bộ quốc phòng Học viện quân y ***** Báo cáo khóa luận TN DS Đại học Nghiên cứu định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch wisconsin - a phơng pháp quang phổ cộng tính Ngời hớng dẫn: TS Phan Văn Bình Thực hiện: SV Nguyễn Hồng Sơn Dợc đặt vấn đề - Trong y học đại ghép tạng phơng pháp chữa bệnh hữu hiệu - Dung dịch Wisconsin V dung dịch để rửa bảo quản tạng ghép dạng Wisconsin - Dung dịch Wisconsin V đợc đóng gói thành đơn vị thành phẩm riêng biệt -Trong dung dịch Wisconsin A adenosin allopurinol hợp chất hữu có hàm lợng nhỏ nhng có vai trò quan trọng đặt vấn đề Chúng chọn đề tài: Nghiên cứu định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch Wisconsin - A phơng pháp quang phổ cộng tính với mục tiêu sau : Xây dựng phơng pháp định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch Wisconsin - A phơng pháp quang phổ cộng tính Khảo sát độ lặp lại độ phơng pháp I Tổng quan 1.1.Thành phần & nồng ®é c¸c chÊt dd Wisconsin - A MgSO4 H2O 0,63 g Adenosin 0,683 g Allopurinol 0,069 g Acid lactobionic 18,28 g Raffinose Hydroxy ethyl starch: Kali hydroxyd võa ®đ ®Õn pH = 7,0 Níc cÊt pha tiªm võa ®đ 500ml 9,20 g 25,50 g 1.2 T¸c dơng cđa adenosin allopurinol Trong tế bào tim, adenosin thể hoạt tính sinh lý dợc lý, tham gia vào trình tái tạo ATP Vì adenosin đợc sử dụng làm thuốc chống loạn nhịp bảo vệ mạch vành bệnh nhồi máu tim Trong dung dịch Wisconsin, adenosin có tác dụng phòng ngừa loạn nhịp sau ghép, nguồn dự trữ để tái tạo lợng Allopurinol có hoạt tính ức chế enzym xanthin oxydase, có tác dụng làm giảm nồng độ acid uric dịch nội tế bào Do y học allopurinol đợc sử dụng làm thuốc chữa bệnh gút Trong dung dịch Wisconsin, allopurinol chất chống oxy hoá, chống acid uric, chống độc, chống peroxyd 1.3.Định lợng hỗn hợp adenosin allopurinol Nguyễn Chí Kiên nghiên cứu định lợng đồng thời adenosin & allopurinol dung dịch Wisconsin A phơng pháp sắc ký lỏng hiệu cao 1.4.Phơng pháp quang phổ cộng tính Do độ hấp thơ cã tÝnh céng tÝnh nªn nÕu cã mét d dịch hỗn hợp gồm n chất độ hấp thụ hỗn hợp tổng độ hấp thụ n dung dịch chất riêng rẽ có nồng độ nh hỗn hợp Trờng hợp đơn giản hỗn hợp gồm hai chất, ta có : Ahh = A1 + A2 Chän hai bíc sãng 1,  đo độ hấp thụ hỗn hợp bớc sóng Tại 1: Ahh = E1 1C1 + E2 1C2 ; T¹i 2: Ahh 2 = E1 2C1 + E2 2C2 Giải hệ phơng trình ta tìm đợc: C1= A1E22-A2E21 x 100; C 2= A2E11-A1E12  = E11E22 – E12E 21 x 100; II VËt liệu & phơng pháp nC 2.1 Vật liệu nghiên cứu 2.1.1 Nguyên liệu, hoá chất, dung môi : - Adenosin ( C10H13N5O4 , ptl = 267,2 đạt USP 24 - Allopurinol (C5H4N4O, ptl = 136,1 ) đạt USP 24 2.1.2 Dơng cơ, thiÕt bÞ : Quang phỉ kÕ UV - VIS Cintra - 40 GBC corporation óc 2.1.3 C¬ së thực nghiệm: 2.2 đối tợng nghiên cứu: Hoá chất adenosin, allopurinol dung dịch Wisconsin - A 2.3 Phơng pháp nghiên cứu 