BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ MAI DUNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 1 SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 1,3,4-THIADIAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ MAI DUNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 1 SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 1,3,4-THIADIAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ Người hướng dẫn : 1.PGS.TS. Nguyễn Hải Nam 2.DS. Nguyễn Xuân Phong Nơi thực hiện : 1. Bộ môn Hóa Dược HÀ NỘI - 2013 LỜI CẢM ƠN Sau một thời gian thực hiện đề tài với nhiều nỗ lực và cố gắng, thời điểm hoàn thành khóa luận là lúc tôi xin phép được bày tỏ lòng biết ơn chân thành với những người đã dạy dỗ, hướng dẫn và giúp đỡ tôi trong suốt thời gian qua. Trước hết với lòng kính trọng và biết ơn sâu sắc nhất tôi xin bày tỏ lời cám ơn chân thành đến PGS.TS. Nguyễn Hải Nam, DS. Nguyễn Xuân Phong - Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, những người thầy đã trực tiếp hướng dẫn và tận tình chỉ bảo tôi trong thời gian thực hiện khóa luận này. Tôi cũng xin gửi lời cảm ơn đến các thầy giáo, cô giáo và các anh chị kỹ thuật viên của Bộ môn Hóa Dược - trường Đại học Dược Hà Nội, Khoa Hóa - Đại học Khoa học tự nhiên Hà Nội, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam, Khoa Dược - Đại học Quốc gia Chungbuk - Hàn Quốc đã luôn giúp đỡ tạo điều kiện thuận lợi cho tôi thực hiện khóa luận tốt nghiệp. Cuối cùng tôi xin được gửi lời cám ơn sâu sắc đến bố mẹ, gia đình và bạn bè đã luôn động viên khích lệ tôi trong suốt quá trình học tập và nghiên cứu. Hà Nội, ngày 21 tháng 5 năm 2013 Sinh viên Đỗ Thị Mai Dung MỤC LỤC Trang DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1. TỔNG QUAN 2 1.1. HISTON DEACETYLASE (HDAC) 2 1.1.1. Khái niệm về histon deacetylase 2 1.1.2. Phân loại các HDAC 3 1.1.3. Mối liên quan giữa ung thư và hoạt động bất thường của HDAC 4 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 6 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 6 1.2.2. Cấu trúc của các chất ức chế HDAC 8 1.3. MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 9 1.3.1. Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC 9 1.3.2. Một số hướng thiết kế nghiên cứu và tổng hợp trên thế giới 10 1.4. PHƯƠNG PHÁP TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC 13 1.4.1. Tổng hợp amid với tác nhân acyl hóa là acid carboxylic 13 1.4.2. Tổng hợp acid hydroxamic từ ester 14 Chương 2. NGUYÊN LIỆU, THIẾT BỊ, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 15 2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU, THIẾT BỊ 15 2.1.1. Hóa chất 15 2.1.2. Thiết bị, dụng cụ 15 2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 16 2.2.1. Tổng hợp hóa học 16 2.2.2. Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được 16 2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 16 2.3.1. Tổng hợp hóa học 16 2.3.2. Thử tác dụng sinh học 17 2.3.3. Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất tổng hợp được 19 Chương 3. THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 20 3.1. HÓA HỌC 20 3.1.1. Nghiên cứu Docking 20 3.1.2. Tổng hợp hóa học 21 3.1.3. Kiểm tra độ tinh khiết 34 3.1.4. Xác định cấu trúc 34 3.2. