BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LAN PHƯƠNG TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3- OXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-2013 BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LAN PHƯƠNG TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3- OXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE Người hướng dẫn: 1. TS. Phan Thị Phương Dung 2. DS. Nguyễn Thị Mơ Nơi thực hiện: Bộ môn Hóa Dược – Trường Đại học Dược Hà Nội HÀ NỘI-2013 LỜI CẢM ƠN Những dòng đầu tiên của khóa luận, tôi xin được dành để gửi lời cảm ơn tới thầy cô và các bạn, những người đã đồng hành và giúp đỡ tôi rất nhiều trong quá trình hoàn thành khóa luận. Trước hết, tôi xin bày tỏ sự biết ơn sâu sắc và chân thành tới những người thầy, người cô đáng kính của tôi tại bộ môn Hóa Dược, trường Đại Học Dược Hà Nội: PGS. TS. Nguyễn Hải Nam, TS. Phan Thị Phương Dung và DS. Nguyễn Thị Mơ. Các thầy cô đã luôn ở bên cạnh chỉ bảo, hướng dẫn tận tình, giúp tôi hoàn thành đề tài tốt nghiệp. Bên cạnh đó, tôi cũng mong được gửi lời cảm ơn tới các thầy cô giáo cũng như các anh chị kỹ thuật viên tại bộ môn Hóa Dược, trường đại học Dược Hà Nội. Mọi người thật sự đã giúp đỡ rất nhiều, tạo những điều kiện tốt nhất cho tôi cùng nhóm thực nghiệm trong quá trình nghiên cứu khoa học và thực hiện đề tài tốt nghiệp tại bộ môn. Ngoài ra không thể không kể tới sự đồng hành của các anh chị và các bạn trong nhóm thực nghiệm. Sự chia sẻ và động viên của mọi người là nguồn động lực rất lớn của tôi trong suốt thời gian thực nghiệm khoa học. Và cuối cùng tôi muốn gửi sự biết ơn chân thành tới gia đình, bạn bè và người thân của tôi, những người đã luôn ở bên giúp đỡ tôi trong mọi hoàn cảnh. Hà Nội, ngày 15 tháng 04 năm 2013 Sinh viên Trần Thị Lan Phương Trang MỤC LỤC DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CÁC CHỮ VIẾT TẮT DANH MỤC CÁC BẢNG DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ ĐẶT VẤN ĐỀ 1 Chương 1: TỔNG QUAN 2 1.1. ENZYM HISTON DEACETYLASE 2 1.1.1. Định nghĩa và vai trò của HDAC trong cơ thể 2 1.1.2. Phân loại các HDAC 3 1.1.3. Cấu tạo của HDAC 4 1.1.4. HDAC và ung thư 5 1.2. CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC 6 1.2.1. Phân loại các chất ức chế HDAC 6 1.2.2. Cơ chế tác dụng của các chất ức chế HDAC 10 1.2.3. Liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC 12 Chương 2: NGUYÊN LIỆU, NỘI DUNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 17 2.1. NGUYÊN LIỆU 17 2.2. TRANG THIẾT BỊ 17 2.3. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU 18 2.4. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 19 2.4.1. Nghiên cứu docking các chất 19 2.4.2. Tổng hợp hóa học và kiểm tra độ tinh khiết 20 2.4.3. Khẳng định cấu trúc 20 2.4.4. Thử hoạt tính sinh học 20 Chương 3: THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 23 3.1. SƠ BỘ ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ DOCKING 23 3.2. TỔNG HỢP HÓA HỌC 24 3.2.1. Tổng hợp các ester trung gian 1a-d 25 3.2.1.2. Tổng hợp các acid hydroxamic 2a-d 27 3.3. KIỂM TRA ĐỘ TINH KHIẾT 29 3.4. KHẲNG ĐỊNH CẤU TRÚC 30 3.2.3.1. Phổ khối (MS) 30 3.2.3.2. Phổ hồng ngoại (IR) 32 3.2.3.3. Phổ cộng hưởng từ (NMR) 33 3.5. THỬ HOẠT TÍNH SINH HỌC 36 3.6. BÀN LUẬN 37 3.4.1. Hóa học 37 3.4.2. Hoạt tính sinh học 38 KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 42 TÀI LIỆU THAM KHẢO 43 PHỤ LỤC 47 DANH MỤC CÁC KÝ HIỆU, CHỮ VIẾT TẮT AML Acute myeloid leukemia (bệnh bạch cầu cấp dòng tủy) AML-ETO Protein gây tăng sinh APL Acute promyelocytic leukemia (ung thư bạch cầu) APAF1 Apoptoic protease activating factor (yếu tố hoạt hóa protease) CHAP Cyclic hydroxamic-containing peptid (các dẫn xuất của acid tetrapeptid hydroxamic vòng) CD Receptor gây chết nội tại CBHA m-carboxycinnamic acid bis-hydroxamid DMF Dimethyl formamid DMSO Dimethyl sulfoxid DMSO-d6 Dimethyl sulfoxid đã được deuteri hóa FBS Fetal bovine serum (huyết thanh bào thai bò) HDAC Enzym histon deacetylase HDACi Histon deacetylase inhibitor (Chất ức chế enzyme histon deacetylase) HAT Enzym histon acetyltransferase IC 50 Nồng độ ức chế 50% sự phát triển của tế bào IHCM1 Intercellular adhesion molecule 1(phân tử kết dính gian bào) IR Phương pháp phổ hồng ngoại MeOH Methanol MHC Major histocompality complex (phức hợp tương thích mô chính) MS Phương pháp phổ khối MTT 3-(4,5-dimethyl-2-thiazolyl)-2,5-diphenyltetrazolium bromid NMR Phương pháp phổ cộng hưởng từ hạt nhân PLRF The Promyelocytic leukemia zinc finger (bệnh lơ-xê-mi cấp tiền tủy bào) RA Retinoic acid RAR Retinoic acid receptor alpha (receptor của acid retinoic) ROS Reactive oxygen species (gốc oxy tự do hoạt động) SAHA Acid suberoylanilid hydroxamic TLC Phương pháp sắc ký lớp mỏng TSA Trichostatin VEGF Vascular endothelial growth factor (yếu tố gây phát triển màng trong mao mạch) DANH MỤC CÁC BẢNG Bảng Tên bảng Trang 3.1 Giá trị Rf và nhiệt độ nóng chảy của các acid hydxamic 28 3.2 Số liệu phân tích phổ khối của các acid hydroxamic 29 3.3 Số liệu phân tích phổ IR của các acid hydroxamic 30 3.4 Số liệu phân tích phổ 1 H-NMR của các acid hydroxamic 31 3.5 Số liệu phân tích phổ 13 C-NMR của các acid hydroxamic 32 3.6 Kết quả thử hoạt tính sinh học 34 DANH MỤC CÁC HÌNH VẼ Hình Tên hình Trang 1.1 Cấu trúc histon trong nucleosome 2 1.2 Vai trò cân bằng của HDAC và HAT với sự phiên mã 3 1.3 Cấu tạo trung tâm hoạt động của HDAC 5 1.4 Vai trò của sinh học của HDAC trong sinh lý tế bào ung thư 6 1.5 Công thức cấu tạo của Trichostatin (TSA) 7 1.6 Công thức cấu