2.3.1.Khảo sát ảnh hởng pH dung dịch đến phổ hấp thụ ánh sáng adenosin allopurinol Ghi phỉ hÊp thơ tõ bíc sãng 200 – 400nm dung dịch adenosin allopurinol có pH từ 6,0 ®Õn 8,0 So s¸nh phỉ hÊp thơ cđa c¸c dung dịch Lựa chọn pH thích hợp 2.3.2 Khảo sát ảnh hởng thành phần khác dd Wisconsin - A độ hấp thụ Adenosin Allopurinol Ghi phỉ hÊp thơ tõ bíc sãng 200 – 400nm dung dịch Magnesi sulfat, Acid lactobionic, Raffinose, Hydroxyethyl starch, dung dịch chuẩn hỗn hợp adenosin allopurinol, dung dịch chuẩn hỗn hợp có thêm thành phần khác Xem xét phổ hấp thụ dung dịch thành phần khác dung dịch Wisconsin A So sánh phổ hấp thụ hai hỗn hợp 2.3.3 Khảo sát, chọn cặp bớc sóng thích hợp để định lợng đồng thời adenosin allopurinol d dịch Wisconsin - A Trên sở phổ UV adenosin allopurinol dung dịch đệm phosphat pH = 7,0 chọn bớc sóng tơng ứng với cực đại hấp thụ adenosin allopurinol 205, 207, 250, 260nm đo độ hấp thụ tất mẫu bớc sóng 205, 207, 250, 260nm Lấy giá trị độ hấp thụ quang trung bình adenosin allopurinol bớc sóng Tính nồng độ adenosin allopurinol hỗn hợp theo công thức : A2E11-A1E12 CAd= A1E22-A2E21 CAL= x 100; = E11E22 – E12E 21 x 100; Chọn cặp bớc sóng thích hợp để định lợng đồng thời adenosin allopurinol 2.3.4 Xây dựng phơng pháp định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch Wisconsin - A 2.3.4.1 đề xuất phơng pháp Dựa vào kết nghiên cứu mục 2.3.1, 2.3.2, 2.3.3 để đề xuất phơng pháp định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch Wisconsin - A 2.3.4.2 Khảo sát ảnh hởng độ lệch tỷ lệ nồng độ adenosin allopurinol kết phân tích Pha dung dịch hỗn hợp adenosin allopurinol chuẩn có độ lệch nồng độ 11/0,9 & 9/1,1 định lợng theo phơng pháp đà đề xuất 2.0 Abs 1.5 1.0 206,5  0.5 227  258  0.0 200.0 225.0 250.0 275.0 300.0 325.0 350.0 375.0 400.0 nm H×nh 3.17 Phổ hấp thụ dung dịch adenosin, allopurinol thành phần khác WA 3.3 Kết khảo sát chọn cặp bớc sóng thích hợp để định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch Wisconsin A Bảng 3.8: Kết định lợng adenosin d dịch chuẩn hỗn hợp Nồng độ tìm thấy (g/l) Cặp bớc sóng Nồng độ đa vào (g/l) X % SD% 205/250 0,68 0,6849 0,6793 0,6824 0,6846 0,6813 0,6825 0,37 0,34 205/260 0,68 0,6827 0,6789 0,6849 0,6863 0,6788 0,6823 0,33 0,50 207/250 0,68 0,6839 0,6778 0,6839 0,6871 0,6839 0,6833 0,38 0,49 207/260 0,68 0,6823 0,6784 0,6854 0,6870 0,6794 0,6825 0,37 0,54 250/260 0,68 0,6817 0,6787 0,6860 0,6870 0,6777 0,6822 0,33 0,61 X B¶ng 3.9 KÕt qu¶ định lợng allopurinol dung dịch chuẩn hỗn hợp Nồng độ tìm thấy (g/l) Cặp bớc sóng Nồng độ đa vµo (g/l) X % SD% 205/250 0,068 0,0662 0,0675 0,0695 0,0696 0,0691 0,0684 0,55 2,17 205/260 0,068 0,0675 0,0678 0,0681 0,0686 0,0705 0,0685 0,74 1,74 207/250 0,068 0,0670 0,0687 0,0683 0,0676 0,0670 0,0677 - 0,41 1,13 207/260 0,068 0,0679 0,0684 