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 40 3.2.1. Thử hoạt tính sinh học 40 3.2.2. Đánh giá mức độ giống thuốc 40 3.3. BÀN LUẬN 41 3.3.1. Tổng hợp hóa học 41 3.3.2. Tác dụng sinh học 41 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 44 TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT ALL : Bệnh ung thư nguyên bào lympho cấp tính AML : Bệnh ung thư bạch cầu dạng tủy cấp tính APL CDI CLL CTCL : : : : Bệnh ung thư bạch cầu tủy bào cấp tính Carbonyldiimidazol Bệnh lympho mãn tính (Chronic lymphocytic leukemia) Tế bào lymphoT dưới da (Cutaneous T cell lymphoma) 13 C-NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân 13 C DCM : Dicloromethan DMF : Dimethyl formamid DMSO : Dimethyl sulfoxid EtOH : Ethanol HAT : Histon acetyltranferase HDAC : Histon deacetylase 1 H-NMR : Cộng hưởng từ hạt nhân 1 H IC 50 : Nồng độ ức chế hoạt độ tế bào xuống một nửa IR MTT : : Phương pháp phổ tử ngoại 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid MeOH : Methanol MS NSCLC : : Phổ khối lượng Ung thư phổi tế bào không nhỏ (Non-smali lung cell) NST : Nhiễm sắc thể SAHA : Acid suberoylanilid hydroxamic T 0 nc : Nhiệt độ nóng chảy TLC : Phương pháp sắc ký lớp mỏng TMS : Tetramethylsilan TSA : Trichostatin A DANH MỤC CÁC BẢNG STT Tên bảng Trang 1 B ả ng 1 .1: Các chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng 8 2 B ả ng 1.2: Tác dụng ức chế HDAC của các acid isoxazol- hydroxamic 13 3 B ả ng 3.1: Kết quả docking của các chất 5a - f với HDAC8 20 4 B ả ng 3. 2 : Chỉ số lý hóa và hiệu suất tổng hợp các acid hydroxamic từ ester 33 5 B ả ng 3 .3: Giá trị R f và nhiệt độ nóng chảy của các chất 5a - f 34 6 B ả ng 3.4: Kết quả phân tích phổ MS của các chất 4a - f 35 7 B ả ng 3.5: Kết quả phân tích phổ IR của các chất 5a - f 36 8 B ả ng 3.6: Kết quả phân tích phổ MS của các chất 5a - f 37 9 B ả ng 3.7: Kết quả phân tích phổ 1 H-NMR của các chất 5a - f 37 10 B ả ng 3.8: Kết quả phân tích phổ 13 C-NMR của các chất 5a - f 39 11 B ả ng 3.8: Đánh giá mức độ giống thuốc của các chất 5a - f theo quy tắc Lipinsky 40 12 B ả ng 3. 1 0: Kết quả thử tác dụng ức chế HDAC và hoạt tính kháng tế bào ung thư 42 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ STT Tên hình Trang 1 Hình 1.1 : Cấu trúc của histon trong nucleosom 2 2 Hình 1. 2 : Mô tả đặc điểm của các loại HDAC 4 3 Hình 1. 3 : Vai trò sinh học của các HDAC trong sinh lý tế bào ung thư 6 4 Hình 1. 4 : Một số chất ức chế HDAC đang thử nghiệm trên lâm sàng 7 5 Hình 1. 5 : Cấu trúc của SAHA và trung tâm hoạt động của HDAC 9 6 Hình 1.6: Cấu trúc của TSA, oxamflatin và các dẫn chất N- hydroxy-2-propenamid 10 7 Hình 1.7: Các dẫn chất amid ngược của SAHA 11 8 Hình 1.8: Các dẫn chất  -alkoxy của SAHA 11 9 Hình 1.9: Các acid phenylthiazol-hydroxamic tương tự SAHA 11 10 Hình 1 . 1 0: Các dẫn chất aicd biphenyl-hydroxamic 12 11 Hình 1.11: Công thức cấu tạo của WR301849 12 12 Hình 3.1: Mô hình tương tác của 6 dẫn chất 5a - f với HDAC8 21 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ STT Tên sơ đồ Trang 1 Sơ đ ồ 1. 