tạo của suberoylanilid hydroxamic acid (SAHA) 7 1.7 Công thức cấu tạo của acid valproic 8 1.8 Công thức cấu tạo của depsipeptid FK228 9 1.9 Công thức cấu tạo của MS275 9 1.10 Cấu trúc chung của một số dãy chất nghiên cứu đã công bố 13 1.11 Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic 14 1.12 Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic 16 3.1 Kết quả docking và dự đoán năng lượng liên kết của chất 5d với HDAC 8 22 3.2 Công thức tổng quát N 1 -hydroxy-N 8 -(5-phenyl-1,3,4-thiadiazol-2- yl)octandiamid và dẫn chất 38 3.3 Công thức tổng quát chất dãy chất acid hydroxamic mang khung benzothiazol 38 DANH MỤC CÁC SƠ ĐỒ Sơ đồ Tên sơ đồ Trang 3.1 Quy trình tổng hợp chung 23 3.2 Quy trình tổng hợp hợp chất trung gian 1a-d 24 3.3 Quy trình tổng hợp các dẫn chất acid hydroxamic 2a-d 26 [...]... nhiều dãy chất với định hướng ức chế histon deacetylase và cho những kết quả bước đầu khả quan Tiếp tục hướng đi đó, chúng tôi đã thực hiện đề tài Tổng hợp một số acid hydroxamic mang khung 3- oxim isatin hướng ức chế histon deacetylase với 2 mục tiêu sau đây: * Tổng hợp N-hydroxy-7- (3- (hydroxyimino)-2-oxoindolin-1-yl) heptanamid và một số dẫn chất * Bước đầu thử tác dụng ức chế HDAC và đánh giá độc... QUAN GIỮA CẤU TRÚC VÀ TÁC DỤNG CỦA CÁC CHẤT ỨC CHẾ HDAC MANG CẤU TRÚC ACID HYDROXAMIC 1.2 .3. 1 Cấu trúc chung của các chất ức chế HDAC mang cấu trúc acid hydroxamic Dựa trên nghiên cứu cấu trúc enzym đích HDAC, nhóm nghiên cứu tại bộ môn Hóa Dược trường Đại Học Dược Hà Nội đã thiết kế và phát triển hàng loạt các dẫn chất acid hydroxamic hướng ức chế HDAC [2, 3, 6] (xem hình 1.10) Các nghiên cứu và thử... đổi phần A còn ảnh hưởng tới khả năng ức chế chọn lọc của các HDACi, nhóm nhận diện bề mặt nhỏ thường tạo ra các HDACi không chọn lọc, còn các vòng lớn như peptid vòng làm tăng khả năng ức chế chọn lọc: SAHA và các acid hydroxamic có phần A nhỏ ức chế không chọn lọc HDAC I và II, trong khi CHAP (các acid hydroxamic tổng hợp chứa peptid vòng) chỉ ức chế chọn lọc một số HDAC nhóm I Điều này có thể do HDAC... tổng hợp tạo dẫn chất 2a 3. 2.1.2 Tổng hợp ethyl 7-(5-cloro-2 ,3- dioxoindolin-1-yl) heptanoat (1b) Quá trình tổng hợp chất 1b từ 0,181g 5-cloroisatin (≈1mmol) và 0, 237 g ethyl 7-bromoheptanoat (≈ 1mmol) được thực hiện tương tự như tổng hợp chất 1a Kết quả thu được như sau: * Khối lượng của dẫn chất 1b: 0,263g * Cảm quan: màu đỏ nâu * Hiệu suất: 78% 3. 2.1 .3 Tổng hợp ethyl 7-(5-bromo-2 ,3- dioxoindolin-1-yl)... trình tổng hợp chất 1c từ 0,226g 5-bromoisatin (≈1mmol) và 0, 237 g ethyl 7-bromoheptanoat (≈ 1mmol) được thực hiện tương tự như quy trình tổng hợp chất 1a Kết quả thu được như sau: * Khối lượng của dẫn chất 1c: 0 ,31 7g * Cảm quan: màu đỏ nâu * Hiệu suất: 83% 3. 2.1.4 Tổng hợp ethyl 7-(2 ,3- dioxoindolin-5-nitro-1-yl) heptanoat (1d) Phản ứng tổng hợp chất 1d từ 0,192g 5-nitroisatin (≈ 1mmol) và 0, 237 g ethyl... có thể là acid hydroxamic, các thiol, benzamid, mercapoceton Mối liên quan giữa cấu trúc và tác dụng của các chất ức chế HDAC mang cấu trúc acid hydroxamic có thể xem ở hình 1.11 Nghiên cứu thiết kế công thức cho các HDACi mới đều dựa trên việc thay đổi cấu trúc của 3 phần này Hình 1.11: Liên quan cấu trúc - tác dụng của các chất ức chế HDAC dẫn chất acid hydroxamic 1.2 .3. 2 Thiết kế công thức cho các... chức tạo chelat với Zn2+ Khả năng tạo phức với ion Zn2+ tại trung tâm hoạt động của HDAC quyết định tính đặc hiệu và hiệu lực của các HDACi Hiện nay đã biết một số 14 nhóm có thể liên kết với Zn2+ bao gồm: acid hydroxamic, sulfanamid, nhóm chức aminoanilin, thiol, acid carboxylic Trong đó, nhóm acid hydroxamic tạo chelat bền vững với Zn2+ nhất và hầu hết các dẫn chất của acid hydroxamic đều ức chế. .. Đây là một điểm mới cần tiến hành nghiên cứu thêm 3. 2 TỔNG HỢP HÓA HỌC Quá trình tổng hợp 4 chất trong khóa luận được thực hiện theo sơ đồ chung dưới đây: O X O X i N H N O O O OC2H5 NHOH X ii N O X = -H -Cl -Br -NO2 O NHOH Sơ đồ 3. 1: Quy trình tổng hợp chung Tác nhân và điều kiện: i) ethyl 7-bromoheptanoat, DMF, K2CO3, CH3OH, KI, 80oC, 2h; ii) CH3OH, NH2OH.HCl, NaOH, -5oC, 15-20’ Quy trình tổng hợp gồm... nhanh, ức chế không chọn lọc trên các HDAC [28] 1.2.1.2 Các acid béo mạch ngắn Nhóm các acid béo mạch ngắn như phenylbutyrat cùng các dẫn chất và các acid valproic (xem hình 1.7) có tác dụng ức chế HDAC tương đối yếu, ở khoảng nồng độ micromol Gần đây, một hợp chất có cấu trúc ghép giữa phenylbutyrat và TSA (BL1521) đã được ghi nhận là có tác dụng ức chế ở nồng độ micromol thấp [30 ] Hình 1.7: Công thức... 1 là phản ứng thế ái nhân, tổng hợp ethyl 7-(2,3dioxoindolin-1-yl) heptanoat từ isatin và ethyl 7-bromoheptanoat trong dung môi là DMF - Giai đoạn 2, tiếp tục tổng hợp N-hydroxy-7- (3- (hydroxyimino)-2oxoindolin-1-yl)heptanamid và hydroxylamin.HCl, trong giai đoạn này có sử dụng xúc tác là NaOH và dung môi là CH3OH 25 3. 2.1 TỔNG HỢP CÁC CHẤT ESTER TRUNG GIAN Quy trình tổng hợp các ester trung gian 1a-d . THỊ LAN PHƯƠNG TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3- OXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE KHÓA LUẬN TỐT NGHIỆP DƯỢC SỸ HÀ NỘI-20 13 BỘ Y. isatin hướng ức chế histon deacetylase với 2 mục tiêu sau đây: * Tổng hợp N-hydroxy- 7- ( 3- (hydroxyimino )-2 -oxoindolin-1-yl) heptanamid và một số dẫn chất. * Bước đầu thử tác dụng ức chế HDAC. HỌC DƯỢC HÀ NỘI TRẦN THỊ LAN PHƯƠNG TỔNG HỢP MỘT SỐ ACID HYDROXAMIC MANG KHUNG 3- OXIM-ISATIN HƯỚNG ỨC CHẾ HISTON DEACETYLASE Người hướng dẫn: 1. TS. Phan Thị Phương Dung 2. DS.