0,0674 0,0676 0,0697 0,0682 0,29 1.34 250/260 0,068 0,0687 0,0680 0,0666 0,0677 0,0720 0,0686 0,88 2,98 X 3.4 Kết xây dựng phơng pháp định lợng đồng thời Adenosin Allopurinol 3.4.1 Đề xuất phơng pháp Từ kết nghiên cứu đề xuất phơng pháp định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dÞch Wisconsin- A nh sau: - Pha dung dịch adenosin allopurinol chuẩn, đo độ hấp thụ quang ë bíc sãng 207 vµ 260 nm - Pha loÃng dung dịch Wisconsin-A 200 lần dung dịch đệm phosphat pH = 7,0 ®o ®é hÊp thơ quang ë bớc sóng 207 260nm - Tính nồng độ adenosin allopurinol dung dịch WisconsinA theo phơng pháp quang phổ cộng tính 3.4.2 Kết khảo sát ¶nh hëng cđa ®é lƯch tû lƯ nång ®é adenosin allopurinol kết phân tích Bảng 3.10 Kết định lợng adenosin dung dịch hỗn hợp chuẩn có độ lệch 11/0,9 9/1,1 Nồng độ đa vào (g/l) 0,748 0,612 Nồng độ tìm thấy (g/l) X % SD% X 0,7572 0,7535 0,7482 0,7462 0,7494 0,7509 0,39 0,58 0,6175 0,6078 0,6151 0,6206 0,6115 0,6145 0,41 0,81 Bảng 3.11 Kết định lợng allopurinol dung dịch hỗn hợp chuẩn có độ lệch 11/0,9 9/1,1 Nồng độ đa vào (g/l) Nồng độ t×m thÊy (g/l) X % SD% 0,0612 0,0617 0,0615 0,0594 0,0619 0,0626 0,0614 0,33 1,92 0,0748 0,0755 0,0748 0,0736 0,0757 0,0758 0,0751 0,40 1,22 X Từ kết hai bảng 3.10 3.11 cho thấy ta thay đổi độ lệch nồng độ kết định lợng adenosin allopurinol cho độ xác cao Vậy ta thay đổi độ lệch nồng độ adenosin allopurinol khoảng từ 9/1,1 đến 11/0,9 không ảnh hởng đến kết phân tích 3.4.3 Kết khảo sát độ lặp lại phơng pháp Bảng 3.12 Kết khảo sát độ lặp lại pp định lợng adenosin Dung dịch WA lô 20/10/04 Số lần định lợng Chai số Nồng độ tìm thấy (g/l) X Ad1 SD % 7,9658 3   0, 10 Chai sè Nång ®é t×m thÊy (g/l) 1,3757 XAd1= 1,3626 1,3532 XAd2 = 1,3588 1,3546 SD = 7,96.10-3 1,3613 SD = 5,2.10-3 1,3584 SD% = 0,58 1,3585 SD% = 0,38 1,3620 1,3662 1,3627 1,3548 B¶ng 3.13 KÕt qu¶ kh¶o sát độ lặp lại pp định lợng allopurinol Dung dịch WA lô 20/10/04 Số lần định lợng Chai số Nồng độ tìm thấy (g/l) Nồng độ tìm thấy (g/l) SD % 5,1838  0, 10 X AL1  0,1362 0,1369 0,1365 0,1358 0,1359 0,1357 Chai sè 0,1370 XAL1 = 0,1362 SD = 5,18.10-4 SD% = 0,38 0,1367 0,1360 0,1362 0,1371 XAL2 = 0,1366 SD = 4,85.10-4 SD% = 0,35 Để đánh giá kết từ chai chai xem sù kh¸c biƯt cã ý nghÜa hay không, tiến hành so sánh giá trị trung bình dÃy kết dựa test t So sánh giá trị trung bình: - Đối với adenosin: ttt = 0,893 Nh vËy ttt = 0,893 < t0,95 = 2,306 (ë  = 0,05; n1 + n2 – = 8) - §èi víi allopurinol: ttt = 1,974 Nh vËy ttt = 1,974 < t0,95 = 2,306 (ë  = 0,05; n1 + n2 – = 8) Kết so sánh cho thấy: giá trị trung bình dÃy kết thu đợc từ chai chai khác ý nghĩa (p>0,05), hay khác biệt kết thu đợc từ chai chai 2, phơng pháp có độ lặp lại cao 3.4.3 Kết khảo sát độ phơng pháp Bảng 3.14 Kết khảo sát độ ph pháp định lợng adenosin Dung dịch WA, lô