1 : Cơ chế xúc tác của CDI 14 2 Sơ đ ồ 3.1: Quy trình tổng hợp chung 21 3 Sơ đ ồ 3 .2: Quy trình tổng hợp chất 2a 22 4 Sơ đ ồ 3.3: Quy trình tổng hợp chất 3a 23 5 Sơ đ ồ 3.4: Quy trình tổng hợp chất 4a 24 6 Sơ đ ồ 3.5: Quy trình tổng hợp chất 5a 25 7 Sơ đ ồ 3.6: Quy trình tổng hợp chất 5b 26 8 Sơ đ ồ 3.7: Quy trình tổng hợp chất 3b 27 1 ĐẶT VẤN ĐỀ Acid suberoylanilid hydroxamic (Zolinza ® , 2006) là chất ức chế histon deacetylase đầu tiên được cục quản lý thực phẩm và dược phẩm Mỹ (US-FDA) phê duyệt trong điều trị u lympho da tế bào T. Sau đó, năm 2009 depsipeptid (Romidepsin ® ) một chất ức chế HDAC khác cũng được cấp phép trong điều trị ung thư tại Mỹ. Như vậy có thể thấy, HDAC là một mục tiêu phân tử quan trọng trong điều trị ung thư và các chất ức chế HDAC là các tác nhân chống ung thư đầy triển vọng. Nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược - Đại học Dược Hà Nội cũng đã thiết kế, tổng hợp và công bố nhiều dãy chất với định hướng ức chế HDAC có hoạt tính kháng tế bào ung thư tốt [40,41]. Các nghiên cứu gần đây tại bộ môn về các acid hydroxamic có tác dụng ức chế HDAC cho thấy có thế thay thế nhóm nhận diện bề mặt của SAHA là nhân phenyl bằng vòng thơm khác như benzothiazol cho hoạt tính in vitro rất khả quan [3]. Tiếp theo đó, trong luận văn thạc sĩ của Đỗ Thị Ánh Tuyết [4] khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol đã được sử dụng làm nhóm nhận diện bề mặt thay cho benzothiazol. Tuy nhiên nghiên cứu trên mới chỉ tổng hợp được 5 dẫn chất, chưa đủ để đánh giá khả năng tương tác của nhóm nhận diện bề mặt mới với HDAC, cũng như chưa tìm được chất có hoạt tính kháng tế bào ung thư in vitro tốt để tiến hành các thử nghiệm sâu hơn. Trên cơ sở thay đổi các nhóm thế ở vòng thơm sẽ làm thay đổi tương tác của chất với mục tiêu phân tử, chúng tôi thiết kế các nhóm thế mới trên khung 5-phenyl-1,3,4-thiadiazol và tiến hành đề tài “Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 1,3,4- thiadiazol” với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp N 1 -hydroxy-N 8 -(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2-yl)octandiamid và 5 dẫn chất. 2. Thử độc tính tế bào và tác dụng ức chế HDAC của các chất tổng hợp được. [...]... N1-hydroxy-N8-[5-(4-methylphenyl) -1,3,4- thiadiazol- 2-yl]octandiamid (5e) - N1-[5-(2,6-diclorophenyl) -1,3,4- thiadiazol- 2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (5f) 2.2.2 Thử tác dụng sinh học của các chất tổng hợp được - Thử tác dụng ức chế HDAC - Thử độc tính trên tế bào ung thư đại tràng (SW620) - Sơ bộ đánh giá tính giống thuốc của các chất tổng hợp được 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Tổng hợp hóa học 2.3.1.1 Nghiên cứu... DUNG NGHIÊN CỨU 2.2.1 Tổng hợp hóa học * Nghiên cứu Docking với 6 acid hydroxamic dự kiến tổng hợp * Tổng hợp 6 acid hydroxamic: - N1-hydroxy-N8-(5-phenyl -1,3,4- thiadiazol- 2-yl)octandiamid (5a) - N1-{5-[4-(dimethylamino)phenyl] -1,3,4- thiadiazol- 2-yl}-N8hydroxyoctandiamid (5b) - N1-[5-(4-flourophenyl) -1,3,4- thiadiazol- 2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid (5c) - N1-[5-(4-bromophenyl) -1,3,4- thiadiazol- 2-yl]-N8-hydroxyoctandiamid... TẠO LIÊN KẾT AMID VÀ TỔNG HỢP ACID HYDROXAMIC Các chất tổng hợp trong đề tài này đều qua 4 bước phản ứng Trong đó, có 2 phản ứng quan trọng là phản ứng tạo liên kết amid và phản ứng tổng hợp acid hydroxamic Qua tham khảo tài liệu chúng tôi đã lựa chọn các phương pháp tổng hợp phù hợp với điều kiện phòng thí nghiệm như sau: 1.4.1 Tổng hợp amid với tác nhân acyl hóa là acid carboxylic Acid carboxylic là... : Không thử hoạt tính Nhìn chung, các nghiên cứu đều cho thấy acid hydroxamic là nhóm chất có khả năng ức chế HDAC tốt, một số chất có tác dụng độc tính với tế bào ung thư ở nồng độ rất thấp Tổng hợp các acid hydroxamic hướng ức chế HDAC đang là một hướng nghiên cứu mới và có nhiều triển vọng trong việc tìm