BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN THẢO DƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ HẢI YẾN TỔNG QUAN VỀ ỨNG DỤNG SINH HỌC PHÂN TỬ TRONG NHẬN DIỆN THẢO DƯỢC KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn: TS. Phùng Thanh Hương Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa sinh HÀ NỘI – 2013 LỜI CẢM ƠN Trong quá trình học tập và hoàn thành khóa luận này, tôi đã nhận được sự giúp đỡ và hướng dẫn quý báu của các thầy cô, gia đình và bạn bè. Với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất, tôi xin được gửi lời cảm ơn tới: - Ban giám hiệu, các thầy, cô giáo trường Đại học Dược Hà Nội đã tận tình dạy dỗ và tạo điều kiện giúp tôi hoàn thành khóa học này. - Các thầy, cô trong bộ môn Hóa sinh đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi hoàn thành khóa luận. Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc tới Tiến sĩ Phùng Thanh Hương – người thầy kính mến đã hết lòng giúp đỡ, dạy bảo, động viên và tạo mọi điều kiện cho tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu đề tài. Tôi xin gửi lời cảm ơn chân thành tới gia đình đã luôn bên cạnh động viên và ủng hộ tôi trong suốt khóa học. Cuối cùng, tôi xin cảm ơn bạn bè đã giúp đỡ và động viên tôi trong thời gian qua. Tôi xin trân trọng cảm ơn! Hà Nội, ngày 7 tháng 5 năm 2013 Tác giả Nguyễn Thị Hải Yến MỤC LỤC DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH ĐẶT VẤN ĐỀ….………………………………………………………………… 1 Chương 1. Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo dược…………………………………………………………… … 3 1.1. Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược……………………………… ……3 1.2. Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược…… …….4 1.2.1. Phương pháp hình thái…………………………………………………… 4 1.2.2. Phương pháp vi học………………………………………………… ……5 1.2.3. Phương pháp phân tích hóa học…………………………………………….6 Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo dược……………………………… ……………………………… 9 2.1. Các marker dựa trên phản ứng khuếch đại chuỗi (PCR)……………….….……9 2.1.1. Kĩ thuật PCR sử dụng các mồi ngẫu nhiên (RP-PCR)……… ……… ….10 2.1.2. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực tiếp (DALP)… ………………………………… 13 2.1.3. Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại (AFLP)…… …14 2.1.4. Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt (CAPS)………18 2.1.5. Kĩ thuật phân tích các trình tự lặp đơn giản (SSR)…………………… …20 2.1.6. Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp (ISSR)…………………….22 2.1.7. Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh (DAMD)………… 25 2.1.8. Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc trưng (SCAR)………………………… …27 2.1.9. Kĩ thuật sự đa hình hình dạng sợi đơn (SSCP)………………………… 31 2.1.10. Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững (ARMS) và multiplex-ARMS (MARMS)………………………………………………….33 2.2. Các marker thu được bằng phương pháp giải trình tự ADN………………… 38 2.2.1 Vùng phiên mã nội (ITS)………………………………………….………40 2.2.2. Vùng trnH – psbA…………………………………………………………42 2.2.3. Maturase K (matK)………………………………… ……………………43 2.2.4. Tiểu đơn vị lớn của ribulose-biphosphat carboxylase (vùng rbcL)……….44 2.2.5. Các trình tự ADN khác dùng trong nhận diện thảo dược…………………45 2.3. Phương pháp ADN microarray………………………………… ……… … 47 2.3.1. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là các oligonucleotid………… …47 2.3.2. Kĩ thuật microarray sử dụng mẫu dò là gen…………… …………… …49 Chương 3. Bàn luận………………………………………………………… ……51 3.1. Đánh giá về các phương pháp nhận diện thảo dược sử dụng công cụ sinh học phân tử………………………………………………… ….51 3.2. Đánh giá thực tế việc nhận diện thảo dược ở Việt Nam……………………….56 KẾT LUẬN………………………………………………………………… ……59 ĐỀ XUẤT…………………………………………… ………………………… 59 DANH MỤC BẢNG VÀ HÌNH ẢNH B ả ng Tên Trang 1 Trình tự mồi SCAR dùng cho phản ứng khuếch đại PCR 29 2 So sánh một số kĩ thuật khác nhau sử dụng công cụ sinh học phân tử để nhận diện thảo dược 55 Hình 1 Nguyên tắc của kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên – RAPD 11 2 Nghiên cứu RAPD với các loài S. angustifolia, S. acutifolia, S. sophera, S. tora 12 3 Nguyên tắc của kĩ thuật AFLP 16 4 Nguyên tắc của kĩ thuật CAPS 18 5 Nghiên cứu CAPS trên các sản phẩm PCR với cặp mồi ITS1, ITS5 và được cắt bằng enzym giới hạn EaeI 19 6 Nguyên tắc của kĩ thuật phân tích các trình tự lặp lại đơn giản SSR 21 7 Nguyên tắc của kĩ thuật ISSR – PCR 23 8 D ấ u vân tay ISSR c ủ a R. palmatum, R. officinale và R. tanguticum sử dụng mồi UBC-811 24 9 Trình tự của tiểu vệ tinh Pge2 26 10 Nguyên tắc của kĩ thuật SCAR (sử dụng mồi SCAR đặc hiệu 27 từ marker RAPD) 11 Trình tự của đoạn ADN đặc trưng cho loài Panax notoginseng 28 12 Nguyên tắc của kĩ thuật SSCP 32 13 Sơ đ ồ vùng ITS và v ị trí các m ồ i đư ợ c s ử d ụ ng 34 14 Sản phẩm thu được sau phản ứng khuếch đại đặc trưng allel của năm loài thuộc chi Citrus 35 15 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự gen matK giữa năm loài thuộc chi Panax 36 16 Mồi đặc hiệu được thiết kế dựa vào sự khác nhau về trình tự gen 18S rADN giữa năm loài thuộc chi Panax 37 17 Đơn vị lặp lại 18S – 26S của ADN ribosom 41 18 Nguyên tắc của kĩ thuật microarray với mẫu dò là oligonucleotid hoặc gen để nhận diện thảo dược 48 DANH MỤC CHỮ VIẾT TẮT Ký hiệu Tiếng Anh Tiếng Việt A Adenine ADN 2’- deoxyribonucleic acid Axít 2’- deoxyribonucleic AFLP Amplified fragment length polyphorphism Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn được khuếch đại AP-PCR Arbitrarily primed- Polymerase chain reaction Kĩ thuật PCR với mồi tùy chọn ARMS Amplification refractory mutation system Kĩ thuật khuếch đại hệ thống đột biến bền vững AS-PCR Allele specific - Polymerase chain reaction Kĩ thuật khuếch đại đặc trưng cho allel ATP-P 33 Adenosine triphosphate - phosphorus 33 BSA Bovine serum albumin Albumin huyết thanh bò C Cytosine CAPS Cleaved amplified polymorphism sequence Kĩ thuật sự đa hình các trình tự khuếch đại được phân cắt CTAB Cetyltrimethylammonium bromide DAF DNA amplification fingerprinting Kĩ thuật vân tay khuếch đại ADN DALP Direct amplification of length polymorphisms Kĩ thuật sự đa hình chiều dài của các đoạn ADN có thể khuếch đại trực tiếp DAMD Directed amplification of minisatellite - region DNA Kĩ thuật khuếch đại trực tiếp vùng ADN tiểu vệ tinh G Guanine IR Infrared Vùng hồng ngoại ISSR Inter-simple sequence repeat polymorphism Kĩ thuật sự đa hình trình tự giữa các vùng lặp ITS Internal trancribed spacer Vùng phiên mã nội MARMS Multiplex amplification refractory mutation system matK Maturase K PCR Polymerase chain reaction Phản ứng khuếch đại chuỗi rADN DNA ribosome ADN ribosom RAPD Random amplified polymorphic DNA Kĩ thuật sự đa hình các đoạn ADN được khuếch đại ngẫu nhiên rbcL Ribulose-bisphosphat carboxylase RFLP Restriction fragment length polymorphism Kĩ thuật sự đa hình chiều dài các đoạn giới hạn RP-PCR Random primed - Polymerase chain reaction Kĩ thuật PCR dùng mồi ngẫu nhiên SCAR Sequence characterized amplified Kĩ thuật khuếch đại vùng đặc regions trưng SNP Single-nucleotide polymorphism Sự đa hình đơn nucleotid SSCP Single strand conformation polymorphism Sự đa hình hình dạng sợi đơn SSR Simple sequence repeats Các trình tự lặp đơn giản T Thymine UV Ultraviolet Vùng tử ngoại WHO World Health Organization Tổ chức Y tế thế giới [...]... thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận diện thảo dược - Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược 3 Chương 1 Tổng quan về hiện trạng nghiên cứu và thực hành nhận diện thảo dược 1.1 Sự cần thiết của việc nhận diện thảo dược Nhận diện thảo dược là khái niệm liên quan đến việc xác định chính xác loài dùng làm thuốc và phân biệt... các phương pháp phân tích hóa học Phân tử ADN tương đối bền vững và ít bị ảnh hưởng bởi môi trường do đó phương pháp này đem lại một công cụ tiên tiến, chính xác và hiệu quả trong nhận diện thảo dược Tại Việt Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước Do... đó, công cụ sinh học phân tử rất hữu ích và thích hợp cho nhận diện thảo dược 9 Chương 2 Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo dược Trong sinh học phân tử, việc nhận diện thảo dược được thực hiện dựa vào các marker di truyền (hay các marker ADN) Marker ADN có thể được hiểu là đoạn ADN đặc trưng thể hiện sự khác biệt ở cấp độ bộ gen Các marker này có thể thu được nhờ sử dụng các... sinh học phân tử 1.2 Các phương pháp thường được sử dụng trong nhận diện thảo dược 1.2.1 Phương pháp hình thái Phương pháp hình thái là phương pháp dựa vào các đặc điểm hình thái tổng quát để nhận diện cây thuốc và các bộ phận của nó Phương pháp truyền thống yêu cầu sử dụng hầu hết các giác quan (quan sát, sờ nắn, nếm, ngửi) để nhận biết một dược liệu [81] Đây là phương pháp đầu tiên được áp dụng trong. .. thành phần hóa học là một công cụ mạnh trong nhận diện thảo dược và hoàn toàn có thể thực hiện khi thảo dược ở dạng dịch chiết Tuy nhiên, nhược điểm chung của các phương pháp hóa học là phụ thuộc vào thành phần hóa học của cây mà thành phần này lại thay đổi rất nhiều tùy theo môi trường, điều kiện thu hái 2 và bảo quản Phương pháp nhận diện thảo dược nhờ sử dụng công cụ sinh học phân tử ra đời đã khắc... đặc điểm bên trong cây thuốc và đặc điểm tế bào Khi thảo dược ở dạng chế biến hoặc dạng khô, đặc điểm hình thái bị thay đổi Phương pháp vi học thích hợp cho việc nhận diện thảo dược trong quá trình chế biến như dạng nguyên liệu đã bị cắt chẻ hoặc ở dạng bột Nó cũng rất có ích trong việc nhận diện các loài có kiểu hình tương tự nhau [81] Một ví dụ sử dụng phương pháp vi học để nhận diện thảo dược là trường... verum và Illicium anisatum [63] Phương pháp vi học là phương pháp rất thông dụng để nhận diện thảo dược Nó có mặt trong Dược điển của nhiều nước như Dược điển Anh, Dược điển thảo dược Mỹ, Dược điển Nhật Bản, Dược điển thảo dược Hàn Quốc… Phương pháp này đơn giản, dễ thực hiện, khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái là có thể xác định thảo dược đã được chế biến hoặc ở dạng bột Tuy nhiên,... nhiều phương pháp khác nhau được sử dụng để nhận diện thảo dược Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái tuy đơn giản nhưng lại phụ thuộc rất nhiều vào kinh nghiệm của người nhận diện và không thể nhận diện được thảo dược ở dạng đã sơ chế Phương pháp vi học có thể khắc phục được nhược điểm của phương pháp hình thái nhưng việc nhận diện lại không thể thực hiện được khi thảo dược ở dạng dịch chiết và khi phải... những tác dụng không mong muốn nêu trên nên việc nhận diện chính xác thảo dược đã và đang là một yêu cầu cấp thiết Có nhiều phương pháp đã được sử dụng trong nhận diện thảo dược từ đơn giản đến phức tạp, từ các phương pháp truyền thống đến các phương pháp hiện đại Phương pháp nhận diện dựa vào hình thái là phương pháp đầu tiên được sử dụng, tiếp đó là phương pháp vi học, phương pháp phân tích hóa học và... giúp phân biệt loài khi ở dạng dịch chiết [81] Phương pháp phân tích hóa học có thể giúp giải quyết được các khó khăn này 1.2.3 Phương pháp phân tích hóa học Phương pháp phân tích hóa học là phương pháp căn cứ vào đặc điểm về thành phần hóa học của một dược liệu để xác định dược liệu đó Các phương pháp phân tích hóa học thường được sử dụng là phương pháp sắc ký, phương pháp điện di và phương pháp quang . Nam, việc ứng dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược vẫn còn mới mẻ và có rất ít nghiên cứu sử dụng công cụ sinh học phân tử trong nhận diện các thảo dược lưu hành trong nước các kĩ thuật sinh học phân tử được sử dụng để nhận diện thảo dược. - Bước đầu đánh giá ưu nhược điểm và khả năng áp dụng của từng kĩ thuật sinh học phân tử trong nhận diện thảo dược. . đoạn sinh trưởng nào của cây [26]. Do đó, công cụ sinh học phân tử rất hữu ích và thích hợp cho nhận diện thảo dược. 9 Chương 2. Các kĩ thuật sinh học phân tử ứng dụng trong nhận diện thảo