sản xuất 20/10/04 có nồng độ adenosin 1,3607g/l, lợng thêm vào là: 0,068g/l Số lần định lợng Chai số Chai số Nồng độ tìm thấy (g/l) Nồng độ tìm thấy g/l) 1,4326 1,4275 1,4245 XAd3 = 1,4309 1,4324 XAd4 = 1,4272 1,4285 SD = 4,56.10-3 1,4266 SD = 3,15.10-3 1,4324 SD% = 0,32 1,4244 SD% = 0,22 1,4365 X Ad  1,4309 SD % 4,5632 3   0, 10 1,4251 % = 0,51 B¶ng 3.15 KÕt qu¶ khảo sát độ ph pháp định lợng allopurinol Số lần định lợng Dung dịch WA, lô sản xuất 20/10/04 có nồng độ allopurinol 0,1362g/l, lợng thêm vào 0,0068g/l Chai số Chai số Nồng độ tìm thấy (g/l) Nồng độ tìm thấy g/l) 0,1426 0,1418 0,1434 XAL3 = 0,14326 0,1441 XAL4 = 0,14334 X AL3 SD  SD%  0,1421 SD = 9,2.10-4 0,1430 SD = 9,84.10-4 0,1444 SD% = 0,64 0,1442 SD% = 0,69 0,1438 0,1436 % = 1,47 ViƯc ¸p dụng phơng pháp quang phổ cộng tính để định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch WA cha đợc đề cập tài liệu đối tợng nghiên cứu dung dịch Wisconsin - A dung dịch có nhiều thành phần phức tạp, lợng hoạt chất chứa mẫu phân tích cần định lợng nhỏ, để thu đợc kết xác cần phải thao tác cẩn thận Trên sở kết thu đợc thực nghiệm, đà chọn đợc dung dịch đệm pH cặp bớc sóng thích hợp cho phép định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch WA Phơng pháp đợc tiến hành nhanh, thuận lợi, có độ độ xác chấp nhận đợc phân tích định lợng IV Kết luận đà xây dựng đợc ph.pháp định lợng ®ång thêi adenosin & allopurinol dung dÞch Wisconsin - A phơng pháp quang phổ cộng tính với qui trình sau : + Pha dung dịch adenosin allopurinol chn, ®o ®é hÊp thơ quang ë bíc sãng 207 260nm + Pha loÃng dung dịch WA 200 lần dung dịch đệm phosphat pH = 7,0 đo độ hÊp thơ quang ë bíc sãng 207 vµ 260nm + Tính nồng độ adenosin allopurinol dung dịch WA theo phơng pháp quang phổ cộng tính Qui trình có độ lặp lại cao với SD% dao động từ 0,38 đến 0,58% độ vói sai số tơng đối % 0,51 adenosin 1,47% ®èi víi allopurinol, ®ã cã thĨ øng dơng ®Ĩ kiểm soát nồng độ adenosin allopurinol dung dịch Wiscosin A đề xuất đề nghị áp dụng phơng pháp quang phổ cộng tính để xác định nồng độ adenosin allopurinol dung dịch WA trình bào chế bảo quản Em xin trân trọng cảm ơn Hội đồng, Quý vị đại biểu đà quan t©m theo dâi! ... dung dịch Wisconsin - A phơng pháp quang phổ cộng tính với mục tiêu sau : X? ?y dựng phơng pháp định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch Wisconsin - A phơng pháp quang phổ cộng tính. .. x? ?y dựng phơng pháp định lợng đồng thời Adenosin Allopurinol 3.4.1 Đề xuất phơng pháp Từ kết nghiên cứu đề xuất phơng pháp định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch Wisconsin- A nh sau:... Việc áp dụng phơng pháp quang phổ cộng tính để định lợng đồng thời adenosin allopurinol dung dịch WA cha đợc đề cập tài liệu đối tợng nghiên cứu dung dịch Wisconsin - A dung dịch có nhiều thành