kiếm các hợp chất có tác dụng kháng tế bào ung thư chọn lọc, có hiệu quả điều trị cao và ít gây... khóa hoạt động - Các acid phenylthiazol -hydroxamic tương tự SAHA Viện nghiên cứu Walter Reed (Mỹ) đã thiết kế và tổng hợp hàng trăm dẫn chất acid hydroxamic mang hợp phần phenylthiazol thay thế vào vị trí phenyl của SAHA (hình 1.9) Trong đó có nhiều chất có tác dụng ức chế HDAC tương đương hoặc mạnh hơn SAHA [19] Hình 1.9: Các acid phenylthiazol - hydroxamic tương tự SAHA - Các acid biphenyl -hydroxamic. .. cứu của Alan P Kozikowski đã thiết kế và tổng hợp một dãy các dẫn chất acid biphenyl -hydroxamic tương tự SAHA (hình 1.10) [31] Kết quả 12 các dẫn chất này ức chế HDAC mạnh hơn SAHA trên 6 loại HDAC (HDAC1, 2, 3, 6, 8, 10) Một số acid biphenyl -hydroxamic cũng có độc tính trên 5 dòng tế bào ung thư tụy thử nghiệm nhưng tác dụng không tốt bằng các acid phenylthiazolhydroxamic Hình 1.10: Các dẫn chất acid. .. thức cấu tạo của WR301849 Tiếp tục mạch nghiên cứu này, một số dẫn chất trong đó vòng isoxazol được đưa vào vị trí ngay sát nhóm acid hydroxamic đã được thiết kế và tổng hợp Kết quả thử hoạt tính ức chế HDAC cho thấy 4 dẫn chất I-IV ức chế cả 5 loại HDAC1, 2, 3, 6 và 10 với IC50 trung bình khoảng 150 nM, thấp nhất là 25 nM (bảng 1.2) 13 Bảng 1.2: Tác dụng ức chế HDAC của các acid isoxazol -hydroxamic. .. một số liên kết peptid làm tăng khả năng phân cực và góp phần cải thiện dược động học cho các chất ức chế HDAC Việc nghiên cứu thiết kế cấu trúc các chất mới đều dựa trên cấu trúc cổ điển này 1.3 MỘT SỐ HƯỚNG NGHIÊN CỨU TỔNG HỢP CÁC ACID HYDROXAMIC ỨC CHẾ HDAC TRÊN THẾ GIỚI 1.3.1 Liên quan cấu trúc tác dụng của các acid hydroxamic ức chế HDAC Các chất ức chế HDAC dựa trên cấu trúc amid-alkyl -acid hydroxamic. .. hình và số liệu dự đoán tương tác 2.3.1.2 Tổng hợp - Dựa trên những nguyên tắc và phương pháp cơ bản của hóa học hữu cơ để tổng hợp các dẫn chất theo thiết kế - Theo dõi quá trình phản ứng bằng sắc ký lớp mỏng (TLC) 2.3.1.3 Kiểm tra độ tinh khiết - Kiểm tra độ tinh khiết của sản phẩm bằng chạy sắc ký lớp mỏng và đo nhiệt độ nóng chảy 2.3.1.4 Xác định cấu trúc các chất tổng hợp được Các chất tổng hợp. .. tương tác với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của các HDAC như acid hydroxamic, các thiol, nhóm o-aminoanilin của benzamid, mercaptoceton Cấu trúc tinh thể kết tinh của các HDAC cho thấy nhóm kết thúc, cầu nối và một phần của nhóm khóa hoạt động nằm trong túi enzym làm lấp đầy khoảng trống trong lòng kênh enzym Phần còn lại của nhóm khóa hoạt động tương tác với phần vành trên bề mặt miệng túi enzym Nhóm . 5-phenyl -1 ,3, 4- thiadiazol và tiến hành đề tài Tổng hợp và thử hoạt tính sinh học của một số acid hydroxamic mang khung 1,3, 4- thiadiazol với hai mục tiêu: 1. Tổng hợp N 1 -hydroxy-N 8 -( 5-phenyl -1 ,3, 4- thiadiazol- 2-yl)octandiamid. TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ MAI DUNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 1 SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 1,3, 4- THIADIAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SĨ HÀ NỘI - 2013. NỘI - 2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI ĐỖ THỊ MAI DUNG TỔNG HỢP VÀ THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC CỦA 1 SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 1,3, 4- THIADIAZOL KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC