lỗ đặc trưng cho tán huyết [13] Đặc trưng của LLO là hoạt động phụ thu c v o pH, được quy định bởi bộ ba amino acid nằm trong D3 (Asp208, Glu247, và Asp320) Cũng có giả thuyết cho... các vector trong hệ thống pHT đều sử dụng promoter Pgrac (Hình 1.9), được dung hợp từ promoter PgroES của B subtilis với lac operator (lacO) của E coli, cho phép biểu hiện cảm ứng bằng IPTG ở cả B subtilis và E coli Ngay sau promoter Pgrac, trình tự Shine-Dalgarno (SD) của gen gsiB và vùng Multi cloning site – MCS (BamHI, XbaI, AatII, SmaI) được chèn v o để hỗ trợ cho việc t o dòng và biểu hiện gen... nhiên sự kết hợp 2 đột biến điểm trong bộ ba acid này cho hiệu quả tăng cao Đột biến 2 điểm LLO E247M/D320K cho kết quả tốt ở pH 5.5 đồng thời không bị biến tính và hoàn toàn ổn định ở pH 7.4 [36] : Mô hình cấu trúc của LLO với các điểm được gây đột biến [36] 1.3.3 Các ứng dụng của LLO đột biến Protein LLO là một trong những độc lực chính của L monocytogenes và không được tìm thấy ở các loài listeria khác... gây độc cho tế b o [44] Ngoài cách đóng gói LLO v o liposome, LLO còn được sử dụng cho bám dính quanh liposome, giảm hiệu quả của thu c Cách này ứng dụng trong một nghiên cứu tiếp cận thu c v o tế b o ung thư vú sử dụng liposome và LLO để hỗ trợ [15] Các ứng dụng trên đều lợi dụng đặc tính chỉ hoạt động trong điều kiện pH acid của LLO, để ứng dụng phá vỡ r o cản không b o ngăn cản phân phối thu c, nhưng... quy định Nồng độ cao LLO có thể gây độc cho tế b o, do đó lượng LLO cần thiết để phân phối thu c càng ít càng tốt, nhưng vẫn đảm b o hiệu qua phân phối [2] Đột biến điểm tại ví trí có nhiều cytein, LLOC484S đã được chứng minh là nâng cao hoạt tính, ổn định hơn LLOWT khi v o trong tế b o cùng với liposome, cho phép giảm lượng LLO sử dụng cho các ứng dụng phân phối thu c nhờ liposome trong tương lai, giảm... LLO giống như chuỗi PEST-like, trình tự PEST do sáu proline, chuỗi helix xoắn 4 lần, không có liên kết hidro nội phân tử Sự sắp xếp này cũng được biết đến như một loại polyproline II helix (PPII), tham gia v o tương tác giữa các phân tử LLO, trình tự này b o tồn trong các loài thu c chi Listeria Đột biến trong vùng PPII, gồm mất o n PPII (LLODPPII) hay đột biến trong vòng xoắn PPII (LLOA40W, LLOS44D,... [33][39][6] 1.3 Protein LLO dạng đột biến Với tính năng phá vỡ màng trong điều kiện pH thấp, LLO được tập trung nghiên cứu để ứng dụng v o y học, chủ yếu theo hướng sản xuất vaccine và làm tá chất vận chuyển thu c tới tế b o Xây dựng mô hình protein LLO đột biến nhằm xác định chức năng của một amino acid, một vùng gen hoặc để tối ưu hóa hoạt tính của LLO trong tế b o chủ 1.3.1 Các dạng đột biến của LLO Vùng... antisense oligonucleotide, kháng nguyên hòa tan, toxin peptide [17][18][20][38] Khi v o cơ thể liposome sẽ dung hợp với màng tế b o và bị mắc kẹt trong bóng không b o, nhạy cảm với pH acid ở không b o liposome giải phóng tác chất v o bóng không b o LLO gặp điều kiện pH acid của bóng không b o, hoạt hóa chức năng ly giải màng, phá vỡ bóng không b o, thu c và tác chất được phóng thích v o tế b o chất, thực hiện